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SOSGRADOEN CIENCIAS ( BIOLÓGICAS Centro de Investigación Científica de Yucatán, A.C.

Posgrado en Ciencias Biológicas

CARACTERIZACIÓN DE PROTEÍNAS TIPO NLP A

PARTIR DEL CULTIVO in vitro DE Phytophthora

capsici

Tesis que presenta

MAYRA ALEJANDRA DÍAZ BRITO

En opción al título de

MAESTRO EN CIENCIAS

(Ciencias Biológicas: Opción Bioquímica y Biología Molecular)

Mérida, Yucatán, México

2012

CENTRO DE INVESTIGACIÓN CIENTÍFICA DE YUCA TÁN, A. C.

POSGRADO EN CIENCIAS BIOLÓGICAS

CICY

RECONOCIMIENTO

( POSGRADO EN

) CIENCIAS . ( BIOLÓGICAS

/

Por medio de la presente, hago constar que el trabajo de tesis titulado

"CARACTERIZACIÓN DE PROTEÍNAS TIPO NLP A PARTIR DEL CULTIVO in vitro DE

Phytophthora capsict fue realizado en los laboratorios de la Unidad de Bioquímica y

Biología Molecular de Plantas del Centro de Investigación Científica de Yucatán , A.C. bajo

la dirección del Dr. Ignacio Islas Flores y el Dr. Luis Manuel Peña Rodríguez, dentro de la

opción de Bioquímica y Biología Molecular, perteneciente al Programa de Posgrado en

Ciencias Biológicas de este Centro.

Atentamente,

Director Académico

Mérida, Yucatán, México, Agosto, 2012.

•

DECLARACIÓN DE PROPIEDAD

Declaro que la información contenida en la sección de Materiales y Métodos

Experimentales, los Resultados y Discusión de este documento proviene de las

actividades de experimentación realizadas durante el período que se me. asignó para

desarrollar mi trabajo de tesis, en las Unidades y Laboratorios del Centro de Investigación

Científica de Yucatán, A.C., y que a razón de lo anterior y en contraprestación de los

servicios educativos o de apoyo que me fueron brindados, dicha información, en términos

de la Ley Federal del Derecho de Autor y la Ley de la Propiedad Industrial , le pertenece

patrimonialmente a dicho Centro de Investigación. Por otra parte, en virtud de lo ya

manifestado, reconozco que de igual manera los productos intelectuales o desarrollos

tecnológicos que deriven o pudieran derivar de lo correspondiente a dicha información, le

pertenecen patrimonialmente al Centro de Investigación Científica, A.C., y en el mismo

tenor, reconozco que si derivaren de este trabajo productos intelectuales o desarrollos

tecnológicos, en lo especial, estos se regirán en todo caso por lo dispuesto por la Ley

Federal del Derecho de Autor y la Ley de la Propiedad Industrial, en el tenor de lo

expuesto en la presente Declaración.

Q.F.B. Mayra Alejandra Díaz Brito

•

Este trabajo se llevó a cabo en la Unidad de Bioquímica y Biología Molecular de Plantas

del Centro de Investigación Científica de Yucatán, y forma parte del proyecto titulado

"Purificación e identificación de metabolitos fitotóxicos, proteínas tipo NLPs y fitotoxinas

lipofílicas, producidas por Phytophthora capsici y evaluación de su papel en el proceso

infeccioso", bajo la dirección del Dr. Ignacio Islas Flores y el Dr. Luis Manuel Peña

Rodríguez.

AGRADECIMIENTOS

A CICY y la UBBMP, por permitirme el uso de sus instalaciones para el desarrollo de este trabajo y a CONACyT por la beca No.240167 otorgada para mis estudios de Maestría.

A la Dirección del CICY, encabezada por el Dr. Inocencia Higuera, por el apoyo y soporte económico para la realización de la estancia en ''The James Hutton lnstitute" de la Universidad de Dundee en Escocia.

A la Subdirección de Posgrado, por el apoyo a través del programa de Becas de Movilidad para la asistencia a congresos y estancias de investigación.

A mi asesor de tesis Dr. Ignacio Rodrigo Islas Flores, por darme la oportunidad de ser parte de su grupo de trabajo, por la orientación y por todo lo aprendido a lo largo de los últimos 5 años en su laboratorio.

A mi asesor de tesis Dr. Luis Manuel Peña Rodríguez, por el apoyo brindado incondicionalmente durante mi paso por la Maestría, por permitirme ser parte de su grupo de trabajo y darme la oportunidad de ser parte del proyecto SEP-CONACyT No. 84827, del cual él es responsable.

A mi comité tutorial: Dr. Gregario Godoy Hernández, Dr. Jairo Cristóbal Alejo, Dr. Ignacio Islas Flores y el Dr. Luis Manuel Peña Rodríguez por las recomendaciones y ayuda brindada para el enriquecimiento del trabajo de tesis.

A mis revisores de tesis: Dr. José Juan Zúñiga Aguilar, Dr. Gregario Godoy Hernández, Dr. Jairo Cristóbal Alejo, Dr. Ignacio Islas Flores y el Dr. Luis Manuel Peña Rodríguez por sus comentarios, consejos y por dedicar su tiempo a la revisión de este trabajo.

A la QBB. Karlina García Sosa, por el apoyo técnico, facilitación de materiales y reactivos, así como el apoyo incondicional que siempre me brindó.

A la M.C. Ligia Brito Argáez, por su apoyo técnico en la realización de los experimentos, por sus consejos, pero sobre todo por darme siempre ese empujoncito de más para convencerme de que puedo lograr lo que me proponga, Gracias Tía!.

Allng . Fernando Contreras, por el apoyo técnico y su valiosa ayuda en el establecimiento y mantenimiento del material vegetal en el invernadero.

A los coordinadores de la Opción Bioquímica y Biología Molecular del Posgrado en Ciencias Biológicas: Dr. Manuel Martínez Estévez y Dra. Ma. de Lourdes Miranda Ham, por el apoyo brindado de manera incondicional en el desarrollo de las actividades académicas durante mi formación como Maestra en Ciencias.

A todos los Profesores de la UBBMP, por todos los conocimientos compartidos durante las horas de clases que contribuyen en mi formación como Maestra en Ciencias, pero también por la disponibilidad para brindarnos ayuda en todo momento.

Al Ores. Edgar Huitema y Andrew Howden, por las enseñanzas durante mi estancia en el JHI, así como a mis amigos Nik, Tieme, Julietta, Remco, Tim, Tam, Annika, Cris, Rapha, Pauline, Martin, Patricia, Stephen, Dorine, Sonia y la pequeña lsabella por su valiosa amistad y apoyo en mi estancia en Escocia.

A mi amiga M.C. Yasmín Sánchez Rodríguez, por su apoyo incondicional, por

•

acompañarme en esta aventura y nunca dejarme rendir ante las adversidades que siempre se presentan, por concluir juntas este camino que iniciamos hace ya 9 años, y por hacerme sentir parte de su familia, te quiero flaca!.

A mis hermanos del laboratorio 06 de la UBBMP, Carmelita, Deysi, Yeny, Geovani, Manuel, Alex, por todo su apoyo, sus ánimos y por hacerme disfrutar de todos los momentos durante mi paso por el laboratorio, ¿Quién puede olvidarse del "muro de la filosofía"?, somos únicos muchachos, el grupo no sería el mismo sin ustedes, los quiero hermanitos!.

A mis amigos de la maestría Ricardo Cuxim, Felipe Alpuín, Miguel Marfil, mis comadres Abril Canché, Beatriz Rodas, Katiana Trejo y Yasmín Sánchez, por emprender juntos esta aventura y por los buenos momentos compartidos en los últimos 2 años, les deseo éxito en todas las metas que se propongan, ¡les extrañaré mucho amiguitos!.

A mis amigos Nayvi Gamboa, Emanuel Bojórquez, Fray Baas, Fernando García y Carlos Cruz, por su amistad, compañerismo y valioso apoyo en todo momento, por todas esas bromas, risas y momentos divertidos.

A mis hermanos del alma Román, Ricardo, Damian, Abdiel, Emanuel, Elman, Fer, Paty, Mary, Lolbe y Yas, por todos los años de amistad y estar en todo momento a mi lado, los quiero gordos.

A los chavitos adorados del laboratorio de plátano de la UBT: Abriluchis, Migue, Muhi, Frank, Pepe, Lalo, Nestor y Kika, gracias por todos los momentos vividos, por todos los litros de nestea, platones de cherry's special, comidas, consejos y palabras de aliento compartidos.

A mis hermanitos de Laboratorio 02 de Química Orgánica: lvan, Abbi, Chucho, Hiatzy y Glendy y la QBB. Fabiola Escalante por su apoyo, consejos y sobre todo por su valiosa amistad.

A mis amigos por demostrar que siempre estarán orgullosos de mí haga lo que haga: Lim, Pachis, Nati, Mera, Mariel, Susi, Afi, Marilucas, Nenuco, Julian y Jemima, ¡los quiero Banda!.

A mis primos y tíos postizos, los Pacheco y los Sánchez, porque a pesar de todo siempre conté con su apoyo y su cariño, gracias por adoptarme en la familia!.

A las familias Arcéo Rivero y Sánchez Arcéo, por todas sus oraciones, consejos y el amor recibido desde el día en que nací, soy muy bendecida al tenerlos a mi lado.

A mi Tío Jorge Díaz, por el apoyo y soporte económico que me permitió realizar la estancia en el extranjero, ¡Gracias Tío!.

Por último, pero para nada menos importante, a Dios, a mis padres Rufino y María, a mis hermanos Sheila y Oliver, mis abuelos, tíos, primos y sobrinos por todo el amor y su apoyo, sin ustedes nada, absolutamente nada hubiese sido posible, los amo y dedico este trabajo a todos Ustedes.

•

DEDICATORIAS

A Dios

A mis padres: María y Rufino

A mis hermanos: Sheila y Oliver

A mi fuerza y motor: Tía Basita y Tío Bello

Al motivo que estuvo presente en todo momento: el Amor

•

ÍNDICE

INTRODUCCIÓN .. .... ............... ... ............................ ........ ............. .... .... ... .... ...... .. ............ .. . 1

CAPÍTULO 1 . . ... . . .. . .. .. . ... .. ..... . ................................ . ... . ........................ . ........... . .... ..... . .. . . . . . .. 5

ANTECEDENTES .. ... ..... ... ..... . ... ... .. .... ... ... ... .... ... ....... ... ....... ... .... .... .... .......... ..... .. .... ... .. ....... ... .. .. .... 5

1 .1 CAPSICUM ..... . .. .... .. ..... .... .. .. ....... .... . ........ .......... .. ..... ........ . ..... ......... . ... ... ..... ..... ...... ......... .. ... ... .. .. 5

1 .1 .1 CAPSICUM CH/NENSE JACQ ..... .... .. .. .. . ... .. .. .. . ... .. .. ... .. .... ... ...... ... .. .. .. ... ... .. .. .... .. .. ... .. ...... .... ... .. ..... 5

1 .2 MARCHITEZ DEL CHILE .... . .. ... ..... ... ... ............... ... ... . ... .... ..................... .. ......... ...... ....... . ..... .. . ..... .... 6

1 .2.1 S íNTOMAS DE LA ENFERMEDAD EN CHILES .... ...... ... .... ..... .. .. ... ............ .. ...... .. ... .. .. . ... .... ... ........ .... 8

1.2.2 MANEJO DE LA ENFERMEDAD .... ... .. .... . .... ... ... . ..... .. ... .. ..... ... ... ...... . .... ... .. .. .............. ....... . ......... .. .. 8

1.2.3 DESCRIPCIÓN DE PHYTOPHTHORA CAPS/C/, AGENTE CAUSAL DE LA MARCHITEZ DEL CHILE .. ........ . 8

1 .2 .3 .1 CLASE ÜOMICETES ........ ... ... ... .... ......... ... .. . ..... ... .. .. ....... . ... .. ... . ................ . .. .... .... ........ ... .. ... ... . 9

1.2 .3 .2 FAMILIA PYTHIACEAE ... . ... . .... . ... . ............. . .. .. ..... .... .. ....... . .... .. ........ .. ....... .. ....... .... ...... ... .... . .... 10

1.2.3.3 GÉNERO PHYTOPHTHORA .. ....... ... .......... .. .. .. ..... ... .. .. ...... . .... ... ... ...... ... .... .......... ............ .... .... . 10

1.2 .3.4 MECANISMO DE INFECCIÓN DE PHYTOPHTHORA Y DISEMINACIÓN DE LA ENFERMEDAD .. .... ... .... 11

1 .2 .3.5 PHYTOPHTHORA CAPSIC/ LEONIAN .. .... ... ... . .. .. .... .. .. .. .. ...... ... ... .... ... ....... ... .. ..... .... .... ...... .... .... 11

1.2.4 CICLO DE VIDA ... .... ...... .... ......... .. .. .. ........ . .... ....... .. .. .. ... ... ........ ........ ...... ..... .... ... .... ... .. ... ...... ... . . 12

1.2.4.1 FASE SEXUAL ... ... ... .. .... ... ... .. ... . ...... .. .... .. .. .... .. ..... ..... ..... ..... ... .. .. .... .. ...... .. .......... ...... ... ... .. .... 12

1.2.4.2 FASE ASEXUAL .. . .. ....... . ... . .... . ... ..... .. ... ... ... . ....... . .. .. ............. .. .. . ...... .. . .. .. ....... ........ .. ... .. .... . .... 13

1.2.5 FACTORES DE PATOGENICIDAD Y MOLÉCULAS EFECTORAS DE PHYTOPHTHORA .... ... .... .. ..... .. ..... 14

1.3 PROTEÍNA NEP1 ............... ... . .... .... . ...... . .... ... ... . ..... .. ... .. ........ ... .... .. ............... ... .. ...... .. . .... ... .. ... . ... 15

1.3.1 PROTEÍNAS TIPO NEP1 S {NLPS) ............. ..... . ..... ... .. .. ........... .. .. .. .......... .... ...... ... ... . ........ ... ...... . 15

•

1.3 .2 NLPS EN OTROS ORGANISMOS ......... ..... .... ..... .. ............. .. ... ... .. ..... ..... ...... ....... .... ....... .. ......... .. . 16 . 1.3 .3 PROTEINAS TIPO NEP1 DE PHYTOPHTHORA .. ..... ..... .. .... .. ...... .... ... .... .. .. ........ .... ..... ... .... ...... ... .. 17

1.3.4 NLPs DE P . CAP SIC! (PcNPP) ........ .. .. .. ............. .. .. ................ .. .. ........ ...... .......... ..................... 17

1.4 OBJETIVO GENERAL. .. .............. .. ... ..... ...... .. .. .. ... .. .... ... ... ..... ..... ..... .. .. .. .. ............... ....... ........ . 19

. 1.5 OBJETIVOS ESPECÍFICOS . ...... .... .. ... . .. ..... .. ....... .. .... ... .... ... ..... .... ... .... .... ... ............. ... .... .. ..... 19

1.6 JUSTIFICACIÓN . ................... ...... .. ...................... ... .. ... .. ..... ............... .. .... .......... ... ... .... ... ........ 19

1.7 ESTRATEGIA EXPERIMENTAL ... ... ... ... .. ..... ....... ... ..... .. ... .. ............. .... ......... ............. ........ .. ... 21

BIBLIOGRA FÍA .... ... ....... .... ....... ... .. .... .................... .... .......... .... .. ... ... ... ...... ... .............. .. ... ........ ..... . 22

CAPÍTULO 11 .. .. ... .......... .. .. .. .......................... ......... ... .. .............. .... ... ... .... ....... .... .. .......... .. 31

PURIFICACIÓN DE UNA PROTEÍNA TIPO NLP A PARTIR DEL CULTIVO IN VITRO DE

PHYTOPHTHORA CAPSICI . ... ....... ..... .. .... ... .................... .... ....... ... .... .. .. ... ... .... . ......... ...................... ... . 31

2.1 INTRODUCCIÓN ... .. .. .. ... ....... .. .. ... ...................... .... .. .... .... .. .. .. ....... ...... .... ....... .... ... .... ............. 31

2.2 MATERIALES Y MÉTODOS . .. .. .. ........................... ... ....... ........ .. .... .... ...... ...... .. .. ................ ..... 31

2 .2.1 PLANTAS DE CHILE HABANERO (CAPSICUM CHINENSE JACQ.) .... .. .... .. .. .. .. ...... ............ .... ........ .... 31

2.2.2 CEPA DE PHYTOPHTHORA CAPSICI .............. .. .. .... .... .. ...... ........ .. .. .... .......... .... .......... ...... .......... 32

2 .2.3 CULTIVO Y SUBCULTIVO DE PHYTOPHTHORA CAPSICI ........ ........ .. .. .. .................... .... .. .... .. ...... .... 32

2 .2.4 COLECTA DEL SECRETOMA DE PHYTOPHTHORA CAPSJCJ ............ .... .. .... .... .... .. .. .......... ...... .. .. ..... 32

2.2.5 BIOENSAYO DE INMERSIÓN PARA LA EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD INDUCTORA DE NECROSIS EN

HOJAS DE CHILE HABANERO . .. .. ................................ .... .. .................... .. .... .. .... .......... .... .. .. .. ...... .... .... 33

2.2.6 PRECIPITACIÓN DE PROTEÍNAS CON SULFATO DE AMONIO ........ ............ .. .... .... .. .. .. ........ ........... .. 33

2.2.7 DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD PROTEOlÍTICA DE LAS PROTEÍNAS INDUCTORAS DE NECROSIS

SECRETADAS POR P . CAP SIC/ . . ... .. ...... . ... ............ . .... . . . . . ........ .. . . . .. ......... . ..... ... . .... .. .. . . ...... ........... .. ..... 34

2.2.8 ELECTROELUCIÓN DE LA PROTEÍNA CORRESPONDIENTE A LA BANDA DE 4 7 KDA .. ...... .. .... ...... .. ... 34

11

..

2.2.9 DETERMINACIÓN DE LA SECUENCIA DE AMINOÁCIDOS DE LOS POLIPÉPTIDOS PRESENTES EN LA

FRACCIÓN E2 ... ..... ...... ............ ........... ............ .. ..... ........... .................................... ...... .. .......... .... ..... 35

2 .3 RESULTADOS .. . .. ... ........ . .... .. ........ . ... .... .. .. .. ....... .. .... . ... ... ...... ... . ...... .. .. . ... ... ... . .... .... .... .... .. ... ... 36

2.3.1 EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD FITOTÓXICA DEL FILTRADO DE CULTIVO DE P. CAPSIC/ SOBRE HOJAS

DE C. CHINENSE . ....... .. .. ................ ... ........... . ... .... ....... .... . ... ... .. . ..... .... .... ...... . .. .. ..... . .. ..... ... ... ... ..... .... 36

2.3 .2 PRECIPITACIÓN CON SULFATO DE AMONIO DE LAS PROTEÍNAS INDUCTORAS DE NECROSIS .......... 37

2.3.3 DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD PROTEOlÍTICA DE LAS PROTEÍNAS INDUCTORAS DE NECROSIS

SECRETADAS POR P. CAPSICI . . ...... .. .... .. .. ........ ... ........ .. . ... ... ..... .. ... ... ............. ... ................ .... ............ 39

2 .3.4 PURIFICACIÓN DE LAS PROTEÍNAS EXTRACELULARES DE P. CAPSICI INDUCTORAS DE NECROSIS. 41

2.3.5 EVALUACIÓN DEL EFECTO FITOTÓXICO DE LA FRACCIÓN E2 SOBRE HOJAS DE C. CHINENSE. ...... . 43

2.3.6 DETERMINACIÓN DE LA SECUENCIA DE AMINOÁCIDOS PRESENTES EN LA FRACCIÓN E2 ............... 44

2.4 DISCUSIÓN .. ..... ... ... ... .. ..... .. ... ..... ... ......... ... . .. .. ............... .. ...... .. ... ..... .. ........ .. ......... .. ... ... ......... 46

BIBLIOGRAFÍA ... .... ... ...... ..... .......... . ...... .. .. .. ......... .. ........... ... .... ......... .. ... ... .. .. .. ........ ........ ..... ... ..... 50

CAPÍTULO 111 ................. ..... ........ ..... .. ............. .............................................................. .. . 53

CARACTERIZACIÓN DEL EFECTO FITOTOXICO DE LA FRACCIÓN E2, UNA FRACCIÓN

PROTEICA CON ACTIVIDAD INDUCTORA DE NECROSIS PURIFICADA A PARTIR DEL

FILTRADO DE C U LTIVO IN VITRO DE P. CAPSICI . .... .. .. .... .... .. .. .. ...... .... .... .. .. .. .. .... .. ........ .. .... .. ....... 53

3.1 INTRODUCCIO N ............. .. .. ........ .. ......... ... .. .. ..... .. .. .. .......... .... .. ... ..... .. .... ...... ........... ..... .... . .... . 53

3.2 MATERIALES Y MÉTODOS .... .. .................. .. .................................................. ... ................ .. .. 54

3.2.1 DETERMINACIÓN DE LA FORMACIÓN DE H202 EN HOJAS DE CHILE HABANERO EXPUESTAS A LA

FRACCIÓN E2 .. .. .. . . ...... .. .. .. .. ...... .... ... ... ... .. .. .... ... . .. .. ...... .. .. .. .......... .. ... . ..... .. ......... .... ........ .. ... . ........... 54

3 .2 .2 EVALUACIÓN DEL DAÑO AL ADN ..... .. .. .. .... .. .. .... .... ........ .......... .. .. .. .... .. .. ...... .... .. .... ...... .... .. .. ..... 55

3.2.3 EVALUACIÓN DEL EFECTO DE LA FRACCIÓN E2 SOBRE LA INTEGRIDAD DE LAS SUSPENSIONES

CELULARES DE CAPSICUM CH/NENSE. .... .... .. ... ..... .. .. . ...... .. ..... . .... .. ........ ...... ... ...... .. .. . ..... .. .. . .... .... ..... . 56

3 .2 .4 D ETERMINACIÓN DEL EFECTO DE LA FRACCIÓN E2 SOBRE LA VIABILIDAD CELULAR DE LAS

SUSPENSIONES CELULARES DE CAP SIC UM CHINENSE. .. ... .. .... ... ............. ... .. ... .. ... ...... . ... ............ .. .... ... 56

3.2.5 EVALUACIÓN DEL DAÑO AL ADN EN SUSPENSIONES CELULARES . ...... ........................................ 57

3 .3 RESU LTADOS .......... .. ............ .. .... . .... ... ....... . .... ... .. .... ........... ........... . .......... ... ... ..................... . 58

3.3 .1 DETERMINACIÓN DE LA FORMACIÓN DE H202 EN HOJAS DE CHILE HABANERO EXPUESTAS A E2 ... 58

3.3.2 EVALUACIÓN DEL DAÑO AL ADN . .. ............................ .. ...... .. .......... .. .......... .................... .... .. .. ... 58

3.3.3 EVALUACIÓN DEL EFECTO DE E2 SOBRE SUSPENSIONES CELULARES DE CAPSICUM CH/NENSE . .. 59

3.3.4 DETERMINACIÓN DEL EFECTO DE LA FRACCIÓN E2 SOBRE LA VIABILIDAD CELULAR DE LAS

SUSPENSIONES CELULARES DE CAPSICUM CHINENSE. .. ...................... .. ........ ...................... ............... 60

3.3.5 EVALUACIÓN DEL DAÑO AL ADN GENÓMICO DE SUSPENSIONES CELULARES ........... .. .. .......... .. ... 62

3 .4 DISCU SIÓN ... .. .......... ............ .. .. .......... ... ........................ ..... ....... . .... .. ... ... ... .. . ... ... .. ................ . 63

BIBLIOGRAFIA ............ .. ........ .. ... ................... .... ..... . ................... ............. ....... .............. .. ... ... ........ 65

CAPÍTULO IV .. ....... ...................................... ............. ..... ... .............. .. ... ......... .... ........ ...... 69

CONCLU S IONES Y PERSPECTIVAS .. ... ....... .. ..... .. .............. .. ............. .... . ........... ....... .. ............ ... 69

4.1 CONCLUSIONES ........ .. ............ . .... .... ..... ... ............ . ................ ........ ... ......... .. .................. ... .. ... 69

4.2 PERSP ECTIVAS . ... ..... .. ... . ........... ... .... .. ....... .. ........ .. ...... ............. ...... .. ........... ....... ..... ..... ....... . 70

iv

LISTADO DE FIGURAS

Figura 1.1 Ciclo de vida de P. capsici, agente causal de la marchitez del chile (Modificado

de Ristaino y Johnston, 1999) ... ........ ........ ............ ............ .. .... ......................................... 14

Figura 1.2 Estrategia experimental para el presente trabajo ....... ...... ...... .. .... .... ... ...... ..... 21

Figura 2.1 Esquematización del proceso de obtención de las diferentes fracciones

evaluadas en el presente trabajo ........ ....... ... .. ... ........ .... ..... .. .... .. : ................... .. ............... 36

Figura 2.2 Evaluación de la actividad fitotóxica sobre hojas de Capsicum chinense del

filtrado crudo (A) y de la fase acuosa (B) de P. capsici .. ..................... ..... ... .... .... ......... .... 37

Figura 2.3 Evaluación del efecto fitotóxico sobre hojas de C. chinense de las proteínas

precipitadas con sulfato de amonio a partir de las fracciones A y C ................................ 38

Figura 2.4 Evaluación del efecto fitotóxico y perfil proteico de las fracciones B, 81 , 82,

83, 0 1, 02 y 0 3 . ... ..... .. ........ .... .... ..... ........... .. ..... .. .... .. .......... ... ..... ...... ............ ......... .... ... 39

Figura 2.5 Determinación de actividad de proteasa y perfil proteico de las diferentes

fracciones proteicas precipitadas con sulfato de amonio a partir de A y B ....................... 40

Figura 2.6 Perfil de proteína en gel de poliacrilamida antes de separar el área que

comigra con la banda correspondiente a la actividad de proteasa ................... ....... ......... 41

Figura 2. 7 Análisis por electroforesis en gel de 12% de poliacrilamida de la eficiencia del

proceso de electroelución y recuperación de la actividad de proteasa ... ... .. ..................... 42

Figura 2.8 Efecto fitotóxico ocasionado por la fracción E2 sobre hojas de chile habanero

........................ ..... ..... ..... ........ ... ..... ........ ... ..... .. ... .. ...... ..... ... ... ... ....... ........ .... .. ........ .. .. ..... 44

Figura 3.1 Determinación de la formación de H20 2 en hojas de chile habanero inducida

por la aplicación de E2 .. ..... .. .. .... ................. ....... .... .... ....... .. .... ......... .... ........ ... .... ... ... ... ... 58

Figura 3.2 Evaluación del daño al ADN de hojas de C. chinense inducido por E2 .. .... .... 59

Figura 3.3 Daño al ADN nuclear en suspensiones celulares de Capsicum chinense

expuestas a la fracción E2 .. ............. .. ..... .. .... ...... ..... ......... ... ......... ........ ...... ..... .. ..... .... ... .. 60

Figura 3.4 Disminución de la viabilidad celular estimada mediante el monitoreo de la

retención del colorante Azul de Evans ........ ......... ... .. ... ... .... ..... ..... ......................... .. ........ 61

Figura 3.5 Evaluación del daño al ADN genómico inducido por la fracción E2 en

suspensiones celulares de Capsicum chinense .. .......................................... , .................. 62

vi

LISTADO DE CUADROS

Cuadro 1.1 Listado de algunas proteínas tipo NLP producidas por diversos organismos

fitopatógenos ....... .... ... ..... ....... .... .. ... ......... .... .... .. ... .. ...... ... .... .. ... .. .......... .......................... 17

Cuadro 2.1 Resumen del proceso de purificación de la fracción E2 a partir del filtrado de

cultivo de P. capsici ..... .. .. ... ......... ... .... ... ........ .. ........ .. ..... ......... ........... . ,. ............. 43

Cuadro 2.2 Identidad de polipéptidos presentes en la fracción E2 ............................. 45

Cuadro 3.1 Viabilidad de las suspensiones celulares de C. chinense expuestas por

diferentes tiempos a la fracción E2 .................... .. .................... ............................. 61

1

viii

•

ABREVIATURAS

oc grados Celsius

j..lg Microgramo

!JL Microlitro

!JM Micromolar

ADN Ácido desoxirribonucleico

ADNg Ácido desoxirribonucleico genómico

CTAB Bromuro de cetil trimetil amonio

DAB 3,3 · -diaminobencidina

k Da Kilodaltons

M Molar

m A Miliamperes

mg Miligramo

m in Minuto

ml Mililitro

mM Mi limolar

Ng Nanogramo

NLPS Proteínas t ipo NLP

N m Nanómetro

pb pares de bases

•

. PBS Phosphate Buffer Saline (amortiguador salino de fosfatos)

PCD Programmed Cell Death (muerte celular programada)

PDA Patato dextrosa agar (agar papa dextrosa)

PDB Patato dextrosa broth (caldo papa dextrosa)

PVP Polivinil pirrolidona

ROS Reactive Oxigen Species (especies reactivas de oxígeno)

rpm Revoluciones por minuto

SOS Dodeci l sulfato de sodio

V Volts

v/v Volumen por volumen

X Número de veces

x g Gravedades

X

RESUMEN

Los oomycetos como Phytophthora spp. producen efectores apoplásticos y citoplásmicos

que modulan los procesos bioquímicos, morfológicos y fisiológicos del hospedante para

establecer una infección exitosa. Entre los efectores de tipo apoplástico se encuentran los

inhibidores de enzimas del hospedante, proteínas que interfieren con la adhesión entre la

pared celular y la membrana plasmática del hospedante y toxinas que conducen a la

muerte celular. Las toxinas incluyen a la familia de proteínas tipo Nep1 (NLPs). Nep1 es

un polipéptido de 24 kDa purificado del filtrado de cultivo de Fusarium oxysporum y

reconocido como inductor de necrosis en varias dicotiledóneas. La presencia de efectores

ha sido descrita en Bacillus spp., Erwinia spp., Verticillium spp., Pythium spp. y

Phytophthora spp., y entre sus características se encuentra su capacidad para ocasionar

necrosis en los hospedantes correspondientes.

Recientemente se reportaron 18 genes de P. capsici que presentan homología con genes

que codifican para NLPs presentes en otros patógenos. Sin embargo, los productos de los

genes de P. capsici aún no han sido estudiados. Dado que estudios previos demuestran

que el filtrado de cultivo de P. capsici tiene un efecto fitotóxico sobre hojas de Capsicum

chinense, y con el fin de profundizar en el estudio de la interacción Phytophthora capsici-

Capsicum chinense y la función que desempeñan los efectores secretados por P. capsici,

en este trabajo se describe la purificación de proteínas inductoras de necrosis presentes

en el filtrado de cultivo de P. capsici, usando los ensayos de actividad proteolítica y

fitotóxica sobre hojas de C. chinense como guía, y la caracterización de una fracción

proteica bioactiva.

\ ABSTRACT

Oomycetes like Phytophthora spp produce apoplastic and cytoplasmic effectors to

modulate the biochemical, morphological and physiological process in host to establish a

successful infection. Among the apoplastic effectors are inhibitors of host enzymes,

proteins that interfere with the adhesion between host cell wall and plasma membrane and . toxins that lead to cell death. Toxins include the Nep1-like (NLP) protein family. The NEP1

is a 24 kDa polypeptide, purified from the Fusarium oxysporum c'ulture filtrate , which has

the ability to induce necrosis in dicot plants. Effectors have been well described in Bacil/us

spp, Erwinia spp., Verticillium spp., Pythium spp, and Phytophthora spp. and their

characteristics include ability to cause necrosis.

Recently, 18 P. capsici genes were described which showed homology with genes that

codify for NLPs in other pathogens. However the products of these P. capsici genes have

not been studied yet. Previous investigations have shown that the filtrate from the in vitro

cultures of P. capsici is phytotoxic to Capsicum chinense leaves. Thus, with the aim to

further study the P. capsici-C. chinense interaction , as well asto better understand the role

of proteins secreted by P. capsici, this work describes the purification of necrosis-inducing

proteins present in the culture filtrate of P. capsici, using the proteolityc activity and

phytotoxicity assays on C. chinense leaves as a guide, and the characterization of a

bioactive protein fraction.

INTRODUCCIÓN

INTRODUCCIÓN

A nivel mundial el cultivo de chile (Capsicum spp.) comprende un total de 1 822 912

hectáreas; los mayores productores son China, México, Indonesia, Turquía, España,

Estados Unidos y Nigeria, siendo los tres primeros los que destinan las rpayores

superficies para este cultivo (FAOSTAT, 2012). De las especies de chile cultivadas en las

diferentes regiones de México, el chile habanero (Capsicum chinense Jacq.) es altamente

apreciado debido a sus características organolépticas y su picor. A nivel nacional,

Yucatán ocupa el primer lugar en la producción de esta especie y la destina

principalmente al consumo en fresco y al procesado industrial (González-Estrada , 2006)

Desde el punto de vista socioeconómico, el cultivo de chile habanero tradicionalmente ha

representado una de las fuentes de empleo con mayor rentabilidad para los pequeños y

medianos productores yucatecos, dado que el cultivo de esta especie genera empleos

directos para un número importante de familias (INEGI-SAGARPA, 2011 ).

Al igual que otros cultivos de interés agronómico, el chile habanero es susceptible al

ataque de virus, bacterias, hongos y Oomicetos. Los Oomicetos pertenecen al reino

Protista y son un diverso grupo de organismos eucariontes heterotróficos que morfológica

y fisiológicamente se asemejan a hongos pero que filogenéticamente están distantes de

ellos. Los estudios filogenético-moleculares los relacionan más con las algas cafés

(Thines y Kamoun, 201 0). Los oomycetos causan grandes pérdidas y aumentan los

costos de producción agrícola, debido a la necesidad de invertir en productos químicos

para su prevención y control (Fiores-Giubi, 2008). Algunos de los problemas fitosanitarios

más importantes en plantaciones de chile habanero los constituyen las enfermedades

causadas por los Oomicetos del género Phytophthora.

El total de las aproximadamente 60 especies conocidas de Phytophthora se reconocen

como patógenos causantes de diversos desórdenes: la pudrición de las raíces, copas,

tallos, hojas y frutas de una amplia gama de plantas, tanto de tipo ornamental como

agrícola (Tyler, 2002).

Phytophthora capsici es un organismo hemibiotrófico (Bouwmeester et al., 2009; Lamour

1

INTRODUCCIÓN

et a/., 201 2) que causa la enfermedad conocida como marchitez del chile en Capsicum

spp.; esta enfermedad está presente en todo el mundo y provoca la muerte prematura de

las plantas (Rilstaino y Johnston, 1999). En México la marchitez del chile está

considerada como la enfermedad más importante de las especies cultivadas del género

Capsicum y su presencia se ha reportado en todos los estados productores, donde las

condiciones ambientales favorecen el desarrollo del Oomiceto (Gónzález-Chavira et al.,

2002; Flores-Giubi, 2008).

El control de P. capsici por medio de productos químicos, y mediante la siembra de

variedades resistentes, se dificulta debido a la aparición de nuevas formas especiales del

patógeno resistentes a los plaguicidas o capaces de romper la resistencia del hospedante.

De igual forma otro aspecto importante que ha influido en el desarrollo de estrategias para

el control de esta enfermedad es el escaso conocimiento que se tiene sobre el

mecanismo de patogénesis de este Oomiceto, ya que aun no se conocen blancos

potenciales que podrían utilizarse para el diseño de nuevos productos con actividad

contra P. capsici (González-Chavira et al., 2002).

Las especies de Phytophthora, producen efectores apoplásticos y citoplásmicos capaces

de modular e interferir en los mecanismos de defensa del hospedero para favorecer la

colonización parasítica; estos efectores son capaces de ocasionar muerte celular por

necrosis y algunos se asocian con actividad proteolítica. Entre los efectores de tipo

apoplástico se encuentra Nep1, un polipéptido de 24 kDa purificado del filtrado de cultivo

de Fusarium oxysporum que induce necrosis en varias dicotiledóneas (Bailey et al., 1997).

Nep1 es parte de una familia de proteínas llamadas NLPs (proteínas tipo Nep 1, por sus

siglas en inglés), que han sido reportados en Baci/lus spp., Erwínía spp., Vertíci/líum spp. ,

Pythíum spp., M. gramíníco/a y Phytophthora spp. (Gijzen y Nurnberger, 2006; Motteram

et al., 2009). Hasta ahora no se ha reportado la presencia de proteínas NLP en P. capsící,

aunque estudios previos reportan la presencia de proteínas con actividad proteolítica en la

fracción hidrofílica, con actividad fitotóxica, obtenida a partir del filtrado de cultivo de P.

capsící (Fiores-Giubi, 2008). El presente estudio describe la implementación de un

protocolo de purificación de proteínas inductoras de necrosis utilizando la actividad

proteolítica y fitotóxica del secretoma de P. capsící sobre hojas de C. chínense como guía,

2

•

INTRODUCCIÓN

y la identificación una fracción proteica de - 4 7 k Da con actividad proteolítica y fitotóxica . que induce la formación de peróxido de hidrógeno en hojas, causa daño al ADN nuclear y

disminuye la viabilidad en suspensiones celulares de chile habanero.

3

CAPÍTULO 1

ANTECEDENTES

1.1 Capsicum

CAPÍTULO 1

El género Capsicum pertenece a la familia Solanaceae, es originario del trópico

americano (Pickersgill, 1997; Votaba et al., 2005) y comprende 25 especies (Esbaugh,

1993; Bosland y González, 2000), cinco de las cuales ya han sido domesticadas:

Capsicum annuum L., Capsicum frutescens L., Capsicum chinense Jacq., Capsicum

pubescens Ruiz & Pav. y Capsicum baccatum L (Bosland y González, 2000; Toquica et

al. , 2003). Se ha indicado que Capsicum annuum L., Capsicum chinense Jacq. y

Capsicum frutescens L. podrían ser formas politípicas de la misma especie, es decir,

varias formas, incluyendo subespecies y variedades (Toquica et al., 2003). Debido al valor

culinario y comercial de sus frutos, las especies domesticadas de Capsicum han sido

explotadas a escala global después del descubrimiento de América. Los frutos pungentes

han sido util izados como especias (ajíes, chiles), mientras las formas dulces

tradicionalmente se han usado como hortalizas (pimentones, pimientos) (Esbaugh, 1993;

Bosland y González, 2000).

1.1.1 Capsicum chinense Jacq.

Se considera que Capsicum chinense Jacq., es la más variable de las especies

domesticadas en América. Está estrechamente emparentada con Capsicum frutescens L.

y la distribución de ambas especies en América del Sur es similar. Su área de mayor

diversidad es la cuenca Amazónica (Cheng, 1989), por lo que se cree que Capsicum

chinense Jacq., tiene ahí su centro de origen; se ha propuesto que esta especie se

dispersó en tiempos precolombinos a diferentes islas del Caribe y que de éstas paso a la

Península de Yucatán (Bosland y González, 2000).

La clasificación taxonómica de Capsicum chinense Jacq. de acuerdo a Bosland y Votaba

(2003) y Marín et al. (2004) es la descrita a continuación:

5

•

CAPÍTULO 1

Reino ..... .. .... ...... ... ... .. .Piantae

Subreino ........ ............ . Embriophyta

División . .. ... .. ......... ..... . Angiospermae

Clase ...... .. ... .............. .Dicoty/edoneae

Subclase ........... .......... Metachlamidae

Orden ........ ...... .. .. ... ... . Tubiflorae

Familia .... .... ..... .. .... ..... So/anaceae

Género .... .................... Capsicum

Especie .. .. .................. Capsicum chinense Jacq.

En Yucatán, el cultivo de chile habanero (Capsicum chinense Jacq.) es una actividad

emergente que se ha caracterizado por mantener un alto valor agregado, por lo que el

cultivo de esta especie ha aumentado en la última década (Fiores-Giubi, 2008). No

obstante el cultivo de chile habanero es susceptible al ataque de diversos fitopatógenos,

como virus, bacterias, nematodos, hongos y oomicetos; estos microorganismos causan

grandes pérdidas y aumentan los costos de producción, debido a la necesidad de invertir

en productos químicos para la prevención y control de las diversas plagas (Fiores-Giubi,

2008). Esta situación se ha dificultado para el caso de C. chinense debido a que, como

Solanácea, comparte enfermedades con el tomate, otra hortaliza a la cual atacan diversos

organismos fitopatógenos y que con frecuencia se siembra en sitios cercanos o en el

mismo sitio donde se han establecido cultivos de C. chinense (Tamayo, 2001 ).

1.2 MARCHITEZ DEL CHILE

La primera publicación y descripción sobre la marchitez del chile y su agente causal P.

capsici fue realizada por Leonian (1922), quien descubrió la enfermedad en plantas de

chile en la estación de investigación agrícola de Las Cruces, Nuevo México, EE.UU. Los

principales hospedantes de P. capsici son los chi les rojos y verdes (Capsicum annuum), la

6

•

CAPÍTULO 1

sandia (Cítrullus /anatus), el melón (Cucumis meto), el pepino (Cucumis sativus), las

calabazas (Cucurbita maxima, C. moschata, C. pepo), el tomate (Lycopersícon

esculetum) , la pimienta (Piper nigrum) y la berenjena (Solanum melongena) (Tian y

Babadoost, 2004 ).

Además de las 49 especies de Solanáceas y Curcubitáceas ya reportadas como

hospedantes de P. capsici (Erwin y Ribeiro, 1996), en 2004 Tian y Babadoost reportaron

que especies como Beta vulgarís y Spínacía oleracea (Amaranthaceae), Phaseolus . lunatus (Fabaceae), Brassíca rapa (Brassicaceae) y Abutilon theophrastí (Malvaceae) son

hospedantes de P. capsící.

En 1989, Palazón y Palazón reportaron la marchitez del chile como la enfermedad de

mayor trascendencia en el cultivo de chile en los Países Mediterráneos. En 1964 se

documentó por primera vez- la marchitez del chile en España (Dávila, 1964) y desde

entonces persiste en ese país (Bartual et al., 1991 ). En Argentina esta enfermedad es una

de las causas más importantes de pérdidas en cultivos de chile (Roig et al., 2009), en

tanto que en Korea se ha reportado que la enfermedad se presenta en todos los órganos

de la planta y que se ve favorecida por altos niveles de humedad (Kim et al., 1989). Por

otra parte, en lllinois, Estados Unidos, considerado como el primer productor de calabaza

para procesamiento comercial (Babadoost e Islam, 2003), la marchitez causada por P.

capsící se ha vuelto una amenaza importante para la producción de esta especie, debido

a que la enfermedad ha causado hasta un 100% de pérdida en el rendimiento

(Babadoost, 2000).

El ahogamiento y la marchitez del chile se han estudiado en México desde 1957,

reportándose que, además de P. capsíci y Pythíum spp., existen otros agentes causantes

de enfermedades con síntomas similares, e.g. Fusarium equiseti, F. verticilloídes, F.

oxysporum, F. sotaní, Fusarium sp., Rhízoctonia sotaní y Rhízoctonía sp. (Gallegly y

Galindo, 1958). En México, la marchitez del chile está considerada como la enfermedad

más importante de las especies cultivadas del género Capsicum y su presencia se ha

reportado en todos los estados productores, donde las condiciones ambientales favorecen

el desarrollo del oomiceto. En condiciones favorables, P. capsicí puede causar pérdidas

económicas importantes al afectar del 60 al 100% de la superficie cultivada (González-

Chavira et al. , 2002). En estados como Aguascalientes y San Luis Potosí, este patógeno

7

•

CAPÍTULO 1

ocasiona pérdidas del 26 a 40% en la producción de chiles (Velásquez y Medina, 2003).

1.2.1. SÍNTOMAS DE LA ENFERMEDAD EN CHILES

Las raíces , tallos , hojas y frutos de chile son susceptibles al ataque de P. capsici, aunque

también puede ocurrir que la infección se presente solo en partes aéreas ; es muy común

que en el tallo la enfermedad se ubique en la línea cercana al suelo (Roberts et al., 2001 ).

El primer síntoma que comúnmente se presenta en lotes de chile es un daño en el cuello

de la raíz, una lesión circular en la base del tallo que causa acame y muerte de la planta

(Babadoost, 2001 ). Las raíces infectadas son de color café oscuro y blando, las manchas

en las hojas comienzan siendo pequeñas, circulares, irregulares y acuosas. Con el tiempo

se agrandan , se aclaran y pueden romperse (Roberts et al., 2001 ). Los frutos de chile son

afectados a través del pedúnculo, se encogen , se arrugan (Roberts et al., 2001) y

presentan lesiones oscuras cubiertas con micelio blanco y permanecen prendidos en la

planta (Babadoost, 2001 ).

1.2.2 MANEJO DE LA ENFERMEDAD

Las estrategias recomendadas para el manejo de la marchitez del chile incluyen la

prevención de la contaminación por el patógeno (Babadoost, 2001 ). La estrategia primaria

es el manejo de la dinámica del agua en el suelo dándole el mejor drenaje posible, así

como la rotación de cultivos con hospederos no susceptibles, la aplicación de fungicidas

apropiados (Lamour y Hausbeck, 2001 ), la selección de terrenos sin historia de la

enfermedad (i.e. terrenos que no hayan tenido cultivos de chiles, cucurbitáceas, tomate o

berenjenas por más de tres años); adicionalmente se recomienda la selección de lotes

aislados de campos infestados con P. capsici, la limpieza del equipo agrícola , la siembra

en camas altas, no regar con agua drenada de lotes infestados, explorar el campo en

busca de plantas con los síntomas producidos por P. capsici después de lluvias fuertes y

en áreas con dificultad de drenaje (Babadoost, 2001 ). Lo anterior facilita la oportuna

detección de P. capsici y permite tomar las medidas preventivas necesarias.

1.2.3 DESCRIPCIÓN DE Phytophthora capsici, AGENTE CAUSAL DE LA MARCHITEZ

DEL CHILE

La clasificación taxonómica de Phytophthora capsící Leonian de acuerdo a Erwin y Ribe iro

8

•

CAPÍTULO 1

(1996) es la siguiente:

Reino: Chromista

Phylum: Peronosporomycetes

División: Pseudofungi

Subdivisión: Mastigomycotina

Clase: Oomicetes

Subclase: Peronosporomycetidae

Orden: Peronosporales (Pythíales)

Familia: Pythiaceae

Género: Phytophthora

Especie: Phytophthora capsící Leonian

1.2.3.1 Clase Oomicetes

Los rasgos diferenciales de los oomicetos son: 1) producen zoosporas biflageladas con

un flagelo barbulado hacia delante y otro liso dirigido hacia atrás, 2) poseen paredes

formadas principalmente por glucano y celulosa, con poca o nada de quitina, 3) su

reproducción sexual es oogámica, por contacto gametangial, y 4) la meiosis es

gametangial, por lo que sus núcleos somáticos son diploides (Aiexopoulos y Mims, 1985).

Los Oomicetos de estructura más sencilla son acuáticos y viven libres o parasitan algas,

mohos, animales pequeños y otras formas de vida acuática. Los más complejos son

parásitos terrestres de plantas y dependiendo de la especie, estos últimos pueden pasar

la totalidad de su ciclo vital en el hospedante (Aiexopoulos y Mims, 1985).

Las estructuras somáticas pueden ser desde un talo unicelular simple hasta un micelio

f ilamentoso y abundante, profusamente ramificado, que crece exuberantemente sobre el

sustrato o medio circundante. La mayoría presentan estructuras reproductivas sexuales y

9

•

CAPÍTULO 1

asexuales (Aiexopoulos y Mims, 1985).

1.2.3.2 Familia Pythiaceae

La familia Pythiaceae comprende a organismos de vida acuática, terrestre y una

combinación de las dos. Su micelio está bien desarrollado y muchos de los organismos de

vida terrestre que pertenecen a esta familia provocan graves enfermedade~ en plantas de

importancia económica. El micelio está bien desarrollado. Algunas especies (e.g· . . Phytophthora infestans) producen haustorios. En la mayoría de las especies, las hifas

portadoras de esporangios son indistinguibles del micelio; en algunas especies (e.g. P.

capsic1) se forman esporangióforos definidos. En las especies más especializadas (e.g. P.

infestans) los esporangios son caducos y a menudo germinan mediante un tubo de

germinación, en lugar de producir zoosporas (Aiexopoulos y Mims, 1985)

1.2.3.3 Género Phytophthora

Antón de Bary fue el primero en acuñar el nombre de Phytophthora (destructor de plantas)

en 1876 cuando describió el tizón tardío de la papa causado por Phytophthora infestans

(Zentmyer, 1983). Actualmente se conocen más de 60 especies del género Phytophthora

y muchos son patógenos destructivos de plantas, por lo que cada año se realizan grandes

esfuerzos para controlar a estos Oomycetos (Goodwin, 1997).

Las especies de Phytophthora producen varias enfermedades en distintos tipos de

plantas. La mayoría generan pudriciones de la raíz, ahogamiento de plántulas,

pudriciones de tubérculos, cormos, tallos y otros órganos. Otras especies (e.g. P.

syringae, P. citrophthora ) causan pudriciones de yema . o de frutos y algunos tizones

foliares. Algunas especies (P. fragariae) son hospedero-específicas, pero otras tienen un

amplio rango de hospederos y pueden producir síntomas similares o distintos en muchas

especies (Agrios, 2005).

Las especies de Phytophthora se ven favorecidas por las altas temperaturas y la alta

humedad en el suelo y en la atmósfera. En la mayoría de los casos, el Oomiceto ataca la

planta a nivel de la superficie del suelo y produce el ablandamiento de la corteza, lo cual

se observa como una zona oscura sobre el tronco. Esta zona avanza en todas direcciones

y si la planta es pequeña y suculenta, el ennegrecimiento puede rodear a todo el tallo;

10

CAPÍTULO 1

esto último hace que las hojas de la parte inferior de la planta se desprendan y que toda la . planta se marchite . En algunos casos las estructuras reproductivas de tipo asexual de

este Oomiceto son diseminadas a las partes aéreas de la . planta produciendo daño y

nuevos centros de infección en hojas, yemas y frutos (Agrios, 2005). En ocasiones el

patógeno ataca el tallo por debajo de la superficie del suelo y en otras, ataca primero la

raíz principal y produce síntomas semejantes a los generados por la sequía, antes de que

aparezcan chancros o cualquier tipo de lesión directa por encima de la superficie del

suelo.

1.2.3.4 Mecanismo de infección de Phytophthora y diseminación de la enfermedad

Todas las especies de Phytophthora tienen como característica común el crecimiento

micelial sin septación y pueden producir tres tipos de esporas asexuales: esporangios,

zoosporas y clamidiosporas. Los esporangios pueden diferenciarse para producir de 1 O a

30 zoosporas o pueden germinar directamente para formar hifas. Las zoosporas

biflageladas rompen la pared de la vesícula y nadan activamente. Las zoosporas son

estructuras de vida corta y rápidamente forman quistes adhesivos, los cuales pueden

germinar para producir hifas o zoosporas secundarias. En muchas especies, las

zoosporas son el agente de dispersión más importante. Las clamidiosporas son de pared

gruesa y se producen solo por algunas especies y se les puede encontrar en el material

vegetal muerto. Durante la reproducción sexual, el anteridio se fusiona con el oogonio y

un solo núcleo haploide es transferido dentro del oogonio. El oogonio fertilizado forma una

oospora, la cual eventualmente puede producir hifas (Tyler, 2007).

1.2.3.5 Phytophthora capsici Leonian

Micelio

Micelio cenocítico, bajo ciertas condiciones de cultivo se pone densamente tuberoso, las

extensiones tuberosas son esféricas u ovoides con formas iguales a los esporangios, rico

en protoplasma. Las extensiones tuberosas a menudo forman crecimientos extensos,

similares a racimos de uva (Leonian, 1922)

11

•

CAPÍTULO 1

Esporangios

Esporangios generalmente ovoides que varían según el medio de cultivo; se presentan en

formas elongadas elipsoides, subesferoides, elongaciones irregulares con formas

intermedias, papilla prominente apical en un solo esporangio. Algunas veces pueden ser

tres variando su disposición (Leonian, 1922; Ristaino y Johnston, 1999). Tienen

germinación por zoosporas y en condiciones especiales por tubos de ·germinación. El

tamaño del esporangio es muy variable pero en promedio ~s de 60 x 36 ¡Jm (Leonian,

1922)

Oosporas

La sobrevivencia a largo plazo o fuera del tejido del hospedante se debe a la oospora

(Hausbeck y Lamour, 2004 ), la cual es gruesa y recubierta de múltiples capas de ~

glucano y celulosa (Erwin y Ribeiro, 1996). Las oosporas requieren de un periodo de

incubación de cuatro semanas antes de germinar directamente o por formación de

oosporangio.

Zoosporas

Las zoosporas son producto de la reproducción asexual y exhiben geotropismo negativo y

quimiotaxis dado que siguen gradientes de nutrientes mientras nadan (Erwin y Ribeiro ,

1996). Cuando las zoosporas tienen contacto con la superficie de la planta se enquistan y

germinan para producir tubos de germinación los cuales penetran los tejidos a través de

las aperturas naturales como los estomas o por las zonas celulares que han sufrido daños

mecánicos (Hichman, 1970; Hausbeck y Lamour, 2004) . .

1.2.4 CICLO DE VIDA

1.2.4.1 Fase sexual

Phytophthora capsici es una especie heterotálica y requiere de dos tipos de

compatibilidad designados A 1 y A2 para completar la fase sexual (Erwin y Ribeiro, 1996).

Las oosporas son formadas cuando los dos tipos de compatibilidad A 1 y A2 entran en

12

•

CAPÍTULO 1

asociación (Hausbeck y Lamour, 2004).

La reproducción sexual es mediada por señales hormonales extracelulares producidas por

cada tipo de talo, dando lugar a la formación del gametangio masculino llamado anteridio

y al femenino llamado oogonio, confiriendo la capacidad para la autofertilización y

fertilización cruzada (Lamour y Hausbeck, 2001 ). Las oosporas generalmente requieren

de un periodo de dormancia antes de germinar y producir micelio cenocítico,-el cual puede

infectar directamente o diferenciarse en esporangios bajo . condiciones apropiadas

(Ristaino y Johnston, 1999) (Figura 1.1 ).

1.2.4.2 Fase asexual

Bajo condiciones ambientales favorables, Phytophthora capsici es capaz de producir un

gran número de esporangios en la superficie de los tejidos infectados. Durante la lluvia o

la irrigación, los esporangios maduros son fácilmente desplazados y, cuando se

encuentran en agua, pueden rápidamente liberar de 20-40 zoosporas biflageladas, las

cuales son atraídas quimiotácticamente hacia la planta hospedante. Una vez en la

superficie de la planta, las zoosporas pierden sus flagelos, se enquistan y adhieren a la

superficie y producen el tubo germinativo. El tubo germinativo ayudado por la secreción

de enzimas, puede penetrar directamente la cutícula de la planta y colon izar el tejido

hospedante (Feng et al., 2011; Li et al., 2011 ). La mayor parte del ciclo de vida de

P.capsici requiere de la presencia del hospedante.

Phytophthora capsici es un organismo hemibiotrófico, ya que la infección se distingue por

dos estados característicos. Durante los estadios de infección iniciales las células del

hospedero no aparentan estar afectadas (biotrofía), indicando la supresión local de los

mecanismos de respuesta de defensa del hospedante. La acumulación de biomasa

suficiente del patógeno ocasiona un cambio en su estilo de vida (necrotrofía), en el cual

ocasiona la muerte de las células infectadas, dando lugar al colapso de los tej idos y

necrosis (Lamour et al., 2012). El colapso de los tejidos, seguido por la emergencia de los

esporangios, proporciona la forma en la cual el patógeno se dispersa y facilita una nueva

infección.

13

CAPÍTULO 1

oosporas por esporangio

Uberadón de zoosporas

~ oc_ .. _. ~ / portubogerminativo

\ Anteridio y oog-on-io ___,__,.........,......,..--~,.,----

-Miceli o- AlyA2

,/ Esporangios

Figura 1.1 Ciclo de vida de P. capsici, agente causal de la marchitez del chile

(Modificado de Ristaino y Johnston, 1999).

1.2.5 FACTORES DE PATOGENICIDAD Y MOLÉCULAS EFECTORAS DE

Phytophthora

Los fitopatógenos emplean una amplia variedad de estrategias para colonizar e infectar a

sus hospederos. Después del enquistamiento y la penetración de la superficie del

hospedero, los patógenos necrotróficos generalmente crecen a través de los tejidos

vegetales como hifas, las cuales secretan diversas enzimas y toxinas que matan y

degradan los tejidos del hospedante. También, los patógenos biotróficos penetran la

pared celular del hospedero pero no así la membrana plasmática, desarrollando

estructuras de alimentación especializadas. Para establecer una infección exitosa, los

patógenos necesitan modular los procesos bioquímicos, morfológicos y fisiológicos del

hospedante. Los oomicetos realizan esta manipulación mediante la secreción de

proteínas y otras moléculas colectivamente conocidas como efectores (Hogenhout et al. ,

2009). Los efectores se definen como proteínas y moléculas pequeñas que manipulan la

función y estructura de las células hospederas, facilitando la infección o activando las

14

CAPÍTULO 1

respuestas de defensa [inductores y factores de virulencia, respectivamente] (Kamoun, •

2006).

Los oomicetos secretan efectores que son dirigidos hacia diferentes sitios en el tejido del

hospedante, el apoplasto o hacia el citoplasma. Los efectores apoplásticos, que incluyen

inhibidores de glucanasas y proteasas, actúan en el espacio extracelular donde interfieren

con las proteínas involucradas en la defensa del hospedante (Rose et al. ,.2002; Tian et

al., 2004b). Los efectores citoplásmicos o efectores con actividades de virulencia, son . liberados dentro de las células del hospedante donde son translocados y reconocidos por

proteínas R (Hogenhout et al., 2009; Schornack et al., 2009).

Muchos genes que codifican para proteínas efectoras poseen distintos patrones de

expresión durante la colonización del hospedante. Algunos efectores, tales como los

inhibidores de enzimas apoplásticas, muestran una regulación transcripcional positiva

durante la fase biotrófica de la infección, mientras que otros, como las proteínas tipo Nep1

(t-JLPs) son expresadas durante la fase necrotrófica de la infección (Kelley et al., 2010).

Dada su importancia en el proceso de la interacción planta-patógeno, y en particular, en el

de Capsicum chinense con Phytophthora capsici, las proteínas inductoras de necrosis

fueron el objeto de estudio del presente trabajo, por lo que se implementó un proceso

para su purificación y posterior caracterización.

1.3 PROTEÍNA NEP1

La proteína Nep1 es un polipéptido de 24 kDa que fue originalmente purificada de filtrados

de cultivo de Fusarium oxysporum (Bailey et al., 1997), es de tipo extracelular y tiene la

capacidad para inducir necrosis en varias plantas (Bailey, 1995; Verica et al., 2004; Bailey

et al., 2005).

1.3.1 PROTEÍNAS TIPO NEP1s (NLPs)

Entre las proteínas efectoras de tipo apoplástico se encuentran las proteínas tipo Nep1

(NLPs, por sus siglas en inglés), las cuales presentan un tamaño aproximado de 25 kDa y

se encuentran ampliamente distribuidas en bacterias, hongos y oomicetos,

particularmente en especies relacionadas con la infección en plantas (Pemberton y

Salmond, 2004).

15

CAPÍTULO 1

Aun cuando las NLPs están presentes en organismos filogenéticamente distantes, todas

sus secuencias conservan el heptapéptido GHRHDWE y algunos residuos de cisteína;

poseen también un péptido señal de secreción , el cual es necesario para dirigir estas

proteínas hacia la célula hospedante y de acuerdo con el número y la posición de los

residuos de cisteína las NLPs son clasificados en dos grupos: NLP tipo 1 y NLP Tipo 2.

En ambos grupos pueden encontrarse proteínas NLPs de bacterias y hongos, sin

embargo, las provenientes de oomicetos solamente se encuentran en el grupo de tipo 1

(Gijzen y Nurnberger, 2006).

En la actualidad se desconoce el mecanismo mediante el cual las NLPs ocasionan

necrosis. Aunque en hojas de tabaco Nep1 causa un incremento en la emisión de etileno,

sugiriendo que la necrosis podría ser un efecto indirecto de este regulador (Bailey et al.,

1997; Jennings et al., 2000; Fellbrich et al., 2002), esto no sucede en otras plantas,

indicando que existen otros mecanismos involucrados (Bailey, 1995; Bailey et al., 1997).

Se ha reportado que una proteína NLP de Verticillium dahliae (VdNEP) induce lesiones

necróticas y la formación de H20 2 cuando es infiltrada en hojas de Arabidopsis thaliana ;

asimismo, suspensiones celulares de Gossypium arboreum tratadas con la misma

proteína muestran reducción en los índices de viabilidad celular y en la fragmentación del

ADN nuclear, sugiriendo un proceso de muerte celular programada (PCD) inducido como

parte de una respuesta hipersensible (Wang et al., 2004).

Se ha reportado que muchas NLPs son capaces de desencadenar respuestas de

defensa, necrosis y muerte celular en la mayoría de las dicotiledóneas (Fellbrich et al. ,

2002; Qutob et al., 2002; Bailey et al., 2005); no obstante, hasta ahora, no se ha reportado

que las plantas monocotiledóneas sean afectadas por esta clase de proteínas.

1.3.2 NLPs EN OTROS ORGANISMOS

En los últimos diez años un número creciente de proteínas NLP han sido reportadas en

Bacil/us, Erwinia, Verticil/ium, Pythium y Phytophthora (Cuadro 1.1 ); las características de

este tipo de proteínas son su capacidad para ocasionar muerte celular y el hecho de

inducir efectos similares tanto en sus hospedantes como no hospedantes (Gijzen y

Nurnberger, 2006).

16

•

CAPITULO 1

Cuadro 1.1 Listado de algunas proteínas tipo NLP producidas por diversos

organismos fitopatógenos

Organismo

Phytophthora infestans

Phytophthora parasítica

Erwinia carotovora

NLP

NPP1

NPP1

Tamaño (kDa)

26

24

26

Hospedero

Papa

Cítricos y tabaco

Amplia gama de hospedantes

1.3.3 PROTEINAS TIPO NEP1 DE Phytophthora

Referencia y Número de accesión

Romanski et al., 2001 AAK25828

Romanski etal., 2001 AAK19753

Pemberton et al., 2005 ECA3087

Las proteínas tipo Nep1 de Phytophthora, representan un nuevo grupo de inductores de

necrosis. Los genes que codifican para NLPs, o las proteínas por sí mismas, han sido

detectados en superfamilias de organismos procariontes y eucariontes. Se ha descrito

que especies de Phytophtora como P. infestans, P. parasítica, P. sojae, y P. ramorum

producen NLPs (Pemberton y Salmond, 2004). Algunos ejemplos de NLPs de

Phytophthora son la PiNPP1, producida por P. infestans, que induce necrosis en tejidos

de tomate, papa y otras especies de dicotiledóneas (Thirumala-Devi et al., 2006); la

PsojNIP, producida por P. sojae, que induce necrosis en soya (Qutob et al. , 2002); y la

NPP1 de P. parasítica que causa necrosis en perejil y Arabidopsis (Fellbrich et al., 2002).

1.3.4 NLPs DE P. capsici (PcNPP)

Recientemente fueron reportados 18 genes que codifican para proteínas NLPs en P.

capsici (Feng et al., 2011 ). El porcentaje de coincidencia entre las secuencias de

aminoácidos reportadas y las correspondientes a NLPs previamente descritas varía desde

un 15 hasta un 84%. Los valores de coincidencia más altos (84.2 y 83.9%) se encontraron

entre Pcnpp1 y P. megakarya, y entre Pcnpp10 y P. sojae, respectivamente,

17

•

CAPÍTULO 1

encontrándose que todas las secuencias poseen el heptapéptldo GHRHDWE y que ocho • de ellas poseen además el péptido de secreción (Feng et al., 2011 ). Hasta ahora la

funcionalidad de los transcritos de dichos genes no ha sido analizada con herramientas

bioquímicas.

Recientemente se reportó que el filtrado de cultivo de P. capsici muestra un efecto

fitotóxico sobre hojas de chile habanero y que al separar el filtrado de acuerdo al tamaño

de sus componentes (menores a 3 kDa y mayores a 3 kDa), se obtienen dos fracciones

con actividad fitotoxica: una fracción hidrofílica de alto peso molecular (fracción proteica) y

una fracción lipofílica de bajo peso molecular; adicionalmente se reportó que la fracción

proteica posee la mayor actividad fitotóxica y que polipéptidos con actividad proteolítica

(Fiores-Giubi , 2008). Dado que estos resultados sugieren la presencia de proteínas NLP

en P. capsici, el presente trabajo tuvo como objetivo principal caracterizar

bioquímicamente proteínas tipo NLP presentes en el secretoma de Phytophthora capsici.

18

•

CAPITULO 1

1.4 OBJETIVO GENERAL

Caracterizar bioquímicamente proteínas tipo NLP presentes en el secretoma de

Phytophthora capsici.

1.5 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

1. Purificar, a partir del secretoma de P. capsici, al menos una proteína inductora de

necrosis en hojas de C. chinense.

2. Caracterizar el efecto de la o las proteínas purificadas con actividad inductora de

necrosis sobre hojas y suspensiones celulares de chile habanero.

1.6 JUSTIFICACIÓN

Las enfermedades causadas por microorganismos fitopatógenos son un problema

importante que afecta el rendimiento de las plantaciones de las diferentes especies del

género Capsicum (Kuhajek et al., 2003).

Un problema fitosanitario reconocido en plantaciones de Capsicum spp. lo constituye la

"marchitez del chile" causada por P. capsici; esta enfermedad, presente en todo el

mundo, provoca la muerte prematura de las plantas. En México, la "marchitez del chile"

está considerada como la enfermedad más importante de las especies cultivadas del

género Capsicum y su presencia se ha reportado en todos los estados productores,

donde las condiciones ambientales favorecen el desarrollo del oomiceto (González-

Chavira et al., 2002).

Aun cuando la inversión anual necesaria para mantener la sanidad de los cultivos de chile

habanero (C. chinense) es alta, debido al gasto en productos químicos destinados a la

prevención y control de diferentes plagas y enfermedades (Tun, 2001 ), hasta el momento

no existe una forma eficiente de control de P. capsici. El control de la "marchitez del chile"

mediante la aplicación de productos químicos o la siembra de variedades resistentes, se

19

•

CAPÍTULO 1

dificulta debido al escaso conocimiento que se tiene sobre el mecanismo de patogénesis

del f itopatógeno y a la aparición de nuevas formas especiales del oomiceto, resistentes a

los plaguicidas, o capaces de romper la resistencia del hospedante (González-Chavira et

al. , 2002).

Desde hace varias décadas existen reportes sobre las moléculas que participan en el

mecanismo de infección de varias especies del género Phytophthora ; sirt embargo, para

el caso de P. capsící, el conocimiento que actualmente se tiene sobre su producción de

proteínas fitotóxicas, entre ellos los efectores citoplásmicos y apoplásticos, es limitado. El

estudio de estas moléculas permitirá entender el mecanismo de infección y encontrar

blancos potenciales para el control de la enfermedad.

20

•

1.7 ESTRATEGIA EXPERIMENTAL

Cultivo de Phytophthora capsici en medio PDB + 2% de infusión de hojas de C.

chinense.

Colecta del secretoma

Filtrado crudo ---1 Partición con AcOEt

/ Fraccionamiento con +---1 Fracción Acuosa 11 Fracción Orgánica 1

Sulfato de amonio

0-30% 30-60% ~ Determinación de actividad proteolítica y Plantas de 60-90% fitotóxica C.chinense

o ! btención de la +---1 1 1)· 1 Hojas J ~ ·~· secuencia de Electroelución

aminoácidos

Determinación de: •Formación de EROs

•Fragmentación deiADN nuclear

Figura 1.2 Estrategia experimental para el presente trabajo.

CAPITULO 1

.... Cultivo celular de ,. C. chinense

Determinación de: •Fragmentación deiADN

nuclear •Viabilidad celular

21

•

CAPiTULO 1

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30

CAPITULO 11

CAPÍTULO 11

PURIFICACIÓN DE UNA PROTEÍNA TIPO NLP A PARTIR DEL CULTIVO IN VITRO DE Phytophthora capsici

2.1 INTRODUCCIÓN

Recientemente se estableció que P. infestans produce y secreta· un grupo de proteínas

relacionado con la familia de proteínas inductoras de necrosis (NLPs), las cuales inducen

muerte celu lar (necrosis) en tejidos de tabaco, tomate y de diferentes plantas

dicotiledóneas (Gvozdeva et al., 2003; Thirumala-Devi et al., 2006). La actividad

proteolítica de las exoproteasas de P. infestans se ha correlacionado con el efecto

necrótico observado en hojas de papa al ser infiltradas con el filtrado de cultivo del

Oomyceto (Paris y Lamattina, 1999). En estudios de interacción Phytophthora infestans-

Nicotiana tabacum y P. infestans-Solanum esculentum, se observó la expresión de tres

NLPs (PiNPP1.1, PiNPP1.2 y PiNPP1.3) durante el proceso infectivo (Thirumala-Devi et

al. , 2006). Para el caso de P. capsici solamente existe un trabajo que reporta la presencia

de 18 genes que codifican para proteínas NLP en el genoma de este fitopatógeno; sin

embargo, hasta ahora no se han purificado las NLPs de este organismo. Con base a lo

anterior, como objetivo principal de este trabajo se planteó establecer el protocolo de

purificación de una proteína NLP a partir del filtrado de cultivo de P. capsici. El protocolo

de purificación establecido, que incluyó la precipitación de proteínas con sulfato de

amonio, su separación por electroforesis y su electroelución utilizando geles de

poliacrilamida, resultó en la obtención de una fracción polipeptídica denominada p47 la

cual induce necrosis en hojas de chile habanero.

2.2 MATERIALES Y MÉTODOS

2.2.1 PLANTAS DE CHILE HABANERO (Capsicum chinense Jacq.)

Para la evaluación de la actividad fitotóxica de las proteínas inductoras de necrosis y la

preparación de la infusión se utilizaron plantas propagadas asexualmente (clonación por

31

•

CAPiTULO 11

esqueje) de chile habanero de dos a tres meses de edad, obtenidas a partir de una planta

orig inada de una semilla comercial (Seminis-Monsanto). Las clonas se reprodujeron de

forma vegetativa y se mantuvieron en condiciones de invernadero.

2.2.2 CEPA DE Phytophthora capsici

La cepa de Phytophthora capsici utilizada en este trabajo se aisló ,de cultivares de

Capsicum annuum cultivados en Oaxaca, México, fue obtenido por la Dra. Bertha Tlapatl . (Departamento de Fitopatología del Colegio de Postgraduados, Montecillos, México) y su

patogenicidad sobre C. chinense ya ha sido demostrada (Moguei-Salazar, 2004; Flores-

Giubi, 2008). Los cultivos de P. capsící se mantuvieron en cajas de Petri con medio sólido

de papa-dextrosa-agar (PDA), a una temperatura de 25 ± 2 °C. Adicionalmente, para su

conservación, muestras de micelio de P. capsici se mantuvieron a -80°C en 50% de

glicerol estéril.

2.2.3 CULTIVO Y SUBCUL TIVO DE Phytophthora capsici

Una porción (ca. 5 mm2 ) de micelio de P. capsící se utilizó para inocular una botella Roux

conteniendo 200 mL de medio de cultivo líquido [caldo de papa-dextrosa (PDB)

adicionado con 2% de infusión de hojas de chile habanero]; las botellas se colocaron a

25° C, en la oscuridad, bajo condiciones estacionarias, durante nueve días.

2.2.4 COLECTA DEL SECRETOMA DE Phytophthora capsici

El micelio se separó del filtrado de cultivo por medio de filtración al vacío, en condiciones

estériles, uti lizando un embudo Büchner y papel filtro Whatman No. 1. El filtrado de cultivo

(2800 mL, 1X) fue liofilizado; posteriormente el liofilizado se resuspendió en 140 mL de

PBS para incrementar su concentración a 20X, a éste concentrado se le denominó filtrado

crudo (A). Este último se utilizó para preparar las diluciones que permitieron evaluar el

efecto del filtrado (secretoma) como inductor de necrosis en hojas de C. chinense.

Una porción del filtrado de cultivo fue extraída con acetato de etilo (3X, 2:1 , v/v); la fase

acuosa (B) fue recuperada, liofilizada y resuspendida a una concentración de 20X. Esta

ultima suspensión se util izó como stock para preparar las diluciones que permitieron

evaluar su efecto fitotóxico sobre hojas de C. chinense.

32

CAPÍTULO 11

2.2.5 BIOENSAYO DE INMERSIÓN PARA LA EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD

INDUCTORA DE NECROSIS EN HOJAS DE CHILE HABANERO

Se utilizaron las terceras o cuartas hojas verdaderas de plantas de chile habanero de

plantas de Capsicum chinense de 2-3 meses de edad, tomando como referencia u hoja

cero los primordios foliares localizados en el meristemo apical. Las hojas se transportaron

del vivero al laboratorio sumergidas en agua, con el fin de evitar la entrada de burbujas de

aire que interrumpieran la columna de agua en el tejido conduc