1

Caracterización de los productos y estabilidad.

Actividad de aguaActividad de agua

La presencia de agua y sus interacciones con La presencia de agua y sus interacciones con otros componentes son factores importantes a otros componentes son factores importantes a tener en cuenta en la estabilidad de diferentes tener en cuenta en la estabilidad de diferentes formulaciones.formulaciones.

El El conceptoconcepto dede actividad de aguaactividad de agua permite permite caracterizar la intensidad con la cual el agua se caracterizar la intensidad con la cual el agua se asocia a los constituyentes no acuosos. asocia a los constituyentes no acuosos.

DefiniciDefinicióón de actividad de aguan de actividad de agua

La La actividad de aguaactividad de agua considera las interacciones considera las interacciones moleculares que se establecen entre el agua y el soluto, y se moleculares que se establecen entre el agua y el soluto, y se define en base al potencial qudefine en base al potencial quíímico, como:mico, como:

aaww= actividad de agua= actividad de aguapp= presi= presióón de vapor de agua en el n de vapor de agua en el producto a la temperatura Tproducto a la temperatura Tppoo= presi= presióón de vapor del agua pura a la n de vapor del agua pura a la temperatura T temperatura T

owpwp

wa =

Isoterma de sorción de agua• En el equilibrio, a cada HR (T= cte) le corresponde una humedad única del material (g H2O / g sólido seco).

0.00 0.50 1.00

HR /100 = awH

2O (%

)

3

6

9 La relación de equilibrio a T= cte entre la HR del ambiente y la humedad del producto se denomina: isoterma de sorción de agua.

2

Isotermas de adsorciIsotermas de adsorcióón n de agua tde agua tíípicaspicas

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0

0.25

0.20

0.15

0.1

0.5

0

aw

Con

teni

do d

e ag

ua

(% b

.s.)

Sacarosa, manitol

almidalmidóón, n, dextranosdextranos

comienza a disolverse

Tipo I

Tipo II

Tipo III

Ca(SiOCa(SiO33))

DeterminaciDeterminacióón de isotermas n de isotermas de sorcide sorcióón de aguan de agua

Existen diversas formas, uno de los mExisten diversas formas, uno de los méétodos mtodos máás simples s simples es el del es el del Equilibrio Equilibrio isopiisopiéésticostico: :

1. Se coloca el material en una c1. Se coloca el material en una cáámara cerrada mara cerrada conteniendo una soluciconteniendo una solucióón saturada de una sal n saturada de una sal cuya PVR o cuya PVR o aaww se conoce a la temperatura de se conoce a la temperatura de la experiencia.la experiencia. T = cte

HR = cte

Sal Humedad Relativa (%)

15 ºC 20 ºC 25 ºC

Bromuro de litio 6.9 6.6 6.4

Hidróxido de sodio 9.6 8.9 8.2

Cloruro de litio 11.3 11.3 11.3

Bromuro de sodio 59.0 58.0 57.5

Sulfato de amonio 80.5 80.5 80.0

Benzoato de sodio 88.0 88.0 88.0

Humedades relativas de equilibriode soluciones saturadas de sales seleccionadas de 15 hasta 25 ºC

2. La cantidad de agua sorbida se 2. La cantidad de agua sorbida se determina pesando en el tiempo determina pesando en el tiempo hasta alcanzar un valor hasta alcanzar un valor ctecte. El . El producto absorberproducto absorberáá óó ““desorberdesorberá”á”agua (vapor) hasta equilibrarse. En el agua (vapor) hasta equilibrarse. En el ““equilibrioequilibrio””: a: aw(producto)w(producto) = a= aw(sn. saturada)w(sn. saturada). .

Tiempo (días)

equilibrio

no equilibrio10

20

30

Hum

edad

(%)

W0

Wf

3

3. El procedimiento se repite para varios 3. El procedimiento se repite para varios valores de valores de aaww o PVR que se logran con o PVR que se logran con soluciones saturadas de diversas sales. soluciones saturadas de diversas sales. En el En el ““equilibrioequilibrio””, a cada HR (T= cte) le , a cada HR (T= cte) le corresponde un contenido de agua corresponde un contenido de agua úúnico nico del producto (g Hdel producto (g H22O / g sO / g sóólido seco). lido seco).

Zonas en la isoterma de sorción de agua

HR /100 = aw

Hum

edad

(%)

I II III

0.2 0.8

0.1

0.4

Zona 1Zona 1:

el agua está firmemente retenida (agua-ión, dipolo-dipolo) y poco móvil (agua ligada). Termina cuando se forma una “monocapa”sobre los compuestos polares, i.e. cuando están recubiertos por una capa de una molécula de grosor.

Zona 2:Zona 2:

se forman capas sobre la monocapa y se comienza asociación con solutos por puentes de H. El agua se hace más móvil. Y de a poco se llenan micro y macro poros. Los solutos comienzan a movilizarse. Las reacciones químicas y bioquímicas comienzan a ocurrir (enzimáticas).

4

Zona 3:Zona 3:

el agua llena capilares de mayor tamaño, se comporta como “agua libre” y actúa como solvente. DVS

Todo el Todo el procedimiento se procedimiento se realiza realiza automautomááticamente ticamente a trava travéés de s de equipos para equipos para sorcisorcióón de vapor n de vapor dindináámica.mica.

EcuaciEcuacióón de n de LangmuirLangmuir

qq: moles de agua sorbida/unidad de masa de sustrato : moles de agua sorbida/unidad de masa de sustrato qqmm: moles de agua en la monocapa : moles de agua en la monocapa KK: constante que depende del adsorbente: constante que depende del adsorbenteCuanto mCuanto máás grande es K la saturacis grande es K la saturacióón se alcanza a menor n se alcanza a menor aaww..

Permite describir Permite describir isotermas tipo Iisotermas tipo I, t, tíípicas de aquellos picas de aquellos sistemas que solo pueden adsorber una molsistemas que solo pueden adsorber una moléécula de agua en cula de agua en cada sitio de sorcicada sitio de sorcióón de superficie (sorcin de superficie (sorcióón monocapa). n monocapa).

wK.a1wKa

mqq

+=

ExpresiExpresióón matemn matemáática de las tica de las isotermas de sorciisotermas de sorcióón.n.

EcuaciEcuacióón BETn BET((BrunauerBrunauer, , EmmettEmmett y y TellerTeller) )

Rango de validezRango de validez((aaww= 0= 0--0.5)0.5)

qqmm= = contenidocontenido de de aguaagua de la monocapa BET de la monocapa BET q= q= contenidocontenido de de aguaagua del del sistemasistemac = c = constanteconstante relacionada con la energrelacionada con la energíía de la a de la interacciinteraccióón entre moln entre molééculas de Hculas de H22O y el O y el adsorbatoadsorbato(calor de sorci(calor de sorcióón)n)

( ) wmmw

w acq

ccqaq

a⋅

⋅−

+⋅

=−

111

ExpresiExpresióón matemn matemáática de las tica de las isotermas de sorciisotermas de sorcióón.n.

5

EcuaciEcuacióón GABn GAB((GuggenheimGuggenheim--AndersonAnderson--de de

BoerBoer) )

CC11, k, k y y qqmm son son constantesconstantes

Es actualmente el modelo de ajuste mEs actualmente el modelo de ajuste máás utilizado s utilizado

Toma en consideraciToma en consideracióón las n las multicapasmulticapas

Tiene 3 parTiene 3 paráámetros (2 de ellos son f(T)) y permite metros (2 de ellos son f(T)) y permite ajustar los datos de sorciajustar los datos de sorcióón de agua en un rango de n de agua en un rango de aawwhasta hasta aaww= 0.9= 0.9

)wka1Cwka)(1wka(1wka1C

mqq

+−−=

Constantes de la ecuación GAB

⎟⎠

⎞⎜⎝

⎛ −=

⎟⎠⎞

⎜⎝⎛ −

=

RTHH

expkK

RTHHexpcC

np

nm

Las ecuaciones BET y GAB permiten ademLas ecuaciones BET y GAB permiten ademáás s predecir el predecir el áárea de adsorcirea de adsorcióón, teniendo como n, teniendo como dato el volumen de una moldato el volumen de una moléécula de agua, y cula de agua, y calculando la masa de agua de la monocapa del calculando la masa de agua de la monocapa del sistema en cuestisistema en cuestióón.n.

MNamS o

GABW =

Área superficial para la adsorción de agua

SWGAB es la superficie para adsorción de agua (m2/g),

m0 es el contenido de agua de monocapa por GAB (gH2O/g) N es el número de Avogadro (6,02×1023 moléculas/mol); M es la masa molar de agua (18 g/mol) a es el área de una molécula de agua (10,6×10−20 m2/molécula)

6

En general las isotermas de adsorciEn general las isotermas de adsorcióón no se superponen a n no se superponen a las de las de desorcidesorcióónn::

aw

adsorción

desorción

Con

teni

dode

agu

a(%

b.

s.)

HistHistééresis de las isotermas de resis de las isotermas de sorcisorcióón de aguan de agua

El fenEl fenóómeno de histmeno de histééresis es especialmente resis es especialmente importante al considerar la etapa de importante al considerar la etapa de desorcidesorcióónn en en la liofilizacila liofilizacióón, ya que la n, ya que la aaww serseráá ligeramente ligeramente superior a la esperada de acuerdo con la isoterma superior a la esperada de acuerdo con la isoterma de adsorcide adsorcióón. n.

Efecto de la temperatura sobre Efecto de la temperatura sobre la la sorcisorcióónn de agua.de agua.

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.00.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

aw

Con

teni

do d

e ag

ua, (

g/g

m.s

.)

40°C20°C

10°C

60°C40°C

20°C10°C

Predecir la estabilidad fPredecir la estabilidad fíísica y qusica y quíímica.mica.

Optimizar la deshidrataciOptimizar la deshidratacióón, pues la facilidad on, pues la facilidad odificultad para remover el agua depende de dificultad para remover el agua depende de aaWW..

Evitar la transferencia de agua entre los Evitar la transferencia de agua entre los ingredientes al formular una mezcla.ingredientes al formular una mezcla.

Determinar las caracterDeterminar las caracteríísticas del material de sticas del material de empaque.empaque.

¿Para qué sirve la isoterma de sorción?

7

Mapa de estabilidad y aW

La estabilidad de biomoléculas depende de:

Transiciones a nivel supramolecular(movimientos cooperativos)

Movilidad molecular del agua y los solutos

Cambios inducidos en las biomoléculasdurante el almacenamiento prolongado

Matriz amorfa Matriz cristalinaReactivos

Azúcar amorfo

Medio cristalinoLa cristalización de componentes de la matrizacelera daños en sistemas deshidratados

amorphousmatrix

crystallinematrix.

amorphoussugar matrix.

crystallinematrix.

8

Posibles estrategias para evitar Posibles estrategias para evitar cristalizacicristalizacióón de solutos. n de solutos.

11. Vitrificación

2. Retraso de la cristalización en medios sobreenfriados.

Combinación conbiopolímeros.

otros azúcares.Combinación con

salesCombinación con

Reacciones que son susceptibles de ocurrir Reacciones que son susceptibles de ocurrir en el almacenamiento a largo plazoen el almacenamiento a largo plazo

InactivaciInactivacióónn enzimenzimááticatica

Reacciones de los carbonilosReacciones de los carbonilos

OxidacionesOxidaciones

Causas de deterioro de proteínas.

•Desdoblamiento

•Agregación

•Oxidación

•Deamidación

deshidratación

congelación

almacenaje

Causas de deterioro de membranas.

•Fusión de las cabezasde fosfolípidos.

•Desnaturalizaciónde proteínas de membrana.

•Oxidación lipídica.

deshidratación

congelación

almacenaje

9

ReacciReaccióón de Maillardn de MaillardReacciReaccióón carbonilon carbonilo--aminaamina

Reactivos principalesReactivos principales

R CH C

O

R2

Reactivos / Catalizadores Reactivos / Catalizadores

R NH2

Semillas de quinoa pardeadas en el almacenamiento Movilidad de protones: RMNMovilidad de protones: RMN--HH11

La espectroscopía de resonancia magnética nuclear se basa en la medida de la absorción de la radiación electromagnética en la región de las radiofrecuencias, aproximadamente de

4 a 900 MHz.

10

En el proceso de absorción están implicados núcleos de átomos que tienen propiedades de espín y momento magnético tales que al ser expuestos a un campo magnético intenso absorben radiación electromagnética como consecuencia del desdoblamiento de sus niveles de energía inducido por el campo magnético.

EfectoEfecto del campo del campo magnmagnééticotico

• En el nivel fundamental todos los núcleos están desordenados, no hay diferencia de energía entre ellos.

• Si aplicamos un campo magnético externo (Bo), se orientan

• Hay un pequeño exceso poblacional alineado

Bo

EnergEnergííaa y y poblacionespoblaciones

• Al aplicar un campo magnético externo creamos una diferencia de E entre los dos estados Bo:

•

Bo = 0

Bo > 0 ΔE = h να

β

MagnetizaciMagnetizacióónn macroscmacroscóópicapica

Mo promedia las contribuciones de todos los ms :es directamente proporcional a la diferencia de población (Na - Nb),

Mo

y

x

z

x

y

z

Bo Bo

11

ExcitaciExcitacióónn en RMNen RMN

• El sistema absorbe radiación electromagnética oscilantegenerada por un campo B1 perpendicular a Bo

Mo

z

x

i

B1

Espira transmisora

yBo

El campo neto que experimentará la muestra es B1perpendicular al eje z, y por lo tanto M cambiará de posición

AlgunosAlgunos pulsospulsos úútilestiles

• El más común es el π / 2, porque pone el máximo de magnetización•Sobre el plano <xy> (se detecta más señal):

• También es importante el pulso π, el cual invierte las poblaciones del •Sistema de espín...

z

x

Mxyy

z

x

y

Moπ / 2

z

x

-Moy

z

x

y

Mo π

RELAJACIÓN

Comprende los procesos por los cuales el sistema vuelve al estado de equilibrio luego de haber sido excitado por el pulso de Rf

Los procesos de relajación se pueden separar en

relajación longitudinal (espín-red) y relajación transversal (espín-espín)

Free Induction Decay (FID) (decaimiento libre de la inducción)

Después de poner la magnetización en el plano <xy> (π / 2) al dejar de aplicar B1 la muestra retornará al equilibrio en el eje z.

Mxy

time

12

Mzz

x

y

Mxy

z

x

y

T1

y

x

z T2

relajación longitudinal (espín-red)

relajación transversal (espín-espín) tiempoμs ms

Componente de rápida caída

(señal del sólido)Componente de caída lenta

(señal del agua)

Intensidad de la señal

Ecos de espín

Se aplican distintas secuencias de pulsos para evitar el efecto de la inhomogeneidad del campo y re-enfocar la señal.

Ejemplos:

90º τ 180º

Secuencia de ecos de espín de Hahn (1950)

90º τ 180º τ 180º τ 180º τ 180º …

Secuencia de ecos de espín de Carr PurcellMeilboom Gill CPMG (1959)

EcosEcos de de espespíínn

Analizamos luego del pulso 90y:

180y (o x)90y

tD tD

z

x

yx

y

≡ x

y

x

y

x

y

tD

180y (o x)

tD

desfasado

reenfocado

13

Congelación de tejidos de pescado. Distribución de tiempos de relajación T2 e intensidad de la señal en función de la temperatura.

Ejemplo de determinación de Tg mediante los tiempos de relajación de 1H-RMN

Datos de Farroni y col., 2008

14

-Tg vs. contenido de agua ó de aw

-Descenso crioscópico

-Curva de solubilidad de los sólidos solubles.

Resumen.

Curvas necesarias para obtener los diagramas de estado suplementados.

BET

GAB

- Descripción matemática de las isotermas de sorción

Gordon y Taylor y sus modificaciones

- Descripción de la dependencia de Tg con el contenido de agua

Herramientas matemáticas para el estudio de las consecuencias de las transiciones de fase

Condiciones para la formulación de medios

Interacciones MolecularesAzúcares o pilisac - proteina

Interacciones MolecularesInteracciones MolecularesAzAzúúcares o cares o pilisacpilisac -- proteinaproteina

Reactividad QuímicaReactividad QuReactividad Quíímicamica

Cristalización CristalizaciCristalizacióón n

TemperaturaTemperaturaTemperatura

ESTABILIDAD DE BIOMOLECULAS ESTABILIDAD DE BIOMOLECULAS EN SISTEMAS DESHIDRATADOSEN SISTEMAS DESHIDRATADOS

Tg TTg g

Hidratación del CristalHidrataciHidratacióón del Cristaln del Cristal

w A partir de los conceptos abordados,

se pueden obtener datos para determinar:

Estabilidad estructural.

Formación de eutéctico o vidrio?

Definición de las temperaturas máximas del proceso y del almacenamiento.

Estabilidad química.

15

Datos para las predicciones de Datos para las predicciones de estabilidadestabilidad

•• Variables tradicionales : Temperatura, Variables tradicionales : Temperatura, contenido de agua y composicicontenido de agua y composicióón n

(Generaci(Generacióón de los diagramas n de los diagramas suplementados)suplementados)

InformaciInformacióón complementaria:n complementaria:

•• Humedad de monocapa (Humedad de monocapa (mmoo))

•• H.RH.R. donde el agua comienza a tener . donde el agua comienza a tener caractercaracteríísticas de solvente: agua congelable, sticas de solvente: agua congelable, movilidad del agua movilidad del agua •• Inhomogeneidades en la distribuciInhomogeneidades en la distribucióón de agua n de agua (aspectos microsc(aspectos microscóópicos).picos).•• Movilidad molecular (RMN, IR)Movilidad molecular (RMN, IR)•• Interacciones intermoleculares (IR)Interacciones intermoleculares (IR)

-DSC

-RMN

-Microscopías

-RX

-IR y otros

Métodos de análisis.