CAPITUI;O V

BACTERIAS HETEROTROFAS (Continuación)

3. Bacterias anaerobias que necesitan hidrógeno combinado.

BACT^RIAS DESTRUCTORAS DE I,A C^I,UI,OSA:

a) Anaerobias.

b) Aerobias.

c) Termófilas.

d) Desnitrificantes.

3. Bacterias aaaerobias. - No se conoce ninguna bacteria abso-lutamente anaerobia, es decir, que sólo pueda vivir y desarrollarse entotal ausencia de oxigeno (pág. i3). I,as anaerobias estrictas parecenestimuladas por la presencia de pequeñas cantidades de osígeno libre,aun cuando pueden vivir en total ausencia de este gas.

I,a primera generación de una bacteria anaerobia, en cultivo, esmás sensible a la presencia de oxfgeno que las generaciones siguientes,y dentro de una generación, toleran peor el oxígeno en las primerasedades del cultivo.

McI,eod y Gordon (68) han destacado la incapacidad de producircatalasa de las bacterias anaerobias. 1~n el desarrollo aerobio de lasbacterias se forma peróxido de hidrógeno, que sería perjudicial paraellas de no existir la catalasa, que desdobla el peróxido en agua y oxf-geno inactivo. A1 carecer las bacterias anaerobias de la capacidad deformar catalasa, cuando se desarrollan en condiciones aerobias estánsometidas a la acción perjudicial del agua oxigenada. ^1 efecto nocivodel aire sobre las bacterias anaerobias en estado vegetativo se hacepatente con una exposición de sólo cuarenta minutos, mientras queen las esporas no se manifiesta al cabo de tres horas (2 y 27).

Las bacterias anaerobias intervienen en el suelo en un número con-siderable de importantes procesos, algunos de los que hemos mencio-nado ya, y entre los que merecen destacarse: formación de amoníacoa partir de los proteidos; fijación del nitrógeno atmosférico por bac-terias libres, más iutensa, probablemente (77), que la llevada a cabopor bacterias aerobias, y descomposición de celulosa, peptinas yproteidos.

^l solo carácter de anaerobias no sirve para caracterizar bacteriasque difieren tan fundamentalmente en su metabolismo, como lasqne obtienen su energía de la celulosa, las que toman su nitrógeno delnitrógeno atmosférico, las que pueden obtener oxígeno de los nitratos

- óI -

y sulfatos o las que ocasionan el desprendimiento de olores pesti-lentes de las prote^nas complejas. Mientras que el anhídrido carbó-nico es el gas principal producido por las bacterias aerobias, las anaero-bias se caracterizan por originar diversos gases, tales como el metanoy el hidrógeno en la descomposición de los glúcidos; el ácido sulfhí-drico en la reducción de los sulfatos; óxidos de nitrógeno y nitrógenolibre en la reducción de los nitratos; determinadas aminas, hidrógenosulfurado, nitrógeno y sus ógidos y mercaptanes, como resultantesde la descomposición de los proteidos. Además, las bacterias anaerobiasforman ácidos acético, butírico, propiónico, fórmico y láctico, alco-holes etílico y butílico, y en algunos casos, acetona.

De entre los varios sistemas de clasificación de las bacteriasanaerobias del suelo, reproducimos el siguiente, propuesto por ^^Vaks-man (io2): ^

I.-Bacterias que actúan prindpalmente sobre hidratos de carbono:

i. - Bacterias que utilizan ampllamente hidratos de carbono sencillos y

almídones como fuentes de energfa, denominadas por varios auto-

res sacarolíticas. A este grupo pertenecen las bacterias butíricas

clasificadas de ordinario como una sola espede: Bacillus amylo-

bacter A. :lfeyer y Bredemann. $stas bacterias descomponen los

azúcares, con formadón de áddo butfrico y Rases.

a) Bacterias. fijadoras de nitrógeno: Clostridium pastorianum Wino-

gtadsky (Bac, amylobacter van Thieghem, Bac. amylocyme

Perdrix, Bac, butyricus Botkin, Granulobacter saccarobuty-

ricum Befjeriack, Bac. ordhobutilicus Grimbert, Clostridium

americanum Ptiagahefm, Bac. amylobacter A. M. y Bred.), y

formas afines encontradas prácticamente como abundantes

ea casi todos los auelos. Bste organ{smo o grupo ha sido clasi-

ficado por Bergey como Cdostridium butyricum Prazmowsky-

y por Lehmann y Newmann, como Bac. pastorianum Wino,

gradsky.

b) Bac. wekhii Migula (Bac. aerogenes capsulatus Weleh y Nutall,

Bac. per/ringens Veillon y Zuber, Bac, enteritidis sporogenes

Kleín). BastondUos cortos, de 4 a 8 µ x i a i,s µ, aíslados o

en parejas, inmóvilea, que forman esporas ovales, centrales

o escéntrícas, encapsulados. Bncontrada repetidas veces en

el suelo y en las aguss residuales.

z. - Bacterias que descomponen los compuestos pécticos.

a) Grupo del Bac. amylobackr, que ineluye al Clostridium pastorianum

(ígual que i, a)). I,as formas que ocasionan el enriado del lino

han sido descrítas con nombtes diveraos, entre ellos el Plec-

tridium de Fribea y Wínogradsky, el Clostridium de Behrens^

el Plectridium pectinovorum de Beijerínck y van Delden.

-gz-.

b) Bac. Jelsineus Carbone. Bastondllos, de o,3 a o,q µ x 3 a g µ,que se preseatan aislados, en pares y en cadenas, móviiea conflageloa perítricos. Esporas ovales, terminales, Gram positivos.No producen áddo butlrIco en el enriado del lino.

3. - Bacterias qne desrnmponen la celulosa.

a) Bacterias anaerobias que descomponen la celulosa a la temperatu-

ra ordinaría. Bntre ellas se encuentran las productoras de

hidrógeno y de metano, de Omellansky; el Bac. cellulos^

dissolvans Khouvíne, y otras.

b) Bacterias termófilas: Clostridium thermocellum Víljcen, Fred yPeterson.

II.-Bacteriae que ad:úan prIndpalmente sobre los prótidos.

i. - Pormas fuertemente proteolíticas. •

a) Bac. sporegenes Metdwihoff (Glostridium sporogenes (Metcluii-

koff) Bergey y ml). Bacilo mbvil, con flagelos perítricos, Gram

posítívo, con extremos redondeados, de 3 a y µ x o,6 a o,8 µ.

Una de las bacterias más fuertemente proteolíticas que se co-

nocen. Descompone los prótidos rnn formacidn de gas, enne-

gredmiento del medio y producdón de an olor marcado. );as

esporas, subterminales, se forman proato. Se encuentra abun-

dantemente en el sudo, estiércol, polvo y aguas residuales.

b) Bac. oadamatis maligni Koch ( Vibrion septique Pasteur, Clostri-

dium oedematis maligni (Koch) Bergey y col.). E;ncoatrado

en el intestino del hombre y en el suelo. Descompoae los pró-

tidos con formaddn abuadante de gas, sin ennegrecer el

medio.

c) Bac. putrificus Bienstodc (Clostridium puirificus Bergey y col.).Badlo rnn flagelos perítricos, móvil. F'orma esporas ovales,graades, termínales. Posee propíedades saca.rolíticas débilesy descompone fuertemente los prótidos, con ennegredmientodel medio y desprendimiento de olor fétido. La leche es dige-rida gradualmente, sin coagulacíóa rápida.

d) Bac. histolytticus Weimberg y Seguin (Clostridium histolytícumBergey y col.). Bad1o de 3 a 5 µ x o,s a o,^ µ, móvil con fla-gelos perftricos, que se presentan aislados o en parejas. Des-compone los prótídos ain desprendimiento de gases, ennegre-ce el medio y posee olor nauseabundo. Este organísmo ha sidoaislado del suelo por Peterson y Hall.

e) Bac, botultinus van Ermengen (Clostridium botulinum Bergeyy rnl.). Badlos gruesos, con estremos redondeados y esporasovales subterminales. Descompone los prótidos con forma-ddn de gasea y ennegredmiento del medio. >~I habitat naturalde esta espede está eztendido por todo el mundo, tanto en lossuelos vfrgenes y forestales como en loa cultivados.

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s. - Organiemoe dEbilmeate proteolitícoa.

a) Bac. bifer+westaus Tíeaier ^ Martelly (Clostridium 6iJermc+^taxs(Tisaíer y Martelly) Bergey y col.). Badlos de 5 a 6 µ x o,8a r µ, inmóvilea, preaeatQndade aialadoa o en cadenas wrtaa.iyaporas ovalea, centralea. I.os baatondllos no engrnesan alesporular. Produce áddo y gas con loa hidratoa de carbono.Dearnmpone los prótídoa oon deaprendimíeato gaseoao y en-negredmimto dei medio. Arede desarroUarae hasta loa go^.

b) Bac. t^taxi Nfoolaiet (Closhidium tetani (Níeolaiet) Holland).Badloe móvíks, oon flageloa perltricos, de 4 a 8 µ x o,4 a o.6 µ,incapaces de ntilizar los hidratos de carbono. Eanegrecen elmedio de caltivo. Pasaa al auelo mn el eatiércol, habiendo aidocomprobada sn eziatenda m muchas muestraa de auelo.

5e han aislado del ando o de otras fuentes, que pueden in-

dícar un habitat m él, bacteríae anaerobfas de eacaso poder pro-

teolítico, pero capacea de atacar a diversoa hidratoa de carbono

con formadón de gas, q tales como Bac. ckauvei Arloing, Corne-

vla y Thomas (Clostridium cáauvei (Arloíng, Cornevin y Thomas)

Holland).

III.-Bacterias qne obtienen au ozígeno de sales mineralea.

r. - Bacterias rednctoras de nitratos.

z. - Bacterias reductorss de sulfatos.

I,as bacterias anaerobias pueden llegar a alcanzar en el suelocifras muy elevadas, del orden de los io millones por gramo de tierrade jardín. 1~1 gran número de bacterias anaerobias que se encuentranen los suelos forestales (de 500.00o a 5 millones por gramo de suelo)merece particular atención, así como la de las fijadoras de nitrógenoanaerobias (de ioo a io.ooo por gramo de suelo). I,as bacterias fija-doras de nitrógeno aerobias, o faltan totalmente en los suelos fores-tales, o están en número muy reducido, lo que prueba (3o y 32) elpapel de las bacterias anaerobias para la fijación del nitrógeno atmos-férico en estos suelos.

Bacterias destructoras de la celulosa. - Fstas bacterias han sidoobjeto de particular atención a causa de que la celulosa es el materialorgánico más abundante entre los que recibe el suelo y a que existenbastantes bacterias que pueden desarrollarse utilizando la celulosacomo material energético, y algunas son incapaces de emplear otraf uente de energía.

I,as bacterias destructoras de celulosa pueden dividirse en lossiguientes cuatro grupos: anaerobias, aerobias, termófilas y desni-

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trificantes, de los que el primero parece ser el de mayor importarr-cia (8o y I^3) en los procesos que se llevan a cabo en el suelo.

aJ BACT^RIAS ANAEROBIA5 DE5TRUCTORA5 D^ I.A CEI.UI,OSA. - Al

frente de este grupo deben figurar las bacterias, ya clásicas, aisladas

por Omeliansky (75) a fines del siglo pasado: Bac. methanigenes I,ehmann

y Neumann y Bac. f ossicularum I,ehmann y Neumann, que fueron

las primeras bacterias que se demostraron definítivamente capaces

de descomponer la celulosa en forma de papel de filtro o de algodón.

Ambos organismos se encuentran en aquellas sitios donde, encondiciones anaerobias, se destruyen tejidos vegetales, por ejemplo,en el esti^rcol o en el cieno de los pantanos y ríos.

Para su aislamiento, Omeliansky empleaba estiércol de caballo 0

cieno del río Neva, inoculados en frascos completamente llenos deun medio que contenía, además de papel de filtro, los siguientes ele-

mentos:Fosfato btpotásico (KfHPOi) ........ . . .. . . . . . . . i,o gramos.

Sulfato magnésim (b1gS0^ • qH^O) ....... . . . . .. . o,s r

Sulfato amónico (NH^)^ SO^ ..... ... . . . . . . . . . . . . i,o r

Carbanato cáldrn (CaCO') ..................... io,o r

Ci,oruro sódico (NaCI) ... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Indidos.

Agua destilada ............................... iooo c. c.

El sulfato amónico puede ser reemplazado por una cantidad igualde fosfato amónico, de peptona o de asparagina.

Los frascos inoculados se incuban a una temperatura de 34^ a 35^.

A1 cabo de unos ocho días empieza el desprendimiento de gases de Ia

fermentación, que, al principio, consisten en una mezcla de hidrógeno,

metano y anhídrido carbónico; pero que después de varios resiembros

en medio nuevo, terminan por contener una mezcla de metano y

anhídrido carbónico, en la proporción de 3 a i cuando los cttltivos son

jóvenes.^n esta fase, cuando el gas desprendido no contiene hidrógeno, el

cultivo es casi puro, pudiendo ser aumentada su pureza mediante pas-teurizaciones realizadas antes de los resiembros, siempre que las espo-ras del fermento metánico estén formadas. Por este medio se destru-yen los organismos contaminadores que no formen esporas.

Examinando al microscopio un cultivo obtenido de este modo, seobserva que contiene unos bacilos delgados, de o,4 ^ x 5 µ, que secolorean fácilmente y se encuentran en gran número depositadossobre las fibras de celulosa, por lo que muchos de ellos están curvados

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y conservan la forma de la sección de la fibra aun después de separa-dos de ésta rnediante lavados. A medida que el cultivo envejece yavanza la destrucción de la celulosa, los bacilos se alargan hastaalcanzar una longitud triple de la primitiva, empezando a percibirseun engrosamiento en uno de los extremos. que se tiñe más intensa-mente, constituyendo finalmente una espora esférica de z µ de diá-metro, en cuyo momento el Bac. methanigenes presenta su aspectomás caractertstico.

I,a destrucción de la celulosa puede seguirse microscópicamente.A1 iniciarse el ataque, el papel de filtro toma una coloración anaran-jada o amarilloanaranjada, apareciendo con numerosos agujeros ylos bordes corroídos. Finalmente pierde su estructura fibrosa y seacumula en el fondo del frasco en forma de un sedimento negruscoo anaranjado. El proceso de la destrucción es lento y puede durarvarios meses. Durante el perlodo de fermentación vigorosa, el des-prendimiento de gases varía de 3,5 c. c. a i5 c. c. por gramo de celu-losa. Adernás de los gases indicados, durante la fermentación se for-man ácidos grasos volátiles.

Con el Bac, methanigenes aparece asociado el Bac, f ossicularum, quedesprende hidrógeno durante la fermentación de la celulosa. Sus es-poras germinan mucho más lentamente que las del primero, hecho quefué aprovechado por Omeliansky para su separación. Como hemosindicado, en el primer cultivo preparado para el aislamiento del Ba-cillus methanigenes, el gas desprendido contenía hidrógeno y metano.Si dicho cultivo, poco tiempo después de iniciado el desprendimientogaseoso, se calienta durante quince minutos a una temperaturade 75^, las células del bacilo metánico procedentes de la germinaciónde las esporas quedan destrufdas, mientras que las esporas del pro-ductor de hidrógeno, que no han germinado todavía, permanecen vi-vas. Repitiendo esta operación en tres o cuatro generaciones sucesi-vas se llega a obtener un cultivo que sólo desprende hidrógeno yanhídrido carbórŭco, en el que se encuentran bacilos de o,5 µ X 4 a 8 µde longitud en los cultivos jóvenes, y en los viejos pueden alcanzarde io a ^5 µ de longitud. ^as esporas, esféricas y terminales, son demayor diámetro que en el Bac. methanigenes, midiendo i,5 µ de diá-metro. A1 igual que este último, las células vegetativas no toman conel yodo la coloración azul o púrpura caracterfstica del Bac. amylobacter.

I,a fermentación hidrogenada de la celulosa progresa más lenta-mente que la metánica, y a la temperatura óptima (35^) puede con-tinuar ininterrumpidamente durante más de un año. El gas, hidró-

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geno y anhídrido carbónico, se forma con más lentitud; aproximada-mente, 8 c. c. por gramo de celulosa en las veinticuatro horas. Ade-más de los gases mencionados, durante la fermentación se formanácidos acético y butírico, trazas de ácido valérico y alcoholes superio-res, asf como pigmentos y substancias aromáticas, que dan al cultivoun aroma parecido al del queso.

Ni el Bac. methanigenes ni el Bac, fossicularum han podido obte-nerse en cultivos puros en la forma habitual, ya que ninguno de losdos se desarrollan en los medios sólidos ordinarios a base de agar ogelatina, habiendo fracasado todos los intentos en este sentido.

En iq23, Khouvine (56) describió otro organismo anaerobio des-tructor de la celulosa aislado del intestino del hombre: el Bac. cellulosaedissolvens Khouvine. (Clostridium dissolvens (Khouvine) Bergey y cola-boradores), interesante porque, además de otros productos, suministraalcohol etílico en proporción de un 8 por ioo de la celulosa fermen-tada. NTorfológicamente, el Bac. cellulosae dissolvens se parece mucho alBac. fossicularum, del que se diferencia por sus esporas, ovales enlugar de esféricas y de mayor tamaño: 2 µ x 2,5 µ. Fste organismose desarrolla bien hasta en temperaturas de 57^, y a este respecto,repre^enta una fase de transición hacia las bacterias termófilas. Fuécultivado en un medio líquido conteniendo substancias fecales comofuente de nitrógeno: las bacterias se adhieren fuertemente a las fibrascelulósicas del papel, lo que permite separarlas de las contaminacionesque son arrastradas al lavar el papel con la solución de sales esteri-lizada.

En la fermentación de la celulosa, único hidrato de carbono al que

ataca, además de hidrógeno y anhídrido carbónico, se forma ácido

acético y butírico, alcohol etílico y un pigmento pardoamarillento.

Únicamente se recupera, en los productos de la fermentación aislados,

e155^15 Por Zoo del carbono fermentado. Madame Khouvine cree que el

resto se encuentra en el líquido de fermentación en forma de hidratos

d e carbono solubles , que son capaces d e ser absorbidos por elintestino.

Este organismo se ha encontrado también distribuído abundante-mente en toda clase de suelos.

En el conducto intestinal de las larvas de Potosea cuprea Fabr., aislóWerner (io6) un organismo anaerobio, Bac. cellulosam fermentans(Clostridium werneri Bergey y col.), capaz de atacar rápidamente ala celulosa, ayudando asf al insecto en su proceso digestivo. Otrosinvestigadores han señalado también la naturaleza anaerobia de las

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bacterias que desrnmponen la celulosa en el aparato digestivo de loscaballos, ganado, termites y larvas de in.sectos.

b^ BACT^RIAS AEROBIAS DESTRUCTORAS DE CEI,ULOSA. -^1 prl-

mer mícroorganismo de este tipo fué descrito por van Iterson (95) ^bajo el nombre de Bac. ferrugineus (Cellulornonas ferruginea Bergeyy rnl.), como un delgado bacilo, muy movible, no esporógeno, que seencuentra en el suelo de jardín, en el humus, en las hojas secas, etc.

Puede obtenerse colocando en un plato un trozo de papel de filtro,que se espolvorea con fosfato amónico magnésico, se cubre con otrotrozo de papel, se humedece rnn una solución al o,og por ioo de fos-fato bipotásico, se inocula con tiena de la indicada anteriormente yse incuba a 28^.

A los cuatro o cinco días aparecen sobre el papel unas manchaspardoamarillentas; en ellas, el papel va siendo descompuesto en unasubsta.ncia mucilaginosa, en la que, observada al microscopio, seadvierten diversos microorganismos, entre los que predominan dostipos: el ya mencionado Bac. ferrugineus y una forma cocoide grande.Ln una fase m^as avanzada de la descomposicíón, los restos de lasfibras aparecen envueltos en una masa mucilaginosa de micrococos.Van Iterson atribuyó la descomposición de la celulosa al Bac. ferrugi-neus, y consideró la fortna cocoide como un organismo en simbiosiscon aquél, que aun cuando por sí solo es incapaz de atacar a la celu-losa, ayuda al primero a destruirla.

Durante una investigación sobxe la descomposición aerobia de la

celulosa en los suelos de Rothamsted, Hutchinson y Clayton (si), ais-

laron un microorganismo aerobio S^irochaeta cyto^haga Hutchinson

y Clayton, muy semejante al Bac. ferrugineus, utilizando una solu-

ción de sales minerales inoculada con suelo, en la que estaba introdu-cido parcialmente un trozo de papel de filtro. A1 cabo de cuatro o seis

días de incubación a 2s^, aparecían en el papel, en la parte no sumer-

gida, pero pró.zima al líquido, unas manchas pardoamarillentas, en las

que el papel iba perdiendo consistencia, y donde se podía observar,

con ayuda del microscopio, que contenfa bacilos delgados y cocos de

tamaño grande. Tras de muchas tentativas consiguieron un cultivo

liquido en el que sólo se encontraban bacilos; pero los resiembros en

medio nuevo, al cabo de algunos días, presentaron nuevamente laasociación de cocos y bacilos, lo que hizo que Hutchinson y Cla.yton

considerasen a las primeros como una fase del ciclo evalutivo del or-

ganismo.

_gg-

En los cultivos jóvenes de Spirochaeta cyto^haga predomina laforma de bacilos de o,3 a o,4 µ por 3 µ de longitud, afilados en los

extremos y frecuentemente encorvados. Aun cuando no se han podido

observar flagelos, los bacilos presentan un movimiento de rotación

lento, pero marcado. 5on muy fle^cibles, tomando a menudo formas

de S, de O ó de U; a medida que el cultivo envejece va siendo más fre-

cuente la forrna de cocos, o xfase esporoide^. I,os esporoides miden i,5 µ

de diámetro, y se tiñen mucho más intensamente que los bacilos. I,osesporoides no pueden considerarse como esporas, ya que basta para

destruirlos el calentamiento a 60^ durante diez minutos.

Winogradsky (ii3), posteriormente, en un estudio sistemático dealgunas bacterias aerobias del suelo destructoras de celulosa, estable-ció los siguientes géneros:

Género Cytophaga Winogradsky, ig2g.

Bastoncillos largos, fleguosos, con extremos afilados, conteniendogránulos metacromáticos. Incapaz de usar como alimento substan-cias carbonadas, con egcepción de la celulosa que hidroliza. Su des-arrollo sobre los medios de cultivo habituales es lento.

1♦a especie ttpica es Cytophaga hutchinsoni Winogradsky, que fuéel organismo descrito por Hutchinson y Clayton como S^irochaetacito^ihaga.

i. - Cyto^haga hutchinsoni Winogradsky.

Bastoncillos de o,3 a o,4 µ x 3 a 8 µ, aislados o en cadena, que setiñen con dificultad, pero presentan gránulos fuertemente teñidos.Gram, negativa. Reproducción probable por los gránulos temdos(^ artrósporas? ). I,os cultivos viejos presentan formas cocoidesgrandes.

Se desarrolla en gel silíceo y ataca la celulosa en este medio, for-mando grandes colonias mucilaginosas de color naranja.

Aerobia facultativa.Temperatura óptima: 20^.Habitat: Suelo. Desintegra las fibras vegetales.

2. - Cyto^haga aurantiaca Winogradsky.

Bastoncillos largos, de i µ x 6 a 8 µ, puntiagudos, inmóviles. Gramnegativos.

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5obre gel silíceo con celulosa forma colonias de color rosa na-

ranja.

3. - Cytophaga rubra Winogradsky.

Bastoncillos largos, de o,4 µ x 3 µ, ligeramente curvados, con unpequeño gránulo cerca de cada extremo. Movilidad no demostrada.Gram negativo.

Sobre gel silíceo con celulosa forma colonias mucilaginosas rojas.

4. - Cytophaga dutea Winogradsky.

Bastoncillos de o,4 µ por 3 µ. Gram negativos. No se ha aislado eucultivo puro.

Sobre gel sílíceo con celulosa forma colonias mucilaginosas, ama-rillo brillante.

^. - Cytophaga tenuissima Winogradsky.

Más tenue que las otras especies.

1lorma colonias mucilaginosas color verde oliva sobre el gel silíceocon celulosa.

Género Cellvibrio Winogradsky, 1929•

Bastoncillos largos, ligeramente curvos, con extremos redondeados.Muestran gránulos, que se tiñen fuertemente (^artrósporas?), que pa-recen relacionados con la reproducción. Móviles con flagelos polares.Oxida la celulosa formando oxicelulosa. Sobre medios ordinarios decultivo muestra crecimiento débil.

I,a especie tipo es Cellvibrio ochracea Winogradsky.

i. - Cellvibrio ochracea Winogradsky.

Bastoncillos curvados, rollizos, con extremos redondeados, deo,^ µ x 2,5 a 5 µ, raramente en espiral. Móviles. Gram negativos.

5obre gel silíceo con celulosa forma colonias difusas, mucilagino-sas, color ocre claro.

2. - Cellr^ibrio flavescens Winogradsky.

Bastoncillos curvados, rollizos, con extremos redondeados, congránulos metacromáticos. Gram negativos.

Sobre gei silíceo con celulosa forma coloni^s difusas, mucilaginosas,color amarillo claro.

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Género Cellfakicula Winogradsky, 1929•

Bastoncillos cortos, que no egceden de a µ, puntiagudos, con grá-

nulos metacromáticos. I,os cultivos viejos presentan formas cocoideas.

:Vlóviles con un flagelo polar. Osida la celulosa y la transforma en

oYicelulosa.

I,a especie tipo es Cell f akicula viridis Winogradsky.

Z. - Cellfakicula viridis Winogradsky.

Bastoncillos curvos, rollizos, de o,7 µ X 2 µ, con extremos ligera-mente puntiagudos. Móviles. Gram negativos.

Forma colonias difusas, mucilaginosas, de color verde, sobre gelsilíceo con celulosa.

2. - Cell f al.cicula mucosa Winogradsky.

Bastoncillos curvos, rollizos, de o,7 µ X a µ, con extremos ligera-

mente aguzados. Móviles. Gram negativos.

Sobre gel silíceo con celulosa forma colonias difusas, mucilaginosas,color crema.

3. - Cell f alcicula f usca Winogradsky.

Muy parecida a la anterior, presentando autolisis en los cultivosviejos.

1^1 gel silíceo con celulosa empleado por Winogradsky puede pre-

pararse del modo siguiente: Se pone en placas de Petri, en la forma in-

dicada anteriormente, una mezcla de una solución normal de xCl y

su equivalente de una solución de silicato potásico. Después que se

ha formado el gel, se colocan las placas durante veinticuatro horas en

agua corriente, y luego, varias veces, en agua destilada hervida, hasta

que queden libres de cloruros. Cinco gramos de papel de filtro, fina-

mente desmenuzado, se mezclan con ioo c. c. de una solución que

contenga:

t^a)a HPOa . ... . . . ... .. . . . .. ...... .. . . .. . g,oo gramos.

Mg SOa ................................... i,oo ►SG ...................................... i,oo r

FeSOa .................................... 0,02 r

Agua destllada ............................. i.ooo c.c.

De la anterior solución se egtienden porciones de unos 2 c. c. sobreel gel de cada placa, espolvoreando con una pequeña cantidad deCaC08. I,as placas se colocan en una estufa a 60^, hasta que la super-

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ficie del gel quede libre de exceso de líquido. Se colocan entonces pe-

queñas partículas de suelo sobre la placa, que se cubre y se pone a

incubar. A los tres o cuatro días se desarrollan colonias de color anaran-

jado, arnarillo, etc., que se extienden sobre el medio de cultivo. De es-

tas colonias se pueden hacer trasplantes a matraces que conten-

gan un gramo de papel de filtro y 25 c, c. de la solucián anterior. I,os

organismos empiezan a desarrollarse como pequeños lunares colorea-

dos, sobre el papel, que posteriormente forman una masa mucilagi-

nosa e^tendida por todo éste. Mediante repetidos trasplantes puede

llegar a obtenerse la bacteria en cultivo puro.

Además de los organismos mencionados anteriormente, Kellerman,McBeth y otros (54 Y 55)^ así como McBeth y Scales (66), han descritonumerosas bacterias aerobias que consideran como destructoras decelulosa. Para el aislamiento de estos organismos, los autores ameri-canos emplearon la siguiente ^olución:

Fosfato bipotá.rirn (K^HPO^) ........ . .. .... .. t,o gramos.

Sulfato magnésíco (MgSO^ • 7H^0) . . . . . . . . . . . r,o ^

Cloruro sódico (NaCI) ... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . T,o r

Sulfato amónirn (I1H^)^ SQ^ . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2,0 >

Carbonato cálcico (CaCOs) .. ... . . . . . . . . . . . . . . zo,o ^r

Agua cozriente .............................. iooo c. c.

b;l sulfato amónico puede reemplazarse por peptona.

En matraces de ^rlenmeyer de 20o c. c. se colocan papeles defiltro de io cm. de diámetro y se añaden ioo c. c. de solución hastaque quede cubierto el papel.

I,os matraces preparados se esterilizan y se inoculan con una pe-queña cantidad de la substancia a examinar, incubándolos a 30^. 1<osprimeros síntomas de fermentación son un enturbiamiento de la solu-ción seguida por una apariencia corroída del papel, lo que tiene lugarde los cinco a los diez días de incubación. Entonces se toma un trozodel papel atacado y se introduce en un matraz de control que conten-ga un trozo de papel estéril suspendido en la solución de sales. Si, poragitación del frasco, se rompe antes el papel atacado que el de control,ha llegado el momento de la inoculación de otro matraz que contengapapel de filtro y solución, con un trozo de papel atacado. Después detres o cuatro trasplantes en el perfodo más corto posible, el papel ata-cado se coloca en un matraz con agua esterilizada y se agita vigorosa-mente hasta que el papel quede desmenuzado. De esta suspensión sepreparan diluciones en la forma acostumbrada para el aislamiento decultivos puros en uno de los medios que se indican a continuación:

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Agar-celulosa. - A un litro de amoníaco diluído que contenga diezpartes de amoníaco (de o,qoo de p. e.) por tres de agua, se añade unligero exceso de carbonato cúprico. I,a mezcla se agita vigorosamentey se deja reposar hasta el dfa siguiente. I,uego se decanta la soluciónde óxido de cobre amoniacal, y se disuelven en ella z5 gramos de pa-pel de filtro sin lavar. F^sta solución se diluye hasta io litros y se pre-cipita la celulosa, acidificando lentamente con ácido clorhídrico di-lufdo (2o por ioo). El lfquido se diluye nuevamente hasta 20 litros,se deja sedimentar la celulosa y se decanta el líquido. I,a celulosa pre-cipitada se lava varias veces con agua acidulada con clorhídrico hastaque el agua de los lavadas no contenga cobre, y luego, con agua des-tilada hasta arrastrar todo el clorhídrico. La celulosa se deja reposarvarios dias, y finalmente se hace una suspensión a1 z por ioo. A50o c. c. de esta suspensión se agregan io gramos de agar y goo c. c. dela solución de sales antes indicada.

Agar-almidó^t. - Diez gramos de almidón de patata se suspendenen 80o c. c. de agua fría. I,a suspensión se hierve, agitando, hasta quese reduzca su volumen a goo c. c. A esta solución se añaden io gramosde agar y 50o c. c. de solución de sales.

Agar-patata. - A ioo gramos de patatas machacadas se añaden80o c. c. de agua corriente. I,a mezcla se lleva al baño de vapor durantetreinta minutos y se filtra a través de algodón. A 50o c. c. del filtradose agregan io gramos de agar y 50o c. c. de solución de sales.

Agar-dextrosa. - Diez gramos de glucosa y ig gramos de agar sedisuelven en 50o c. c. de agua corriente, y esta solución se mezcla con50o c. c. de solución de sales.

^s caracterfstico de los cultivos de estas bacterias que produzcanunas zonas transparentes alrededor de las colonias, que no son debidasa la neutralización del carbonato cálcico ni a una acción enzimáticade las bacterias, sino a la invasión del medio por un gran número debacterias (98). I,os resiembros de las colonias tienen menos marcado elcerco claro, que desaparece al tercero o cuarto trasplante.

Estas bacterias de Kellerman y sus colaboradores, así como otrasaisladas por Sack (8^), fueron incluídas por Bergey en el género Cellulo-monas, caracterizado por bacterias en forma de pequeños bastoncilloscon extremos redondeados, no esporógenos, móviles o inmóviles, quese encuentran en el suelo y tienen la propiedad de digerir la celulosa.I,a especie tipo e^ Cellulomonas biaxotea (Kellerman) Bergey y col., ci-tando Bergey 33 especies, de las que i8 son móviles con flagelos perí-tricos, ^ móviles con flagelos polares y 8 inmóviles.

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C^ BACTRRIAS TERMÓPII,AS DESTRUCTORAS DE CEI.UI,OSA. - ESte

grupo de bacterias no está bien estudiado. McFayden y Blaxall (67)

fueron los primeros en observar que las bacterias termófilas que ha-

bfan encontrado en el suelo eran capaces de fermentar la celulosa,

necesitando veintiún días para descomponer el papel de filtro, o la

viscosa, a la temperatura de 60^. Como productos de esta descomposi-

ción, se formaban ácidos acético y butfrico, anhidrido carbónico y

metano. Los organismos productoxes de esta fermentación no pudieron

aislarse en cultivo puro.

Posteriormente, Kroulik (57) realizó investigaciones con ciertosorganismos termófilos, y aun cuando no pudo aislarlos en cultivopuro, mediante el estudio microscópico llegó a la conclusión de que ladestrucción de la celulosa era ocasionada por dos formas distintas: elBacillus II, i, y el Bacitlus II, 2, produciéndose en ellas ácidos fórmico,acético y butírico, anh{drido carbónico e hidrógeno, este último encantidades pequeñas. El hidrógeno sulfurado, que se formaba ocasio-nalmente en cantidades apreciables, fué considerado como productode la reacción del hidrógeno formado con los sulfatos del medio. Ladestrucción de celulosa era más intensa cuando actuaba el Baci-llus II, 2, alcanzando al go por ioo, y aun más, de la celulosa empleada.

En ig23, Langwell y Hind (58) dieron noticias de una bacteriatermófila destructora de celulosa que producía ácidos orgánicos volá-tiles: alcohol etílico, metano, hidrógeno y anhídrido carbónico. Auncuando dieron una descripción del organismo y un balance de lasreacciones, las investigaciones posteriores no han confirmado estoshechos ni han permitido aislarla.

Finalmente, Viljcen, Fred y Peterson (97), estudiaron la descom-posición de la celulasa por una bacteria termófila, cuya descripciónmorfológica dieron, y a la que denominaron Clostridium theymocellum,dudándose de que consiguieran aislarla en cultivo puro, tanto por latécnica empleada (go) como por el hecho de que al cultivarla sobreagar perdía la facultad de descomponer la celulosa. Por ello debenacogerse con reserva las propiedades que se le asignaron.

^n su escrito de tg24 afirmaron que cuando se desarrolla entre60^ y 65^, el Cl. thermocellum descompone la celulosa rápidamente,formando un g6,8 por ioo de ácida acético y un io por ioo de alcoholetílico a los once dfas de incubación; en este período desaparece del6o al 8o por ioo de la celulosa, quedando el resto formando un sedi-mento amarillento amorfo. En su publicación de ig26 se hace constarque el rendimiento en alcohol varfa considerablemente.

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[^J BACTERIAS DFSNITRIFICANTES QU$ ATACAN A I.A CEI,UI,OSA. -Algunas bacterias reductoras de nitratos pueden usar la celulosa como

fuente de energía, Un medio que contenga o,25 gramos de KNO,,0,05 gramos de K,HPO, y 2 gramos de celulosa en forma de papel de

filtro, en ioo c. c. de agua corriente, se coloca llenando completamente

un matraz tapado, que se inocula con cieno y se incuba anaerobia-

mente a 3g^. 1~1 ataque de la celulosa empieza en una semana, yviene acompañado de la reducción del nitrato a nitrito, que a su vez

desaparece en quince días. Renovado el medio, el proceso de reducción

de nitratos se acelera considerablemente. La celulosa toma color ana-

ranjado amarillo y consistencia mucilaginosa, descomponiéndose en

fibras, que terminan por desaparecer. I,os gases que se desprenden•

son una mezcla de nitrógeno con anhídrido carbónico.

Groenewege (45) considera que el proceso de descomposición dela celulosa en presencia de nitratos es llevado a cabo por la acciónsimbiótica de dos grupos de organismos: uno descompone la celulosa,mientras que el otro reduce los nitratos usando como fuente de energíalos productos formados en la descomposición de la celulosa. Por laacción simbiótica de los dos organismos desaparece la celulosa másrápidamente que por la acción aislada del organismo espec{fico de Iacelulosa. I,a formación de gas se inicia al segundo día, acompañada dela reducción del nitrato a nitrito y óxido de nitrógeno, con una disolu-ción gradual del papel. El proceso es sumamente activo cuando la solu-ción de cultivo se renueva por decantación.

Groenewege aisló las bacterias que intervienen en eI proceso, en-contrando varias estirpes de una bacteria aerobia, Bacterium cella-resolvens, que actúa sobre la celulosa, y los productos de la descompo-

sición de ésta (ácidos acético, butírico y láctico) sirven de alimento

a los organismos desnitrificantes Bacterium o^ialescens y Bacteriumviscosum.