CAPÍTULO 3. MARCADORES DE DETERMINACIÓN DIRECTA (II) -Extracción y cuantificación de ADN....

CAPÍTULO 3. MARCADORES DE DETERMINACIÓNCAPÍTULO 3. MARCADORES DE DETERMINACIÓNDIRECTA (II)DIRECTA (II)

-Extracción y cuantificación de ADN. -Enzimas de restricción. -PCR. -Secuenciación. -RT-PCR. -Micromatrices. -RFLPs. -VNTRs. -Genes. -Inserciones Alu. -SNPs. -ADN mitocondrial. -VCNs.

RFLPsRFLPs

El tipo más tempranamente estudiado de variante de ADN fue el que puede detectarse cuando una enzima de restricción encuentra una mutación puntual en su secuencia de reconocimiento habitual, por lo que no puede fijarse. En ese caso, alguno de los fragmentos de ADN obtenidos mediante esta enzima serán de una longitud diferente. Por ello se conocen estos polimorfismos como polimorfismos de longitud de los fragmentos de restricción (RFLP en inglés). Puesto que las diferencias entre las variantes del polimorfismo estriban en la longitud de la molécula y por tanto, en su peso molecular, pueden reconocerse mediante electroforesis. Así, las técnicas electroforéticas no sólo son aplicables a las moléculas de proteína sino también a las moléculas de ADN.Figura: Electroforesis de RFLPs

RFLPsRFLPs

Barbujani Barbujani et alet al, 1997, 1997

Mediante enzimas de restricción puede analizarse cualquier región del genoma, codificante o no. Sin embargo, sólo pueden detectarse cambios dentro de unas secuencias determinadas, de modo que no todas las mutaciones existentes serán reveladas mediante esta técnica.Las enzimas de restricción se han utilizado para estudiar numerosas variantes de polimorfismos, desde secuencias de ADN repetitivas hasta ADN mitocondrial o mutaciones puntuales. Sin embargo, los resultados obtenidos a menudo no son comparables a los obtenidos por otros métodos, por lo que pueden considerarse un tipo de polimorfismo diferenciado.La tabla muestra los valores de los diferentes componentes de la varianza molecular obtenidos a partir de STRs y RFLPs, comparados con varios trabajos sobre proteínas.

RFLPsRFLPs

Nei Nei et alet al, 1996, 1996

La figura muestra un dendrograma obtenido a partir de RFLPs.

STRsSTRs

Otro tipo de polimorfismo de ADN consiste en la existencia de diferentes números de repeticiones en tandem de un núcleo de unos pocos pares de bases. Son las repeticiones en tándem de número variable (VNTR en inglés). Cuando la secuencia que se repite consta de 2 a 6 pares de bases, se denominan microsatélites (microsatellites, short tandem repeats o STRs). Si la secuencia es de una longitud mayor (de entre 7 y 100 nucleótidos), reciben el nombre de minisatélites. Es un tipo de polimorfismo muy extendido por el genoma, calculándose que existe al menos un millón de STRs, que suponen el 3% del genoma humano. Una vez que existe una secuencia repetida, la producción de nuevas variantes se ve facilitada por entrecruzamientos desiguales.En general, las secuencias repetidas en tándem se encuentran en regiones no codificantes del ADN. Sin embargo, se han detectado en algunos casos microsatélites que invaden un gen, lo que suele conllevar consecuencias negativas para el individuo portador, como en el caso de la distrofia miotónica.El polimorfismo que determinan los VNTRs se caracteriza por el número de repeticiones, de modo que se considera un número de repeticiones determinado como un alelo y su frecuencia alélica será la frecuencia con la que aparece el mismo número de repeticiones en una población.

STRsSTRs

Los VNTRs pueden analizarse mediante enzimas de restricción. En ese caso, los fragmentos de restricción resultantes variarán en tamaño dependiendo del número de repeticiones y serán reconocibles mediante electroforesis. Pero también pueden analizarse mediante la reacción en cadena de la polimerasa y la consiguiente electroforesis. Una variante de esta última técnica es la que realizan los analizadores de ADN, que son capaces de identificar las diferentes bandas amplificadas y determinar automáticamente su tamaño y por tanto los diferentes alelos.En el electroferograma de la figura se observan los dos alelos (3 y 4) de un heterocigoto para el STR D11S1984. Las bandas rojas corresponden con el ADN control de tamaño conocido.

STRsSTRs

Debido a su elevado grado de polimorfismo, son los marcadores utilizados rutinariamente en Genética Forense. Los 13 STRs que componen el sistema CODIS son el grupo de marcadores más utilizado para la identificación de muestras de ADN en laboratorios forenses de todo el mundo.

RosenbergRosenberg et al et al, 2002, 2002

STRsSTRs

Análisis de Structure para un grupo de STRs en diferentes poblacionesAnálisis de Structure para un grupo de STRs en diferentes poblaciones

A partir de un grupo suficientemente amplio de STRs, puede discriminarse razonablemente bien entre individuos de diferentes grupos poblacionales, como muestra este análisis de Structure sobre poblaciones de varios continentes.

Zhivotovsky Zhivotovsky et alet al 2003 2003

STRsSTRs

Análisis de Coordenadas Principales para un grupo de STRs en diferentes poblacionesAnálisis de Coordenadas Principales para un grupo de STRs en diferentes poblaciones

Pérez-Miranda Pérez-Miranda et alet al 2005 2005

STRsSTRs

MDS para STRs en poblaciones de la cuenca mediterraneaMDS para STRs en poblaciones de la cuenca mediterranea

Distrofia miotónica tipo IDistrofia miotónica tipo I

La distrofia miotónica es una enfermedad genética caracterizada por severas dificultades para relajar los músculos contraídos, pérdida de masa muscular, cataratas, defectos en las gónadas y el corazón y retraso mental. Puede aparecer a diferentes edades, entre la infancia y la vejez. Puesto que es una enfermedad degenerativa, cuanto más temprana sea la edad de comienzo, más grave será su manifestación. Su origen se encuentra en la invasión de un gen estructural (DMPK, myotonic dystrophy protein kinase, 19q13.3) en su región 3' no traducida por un microsatélite con una secuencia repetida CTG, que puede tener entre 5 y 37 repeticiones en individuos normales y hasta varios miles en afectados, con síntomas más severos cuanto mayor es el número de repeticiones. Hasta 80 repeticiones determinan una forma leve, en tanto que a partir de 2.000 copias los síntomas son severos. La tasa de mutación estimada para esta enfermedad es de 9,5 . 10-6. Afecta a 1 de cada 20.000 personas.En Saguenay (Canadá), la prevalencia es de 1/530, con un origen común para todos los afectados, localizado en una pareja de inmigrantes que se instaló en la región en el siglo XVII.

Figura: Paciente de 40 años de edad con distrofia miotónica, cataratas bilaterales y bloqueo cardíaco

La DM1 presenta anticipación, es decir, aparece más temprano en las sucesivas generaciones de una familia, lo que suele ser proporcional al número de repeticiones, como se observa en esta genealogía. Figura: Genealogía de DM1 con anticipación


Hamzi et al, 2010Hamzi et al, 2010


Curiosamente, como se observa en esta genealogía y en la anterior, el mecanismo de anticipación se transmite exclusivamente por línea materna.Figura: Genealogía de DM1 con anticipación

Frecuencias alélicas de genesFrecuencias alélicas de genes

PCR-SSPPCR-SSP

Utilizando las técnicas de análisis del ADN, también es posible detectar polimorfismos en los genes, incluyendo aquellos que eran analizados anteriormente por técnicas inmunológicas. Naturalmente, ahora se obtiene una mayor resolución.Existen varias técnicas mediante las cuales es posible analizar los diferentes genotipos de un gen. Entre ellas se pueden citar la PCR-SSP (Sequence Specific Primer) y la PCR-SSO (Sequence Specific Oligonucleotide). En la actualidad es posible analizar, por ejemplo, grupos sanguíneos como el sistema AB0 o genes HLA mediante esta técnica. Para ello, basta con disponer de sondas específicas de la secuencia codificante de cada alelo.

El control positivo en la PCR-SSP se consigue con otro par de cebadores que permiten amplificar una fracción no polimórfica del genoma, de modo que se amplifica siempre.


Conocida la secuencia de los diferentes alelos de un gen, es posible diseñar cebadores específicos de cada alelo para su amplificación mediante la reacción en cadena de la polimerasa. Cuando sean complementarias la secuencia del cebador y la del ADN de una muestra, se producirá amplificación. Se conocerá, por tanto, el genotipo de un individuo por electroforesis de los productos PCR. Donde haya habido amplificación aparecerá la correspondiente banda en la electroforesis y donde no haya habido amplificación no aparecerá nada.Puesto que un gen a menudo consta de varios exones y puede haber mutaciones en más de uno, será preciso utilizar varios pares de cebadores para identificar las diferencias entre todos los alelos del gen.

En la imagen, cada fila corresponde a un alelo HLA-A, del grupo A2 y cada columna a una mutación con su correspondiente par de cebadores.


Estas técnicas son muy utilizadas en la actualidad para el análisis de los loci HLA.A menudo también pueden identificarse los alelos de un gen mediante enzimas de restricción y desde luego siempre está disponible la secuenciación, aunque no necesariamente es el método más razonable por su coste.

Figura: Gel de agarosa con el resultado de un análisis PCR-SSP para un gen HLA.


Número de alelos, en enero de 2013, de la región HLA en humanos

http://www.ebi.ac.uk/imgt/hla/stats.htmlhttp://www.ebi.ac.uk/imgt/hla/stats.html


Análisis MDS con frecuencias HLA-DPB1Análisis MDS con frecuencias HLA-DPB1Sánchez-Mazas, 2001Sánchez-Mazas, 2001


Algunas clinas de alelos HLA en EuropaAlgunas clinas de alelos HLA en Europa

Pérez-Miranda Pérez-Miranda et alet al 2004 2004

Inserciones AluInserciones Alu

Las inserciones Alu son secuencias de aproximadamente 300 pares de bases originadas a partir del gen 7SL RNA por retrotransposición. La estructura de los elementos Alu es dimérica; es decir, su secuencia está compuesta por dos subunidades similares. Esto se debe a que los elementos Alu modernos surgieron de la fusión cabeza-cola de dos Alu primitivos, que eran monoméricos. El resultado fue una estructura con dos regiones similares, unidas por una región rica en Adenina y con una cola Poli-A. El monómero del extremo 3’ (derecha) contiene un segmento adicional de 31 pb del que carece el monómero del extremo 5’ (izquierda). Sin embargo es en el 5´ donde se controla el proceso de retrotransposición porque es allí donde se encuentra el promotor de la RNA polimerasa III.


Son los más abundantes dentro del grupo de secuencias SINE (short interspersed elements) en el genoma humano, ya que hay más de un millón de copias, lo que supone el 10% del genoma. El origen y la amplificación de los elementos Alu son fenómenos evolutivamente recientes, que coinciden con la radiación de los primates hace 65 millones de años.Existen varias familias de elementos Alu, dentro de las cuales algunas son exclusivas de los seres humanos. No todos los elementos Alu son polimórficos puesto que algunos con el paso del tiempo se han fijado o perdido. Sin embargo, aquellos Alu que se han insertado recientemente son polimórficos con respecto a su presencia o ausencia en el genoma humano.

En la figura se esquematiza el proceso de inserción: En primer lugar, el elemento Alu se transcribe a ARN mensajero. Después, eventualmente, puede unirse en otro lugar del genoma y mediante una transcripción inversa quedar insertado.


Su análisis es relativamente sencillo. Dado que se trata de una secuencia de gran tamaño, puede identificarse su ausencia o presencia mediante una PCR y una electroforesis en gel de agarosa. La diferencia entre las bandas resultantes, generalmente de unos 300 pares de bases, puede apreciarse a simple vista.

En la figura, una electroforesis de agarosa de varias muestras analizadas para una inserción Alu.


Watkins et al 2003Watkins et al 2003

A pesar de ser marcadores bialélicos y por tanto con un escaso grado de polimorfismo, son interesantes en Antropología, ya que puede conocerse el genotipo ancestral (no inserción). Además, se supone que cada inserción es un evento evolutivo único (o casi), por lo que todos los portadores de una secuencia derivarían de un antepasado común.

En la figura se observa un dendrograma obtenido a partir de frecuencias de 100 inserciones Alu. La población ancestral se ha definido como una población hipotética con frecuencia de inserción 0 para las 100 inserciones.


García-Obregón et al 2006García-Obregón et al 2006

Se ha especulado sobre su importancia evolutiva, incluso sobre su implicación en el proceso de especiación, pero todavía no existen datos consistentes. En todo caso, entre otros hallazgos recientes, se ha observado que existen genes que derivan de elementos genéticos móviles, como Rag1, una transposasa implicada en los reordenamientos del ADN para la codificación de la región hipervariable de las moléculas de anticuerpos.En la figura, un mapa topogenético de una serie de poblaciones de la cuenca mediterránea


Gómez-Pérez et al 2007Gómez-Pérez et al 2007

En la figura se observa la capacidad de discriminación de tan sólo 8 inserciones Alu, de modo que cada región aparece claramente diferenciada.La población ancestral se ha definido como en el caso anterior, como una población hipotética con frecuencia de inserción 0 para las 8 inserciones.

SNPsSNPs

Polimorfismos de un solo nucleótido (SNPs)Sus abreviaturas derivan del nombre en inglés (Single Nucleotide Polymorphisms). Son variaciones de una sola base. La mayor parte de la variabilidad del genoma es de este tipo, estimándose que suponen el 80% de los polimorfismos. Se ha calculado su densidad en aproximadamente 1 por cada mil pares de bases. A pesar de que son generalmente bialélicos, son más frecuentes y estables que los microsatélites, lo que les hace interesantes sobre todo para estudios de desequilibrio de ligamiento. En la figura, la mutación responsable de la anemia falciforme, que es un SNP, detectada mediante enzimas de restricción.

SNPsSNPs

Análisis de ligamiento de una pequeña región (arriba) y de una región más grande (abajo) del cromosoma 5, mediante SNPs.Se muestra un punto naranja cuando existe correlación entre 2 SNPs, es decir, cuando se ha observado desequilibrio de ligamiento entre ellos. Se detectan varias zonas con desequilibrio de ligamiento.

Altshuler et al., (2008)

SNPsSNPs

Para su identificación pueden utilizarse distintas técnicas, como las enzimas de restricción, la secuenciación, las micromatrices o la PCR cuantitativa.

En la figura, 2 SNPs identificados mediante secuenciación (Técnica SNaPshot).

Reneland Reneland et alet al 2005 2005

SNPsSNPs

Actualmente, estos polimorfismos son muy utilizados para la localización de genes causantes de enfermedades, en Genética Humana.

En la figura, asociación entre la variación en el gen fosfodiesterasa 4D y la densidad mineral del hueso de un grupo de individuos. Se ha realizado una cartografía fina mediante 80 SNPs en un pequeño fragmento del cromosoma 5. Los puntos indican la significación para cada SNP y las líneas azul y gris son regresiones, directa y suavizada a partir de estos puntos.

SNPsSNPs

Estudio de cartografía de riesgo relativo de asma en 994 niños asmáticos y 1.243 no asmáticos mediante el análisis de 317.447 SNPs. Se muestran los valores de significación al 1% y 5%.Se ha observado una asociación con el gen ORMDL3, situado en 17q21

Moffat Moffat et alet al 2005 2005

SNPsSNPs

Rodríguez-Ezpeleta et al 2010Rodríguez-Ezpeleta et al 2010

MDS y análisis Structure realizados a partir de SNPs en una serie de muestras europeas

ADN mitocondrialADN mitocondrial

Las mitocondrias se transmiten únicamente de la madre a sus hijos. Dado que las mitocondrias que porta el espermatozoide no penetran en el óvulo en el momento de la fertilización (sólo penetra el núcleo), todas las mitocondrias que posee una persona en sus células provienen de su madre. Por tanto, no hay diploidía, meiosis, ni existe la recombinación en el ADN de las mitocondrias. El ADN mitocondrial es circular, con dos cadenas complementarias de 16.569 nucleótidos y tiene 37 genes, de los que 13 codifican para ARN mensajeros y por lo tanto para proteínas, 22 para RNA de transferencia y 2 para RNA ribosómico.

El ADN mitocondrial se analiza habitualmente mediante secuenciación o enzimas de restricción, aunque lógicamente en este caso el resultado es menos informativo. Habitualmente se estudian dos regiones hipervariables, HVR-I y HVR-II, dos zonas supuestamente neutrales y con una gran variabilidad, lo que permite una resolución prácticamente a escala familiar.

Figura: Esquema del ADN mitocondrial humano


Dispersión de los principales haplogrupos de ADN mt con la colonización por el hombre moderno de los diferentes continentesDispersión de los principales haplogrupos de ADN mt con la colonización por el hombre moderno de los diferentes continentes


Dendrograma de un grupo de primates a partir de ADN mt. Se incluye la secuencia de especimen de neandertal encontrado en Dendrograma de un grupo de primates a partir de ADN mt. Se incluye la secuencia de especimen de neandertal encontrado en Alemania en 1856 y la secuencia de numt, un fragmento de ADN nuclear del cromosoma 11, cuyo origen parece ser Alemania en 1856 y la secuencia de numt, un fragmento de ADN nuclear del cromosoma 11, cuyo origen parece ser

mitocondrial.mitocondrial.

Gagneux et al 1999Gagneux et al 1999


MDS para un grupo de poblaciones a partir de ADN mtMDS para un grupo de poblaciones a partir de ADN mtAlfonso-Sánchez et al 2006Alfonso-Sánchez et al 2006

Número de copias variable (CNVs)Número de copias variable (CNVs)

Redon et al, 2006Redon et al, 2006

Los polimorfismos de variación en el número de copias se refieren a las Los polimorfismos de variación en el número de copias se refieren a las alteraciones en el número de copias de un fragmento determinado de ADN, que alteraciones en el número de copias de un fragmento determinado de ADN, que puede implicar deleciones (menor número de copias de lo normal), puede implicar deleciones (menor número de copias de lo normal), duplicaciones (mayor de lo normal) deleciones y duplicaciones combinadas o duplicaciones (mayor de lo normal) deleciones y duplicaciones combinadas o patrones más complejos, como puede observarse en la figura.patrones más complejos, como puede observarse en la figura.Afectan al más del 10% del genoma y pueden implicar desde 1.000 nucleótidos Afectan al más del 10% del genoma y pueden implicar desde 1.000 nucleótidos a varios millones.a varios millones.

Número de copias variable (CNVs)Número de copias variable (CNVs)


Caucasoides

Chinos

Japoneses

Yorubas

Pueden analizarse mediante diferentes técnicas, pero principalmente mediante micromatrices, con sondas que identifican zonas Pueden analizarse mediante diferentes técnicas, pero principalmente mediante micromatrices, con sondas que identifican zonas representativas de las regiones duplicadas o perdidas.representativas de las regiones duplicadas o perdidas.En general son bastante útiles para discriminar entre poblaciones de diferentes orígenes, como se observa en la figura. En general son bastante útiles para discriminar entre poblaciones de diferentes orígenes, como se observa en la figura.


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