Principios y aplicaciones microscópicos

La microbiología utiliza el microscopio para detectar e identificar microrganismos a partir de muestras clínicas.

Métodos microscópicos

Microscopía de campo brillante

Los microscopios ópticos utilizan una fuente de luz para iluminar las muestras, un condensador para enfocar la luz sobre ellas y dos sistemas de lentes (lentes del objetivo y lentes oculares) para amplificar sus imágenes. Las muestras se visualizan al ser atravesadas por la luz que sale del condensador. Las imágenes son amplificadas primero por las lentes del objetivo y después por las lentes oculares. Generalmente se emplean tres lentes del objetivo: de bajo aumento (×10), para obtener una visión general de las muestras, de alto aumento en seco (×40), para detectar microrganismos de gran tamaño, y de inmersión en aceite (×100), para observar microrganismos pequeños. Las lentes oculares pueden amplificar las imágenes entre 10 y 15 veces.

El límite de la microscopía óptica está en la resolución de la imagen, es decir, en la capacidad de distinguir que dos objetos están separados y no son uno solo. El poder de resolución de un microscopio está determinado por la longitud de onda de la luz utilizada y el ángulo con el que esta luz incide en las lentes objetivo (conocido como apertura numérica). El poder de resolución aumenta cuando se coloca una capa de aceite entre la lente objetivo y la muestra, esto porque el aceite reduce la dispersión óptica. Aunque muchos microrganismos pueden visualizarse mediante microscopía de campo brillante, tanto ellos como el fondo tienen índices de refracción similares. Por tanto, los microrganismos deben teñirse para poder distinguirlos.

Microscopía de campo oscuro

Los microscopios de campo oscuro utilizan las mismas lentes que los microscopios de campo brillante, pero tienen un condensador especial que impide que la luz ilumine directamente las muestras. Solo la luz oblicua y diseminada alcanza las muestras y penetra los sistemas de lentes, haciendo que las imágenes brillen sobre un fondo negro. El microscopio de campo oscuro tiene un poder de resolución mayor al del microscopio de campo claro, por lo que permite detectar bacterias sumamente delgadas, como Treponema pallidum. Sin embargo, como la luz pasa alrededor de los microrganismos y no a través de ellos, la microscopía de campo oscuro no permite ver sus estructuras internas.

Microscopía de contraste de fases

En la microscopía de contraste de fases, los haces de luz que atraviesan los materiales más densos se retrasan considerablemente con respecto a los demás. Empleando una serie de anillos en el condensador y en las lentes del objetivo, estas diferencias de fase pueden amplificarse, haciendo que la luz en fase brille más que la luz desfasada. Esto genera una imagen tridimensional de las muestras y permite analizar mejor las estructuras internas.

Microscopía de fluorescencia

Los fluorocromos son compuestos que pueden absorber la luz ultravioleta y emitir luz visible. Pocos microrganismos son naturalmente fluorescentes (autofluorescentes), por lo que la microscopía de fluorescencia debe emplear fluorocromos para teñir las muestras y poder visualizarlas. Los microscopios de fluorescencia utilizan lámparas halógenas, de vapor de xenón o de mercurio presurizado para emitir haces luminosos de longitud corta. Una serie de filtros bloquea el calor de la lámpara, elimina la luz infrarroja y selecciona la longitud de onda adecuada para excitar los fluorocromos. La luz emitida por estos es después amplificada por las lentes del microscopio. Los microrganismos autofluorescentes y las muestras teñidas con fluorocromos brillan sobre un fondo negro, con un color característico para cada fluorocromo.

Microscopía electrónica

Los microscopios electrónicos utilizan espirales magnéticos para dirigir un haz de electrones desde un filamento de tungsteno a través de una muestra y hacia una pantalla. La resolución de estos microscopios es considerablemente mayor, por lo que permiten observar incluso partículas víricas individuales. Las muestras suelen teñirse o recubrirse con iones metálicos para generar contraste. En el microscopio electrónico de transmisión los electrones atraviesan directamente las muestras; en el microscopio electrónico de barrido, en cambio, rebotan en su superficie para generar imágenes tridimensionales.

Métodos de examen

Las muestras clínicas pueden simplemente colocarse en un portaobjetos y examinarse así bajo el microscopio. Aunque este método permite visualizar microrganismos de gran tamaño, no es el ideal para observar estructuras internas. La tinción de las muestras, en cambio, permite distinguir adecuadamente múltiples detalles internos de los microrganismos.

Examen directo

Los métodos de examen directo son los sistemas de preparación de muestras más sencillos. Las muestras pueden sumergirse en agua o suero fisiológico, mezclarse con un álcali o con una combinación de un álcali y una tinción de contraste. Los pigmentos tiñen de manera inespecífica el material celular, incrementando el contraste y permitiendo realizar un examen detallado de diversas estructuras. El método de la tinta china emplea tinta para oscurecer el fondo en lugar de los microrganismos, permitiendo así detectar cápsulas alrededor de los mismos.

Tinciones diferenciales

Las diferentes tinciones que existen se usan para teñir microrganismos o componentes celulares específicos. La tinción de Gram constituye la base de la clasificación de las bacterias en bacterias grampositivas y gramnegativas. Además, también es útil para teñir levaduras (que son grampositivas). Las tinciones con hematoxilina férrica y tricrómica son útiles para identificar parásitos protozoos. La tinción de Wright-Giemsa, por otro lado, permite identificar parásitos sanguíneos.

Tinciones acidorresistentes

Las tinciones acidorresistentes permiten distinguir ciertos microrganismos a partir de su capacidad para retener una tinción primaria incluso al ser expuestos a agentes decolorantes, como las mezclas de ácidos y alcoholes. Los métodos de tinción acidorresistente más comunes son el método de Ziehl-Neelsen, que requiere el calentamiento de la muestra durante la tinción, el método de Kinyoun, que se realiza en frio, y el método auramina-rodamina, que emplea un fluorocromo. El método del fluorocromo es el más conveniente porque permite examinar rápidamente grandes áreas simplemente buscando regiones fluorescentes sobre un fondo negro.

Tinciones fluorescentes

La tinción con auramina-rodamina es solo una de las diferentes tinciones fluorescentes. El naranja de acridina, por ejemplo, puede utilizarse para teñir bacterias y hongos. El blanco de calcoflúor, a su vez, se emplea para teñir la quitina de las paredes de los hongos.

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