Caracterización molecular y morfológica de aislamientos de ...

Caracterización molecular y

morfológica de aislamientos de Fusarium spp. productores de

micotoxinas

Claudia Elizabeth Salazar Gonzalez

Universidad Nacional de Colombia Facultad de Ciencias Agropecuarias

Palmira, Colombia 2016

Caracterización molecular y morfológica de aislamientos de Fusarium spp. productores de

micotoxinas

Claudia Elizabeth Salazar Gonzalez

Tesis presentada como requisito parcial para optar al título de:

Doctor en Ciencias Agrarias

Directores:

Ph.D. Eyder Daniel Gómez López Ph.D. Jaime Eduardo Muñoz

Línea de Investigación: Protección de Cultivos

Grupo de Investigación: Protección vegetal para el Mejoramiento de la productividad

Universidad Nacional de Colombia Facultad de Ciencias Agropecuarias

Palmira, Colombia 2016

Dedicatoria y lema

A mis queridas hijas Sofia y Laura

A mi amado esposo Carlos

A mi Familia

“Debe quedar claro que con todo lo que he

dicho hasta en mi investigación tengo una

deuda enorme con el trabajo de otros, mis

colegas que han aportado muchas de las ideas

que he usado y muchos ejemplos interesantes

de análisis y mis colaboradores, sin cuyo

cerebro, ojos y manos muy poco se habría

hecho”

Dorothy Crowfoot Hodgkin

Premio Nobel de Química - 1964

Agradecimientos

A Dios, por darme la fortaleza que me impulsó a culminar esta investigación. Al profesor Eyder Gomez López, por su orientación, confianza, colaboración y constante

motivación durante la ejecución de la tesis.

Al profesor Jaime Eduardo Muñoz por sus valiosos y acertados consejos en el desarrollo

del trabajo de tesis.

Al comité Evaluador Dra. Liliana Hoyos-Carvajal, Universidad Nacional de Colombia sede

Medellín, Dra. Gloria Mosquera, CIAT y Dra. Marina Sanchez de Prager, Universidad

Nacional de Colombia sede-Palmira por sus valiosos aportes en el desarrollo y

mejoramiento de este documento.

Al grupo de Investigación en protección vegetal para el mejoramiento de la productividad,

por permitirme ser parte de las investigaciones y por su constante colaboración en el

desarrollo de esta tesis.

A Corpoica y en especial a la Doctora Nubia Murcia y al Ingeniero Mauricio Martínez, por

facilitarme las instalaciones del centro de investigación, los laboratorios de biotecnología y

fitopatología.

A la Universidad de Nariño, entidad donde laboro, la cual me concedió una comisión de

estudios para mi formación doctoral.

A la Universidad Nacional a quien debo mi formación de posgrado y el financiamiento de

esta tesis mediante la convocatoria Hermes.

A las personas que estuvieron apoyando esos momentos de logros y angustias generadas

durante el desarrollo de esta tesis, Profesor Carlos Huertas, I. A. Magaly Cobo, I. A. M.Sc.

Diana Rodríguez, I. A. M.Sc. Alejandro Jaramillo, I. A. David Velásquez, Sra. Luz Marina

Acosta.

A todos aquellos que de una u otra forma contribuyeron en el desarrollo y culminación de

esta tesis.

Resumen y Abstract IX

Resumen

El género Fusarium se caracteriza por una amplia diversidad y número de especies que afectan a cultivos de importancia económica, además de producir micotoxinas que perturban la salud de los animales y el hombre. Con el objetivo de reconocer las especies presentes en aislamientos del género Fusarium como también detectar y cuantificar sus toxinas se caracterizaron 206 aislamientos obtenidos de diferentes hospedantes. La caracterización molecular se realizó haciendo uso de PCR con los cebadores ITS1 – ITS4 y TEF-1α. Las secuencias de los productos de PCR se compararon con el National Center for Biotecnology Information (NCBI) y el programa Fusarium ID y se alinearon usando Clustal W2, se construyeron las relaciones filogenéticas con el programa MEGA 6 con el coeficiente de similitud del vecino más cercano y máxima parsimonia con un bootstrap de 1000 réplicas. La detección molecular de las micotoxinas del grupo de los tricotecenos, zearalenona y fumonisinas se realizó por PCR, la cuantificación de las mismas se realizó mediante la prueba de inmunoimpresión ELISA. Los resultados de secuenciación para los marcadores mostraron coincidencias en el 95% de la población evaluada. El concepto filogenético permitió agrupar las 14 especies. Se encontró presencia de micotoxinas en las especies F. graminearum, F. equiseti, F. verticillioides, F. proliferatum y F. oxysporum. Los valores obtenidos desde medio de cultivo muestran alta cantidad de fumonisinas especialmente en cultivos de maíz.

Palabras Clave: Fusarium, micotoxinas, especie filogenética, caracterización morfológica, ELISA, PCR.

X Caracterizacion molecular y morfologica de aislamientos de Fusarium spp. Productores de micotoxinas

Abstract

The genus Fusarium is characterized by a wide variety and number of species that affect economically important crops, and produce mycotoxins that disturb the health of animals and man. In order to recognize the species, present in a population of fungi of the genus Fusarium and their toxins detect and quantify 206 isolates obtained from different hosts were characterized. The molecular characterization was implemented using PCR primers with ITS1 - ITS4 and TEF-1α. The sequences of the PCR products were compared with the National Center for Biotechnology Information (NCBI) and the Fusarium ID program and aligned using Clustal W2, phylogenetic relationships with the MEGA program 6 were constructed with the similarity coefficient of neighbor joining and maximum parsimony bootstrap 1000 replicates. The molecular detection of mycotoxins group of trichothecenes, zearalenone and fumonisin was made by PCR, quantification of these was did by immunoblotting ELISA test. The sequencing results showed matches for markers in 95% of the study population. Phylogenetic concept grouped the 13 species. Mycotoxins were found in F. graminearum species, F. equiseti, F. verticillioides, F. proliferatum, F. napiforme and F. oxysporum. The allowed values for Colombia show a high amount of fumonisin in corn.

Keywords: Fusarium, mycotoxins, phylogenetic species, morphological characterization, ELISA, PCR.

Contenido XI

Contenido

Pág.

1. Capítulo 1 Caracterización mediante técnicas moleculares aislamientos del género Fusarium .......................................................................................................................... 7

Resumen ................................................................................................................ 7 Abstract ................................................................................................................... 8 Introducción ............................................................................................................ 8 Materiales y métodos ............................................................................................ 10

1.4.1 Aislamiento de Hongos .................................................................................... 10 1.4.2 Caracterización Molecular ............................................................................... 11 Resultados y Discusión ......................................................................................... 12

1.5.1 Aislamiento de Hongos .................................................................................... 12 1.5.2 Caracterización molecular ............................................................................... 13 1.5.3 Secuenciación de la región ITS y TEF-1α ........................................................ 14 Conclusiones ........................................................................................................ 38 Bibliografia ............................................................................................................ 39

2. Capitulo 2 Caracterización molecular de aislamientos de Fusarium productores de micotoxinas ................................................................................................................... 53

2.1 Resumen .............................................................................................................. 53 2.2 Abstract ................................................................................................................ 53 2.3 Introducción .......................................................................................................... 54 2.4 Materiales y métodos ............................................................................................ 57

2.4.1 Aislamiento, medio y condiciones de cultivo .................................................... 57 2.4.2 PCR para detección de las micotoxinas .......................................................... 58 2.4.3 Caracterización Morfológica ............................................................................ 59

2.5 Resultados y Discusión ......................................................................................... 60 2.5.1 Análisis Filogenético de especies seleccionadas ............................................. 60 2.5.2 Caracterización molecular ............................................................................... 62 2.5.3 Caracterización morfológica ............................................................................ 67

2.6 Conclusiones ........................................................................................................ 67 2.7 Bibliografía ............................................................................................................ 67

3. Capitulo 3 Detección y Cuantificación de micotoxinas producidas por especies del género Fusarium ........................................................................................................... 79

3.1 Resumen .............................................................................................................. 79 3.2 Abstract ................................................................................................................ 80 3.3 Introducción .......................................................................................................... 80 3.4 Materiales y métodos ............................................................................................ 83

3.4.1 Cuantificación de Micotoxinas ......................................................................... 84 3.5 Resultados y Discusión ......................................................................................... 86

XII Caracterización molecular y morfológica de aislamientos de Fusarium spp. productores de micotoxinas

3.5.1 Deoxinivalenol ................................................................................................. 86 3.5.2 Zearalenona .................................................................................................... 87 3.5.3 Fumonisina ..................................................................................................... 89

3.6 Conclusiones ......................................................................................................... 91 3.7 Bibliografía ............................................................................................................ 91

4. Capitulo 4 Consideraciones Finales ........................................................................ 97 4.1 Bibliografía .......................................................................................................... 101

Contenido XIII

Lista de figuras

Pág.

Figura 1-1: Gel de agarosa al 1.2 % en TBE 0.5X para determinar la presencia de ADN en

los aislamientos evaluados (No. 1-19), (C) Control. ........................................................ 13

Figura 1-2: Gel de agarosa al 1% en TBE 0.5X para determinar la amplificación de la

banda de ITS 560 pb en los aislamientos evaluados MP. Marcador de peso molecular

100pb ADN ladder, Thermo scientific®. .......................................................................... 14

Figura 1-3: Gel de agarosa al 1% en TBE 0.5X para determinar la amplificación de la

banda de TEF-1α a 700 pb en los aislamientos evaluados. MP. Marcador de peso

molecular 100pb ADN ladder, Thermo scientific®. ......................................................... 14

Figura 1-4: Árbol filogenético de las secuencias de Fusarium con el primer ITS1-ITS4

(espacio interno transcrito) usando el coeficiente de similitud del vecino más cercano

neighbor joining (NJ), el árbol se elaboró con un bootstrap de 1000 réplicas. Universidad

Nacional de Colombia-Sede Palmira, Marzo, 2016 ........................................................ 27

Figura 1-5: Árbol filogenético de las secuencias de Fusarium con el primer ITS1-ITS4

(espacio interno transcrito) usando el coeficiente de similitud de Máxima parsimonia, el

árbol se elaboró con un bootstrap de 1000 réplicas. Universidad Nacional de Colombia-

Sede Palmira, Marzo, 2016. ........................................................................................... 29

Figura 1-6: Árbol filogenético de las secuencias de Fusarium con el primer TEF-1α (Factor

de elongación de la traducción) usando el coeficiente de similitud de Neighbor joining NJ,

e árbol se elaboró con un bootstrap de 1000 réplicas. Universidad Nacional de Colombia-

Sede Palmira, Marzo, 2016. ........................................................................................... 31

Figura 1-7: Árbol filogenético de las secuencias de Fusarium con el primer TEF-1Α (Factor

de elongación de la traducción) usando el coeficiente de similitud de Máxima parsimonia,

el árbol se elaboró con un bootstrap de 1000 réplicas. Universidad Nacional de Colombia-

Sede Palmira, Marzo, 2016 ............................................................................................ 33

Figura 1-8: Árbol filogenético de los complejos de especies de F. fujikuroi (A) y F.

oxysporum (B) con el cebador del Factor de elongación de la traducción (TEF-1α) usando

el coeficiente de similitud de Máxima parsimonia, el árbol se elaboró con un bootstrap de

1000 réplicas. Universidad Nacional de Colombia-Sede Palmira, marzo, 2016. ............. 35

Figura 1-9: Árbol filogenético de los complejos de especies de F. solani (A) y F.

graminearum (B) con el cebador del Factor de elongación de la traducción (TEF-1 α)

usando el coeficiente de similitud de Máxima parsimonia, el árbol se elaboró con un

XIV Caracterización molecular y morfológica de aislamientos de Fusarium spp. productores de micotoxinas

bootstrap de 1000 réplicas. Universidad Nacional de Colombia-Sede Palmira, marzo, 2016.

....................................................................................................................................... 35

Figura 2-1: Árbol filogenético de las secuencias de Fusarium con el primer TEF 1α (Factor

de elongación de la traducción), usando el coeficiente de similitud del vecino más cercano.

....................................................................................................................................... 61

Figura 2-2: Amplificación de las especies F. graminearum y F. equiseti en un gel de

agarosa al 1.2% en TBE 0.5 X con el gen TRI5 P: Marcador de peso (GeneRuler 100 pb

DNA ladder Thermo Scientific). ....................................................................................... 62

Figura 2-3: Amplificación de las especies F. graminearum y F. equiseti en un gel de

agarosa al 1.2% en TBE 0.5 X con el gel P: Marcador de peso (GeneRuler 100 pb ADN

ladder Thermo Scientific). ............................................................................................... 63

Figura 2-4: Amplificación del gen FUM de las especies productoras de fumonisinas en un

gel de agarosa al 1.2% en TBE 0.5 X MP: Marcador de peso (GeneRuler 100 pb ADN

ladder Thermo Scientific). ............................................................................................... 64

Figura 3-1: Metodología usada en la cuantificación de micotoxinas de Fusarium con un

lector de micropocillos Neogen. A. Aislamientos. B: Filtración con embudo. C: Controles,

D: Mezcla del conjugado. E. Transferir el conjugado a los micropocillos F. Mezclar el

conjugado con el anticuerpo. G. Reaccion colorimétrica H. Uso del lector ELISA I: Lectura

de la concentración. ........................................................................................................ 85

Contenido XV

Lista de tablas

Pág.

Tabla 1-1: Número y porcentaje de especies del género Fusarium encontradas en 206

aislamientos colectados en 30 cultivos y suelo. .............................................................. 15

Tabla 1-2: Relación de hospedantes, procedencia y especies del género Fusarium

encontradas en los 206 aislamientos caracterizados molecularmente con los marcadores

ITS (espacio interno transcripto) y TEF-1α (Factor de elongación de la traducción) ....... 16

Tabla 1-3: Número de accesión y porcentaje de similitud (según GenBank) de aislamientos

de Fusarium de la colección de pitaya identificados por secuenciación con los marcadores

ITS (espacio interno transcripto) y TEF-1α (Factor de elongación de la traducción). ...... 19


de Fusarium de la colección de maíz Universidad Nacional de Colombia Sede Palmira,

identificados por secuenciación con los marcadores ITS (espacio interno transcripto) y

TEF-1α (Factor de elongación de la traducción). ............................................................ 20


de Fusarium de la colección maíz campo identificados por secuenciación con los

marcadores ITS (espacio interno transcripto) y TEF-1α (Factor de elongación de la

traducción). .................................................................................................................... 21


de Fusarium de la colección Fusarium Universidad Nacional de Colombia Sede Palmira,

identificados por secuenciación con los marcadores ITS (espacio interno transcripto) y

TEF-1α (Factor de elongación de la traducción). ............................................................ 22


de Fusarium de la colección del Plan Frutícola de Universidad Nacional de Colombia Sede

Palmira, identificados por secuenciación con los marcadores ITS (espacio interno

transcripto) y TEF-1α (Factor de elongación de la traducción). ....................................... 23


de Fusarium de la colección de Solanáceas de la Universidad Nacional de Colombia Sede

Palmira, identificados por secuenciación con los marcadores ITS (espacio interno

transcripto) y TEF-1α (Factor de elongación de la traducción). ....................................... 26

Tabla 2-1: Especie, hospedante y procedencia de aislamientos obtenidos por análisis

filogenéticos de la colección de la Universidad Nacional de Colombia—Sede Palmira. .. 57

XVI Caracterización molecular y morfológica de aislamientos de Fusarium spp. productores de micotoxinas

Tabla 2-2: Cebadores usados para detección de micotoxinas en aislamientos de Fusarium.

....................................................................................................................................... 59

Tabla 2-3: Detección de micotoxinas presentes en aislamientos obtenidos por análisis

filogenético de la colección de la Universidad Nacional de Colombia—Sede Palmira ..... 66

Tabla 3-1: Detección de micotoxinas presentes en aislamientos obtenidos por análisis

filogenético de la colección de la Universidad Nacional de Colombia—Sede Palmira ..... 84

Tabla 3-2: Valores de los controles usados en los ensayos de cuantificación de

micotoxinas ..................................................................................................................... 86

Tabla 3-3: Valores de absorbancia y Concentración en ppm de aislamientos productores

de deoxinivalenol. ........................................................................................................... 86

Tabla 3-4: Valores de absorbancia y Concentración en ppm de aislamientos productores

de zearalenona. .............................................................................................................. 88

Tabla 3-5: Valores de absorbancia y concentración en ppm de aislamientos productores

de fumonisinas. ............................................................................................................... 89

Lista de abreviaturas

Abreviaturas Abreviatura Término

ITS Internal transcribed spacer TEF 1α Traslation elongation factor 1- α FUM ZEA TRI PKS F. AF OTA PCR ELISA BLAST NCBI NJ MP kb pb TBE EDTA TE PDA CLA µL PM ONU OEA DON NIV OMS/WHO ng IARC HPLC CG TLC

Gen FUM/Fumonisina Zearalenona Gen TRI Poliquetido sintetasa Fusarium Aflatoxina Ocratoxina Polymerase chain reaction Enzime linked immunoabsorbent assay Basic local alignment search tool National center for biotechnology information Neighbor joining Máxima parsimonia Kilobase Pares de base Tris borato EDTA Ácido etilendiaminotetraacetico Tris EDTA Papa dextrose agar Agar clavel Microlitro Peso molecular Organizacion de Naciones Unidas Organizacion de Estados Americanos Deoxinivalenol Nivalenol Organización mundial de salud nanogramo Agencia internacional para investigaciones en Cáncer High performance liquid chromatography Cromatografía de gases Cromatografía de capa fina

2 Introducción

Introducción

El estudio de los hongos ha sido difícil debido al carácter heterogéneo de este grupo microbial en cuanto a sus aspectos morfológicos, metabólicos, reproductivos y genéticos (Nelson, 1990). También su amplia diversidad y número de especies asociadas a cultivos de importancia económica, hacen creciente el interés en su organización taxonómica y sistemática. Además, esfuerzos y recursos significativos se destinan al estudio de micotoxinas producidas por ellos las cuales generan inconvenientes en salud humana y animal (Desjardins y Proctor, 2007; Fanelli et al., 2013)

Dentro de los hongos fitopatógenos, se destacan las especies que conforman el género Fusarium, tanto por su distribución como por su efecto deletéreo en las plantas hospedantes con las que interactúan; así como por su capacidad ecológica que abarca todo tipo de áreas geográficas (Agrios, 2005; Magan et al., 2010). Su importancia también se debe por ser uno de los principales grupos de hongos productores de micotoxinas, las cuales se han detectado contaminando productos agrícolas desde el proceso productivo hasta su almacenamiento (Leslie y Summerell, 2006; Fanelli et al., 2013).

El género Fusarium tiene una amplia distribución en el mundo y gran importancia desde el punto de vista agrícola y económico. Su ocurrencia es cosmopolita con presencia en el aire, agua y suelo. Dentro de este género existe una gran diversidad formas especiales de razas y se caracterizan por ser patogénicas, saprófitas y biocontroladoras (Nelson et al., 1983; Cook y Barker, 1989; Arbeláez, 2000; Agrios, 2005; Gómez, 2008).

Fusarium es considerado uno de los géneros más importantes del mundo, puesto que sus especies pueden afectar principalmente plantas, pero además humanos y animales domésticos. En plantas, 81 de las 101 especies económicamente más importantes se ven afectadas por síntomas característicos como marchitamiento vascular, necrosamiento en las hojas asociadas a especies de Fusarium; algunas de las cuales también se han registrado como productoras de metabolitos secundarios que pueden causar cáncer y otros efectos en el desarrollo humano y de animales (Leslie y Summerell, 2006; Awad et al., 2013; Sumalan et al., 2013).

En este sentido, varias especies del género Fusarium afectan diversos cultivos especialmente los de mayor consumo e importancia económica siendo el trigo, el maíz y el arroz los productos en los que se ha manifestado altos niveles de micotoxinas del grupo de los tricotecenos (deoxinivalenol y nivalenol), zearalenonas y fumonisinas (Desjardins y Proctor, 2007; Magan et al., 2010; Lattanzio et al., 2012; Menke et al., 2013).

Desde hace más de 200 años intentos por describir y clasificar las especies dentro del género se han realizado, no obstante, aun en la actualidad se presentan inconvenientes para generar una organización sistemática estable; entre otras razones, por las diferencias

Introducción 3

y amplitud de criterios al momento de delimitar una especie, forma especial y raza. Sin embargo, los progresos en las técnicas moleculares han permitido afinar conceptos tradicionales de la sistemática. Los acercamientos y la incorporación a la filogenética de las técnicas de biología molecular, particularmente al análisis de secuencias de ADN, han proporcionado información valiosa que cambió el concepto de especie biológica a especie filogenética (Magan et al., 2010; Menke, 2013)

Estudios de última generación se enfocan a la caracterización molecular de genes involucrados en la biosíntesis de las rutas metabólicas de las diferentes micotoxinas, que han mostrado las principales especies de Fusarium asociadas a estos procesos, entre ellas, las causantes de enfermedades en cereales de importancia económica como el maíz, trigo y centeno. Grupos de investigadores europeos y asiáticos han demostrado que el proceso evolutivo de los genes involucrados en la biosíntesis de micotoxinas ha sido independiente del resto del genoma de los hongos (O’ Donnell et al., 2000; Ward, et al., 2002; Aoki et al., 2012; Menke et al., 2013).

Las micotoxinas producidas por el género Fusarium tienen lugar a partir de un número reducido de precursores, derivados de intermediarios del metabolismo primario del hongo, dando lugar a pequeñas cantidades de toxinas que resultan dañinas para los organismos. Es así, como el estudio de los metabolitos secundarios asociados al hongo, ha permitido descifrar las rutas metabólicas que los producen e identificar y secuenciar los genes responsables de su biosíntesis. Con este conocimiento se han generado también oligonucleótidos que facilitan el estudio de nuevos aislamientos toxigénicos dentro del género, los cuales tienen mayor relevancia puesto que desencadenan intoxicaciones agudas o crónicas para la salud humana y animal (Diaz, 1997; Jestoi, 2005; Desjardins, 2006; Zhang et al., 2013; Chakrabarti, 2013)

De otra parte, los niveles de tolerancia admitidos para algunas micotoxinas han sido motivo de un estudio detallado en países de Europa y Asia. No obstante, la información respecto a la incidencia y niveles de contaminación en América Latina es muy limitada. En Colombia la situación es similar, ya que el desarrollo investigativo en esta área es escaso; por lo tanto, los pocos estudios reportados demuestran una alta incidencia de fumonisina B1 en muestras de maíz de consumo animal y humano (Perilla y Díaz, 1998; Rojas y Wilches, 2011; Rojas et al., 2015).

En la Universidad Nacional de Colombia sede Palmira se han realizado diferentes investigaciones en los últimos años tendientes a la caracterización molecular de aislamientos de Fusarium, procedentes de diferentes regiones geográficas del país, aisladas desde suelos y tejidos vegetales con un interés particular en la identificación de especies con capacidad toxigénica.

El desarrollo de esta tesis doctoral se realizó con el fin de obtener aislamientos del género Fusarium a partir de suelo, maíz y frutas de consumo frecuente en Colombia, realizar la caracterización morfológica, molecular y secuenciación con el objetivo de contribuir en el conocimiento de la diversidad genética existente en el país e identificación de aislamientos con capacidad toxigénica.

4 Introducción

Bibliografía

Agrios, G. 2005. Plant Pathology. University of Florida. Fifth edition.356 p

Aoki, T., Ward. T., Kistler, H., O'Donnell, K. 2012. Systematics, phylogeny and trichothecene mycotoxin potential of fusarium head blight cereal pathogens Mycotoxin vol 62(2) 2012. 91-102p.

Arbelaez, G. 2000. Algunos aspectos de los hongos del género Fusarium y de la especie

Fusarium oxysporum. Agronomía colombiana (17): 11-22.

Awad, W., Ghareeb, K., Bohm, J., Zentek, J. 2013. The toxicological impacts of the Fusarium mycotoxin. Toxins, 912-925.

Chakrabarti, A. 2013. Fusarium oxysporum: A “Moving” View of Pathogenicity. In Genomics of Soil-and Plant-Associated Fungi (pp. 157-189). Springer Berlin Heidelberg.

Cook, J. y Barker, K. 1989. The nature and practice of biological cpntrol of plant pathogens.

St. Paul, Minnesota. The Americam Phytopathological Society. 539 p.

Desjardins, A. 2006. Fusarium micotoxyn: chemistry, genetics and biology. Americam

Phytopathology Society Press, St. Paul. MN. 260p.

Desjardins, A. and Proctor, R. 2007. Molecular biology of Fusarium mycotoxins.

International Journal of Food Microbiology 119:47-50.

Díaz G. and Céspedes, A. 1997. Natural occurrence of zearalenone in feeds and feedstuffs

used in poultry and pig nutrition in Colombia. Mycotoxin Research; 13: 81-8738

Fanelli, F., Iversen, A., Logrieco, A., Mulè G., 2013 Relationship between fumonisin production and FUM gene expression in Fusarium verticillioides under different environmental conditions Food Additives & Contaminants: Part A Vol. 30, Iss. 2, 365-371.

Gómez, E. 2008. Caracterización de cepas toxigénicas del género Fusarium mediante

técnicas de biología molecular. Tesis Doctoral. Universidad Politécnica de Valencia.

226p.

Jestoi, M. 2005. Emerging Fusarium mycotoxins in Finland. Academic dissertation.

National veterinary and food Research Institute (EELA), Departament of chemistry

and department of biochemistry and food chemistry. University of Turkey. p123.

Lattanzio, V., Visconti, A., Haidukowski, M. and Pascale, M. 2012. Identification and characterization of new Fusarium masked mycotoxins, T2 and HT2 glycosyl derivatives, in naturally contaminated wheat and oats by liquid chromatography–high-resolution mass spectrometry. J. Mass Spectrom., 47: 466–475. doi: 10.1002/jms.2980

http://scholar.google.es/citations?user=5FyqzXAAAAAJ&hl=es&oi=sra

http://scholar.google.es/citations?user=93PeNdgAAAAJ&hl=es&oi=sra

http://afrsweb.usda.gov/SP2UserFiles/person/3041/FGSC_review_pdf.pdf


http://www.tandfonline.com/doi/abs/10.1080/19440049.2012.743039



http://www.tandfonline.com/toc/tfac20/30/2

Introducción 5

Leslie, J, Summerell, A., 2006. The Fusarium lab manual. Blackwell Publishing, Ames.

278p.

Magan, N., Aldred, D., Mylona, K. and Lambert, R.J.W. 2010. Limiting mycotoxins in stored

wheat. Food Addit. Contam. A, 27, 644–650.

Menke, J., Weber J., Broz, K, Kistler, H. 2013. Cellular Development Associated with

Induced Mycotoxin Synthesis in the Filamentous Fungus Fusarium graminearum.

PLoS ONE 8(5): e63077.

Nelson, P., Toussoun, T., and Marasas, W. 1983. Fusarium species. An Illustrated Manual for Identification. The Pennsylvania State University Press, University Park. 30.

O’Donnell, K., Kistler, H. C O’Donnell, K., Kistler, H., Tacke, B. Casper HH, 2000. Gene genealogies reveal global phylogeographic structure and reproductive isolation among lineages of Fusarium graminearum, the fungus causing wheat scab. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 97, 7905–10.

Perilla, N., Diaz, G. 1998. Incidence and levels of fumonisins contamination in Colombian

corn and corn products. Mycotoxin Research. 14: 74-82.

Rojas, C., Wilches, F., y Darghan, C. 2015. Co-ocurrence of microorganisms and toxic metabolites in food for children. Revista UDCA Actualidad & Divulgación Científica, 18(1), 3-12.

Rojas, L., y Wilches, A. M. 2011. Coexistencia de aflatoxinas, zearalenona y deoxinivalenol en alimentos de consumo infantil. @ limentech, Ciencia y Tecnología Alimentaria, 10(1).

Sumalan, R. M., Alexa, E., & Poiana, M. A. 2013. Assessment of inhibitory potential of

essential oils on natural mycoflora and Fusarium mycotoxins production in wheat.

Chemistry Central Journal, 7(1), 1-12.

Ward, T., Bielawski, J., Kistler, H., Sullivan, E., O’Donnell, K. 2002. Ancestral polymorphism

and adaptive evolution in the trichothecene mycotoxin gene cluster of

phytopathogenic Fusarium. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA

99, 9278–83.

Zhang, J. Wang, J. Gong, F., Song, B., Li, X., Li, H., Peng, C. y Liao, C. 2013. Natural

occurrence of Fusarium head bligt, micotoxins and micotoxin-producing isolate of

Fusarium in commercial fields of wheat in Hubei. Plant Pathology Vol 62, 1, p 92–

102.

http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/ppa.2012.62.issue-1/issuetoc

Capítulo 1

Caracterización mediante técnicas moleculares aislamientos del género Fusarium

Characterization by molecular techniques isolates of the genus Fusarium

Resumen

El género Fusarium se caracteriza por una amplia diversidad y número de especies que afectan a cultivos de importancia económica. En Colombia no hay información relacionada con la organización taxonómica y filogenética de las especies presentes en los cultivos. Con el objetivo de identificar las especies presentes en aislamientos del género de Fusarium, se caracterizaron 206 aislamientos obtenidos de diferentes hospedantes. La caracterización molecular se realizó haciendo uso de PCR con los cebadores ITS1 – ITS4 y TEF-1α. Las secuencias de los productos de PCR se compararon con el National Center for Biotecnology Information (NCBI) y el programa Fusarium ID y se alinearon usando Clustal W2, se construyeron las relaciones filogenéticas con el programa MEGA 6 con el coeficiente de similitud del vecino más cercano y máxima parsimonia con un bootstrap de 1000 réplicas. Los resultados de secuenciación para los marcadores mostraron coincidencias en el 95% de la población evaluada. El concepto filogenético permitió agrupar las 13 especies en siete clados correspondientes a complejos de especies esto determina que en la colección de aislamientos evaluados se presenta una alta diversidad entre y dentro de las especies.

Palabras clave: filogenia, Fusarium, ITS, TEF-1α, cultivos

8 Caracterización mediante técnicas moleculares aislamientos del género Fusarium

Abstract

The genus Fusarium is characterized by a wide variety and number of species affecting

crops of economic importance. In Colombia there is no information regarding the taxonomic

and phylogenetic organization of the species present in crops. In order to identify the

species present in a population of fungi of the genus Fusarium, 206 isolates obtained from

different hosts they were characterized. The molecular characterization was performed

using PCR primers with ITS1 - ITS4 and TEF-1α. The sequences of the PCR products were

compared with the National Center for Biotechnology Information (NCBI) and the Fusarium

ID program and aligned using Clustal W2, phylogenetic relationships with the MEGA

program 6 were constructed with the similarity coefficient of neighbor joining and maximum

parsimony with 1000 bootstrap replicates. The sequencing results showed matches for

markers in 95% of the study population. Phylogenetic concept grouped the 13 species in

seven species for complex clades this determines that the population evaluated high

diversity between and within species occurs.

Keywords: phylogeny, Fusarium, ITS, TEF-1α, crops.

Introducción

El género Fusarium tiene una amplia distribución en el mundo y gran importancia desde el punto de vista agrícola y económico es cosmopolita con presencia en el aire, agua y suelo. Dentro de este género existe una gran diversidad de razas o formas especiales que se caracterizan por ser patogénicas, saprófitas y biocontroladoras (Nelson et al., 1983; Cook y Barker, 1989; Arbeláez, 2000; Agrios 2005).

Sin embargo, el estudio de este género ha presentado dificultades debido al carácter heterogéneo en cuanto a sus aspectos morfológicos, metabólicos, reproductivos y genéticos (Nelson, 1990). También su amplia diversidad y número de especies asociadas a cultivos de importancia económica, hacen creciente el interés en su organización taxonómica y sistemática. Además, esfuerzos y recursos significativos se destinan al estudio de micotoxinas producidas por ellos las cuales generan problemas en salud humana y animal (Desjardins y Proctor, 2007; Astoreca et al., 2012; Fanelli et al., 2013).

En los procesos de clasificación taxonómica de éste género en particular, se presenta controversia entre los trabajos publicados, puesto que los expertos han utilizado diferentes criterios de ubicación sistemática en cada caso; así, se han establecido un número determinado de especies que van desde nueve (Snyder y Hansen) hasta 78 (Gerlach); u otras cifras, Gordon, 26 especies; Booth, 44 especies y Leslie y Summerell 70 (Nelson, 1990; Leslie y Summerell, 2006).

Investigadores de Europa, Asia y América establecen estrategias de comunicación con el fin de determinar y definir criterios de clasificación sólidos, que conduzcan a esclarecer la compleja taxonomía de Fusarium de manera permanente. Es así como (Geiser et al., 2013; Aoki et al., 2014; O´Donnell et al., 2015) entre otros, basados en la sistemática molecular y morfológica proponen una nueva forma universal para nombrar tanto las especies de anamorfos y teleomorfos con el único nombre de Fusarium, donde la mayoría de sus especies se encuentran repartidas en cuatro complejos entendidos estos como 1(complejo

Capítulo 1 9

de especies de F. fujikuroi, F. graminearum, F. oxysporum y F. solani). Esta propuesta sistemática está siendo aceptada y adoptada por la mayoría de investigadores de este género.

La caracterización morfológica de patógenos de plantas es el primer y más difícil paso en los procesos de identificación, especialmente en las especies del género Fusarium. Aunque la mayoría de observaciones morfológicas no son suficientes para completar la compatibilidad, se hace indispensable unir herramientas biológicas y moleculares que aporten significativamente en la identificación de las especies (Leslie y Summerell, 2006).

Se han registrado desde hace más de 200 años intentos por describir y clasificar las especies, no obstante, en la actualidad se presentan inconvenientes para generar una organización sistemática estable; entre otras razones, por las diferencias y amplitud de criterios al momento de delimitar una especie, forma especial y raza (Leslie y Summerell, 2006; Fanelli et al., 2013).

Los progresos en las técnicas moleculares han permitido afinar conceptos tradicionales de la sistemática. Los acercamientos y la incorporación a la filogenética de las técnicas de biología molecular, particularmente al análisis de secuencias de ADN, han proporcionado información valiosa que cambió el concepto de especie biológica a especie filogenética (Magan et al., 2010; Menke, 2013); tal es el caso de algunas especies como las del complejo de F. fujikuroi que no permiten una identificación por criterios morfológicos, pero se pueden identificar mediante el análisis de secuencias de ADN, basados en producto de PCR (Rahjoo et al., 2008; Aoki, et al., 2014).

En los últimos años, uno de los cebadores más empleados en la identificación molecular de hongos del género Fusarium es el factor de elongación de la traducción 1α (TEF-1α), que muestra un alto nivel de polimorfismo entre especies estrechamente relacionadas, cuando se comparan con genes que codifican proteínas como la calmodulina, β tubulina y la histona H3. Estos fueron inicialmente desarrollados en los hongos para investigar linajes dentro del complejo Fusarium oxysporum (O’Donnell et al., 1998, Aoki et al., 2014).

Otro de los cebadores más ampliamente usado a nivel mundial es la región ITS (Internal transcribed spacer) del ADNr se amplifica con los cebadores universales descritos por White et al. (1990) ITS1- ITS4 y Tri 13 (F. graminearum) descrito por (Wang et al., 2008). Las secuencias ITS son el blanco ideal para el desarrollo de cebadores específicos debido a su alto número de copias, porque evolucionaron relativamente rápido y son altamente variables en longitud y secuencia entre especies estrechamente relacionadas, permitiendo la diferenciación de especies o cepas dentro de una misma especie (Esteve-Zarzoso et al., 1999; Entz et al., 2005). Estas regiones son ahora quizás las regiones del ADN fúngico más ampliamente secuenciadas. Sin embargo, a nivel intraespecífico, la variabilidad de estas secuencias es generalmente muy baja o no es detectada (Lee y Taylor, 1992, Magan et al., 2010; Menke et al., 2013).

Geiser et al. (2004) desarrollaron una base de datos (Fusarium-ID v. 1.0) que puede ser empleada en la clasificación de especies de Fusarium mediante la amplificación y secuenciación del gen TEF-1α, esta base de datos actualmente consta de 78 especies, 1905 aislamientos y 5747 secuencias que representan una colección filogenéticamente diversa de secuencias del género Fusarium. Se puede acceder a través del sitio web http://fusarium.cbio.psu.edu.) (O’Donnell et al., 1998; O’Donnell et al., 2000; Geiser et al., 2001; Ward et al., 2002; Daren et al., 2013; Chakrabarti., 2013; Madamia et al, 2013).


Con base en lo anterior, se planteó el presente trabajo con el objetivo de caracterizar por técnicas moleculares una población de aislamientos del género Fusarium procedente de diversos cultivos de Colombia.

Materiales y métodos

El trabajo se desarrolló en el laboratorio de Diagnóstico Vegetal de la Universidad Nacional de Colombia, sede Palmira, y en los laboratorios de fitopatología y biotecnología del Centro de Investigación C.I. Corpoica Palmira. Esta investigación hace parte de los proyectos del Grupo de investigación en Protección Vegetal para el Mejoramiento de la Productividad de la Universidad Nacional de Colombia.

1.4.1 Aislamiento de Hongos

Se contó con una colección de trabajo perteneciente al grupo de Investigación Protección de cultivos para el mejoramiento de la productividad de la Universidad Nacional de Colombia sede Palmira. Esta se amplió con aislamientos provenientes de cultivos de maíz y frutales del Valle del Cauca. Un total de 206 aislamientos se evaluaron en este estudio (Anexo A) los cuales se colectaron en treinta (30) cultivos de setenta y tres (73) localidades de Colombia.

Aislamiento a partir de suelo

De muestras de suelo procedentes de diferentes localidades donde se presentó la enfermedad, se pesaron 10 g de suelo por muestra, se agregaron 90 mL de agua destilada estéril; logrando la primera disolución de 10-1, de esta solución se transfirió 1 mL a un tubo de ensayo con 9 mL de agua destilada y así sucesivamente hasta 10-4,con esto se logró encontrar colonias separadas que fueron sembradas posteriormente en cajas de Petri con medio PDA, este fue acidificado con HCL y se agregó una mezcla de rifampicina con una concentración 300 mg/L (Llanos y Sánchez, 1982; Sañudo et al., 2003).

Aislamiento de hongos y purificación a partir de tejido

Con el material vegetal colectado, se realizó un lavado con agua corriente, tomando trozos de tejidos sintomáticos, de tamaño 5mm x 5mm y posteriormente fueron sometidos a un lavado con agua destilada durante 2 minutos, para desinfestar con una solución de hipoclorito de sodio al 3% durante 15 a 30 segundos, y posterior enjuague en agua destilada durante un minuto (Agrios, 2005).

Estas muestras de tejido se sembraron en cajas Petri con medio de cultivo PDA en concentración 39g por litro de agua, acidificado con ácido clorhídrico 1 % y enmendado con rifampicina de 300 mg/L, incubándose a temperatura ambiente hasta el desarrollo de colonias fungosas en PDA (Castella et al., 1997).

Para el aislamiento a partir de granos de maíz, estos se llevaron a una suspensión de hipoclorito de sodio al 1% durante un minuto, alcohol al 70% y después se lavaron dos veces con agua estéril durante un minuto. Tras la desinfección, se depositaron 5 granos por caja en la superficie de diez cajas Petri con medio de cultivo PDA (Gómez, 2008).

Capítulo 1 11

Los aislamientos, se incubaron a 28°C de 7 a 10 días hasta cubrir el área de la caja Petri, verificando el desarrollo de un cultivo puro. Para la obtención de cultivos monospóricos, se siguió la metodología descrita por Nelson (1986). Los aislamientos se identificaron mediante un microscopio de luz por características morfológicas y criterios taxonómicos propios del género Barnett, (1960), Nelson et al. (1983); Alexoupolus et al.1996; Samson et al. 2004 y Leslie y Summerell (2006).

1.4.2 Caracterización Molecular

Extracción de ADN de aislamientos de Fusarium

La extracción se realizó siguiendo el protocolo de Wilson (1987) con modificaciones de Gómez (2008). Los aislamientos de Fusarium se desarrollaron en medio de PDA y se cosecharon a los ocho días, pesando 100 mg por cada aislamiento, el micelio fue depositado en tubo de 1.7mL punzando con la punta de un asa bacteriológica hasta que el micelio se deshizo completamente. Luego se añadió 750 µL de una solución tampón Tris-HCl 100mM pH 7.2; EDTA 100mM y dodecil sulfato sódico (SDS) a l 10% se agitó y se mantuvo en frio. Inmediatamente se agregaron 3 µL de una solución de proteinasa K (20mg/mL), se agitó e incubó a 37°C por una hora. Se adicionaron 100µL de NaCl 5M, posteriormente, se agregaron 80µL de una solución CTAB/NaCl (CTAB al 10% en NaCl 0.7 M) se agitó en vortex y se incubó a 65°C durante 10 min. Luego se agregó 600 µL de cloroformo/alcohol isoamílico (24:1), se agitó y centrifugó a 12000 rpm durante 10min. El sobrenadante se transfirió a un tubo nuevo al que se incorporó 600µL de fenol/cloroformo/alcohol isoamílico (25:24:1) agitándolo después, se centrifugó a12000 rpm durante 5 min. El sobrenadante se transfirió a otro tubo al cual se le añadieron 600 µL de isopropanol para precipitar el ADN; el cual se mantuvo por espacio de una hora en nevera de -20°C se agitó por inversión y se centrifugó a 12000 rpm durante 10 min. Se eliminó el isopropanol y se añadieron 500 µL de etanol frío al 70%; se agitó y se centrifugó nuevamente durante 5 min, el etanol se eliminó y las muestras se secaron al vacío. Finalmente, el ADN se resuspendió en 30 µL de una solución tampón TE (Tris 10mM, EDTA 1mM, pH 8) dejando el ADN extraído a -20°C.

Amplificación por PCR del gen EF-1α

Se amplificó la región del gen TEF-1α Ef1α y Ef2α con los cebadores 5´ATGGGTAAGGAGGACAAGAC-3) y 5´-GGAGGTACCAGTGCATCATGTT-3 (O’Donnell et al. 1998).

La reacción de PCR se realizó en un volumen final de 50 µl, se adicionaron 25µLde Green Master mix (Thermo scientific®), 1 µL de cada primer (10µM), se agregaron 2µL de ADN (20ng) y se completó con el agua libre de nucleasas que contiene el kit. El programa de PCR comprendió una desnaturalización inicial a 95 °C por 2 min, seguido de 35 ciclos de desnaturalización a 95 °C por 30 segundos, hibridación a 57°C por 30 segundos, extensión de 72°C por 1 min y una extensión final de 72 °C por 10 min. Las amplificaciones se llevaron a cabo en un termociclador Agilent Technologies Sure cycler 8800 de 96 pozos (USA). La lectura de los productos de PCR se visualizó en una cámara de electroforesis horizontal en un gel de agarosa al 1. 2% revelando con Sybr safe®, se dispuso un buffer TBE al 0.5X con un marcador de peso molecular de 100pb (Thermo scientific gene ruler 100pb®). Para


su visualización se usó un fotodocumentador (Enduro GDS Labnet, USA), se observó la presencia de fragmentos entre 600 y 700 pb.

Amplificación por PCR de la región ITS

La región ITS del ADNr se amplificó con los cebadores universales descritos por White et al. (1990) ITS1 (5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-‘3) e ITS4 (5’TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’). La reacción de PCR se realizó en un volumen final de 50 µl, se adicionaron 25µLde Green Master mix (Thermo scientific®), 1.5 µL de cada primer con una concentración de 10µM, 2µL de ADN (20ng) y se completó con el agua libre de nucleasas que contiene el kit. La amplificación se realizó en un termociclador (Agilent Technologies, Sure cycler 8800, de 96 pozos programable, USA). Se siguieron los ciclos de temperatura así, 95°C por un minuto, para desnaturalizar las muestras. 35 ciclos de desnaturalización a 95°C por 30 segundos. 55°C por 1 minuto para alineamiento. Extensión de 72°C por 45 segundos. Finalmente, una extensión final a 72°C por 5 min. Para la lectura se usó una cámara de electroforesis con un marcador de peso molecular de 100 pb (Thermo scientific Gene Ruler®) en un gel de agarosa al 1.2% con TBE al 0.5X con Sybr safe®, agregando 4µL de producto de PCR. Posteriormente, se observó la presencia de fragmentos de 560 pb, en un fotodocumentador (Enduro GDS Labnet, USA).

Los productos de PCR se secuenciaron mediante el método de Sanger en MACROGEN, Corea. La identidad a nivel de especie se determinó mediante el programa BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) del NCBI (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) y el programa Fusarium ID Versión 1 (Geisser et al., 2004).

Análisis filogenético

Las secuencias fueron alineadas con el programa ClustalW. Los análisis filogenéticos se realizaron con el coeficiente de similitud de Neighbor joining (NJ) y Máxima parsimonia (MP) con un bootstrap de 1000 réplicas, usando el programa MEGA 6 (Tamura et al., 2013).

Resultados y Discusión

1.5.1 Aislamiento de Hongos

En total se obtuvieron 206 aislamientos del género Fusarium procedentes de 71 localidades correspondientes a seis colecciones: pitaya (17), maíz Universidad Nacional (24), maíz campo (41), Fusarium Universidad Nacional (26), Colección Fusarium frutales (80) y pimentón-ají (16). Cada colección de trabajo se procesó por separado, dependiendo de la procedencia tanto de material vegetal como de suelo. Los aislamientos que no produjeron crecimiento micelial ni algún tipo de estructura en medio de PDA se descartaron de este estudio.

Capítulo 1 13

1.5.2 Caracterización molecular

La metodología de extracción se modificó en el paso de precipitación del ADN en isopropanol dejándolo toda la noche a una temperatura de -20°C. Además, el paso final de resuspensión del pellet se cambió de TE por agua miliq, esto mejoró la calidad del producto de PCR para su posterior secuenciación. El ADN obtenido se cuantificó en un nanodrop (colibrí, USA) con valores que fluctuaban de 260 a 300 ng/µL lo cual permitió confirmar que la metodología de extracción empleada era la adecuada. (Figura 1-1).

Figura 1-1: Gel de agarosa al 1.2 % en TBE 0.5X para determinar la presencia de ADN en los aislamientos de Fusarium evaluados (No. 1-19), (C) Control.

Los ensayos de PCR con los marcadores ITS y TEF-1α confirmaron la presencia de

aislamientos del género Fusarium en los aislamientos evaluados. Cada cebador amplificó

en la banda esperada. En la región ITS los cebadores ITS1-ITS4 amplificaron a 560pb y

para TEF-1α se produjo un fragmento de 700 pb. (Figura 1-2 y 1-3). La región ITS usada

para la amplificación y detección de hongos como Fusarium (O’ Donnell, 1992) es

ampliamente usada debido a que los genes ribosomales (ADNr) poseen características

convenientes para detectar un amplio rango de patógenos a nivel de especies. Estos ADNr

son estables y presentan regiones altamente conservadas dentro del genoma del hongo

(Hibbett, 1992). En cambio, TEF-1α posee un alto nivel del polimorfismo y genera una

sola copia que permite encontrar información de gran utilidad filogenética a nivel de

especie (O´Donnell, 1998).


Figura 0-2: Gel de agarosa al 1% en TBE 0.5X para determinar la amplificación de la banda de ITS 560 pb en los aislamientos evaluados MP. Marcador de peso molecular 100pb ADN ladder, Thermo scientific®.

Figura 0-3: Gel de agarosa al 1% en TBE 0.5X para determinar la amplificación de la banda de TEF-1α a 700 pb en los aislamientos evaluados. MP. Marcador de peso molecular 50pb ADN ladder, Thermo scientific®.

1.5.3 Secuenciación de la región ITS y TEF-1α

Los resultados de secuenciación para estas regiones indican que se encontraron 13

especies de Fusarium repartidas en los diferentes 30 cultivos evaluados (Tabla 1-1). La

especie que más prevaleció fue F. oxysporum, seguida de F. verticillioides, F. incarnatum–

equiseti y F. solani. Especies como, F. guttiforme, F. camptoceras, F. coeruleum, F.

chlamydosporum, F. fujikuroi, F. decemcellulare, aún no han sido registradas en Colombia

para esos hospedantes (ICA, 2014).

Capítulo 1 15

Tabla 0-1: Número y porcentaje de especies del género Fusarium encontradas en 206 aislamientos colectados en 30 cultivos y suelo.

Especie N° % Cultivo

F. oxysporum 74 34.9

Aguacate (Persea americana), ají (Capsicum annuum), arveja (Pisum sativum) banano (Musa paradisiaca), chontaduro (Bractis gasipaes) , guama (Inga feuilleei), guanábana (Annona muricata), guayaba (Psidium sativum), heliconia, laurel de cera (Morella pubescens), lulo (Solanum quitoense), maíz (Zea mays), mango (Mangifera indica) , maracuyá (Passiflora edulis), melón (Cucumis melo), mora (Rubus glaucus), papaya (Carica papaya),pimentón (Capsicum annuun), piña (Ananas comusus), piñuela (Bromelia karatas), pitaya (Selenicereus megalanthus), rosa (Rosa bracteata), tomate de árbol (Solanum betaceum), tomate (Solanum lycopersicum), uva (Vitis vinífera) y suelo.

F. coeruleum 1 0.48 Maíz (Zea mays)

F. proliferatum 11 5.33

Chontaduro (Bractis gasipaes), maíz (Zea mays), maracuyá (Passiflora edulis), mora (Rubus glaucus), uva (Vitis vinífera).

F. camptoceras 2 0.97 Maíz (Zea mayz).

F. chlamydosporum 3 1.45 Aguacate (Persea americana), lulo (Solanum quitoense).

F. decemcellulare 3 1.45 Aguacate (Persea americana), maíz (Zea mays), mango (Mangifera indica).

F. fujikuroi 3 1.45 Maíz (Zea mays), mango (Mangifera indica) pitaya (Selenicereus megalanthus).

F. graminearum 5 2.43 Aguacate (Persea americana), maíz (Zea mays).

F. guttiforme 1 0.48 Maíz (Zea mays)

F. incarnatum-equiseti 31 15.04

Aguacate (Persea americana), Fresa (Fragaria sp.), lulo (Solanum quitoense), maíz (Zea mays), mango (Mangifera indica), maracuyá (Passiflora edulis), melón (Cucumis melo), mora (Rubus glaucus), piña (Anannas cumusus), uva (Vitis vinífera).

F. sacchari 3 1.45 Pitaya

F. solani 21 10.19

Lulo (Solanum quitoense), mora (Rubus glaucus), maracuyá (Passiflora edulis), Aguacate (Persea americana), ají (Capsicum annuum), cacao (Theobroma cacao), cítricos, guanábana (Annona muricata), maíz (Zea mays), papaya (Carica papaya), suelo.

F. verticillioides 48 23.3

Aguacate (Persea americana), algodón (Gossypium sp), maíz (Zea mays), maracuyá (Passiflora edulis), mora (Rubus glaucus), pimentón (Capsicum annuum), uva (Vitis vinífera).

TOTAL 206 100


En la tabla 1-2, se observa la relación de los cultivos evaluados y las especies del género

Fusarium. Para Colombia, según el estatus fitosanitario del ICA (2014), se registran 9

especies. F. oxysporum se presenta en Musa paradisiaca, Phaseolus vulgaris, Dianthus

caryophyllus, Pisum sativum, Psidium guajava, Lycopersicon sculetum, Passiflora ligularis,

Passiflora edulis, Chrysanthemun sp, Glycine max, Gossypium hirsutum, Cucumis sativus,

Brsassica oleracea, Allium sativum, Solanum tuberosum, Physalis peruviana, Citrus

latifolia, Citrus aurantifolia, Rosa spp, Solanum quitoense y Cucumis melo (Buritica, 1999;

Castaño, 1978; Mosquera et al., 2001; Pardo-Cardona, 1995; Arango, 1982; Guerero y

Angulo, 1990; Woo et al., 1996; Alzate, 1999; Guerra, et al., 2011; Gomez et al., 2003;

Escobar y Lee,2009; Hernandez et al.,2011; Valcaárcel, 1995; Orjuela, 1965; Borda y

Arbelaez, 1993; Angulo et al., 2005; Delgadilo et al., 2003; Ortíz et al., 2010 y Pinto et al.,

2012)

La especie F. fujikuroi se registra en Elaeis guineensis; F. verticillioides en Zea mayz,

Ananas comosus, Saccarum officinarum y Musa paradisiaca. F. graminearum, en Zea

mayz y Triticum aestivum, F. equiseti en Phaseolus vulgaris y Beta vulgaris, F.

aquaeductuum, en Annona cherimol, F. avenaceum, en Lens sculentum, F. roseum en

Dianthus caryophyllus, F. circinatum en Pinus sp. (Aldana et al., 2010; Varón de Agudelo

y Sarria, 2007; Castaño, 1999; Sañudo, 1993; Buriticá, 1999; Gómez, 1988; Arbeláez,

1987). Según Bosland (1988) tanto angiospermas como gimnospermas son afectadas por

diferentes especies del género Fusarium. Solo para el caso de F. oxysporum se registra

su patogenicidad en más de 100 especies cultivadas (Leslie y Sammuerell, 2006). Así

mismo, la diversidad de especies de este género ha permitido encontrar en un solo cultivo

síntomas relacionados y una alta incidencia de plantas afectadas, tal es el caso del cultivo

de maíz donde se registran hasta 21 especies atacando raíz, tallo y mazorca de la planta

(Logiereco et al., 2002).

En el mundo, el cultivo de maíz es uno de los que más se ve afectado por diferentes

especies del género Fusarium, siendo las especies F. verticillioides y F. graminearum,

estas causan una reducción considerable en las cosechas. En países productores, los

daños causados por estos hongos pueden alterar la calidad y la cantidad de las cosechas.

La presencia de micotoxinas producidas por estas especies alteran la calidad de los

alimentos derivados de la cadena alimentaria especialmente de la leche y la carne (De

Rossi et al., 2016).

Capítulo 1 17

Tabla 0-2: Relación de hospedantes, procedencia y especies del género Fusarium

encontradas en los 206 aislamientos caracterizados molecularmente con los marcadores

ITS (espacio interno transcripto) y TEF-1α (Factor de elongación de la traducción)

HOSPEDANTE

N° DE AISLAMIENTOS ESPECIE

PROCEDENCIA

REFERENCIA

Aguacate

15

F. oxysporum (2) F. chlamydosporum (1)* F. decemcellulare (1) F. graminearum (1) F. incarnatum-equiseti (2) F. solani (7) F. verticillioides (1)

El Cairo, Yotoco Versalles Argelia Sevilla Argelia (2) Argelia (4), Cali, Palmira, Caicedonia El Cerrito

Kasson et al., 2013; McDonald, et al., 1992 Pegg et al., 1985 Darvas y Kotze, 1987

Ají

15 F. oxysporum (14) F. solani (1)

Darién (5), Palmira (5), Yumbo (3), Yotoco Guacari

Ma et al., 2001; Yu et al., 2011

Algodón

1 F. verticillioides (1)

Palmira

Marupov et al., 2013

Arveja

1

F. oxysporum (1)

Pasto

Erazo et al.,2014; Chittem et al., 2015 Guerra et al., 2012

Banano

1 F. oxysporum (1)

Sevilla

García et al., 2015

Cacao 1 F. solani (1)

Palmira

Nwaogu et al., 2015; Steindorff et al.,2012

Chontaduro 2

F. oxysporum (1) F. proliferatum (1)*

Buenaventura Buenaventura

Peña, 2000

Cítricos

1 F. solani (1)

Jamundí

Herrera y Grande, 1995

Fresa

1 F. incarnatum-equiseti (1)*

Ginebra

Guama

1 F. oxysporum (1)*

Cali

Guanábana

1 F. solani (1)*

La Paila

Guayaba

1 F. oxysporum (1)

La Unión

Molina et al., 2002, Zacaria, 2012

Heliconia

1 F. oxysporum (1)*

Pereira

Laurel

1 F. oxysporum (1)

Pasto

Lulo

8

F. oxysporum (1) F. chlamydosporum (2) F. incarnatum-equiseti (3)* F. solani (2*)

Sibundoy Tuluá (2) Cali, Restrepo (2) Guacari, Restrepo

Rojas, et al., 2010; Betancourth et al., 2007

Maíz

66

F. oxysporum (6)

F. coeruleum (1) F. proliferatum (3) F. camptoceras (2)* F. decemcellulare (1) F. fujikuroi (1) F. graminearum (4) F. guttiforme (1) F. incarnatum-equiseti (3) F. napiforme (1) F. solani (2) F. verticillioides (42)

Bochalema, Fundación, Guayata, San Francisco Palmira Bolívar, Palmira, Riofrío Campo de la Cruz, Tierraalta Tierraalta Choachi Carmen del Viboral, Las Piedras, Palmira, Versalles Tierraalta Belén de los Andaquies, Patía, Rio Sucio Palmira Riohacha, Rozo Bolívar (4), Candelaria (4), Cerrito (4), La Palma, Fundación, Guacari (3), Palmira (10), Patía (2), Ocaña, Riofrío (2), Rozo (3), San Agustín, Sibundoy, Versalles (3), Zambrano

Reynoso et al., 2013; Hirata et al., 2001; Pamphile y Azevedo, 2002; Proctor et al., 2009; Fandohan et al., 2004; Nelson et al., 1993; Kvas et al., 2009

Mango

4

F. oxysporum (1) F. decemcellulare (1) F. fujikuroi (1) F. incarnatum-equiseti (1)

Obando La Unión La Unión La Unión

Marasas et al., 2006; Rojas y Rondon 1995; Lima et al., 2009;


Maracuyá

20

F. oxysporum (5) F. proliferatum (4) F. incarnatum-equiseti (9)

F. solani (1) F. verticillioides (1)

La Unión (3), Roldanillo (2) La Unión, Palmira, Bolívar (2) Roldanillo, Trujillo (2), Andalucía, Jamundí, Toro, Bolívar (2), Obando Bolívar Roldanillo

Barbosa y Meza 2009; Londoño, 2012; Sallet, 1994

Melón

3 F. incarnatum-equiseti (3)

La Unión, Roldanillo (2)

Marziano, et al., 1993

Mora

11

F. oxysporum (4) F. proliferatum (2) F. incarnatum-equiseti (2) F. solani (2)* F. verticillioides (1)*

Ginebra (2), Tenerife, Tuluá Ginebra (2) El Águila, Tuluá Cali, Tuluá Ginebra

Petrovic et al., 2013; Gordon et al., 2015

Papaya

3

F. oxysporum (1) F. solani (2)

La Unión Zarzal

Zacaria,2012

Pimentón

5

F. oxysporum (3) F. verticillioides (2)

Bolívar (2), Yumbo Darién, Yumbo

Oelke y Bosland, 2001; Miller, et al., 1996, Sherfy Mac Nab, 1986

Piña 4

F. oxysporum (2) F. incarnatum-equiseti (2)*

Dagua (2) Santander de Quilichao, Restrepo

Jimenez y Granados, 2014

Piñuela 2 F. oxysporum (1)*

Mercaderes

Pitaya

20

F. oxysporum (16)

F. fujikuroi (1)* F. sacchari (3)*

El Dobio, Fusagasugá (4), Belén de Umbría (2), Palmira (6), La Unión (2), Berbeo Berbeo Fusagasugá (3)

Varón, 2006.

Rosa

1 F. oxysporum (1)

Bogotá

Ghosh y Shamsi, 2014

Suelo

4

F. oxysporum (3) F. solani (1)

Boyacá, Bravo, Riohacha Miraflores

Tomate de árbol

1 F. oxysporum (1)

Samaniego

INIAP, 2004

Tomate 1

F. oxysporum (1)

Palmira

Michielse et al., 2012; Bravo et al.,2013

Uva

10

F. oxysporum (3) F. proliferatum (1)

F. incarnatum-equiseti (5)* F. verticillioides (1)

Ginebra (3) Ginebra

Ginebra (5) Roldanillo

Granett et al., 2015 Wang et al., 2015

Mikusova et al., 2013

*No ha sido registrada o no existen registros.

La Tabla 1-2 muestra la distribución de los aislamientos en las zonas de colección,

indicando que la presencia de las diferentes especies está condicionada a un hospedante

susceptible y a condiciones ambientales que faciliten la supervivencia y diseminación del

hongo.

Los resultados de secuenciación para la colección de aislamientos procedentes de pitaya muestran que los porcentajes de similitud para ITS y TEF-1α variaron desde 83 hasta 99% (Tabla 1-3). Para TEF-1α se presentó un aislamiento (No.4) con características conferidas a la especie de F. cf oxysporum, sin embargo, su secuencia tuvo un porcentaje de similitud bajo (83%) con respecto a los demás aislamientos evaluados. En la tabla 1-3, se presenta para cada aislamiento el número de accesión y los porcentajes de similitud para la región ITS y para TEF-1α. De un total de 17 aislamientos caracterizados en pitaya, 13 de las especies corresponde a F. oxysporum, seguidas de F. sacchari (3) y F. fujikuroi (1).

Capítulo 1 19

Tabla 0-3: Número de accesión y porcentaje de similitud (según GenBank) de aislamientos de Fusarium de la colección de pitaya identificados por secuenciación con los marcadores ITS (espacio interno transcripto) y TEF-1α (Factor de elongación de la traducción).

No. TEF-1α ACCESION % ITS ACCESION %

1 F. oxysporum JF740724.1 99 F. oxysporum KF998987.1 99


3 F. oxysporum JF740724.1 99 F. oxysporum JN020659.1 99

4 F. cf oxysporum HM852047.1 83 F. oxysporum JX853767.1 99


6 F. oxysporum JF740724.1 99 F. oxysporum JQ701799.1 99

7 F. sacchari JF740709.1 99 F. sacchari KJ000438.1 96



10 F. oxysporum JF740724.1 99 F. oxysporum f.sp. cumini HQ443247.1 99


12 F. oxysporum JF740724.1 99 F. oxysporum f.sp. cumini KF718260.1 99

13 F. fujikuroi HF679028.1 99 F. fujikuroi HQ443247.1 99





Los resultados de secuenciación para la colección de aislamientos de Fusarium procedentes de la colección de maíz de la Universidad Nacional muestran que los porcentajes de similitud para ITS y TEF-1α variaron desde 86 hasta 99% (Tabla 1-4). De un total de 24 aislamientos, se encontraron nueve especies correspondientes a F. verticillioides (7), F. oxysporum (6), F. graminearum (3), %) F. incarnatum-equiseti (2), F. camptoceras (2), F. decemcellulare (1), F. fujikuroi (1) F. guttiforme (1) y F. solani (1). Las especies F. verticillioides y F. oxysporum fueron los más frecuentes. En la tabla 1-4, se presenta para cada aislamiento el número de accesión y los porcentajes de similitud para la región ITS y para TEF-1α.


Tabla 0-4: Número de accesión y porcentaje de similitud (según GenBank) de aislamientos de Fusarium de la colección de maíz Universidad Nacional de Colombia Sede Palmira, identificados por secuenciación con los marcadores ITS (espacio interno transcripto) y TEF-1α (Factor de elongación de la traducción).

No TEF-1α ACCESION % ITS ACCESION %

18 F. verticillioides JQ026466.1 99 F. verticillioides FN179337.1 99

19 F. verticillioides KC599244.1 99 F. verticillioides KJ464994.1 99

20 F. verticillioides JX268996.1 99 F. verticillioides KJ464994.1 99

21 F. verticillioides FN179345.1 99 F. verticillioides KJ655442.1 86


23 F. incarnatum-equiseti KM886212.1 99 F. incarnatum KT192274.1 98

24 F. solani JF740784.1 99 F. solani KM519192.1 99


26 F. oxysporum KC599244.1 99 F. oxysporum JN020659.1 94

27 F. camptoceras AB820722.1 99 F. camptoceras AB820722.1 99

28 F. oxysporum AF246873.1 96 F. oxysporum KF941285.1 99

29 F. graminearum JF740836.1 99 F. graminearum JF740836.1 99

30 F. oxysporum KF728241.1 98 F. oxysporum JN020659.1 93

31 F. incarnatum KF993974.1 93 F. incarnatum KP133058.1 99

32 F. graminearum KJ767648.1 99 F. graminearum KP689197.1 99

33 F. graminearum KP265455.1 99 F. graminearum KF998990.1 99

34 F. guttiforme KC514066.1 98 F. guttiforme KC464629.1 99

35 F. decemcellulare KM875661.1 99 F. decemcellulare KJ648614.1 99

36 F. camptoceras AB820706.1 99 F. camptoceras AB820722.1 99


38 F. verticillioides KF562131.1 99 F. verticillioides KJ655442.1 99


40 F. verticillioides JX456579.1 99 F. verticillioides JQ363719.1 96

41 F. fujikuroi KF999809.1 99 F. fujikuroi KF999809.1 99

Los resultados de secuenciación para la colección de campo para aislamientos procedentes los municipios del Valle del Cauca y Cauca, muestran que los porcentajes de similitud para ITS y TEF-1α variaron desde 86 hasta 100% (Tabla 1-5). De un total de 42 aislamientos, se encontraron seis especies correspondientes a F. verticillioides (35), F. proliferatum (3), F. graminearum (1), F. equiseti (1), F. oxysporum (1) y F. solani (1). La especie F. verticillioides fue la más predominante en esta colección. En la tabla 1-5, se presenta para cada aislamiento el número de accesión y los porcentajes de similitud para la región ITS y para TEF-1α.

Capítulo 1 21

Tabla 0-5: Número de accesión y porcentaje de similitud (según GenBank) de aislamientos de Fusarium de la colección maíz campo identificados por secuenciación con los marcadores ITS (espacio interno transcripto) y TEF-1α (Factor de elongación de la traducción).



43 F. verticillioides KJ540092.1 97 F. verticillioides KC215112.1 99


45 F. verticillioides KJ464994.1 79 F. verticillioides KF494134.1 100

46 F. oxysporum DQ164859.1 86 F. oxysporum KJ605159.1 95

47 F. verticillioides KC599244.1 99 F. verticillioides KT587649.1 99

48 F. verticillioides KJ79339.1 99 F. verticillioides KJ605159.1 99

49 F. proliferatum JX456580.1 99 F. proliferatum KF494135.1 99

50 F. verticillioides KC599244.1 99 F. verticillioides KT587649.1 99


52 F. verticillioides KJ767648.1 99 F. verticillioides JQ003920,1 99

53 F. equiseti KJ464994.1 99 F. equiseti KM886212.1 99

54 F. verticillioides KJ464994.1 99 F. verticillioides JN672602.1 99

55 F. verticillioides KJ599244.1 99 F. verticillioides HQ637284.1 99

56 F. solani KF939495.1 99 F. solani KC215123.1 99

57 F. verticillioides KF993999.1 99 F. verticillioides KT587649.1 99


59 F. verticillioides KJ464994.1 99 F. verticillioides KT587649.1 99


61 F. proliferatum FN252396.1 99 F. proliferatum KF494134.1 100




65 F. verticillioides KC599244.1 100 F. verticillioides HQ449996.1 95

66 F. verticillioides KJ464994.1 99 F. verticillioides KT587649.1 99

67 F. graminearum KJ767648.1 96 F. graminearum KF999890.1 100


69 F. verticillioides KC599244.1 99 F. verticillioides HQ637284.1 99

70 F. verticillioides JQ026466.1 99 F. verticillioides HQ637284.1 94

71 F. verticillioides KC964129.1 99 F. verticillioides KF494134.1 99



74 F. verticillioides JX456581.1 98 F. verticillioides KP307911.1 99





78 F. verticillioides FN179339.1 99 F. verticillioides KT587649.1 99

79 F. proliferatum KJ020897.1 99 F. proliferatum KP407870.1 99




83 F. verticillioides KJ464994.1 99 F. vericillioides KJ598858.1 99

Los resultados de secuenciación para la colección de campo para aislamientos

procedentes de 30 cultivos y suelo de varias localidades de Colombia, muestran que los

porcentajes de similitud para ITS y TEF-1α variaron desde 87 hasta 100%. (Tabla 1-6). De

un total de 27 aislamientos evaluados se encontraron cuatro especies correspondientes a:

F. oxysporum (18) en F. verticillioides (4) en F. proliferatum (2), y F. solani (1), F. cf solani

(1) En la tabla 1-6 se presenta, para cada aislamiento el número de accesión y los

porcentajes de similitud para la región ITS y para TEF-1α.

Tabla 0-6: Número de accesión y porcentaje de similitud (según GenBank) de aislamientos de Fusarium de la colección Fusarium Universidad Nacional de Colombia Sede Palmira, identificados por secuenciación con los marcadores ITS (espacio interno transcripto) y TEF-1α (Factor de elongación de la traducción).


84 F. oxysporum DQ837692 99 F. oxysporum KR094464.1 99

85 F. oxysporum DQ465933.1 99 F. oxysporum KC215112.1 99

86 F. oxysporum DQ837692 99 F. oxysporum KP638345.1 99

87 F. verticillioides KP732012.1 99 F. verticillioides KJ544799.1 97

88 F. verticillioides FN179345.1 99 F. verticillioides KC215120.1 99

89 F. oxysporum. AB674271.1 99 F. oxysporum GQ121294.1 99

90 F. oxysporum KF574861.1 99 F. oxysporum JF807396.1 98

91 F. oxysporum KF728241.1 93 F. oxysporum KF941285.1 99

92 F. oxysporum KF562122.1 99 F. oxysporum JX435197.1 99

93 F. cf solani AB817215.1 99 F. solani JF740784.1 99


95 F. solani HQ731052 99 F. cf solani JX270171.1 98


97 F. proliferatum KF562130.1 99 F. proliferatum GQ924895.1 99


99 F. oxysporum GQ848539.1 99 F. oxysporum GU250612.1 87

100 F. proliferatum KM893095.1 99 F. proliferatum KM592959.1 100

101 F. oxysporum EU246586.1 99 F. oxysporum GQ121285.1 99

102 F. oxysporum DQ435355.1 99 F. oxysporum KF264963.1 99

103 F. oxysporum KC622305.1 99 F. oxysporum KF998987.1 96

104 F. oxysporum JQ965461.1 99 F. oxysporum KF914476.1 99

105 F. oxysporum KF728241.1 99 F. oxysporum GQ121294.1 91

106 F. oxysporum JF740824.1 99 F. oxysporum JF807397.1 89

Capítulo 1 23

107 F. oxysporum FJ939699.1 99 F. oxysporum GQ121285.1 95

108 F. oxysporum DQ435355.1 98 F. oxysporum GQ121297.1 99

109 F. oxysporum JF740824.1 99 F. oxysporum JX853767.1 95

110 F. oxysporum KC622305.1 99 F. oxysporum KF998987.1 100

Los resultados de secuenciación para la colección de campo de muestras colectadas en

20 especies de plantas procedentes de los municipios del Valle del Cauca, indican que los

porcentajes de similitud para ITS y TEF-1α variaron desde 86 hasta 100% (Tabla 1-7). En

total se evaluaron 80 aislamientos donde se encontraron once especies correspondientes

a: F. chlamydosporium (3) en aguacate y lulo, F. decemcellulare (2) en aguacate y mango,

F. fujikuroi (1) en mango, F. graminearum (1) en aguacate, F. incarnatum-equiseti (26) en

aguacate, fresa, lulo, mango, maracuyá, melón, mora, piña y uva. F. oxysporum (19) en

aguacate, banano, chontaduro, guama, guayaba, lulo, mango, maracuyá, mora, papaya,

piña y uva. F. proliferatum (4), en chontaduro, maracuyá, mora y uva. F. solani (17) en

aguacate, cacao, cítricos, guanábana, lulo, maracuyá, mora y papaya. F. verticillioides (3)

en aguacate, maracuyá y mora. F.cf solani (1) en maracuyá y F. cf incarnatum (1) en

guanábana. En la tabla 1-7 se presenta, para cada aislamiento el número de accesión y

los porcentajes de similitud para la región ITS y para TEF-1α. La mayor predominancia se

encontró en la especie F. incarnatum-equiseti, seguida de F. oxysporum y F. solani.

Tabla 0-7: Número de accesión y porcentaje de similitud (según GenBank) de aislamientos de Fusarium de la colección del Plan Frutícola de Universidad Nacional de Colombia Sede Palmira, identificados por secuenciación con los marcadores ITS (espacio interno transcripto) y TEF-1α (Factor de elongación de la traducción).


111 F. oxysporum JX465111.1 99 F. oxysporum JN903939.1 99

112 F. solani HE647936.1 99 F. solani H6798753.1 99

113 F. equiseti KM886212.1 98 F. equiseti KC311517.1 99

114 F. solani HE647936.1 99 F. solani KF494125.1 89

115 F. chlamydosporum KM655867.1 96 F. chlamydosporum KC778405.1 99

116 F. chlamydosporum KM655867.1 95 F. chlamydosporum EU556725.1 99

117 F. oxysporum DQ435355.1 96 F. oxysporum GQ121297.1 99

118 F. oxysporum KC196120.1 97 F. oxysporum JX853767.1 95

119 F. incarnatum KT211600.1 96 F. incarnatum KJ677250.1 99

120 F. chlamydosporium KM655867.1 99 F. chlamydosporum KC758963.1 99

121 F. incarnatum JX269001.1 99 F. incarnatum KT587650.1 99

122 F. equiseti KM886212.1 99 F. equiseti KT587650.1 99

123 F. incarnatum- equiseti KM886212.1 99 F. incarnatum-equiseti KT192274.1 97

124 F. oxysporum JF740824.1 99 F. oxysporum JF807396.1 99

125 F. graminearum JF740836.1 99 F. graminearum KF022238.1 99

126 F. solani JF794783.1 88 F. solani HG798753.1 99

127 F. solani KJ528278.1 98 F. solani KJ125744.1 99


128 F. equiseti KM886212.1 99 F. equiseti KP267176.1 96

129 F. oxysporum FJ939699.1 99 F. oxysporum GU371875.1 99

130 F cf. incarnatum HM852055.1 99 F. incarnatum KM519192.1 99

131 F. proliferatum KT211613.1 99 F. proliferatum GQ167230.1 99

132 F. verticillioides KC599244.1 99 F. verticillioides KP267179.1 92

133 F. fujikuroi KP009958.1 95 F. fujikuroi JQ363726.1 98

134 F. proliferatum KF562130.1 99 F. proliferatum EU821467.1 99

135 F. proliferatum KM675672.1 98 F. proliferatum KJ020897.1 97

136 F. incarnatum-equiseti KM886212.1 98 F. incarnatum-equiseti KP264959.1 100

137 F. oxysporum DQ465933.1 99 F. oxysporum KF941285.1 99

138 F. oxysporum JQ965436.1 99 F. oxysporum KF998987.1 100

139 F. cf solani AB817213.1 99 F. solani KJ125744.1 99

140 F. incarnatum LN901581.1 99 F. incarnatum KP133058.1 99

141 F. equiseti KT277004.1 97 F. equiseti KJ526173.1 100

142 F. solani KM096385.1 99 F. solani HQ833835.1 99

143 F. solani KM096385.1 99 F. solani EU912432.1 98

144 F. verticillioides KP732012.1 99 F. verticillioides KP267179.1 92

145 F. equiseti KT277004.1 97 F. equiseti KJ371094.1 98

146 F. solani JF740784.1 99 F. solani KT388106.1 99

147 F. oxysporum KF562122.1 99 F. oxysporum KP050556.1 99

148 F. oxysporum KC874727.1 96 F. oxysporum HQ647333.1 96

149 F. oxysporum KF624780.1 97 F. oxysporum GQ121293.1 98

150 F. incarnatum- equiseti KF993974,1 93 F. incarnatum- equiseti KP264959.1 100

151 F. proliferatum KM675672.1 98 F. proliferatum JQ363737.1 99

152 F. proliferatum KM675672.1 98 F. proliferatum KC254042.1 98

153 F. oxysporum FJ985314.1 99 F. oxysporum HQ647333.1 99

154 F. incarnatum JX268996.1 86 F. incarnatum KP133058.1 99

155 F. oxysporum GQ121285.1 95 F. oxysporum JN020659.1 99

156 F. incarnatum JF740780.1 99 F. incarnatum KT587650.1 99

157 F. incarnatum JF740780.1 99 F. incarnatum KT192274.1 99

158 F. solani HE647924.1 99 F. solani KT388106.1 99

159 F. decemcellulare KC491872.1 98 F. decemcellulare GU797410.2 98

160 F. solani HE647924.1 99 F. solani KJ584550.1 99

161 F. incarnatum JF715935.1 99 F. incarnatum EU910588.1 99

162 F. oxysporum KF562122.1 99 F. oxysporum JF807396.1 100

163 F. solani JF740784.1 99 F. solani KT388106.1 99

164 F. solani KJ528278.1 98 F. solani KR997532.1 99

165 F. incarnatum JX268996.1 99 F. incarnatum KM519192.1 99




Capítulo 1 25

169 F. solani JN167185.1 96 F. solani KT581406.1 97

170 F. decemcellulare KC491872.1 94 F. decemcellulare KM893858.1 93

171 F. incarnatum JX268996.1 99 F. incarnatum HQ995668.1 99

172 F. incarnatum JX268996.1 97 F. incarnatum KJ412506.1 99


174 F. oxysporum FJ664919.1 97 F. oxysporum FJ158124.1 98

175 F. solani KM096385.1 97 F. solani HQ022461.1 98

176 F. solani DQ247232.1 91 F. solani KF999012.1 97

177 F. oxysporum KF575346.1 98 F. oxysporum KR856356.1 98

178 F. solani KT211624.1 98 F. solani JN190943.1 99

179 F. incarnatum JX268996.1 95 f. incarnatum KT277307.1 98

180 F. proliferatum KM675672.1 98 F. proliferatum KP407870.1 91

181 F. incarnatum LN901580.1 92 F. incarnatum EU595566.1 98


183 F. incarnatum KT211600.1 94 F. incarnatum KT366737.1 99

184 F. verticillioides KC599244.1 97 F. verticillioides JX406505.1 98

185 F. oxysporum JX465109.1 99 F. oxysporum KC870055.1 75

186 F. oxysporum KU170704.1 98 F. oxysporum KM203588.1 99

187 F. oxysporum JX465111.1 97 F. oxysporum JN222394.1 97

188 F. solani KM065871.1 98 F. solani KJ729475.1 98

189 F. oxysporum AB916979.1 98 F. oxysporum JN222394.1 97

190 F. solani LC102196.1 96 F. solani HQ384397.1 97

Los resultados de secuenciación para la colección de campo de las muestras colectadas

de los municipios productores de pimentón y ají del Valle del Cauca, manifiestan que los

porcentajes de similitud para ITS y TEF-1α variaron desde 95 hasta 99% (Tabla 1-8). Se

encontró una especie que corresponde al 100% de la población de F. oxysporum, y en

algunos aislamientos se llegó a forma especial (F. oxysporum f. sp. lycopersici). En la tabla

1-8, se presenta para cada aislamiento el número de accesión y los porcentajes de similitud

para la región ITS y para TEF-1α.


Tabla 0-8: Número de accesión y porcentaje de similitud (según GenBank) de aislamientos de Fusarium de la colección de Solanáceas de la Universidad Nacional de Colombia Sede Palmira, identificados por secuenciación con los marcadores ITS (espacio interno transcripto) y TEF-1α (Factor de elongación de la traducción).



192 F. oxysporum AF246873.1 99 F. oxysporum HM179533.1 99


194 F. oxysporum KF562122.1 99 F. oxysporum KP132221.1 99

195 F. oxysporum KF575347.1 99 F. oxysporum KM817209.1 99

196 F. oxysporum DQ452430 99 F. oxysporum JN020659.1 95

197 F. oxysporum f. sp. lycopersici JQ965436.1 99 F. oxysporum KJ584544.1 99

198 F. oxysporum KF562122.1 99 F. oxysporum f. sp lycopersici KF914468.1 99

199 F. oxysporum AF246873.1 99 F. oxysporum KC478640.1 99



202 F. oxysporum AF246873.1 99 F. oxysporum f. sp lycopersici KF914468.1 99

203 F. oxysporum AF246873.1 99 F. oxysporum KC202939.1 99

204 F. oxysporum KF562122.1 99 F. oxysporum KC311554.1 99

205 F. oxysporum AB898823.1 99 F. oxysporum KP132221.1 99

206 F. oxysporum AF246873.1 99 F. oxysporum f. sp lycopersici KF914468.1 99

1.4.3 Análisis Filogenético

Se incluyeron todas la muestras para el análisis filogenético para la región ITS con el

coeficiente de similitud Neighbor joining (NJ) (Figura 1-4), muestra que el cálculo de las

distancias se desarrolla por medio de modelos de evolución molecular donde los mínimos

valores encontrados corresponden a una mínima evolución, tal como se observa en la

primera parte del árbol consenso donde se encuentran las mínimas distancias entre las

especies, mientras que con los individuos que están al final del árbol se encuentra una alta

diversidad y divergencia entre las secuencias de aislamientos evaluados.

Capítulo 1 27

Figura 0-4: Árbol filogenético de las secuencias de Fusarium con el primer ITS1-ITS4 (espacio interno transcrito) usando el coeficiente de similitud del vecino más cercano neighbor joining (NJ), el árbol se elaboró con un bootstrap de 1000 réplicas. Universidad Nacional de Colombia-Sede Palmira, Marzo, 2016

148 F

. oxysporu

m18

5 F

. oxysp

oru

m

73

2.

F.o

xysp

oru

m

38

18

9 F

. oxysp

oru

m

19

14

7 F

. oxysp

oru

m153 F

. oxysporu

m

34

10

81. F

. vert

icill

ioid

es

18

58. F

. vert

icill

ioid

es

16

7. F

.sacchari

2

109. F

. oxysporu

m

Acre

moniu

m d

ichro

mosporu

m

29

110. F

.oxysporu

m

108. F

.oxysporu

m133 F

. fu

jikuro

i

10

27

11

0

102. F

. oxys

poru

m0

1. F

.oxy

sporu

m

53.F

. equis

eti

0

03. F.o

xysp

oru

m

203. F. oxy

sporu

m

0

04. F.o

xysp

oru

m

44. F. ve

rtic

illio

ides

0

05.

F.o

xysp

orum

23. F

. inc

arna

tum

0

0

6. F

. oxy

spor

um

31. F

. inc

arna

tum

0

0

8. F

.oxy

spor

um

41. F

. fuj

ikur

oi

0

0

9. F

.sac

char

i

162

F. oxy

spor

um

0

0

10. F

.oxy

spor

um fs

cum

ini

103. F. o

xysp

orum

00

11. F.o

xysp

orum

180 F. p

rolife

ratu

m

00

12. F.o

xysp

orum

fs cu

mini

195. F. o

xysp

orum

00

13. F. fu

jikuro

i

187 F. oxysporum

00

14. F. o

xysporum

20. F. v

erticillio

ides

00

15. F.oxysporum

72 F. verticillio

ides

00

16. F.oxysporum

149 F. oxysporum

00

17. F. sacchari

78. F. verticillioides

00


202. F. oxysporum

00


125 F. graminearum

00 21. F. verticillioides


0

022. F. oxysporum

105. F. oxysporum

0

0


29. F. graminearum 176 F. solani

2

178 F. solani190 F. solani2

160 F. solani170 F. decemcellulare

2

188 F. solani

0

142 F. solani144 F. verticillioides

2112 F. solani158 F. solani

195. F. solani

131 F. proliferatum

2159 F. decemcellulare

164 F. solani2

0

56.F. solani

127 F. solani

2 114 F. solani

152 F. proliferatum

2

024. F. solani

126 F. solani

2

132 F. verticillioides

175 F. solani

2

035. F. decem

cellulare

146 F. solani

2 163 F. solani

169 F. solani

20

0

0

0

0

0

0

0

54

0

0

25 F. oxysporum

197. F. oxysporum

0

0


26. F. oxysporum

177 F. oxysporum

00

0

27. F. cam

ptoceras


0

0

28. F

. oxysporum

79. F

. pro

lifera

tum

0

0

30 F

. oxysp

oru

m

138 F

. oxysp

oru

m

0

0

32. F

. gra

min

earu

m

68. F

. verticillio

ides

0

0

33. F

. gra

min

earu

m

154 F

. incarn

atu

m

0

0

34. F

. guttifo

rme

161 F

. incarn

atu

m

0

0

36. F

. cam

pto

cera

s

62. F

. vertic

illioid

es

00

37. F

. oxysporu

m98. F

. vertic

illiodes

00

38. F

. vertic

illioid

es

83. F

. vertic

illioid

es

00

61 F

. pro

lifera

tum

39

. F. v

ertic

illioid

es

93

. F. s

ola

ni

0 0

0

40

. F. v

ertic

illioid

es

18

4 F

. ve

rticillio

ide

s

0

0

42

. F

. na

piform

e

80

. F

. ve

rtic

illio

ide

s

0

00

45

. F

. ve

rtic

illio

ide

s

123 F

. equis

eti

0

0

46. F

. coeru

leum

120 F

. chla

mydosporu

m 0

0

48. F

. vert

icill

ioid

es

91. F

. oxysporu

m 0

0

49 F

. pro

lifera

tum

51. f. v

ert

icill

ioid

es

0

0

50. F

. vert

icill

ioid

es

174 F

. oxysporu

m

0

0

54. F

. vert

icill

ioid

es

85. F

. ve

rtic

illio

ides

0

0

57 F

. ve

rtic

illio

ides

143 F

. so

lani

0

0

59. F. ve

rtic

iolli

oid

es

205. F. oxy

sporu

m

0

0

60 F

. ve

rtic

illio

ides

86. F

. oxy

spor

um

0

0

63. F

. ver

ticillio

ides

134

F. p

rolif

erat

um

191.

F. o

xysp

orum

0 0

0

64. F

. ver

ticillio

ides

206.

F. o

xysp

orum

0

0

65. F

. ver

ticillio

ides

84. F

. oxy

spor

um

0

0

66. F

. ver

ticilli

oide

s

137

F. oxy

spor

um

0

0

67. F. g

ram

inearu

m

73. F. v

erticil

lioid

es

0

0

151 F. p

rolife

ratu

m

69. F. v

erticil

lioides

140 F. in

carnatum

00

0

70. F. v

erticillio

ides

92. F. o

xysporum

0

0

71. F.vertic

illioides

204. F. o

xysporum

0

0

74. F. vertic

illioides

75 F. verticillio

ides

0

0

76. F. verticillio

ides

171 F. incarnatum0

0


182 F. incarnatum-equiseti

0

0

88.F. verticillioides

111 F. oxysporum

0

89. F. oxysporum97. F. proliferatum

0

90. F. oxysporum141 F. equiseti

0

94.F. oxysporum100. F. proliferatum

0

96. F. verticillioides122 F. equiseti

0

104. F. oxysporum

118 F. oxysporum

0


186 F. oxysporum

0

107. F. oxysporum

172 F. incarnatum

0

113 F. equiseti

167 F. incarnatum

0

115 F. chlamydosporum

135 F. proliferatum

0


201. F. oxysporum

0

117 F. oxysporum

139 F. solani

0

119 F. incarnatum

128 F. equseti

0

121 F. incarnatum

200. F. oxysporum

0

124 F. oxysporum

150 F. incarnatum

0

129 F. oxysporum


0

130 F. incarnatum

145 F. equiseti

0


183 F. incarnatum

0

155 F. oxysporum

165 F. incarnatum

0

156 F. incarnatum

157 F. incarnatum

0166 F

. incarnatum

193. F. oxysporum

0168 F

. incarnatum

198. F

. oxysp

oru

m

0

173 F

. inca

rnatu

m-e

quise

ti

196. F

. oxysp

oru

m

0

179 F

. inca

rnatu

m

194. F

. oxysp

oru

m

0

192. F

. oxysp

oru

m

199. F

. oxysp

oru

m

00

00

00

00

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0000 0

99. F

. oxysporu

m87. F

. vertic

illioid

es


El árbol consenso de Máxima parsimonia (Figura 1-5), muestra un agrupamiento de las

secuencias similares por clados correspondientes a las diferentes especies. Se observa al

interior de las especies diferencias marcadas. La alta variabilidad observada en los

aislamientos evaluados para Máxima parsimonia, (>50%) refleja los cambios que están

sucediendo en la población especialmente para la especie F. oxysporum F. verticillioides.

F. incarnatum y F. solani. Las agrupaciones de las especies permiten detectar complejos

de especies altamente diferenciados, formándose los complejos de especies de F.

graminearum CSFG (F. graminearum, F. coeruleum); Complejo de especies de F.

oxysporum CSFO (F. oxysporum); Complejo de especies de F. solani CSFS (F. solani);

Complejo de especies de F. fujikuroi CSFF (F. fujikuroi, F. sacchari, F. proliferatum,

pertenecientes al subclado Asiático; F. verticillioides, perteneciente al subclado Africano, y

F. guttiforme perteneciente al subclado Americano). Además, se agruparon los Complejos

de especies de F. chlamydosporum; Complejo de especies de F. incarnatum-equiseti y

Complejo de especies de F. decemcellulare (Geiser et al., 2013; Aoki et al., 2014).

El coeficiente de similitud del vecino más cercano, (NJ) y Máxima parsimonia (MP), indican

en cada caso la alta diversidad intra especies que se encuentran en los hospedantes

colectados, siendo la población de la especie F. oxysporum la más predominante y a su

vez, la que presentó mayor diversidad de especies; llegando en algunos casos a

clasificarlas hasta formas especiales (F. oxysporum fs. lycopersici). Se considera que la

fuente de variabilidad para esta especie que no presenta reproducción sexual o estado

teleomorfo, estaría asociada con mutaciones, este fenómeno le facilita al hongo la

transferencia genética vía anastomosis de hifas y a su vez la presencia de elementos

transposones; lo cual permite que con la reproducción asexual se establezcan linajes

clónales dentro de la población (Jacobson y Gordon, 1991; Klister, 1997). Los elementos

transposones actúan como generadores de la diversidad debido a que su actividad

produce mutaciones espontáneas y por consiguiente variabilidad en el genoma (McDonald,

1993; Daboussi y Langin, 1994).

Se cree que el elemento transposon Fot1 es el causante de esa diversidad (Edel et al.,

2001). Otros autores consideran que esta condición no está dada por la presencia de

elementos transposones sino que el hongo porta un genoma haploide que exhibe un alto

grado de variación en cariotipo y puede albergar duplicaciones segmentarias (Boehm et

al., 1994; Ma et al., 2010.). La transferencia cromosómica horizontal dentro de las especies

parece haber contribuido potencialmente a la generación de variantes y en particular a

generar los nuevos patógenos (Ma et al., 2010).

Capítulo 1 29

Figura 0-5: Árbol filogenético de las secuencias de Fusarium con el primer ITS1-ITS4 (espacio interno transcrito) usando el coeficiente de similitud de Máxima parsimonia, el árbol se elaboró con un bootstrap de 1000 réplicas. Universidad Nacional de Colombia-Sede Palmira, Marzo, 2016.

5.

F.o

xysporu

m

20

5.

F.

oxysp

oru

m

7

20

2.

F.

oxysp

oru

m

7

19

9.

F. oxysp

oru

m

7

19

6. F

. oxysp

oru

m

7

193. F

. oxysporu

m

7

187 F

. oxysporu

m

7

184 F

. vert

icill

ioid

es

7

181 F

. in

carn

atu

m-e

quis

eti

7

172 F

. in

carn

atu

m

7

166 F

. in

carn

atu

m

7

157 F

. in

carn

atu

m

7

154 F

. in

carn

atu

m

7

151 F

. pro

lifera

tum

7

145 F

. equis

eti

7

139 F

. sola

ni

7

136 F

. in

carn

atu

m-e

quis

eti

7

130 F

. in

carn

atu

m7

124 F

. oxy

sporu

m7

121 F

. in

carn

atu

m

7

118 F

. oxy

sporu

m

7

115 F

. ch

lam

ydosp

oru

m

7

106.

F. v

ertic

illio

ides

710

3. F

. oxy

spor

um

710

0. F

. pro

lifer

atum

797

. F. p

rolif

erat

um

794

.F. o

xysp

orum

7

91. F

. oxy

spor

um

7

88.F

. ver

ticilli

oide

s

7

85. F

. ver

ticilli

oide

s

7

82. F

. ver

ticilli

oide

s

7

79. F. p

rolife

ratu

m

7

76. F. v

erticil

lioid

es

7

73. F. v

erticil

lioides

7

70. F. v

erticilli

oides

7

67. F. g

raminearu

m

7

64. F. v

erticillio

ides

7

61 F. prolife

ratum

7

58. F. v

erticillio

ides

7

55. F. vertic

illioides

7

52. F. vertic

illioides

7

49 F. proliferatum

7

46. F. coeruleum

7


7


7

37. F. oxysporum

7

34. F. guttiforme

731. F. incarnatum

728. F. oxysporum

7 25 F. oxysporum

7 22. F. oxysporum

7 19. F. verticillioides7

16. F.oxysporum7

13. F. fujikuroi7

10. F.oxysporum fs cumini7

7. F.sacchari

7

4. F.oxysporum

7

1. F.oxysporum

7

204. F. oxysporum

7

201. F. oxysporum

7

198. F. oxysporum

7

195. F. oxysporum

7

192. F. oxysporum

7

186 F. oxysporum

7

183 F. incarnatum

7

180 F. proliferatum

7

177 F. oxysporum

7

174 F. oxysporum

7

171 F. incarnatum

7

168 F. incarnatum

7

165 F. incarnatum

7

162 F. oxysporum

7

156 F. incarnatum

7

150 F. incarnatum

7

141 F. equiseti

7

138 F. oxysporum

7

135 F. proliferatum

7

129 F. oxysporum

7

123 F. equiseti

7


7

117 F. oxysporum

7

111 F. oxysporum

7

105. F. oxysporum

7

102. F. oxysporum

7

99. F. oxysporum

7


7

93. F. solani

7

90. F. oxysporum

7

87. F

. verticillio

ides

7

84. F

. oxysp

oru

m

7

78. F

. verticillio

ides

7

75 F

. verticillio

ides

7

72 F

. verticillio

ides

7

69. F

. verticillio

ides

7

66. F

. vertic

illioid

es

7

63. F

. vertic

illioid

es

7

60 F

. vertic

illioid

es

7

57 F

. vertic

illioid

es

7

54. F

. vertic

illioid

es

7

51. f. v

ertic

illioid

es

7

48. F

. vertic

illioid

es

7

45. F

. vertic

illioid

es

7

42. F

. napifo

rme

7

39. F

. vertic

illioid

es

7

36. F

. cam

pto

cera

s

7

33

. F. g

ram

ine

aru

m

7

30

F. o

xysp

oru

m

7

27

. F. c

am

pto

cera

s

7

21

. F. v

ertic

illioid

es

7

18. F

. vertic

illioid

es

7

15

. F

.oxysp

oru

m

7

12

. F

.oxysp

oru

m fs c

um

ini

7

9.

F.s

acch

ari

7

6. F

. oxysp

oru

m

7

3. F

.oxysporu

m

7

206. F

. oxysporu

m

7

203. F

. oxysporu

m

7

200. F

. oxysporu

m

7

197. F

. oxysporu

m

7

194. F

. oxysporu

m

7

191. F

. oxysporu

m

7

182 F

. in

carn

atu

m-e

quis

eti

7

179 F

. in

carn

atu

m

7

173 F

. in

carn

atu

m-e

quis

eti

7

167 F

. in

carn

atu

m

7

161 F

. in

carn

atu

m

7

155 F

. oxy

sporu

m

7

149 F

. oxy

sporu

m

7

143 F

. so

lani

7

140 F

. in

carn

atu

m

7

137 F

. oxy

sporu

m

7

134

F. p

rolif

erat

um

7

128

F. e

quse

ti

7

125

F. g

ram

inea

rum

7

122

F. e

quis

eti

7

119

F. in

carn

atum

7

116

F. chlam

ydos

poru

m

7

113

F. equ

iset

i

7

109.

F. o

xysp

orum

Acrem

oniu

m d

ichr

omos

poru

m

53

189 F. o

xysp

orum

108. F.o

xysp

orum

110. F.o

xysp

orum

133 F. f

ujikuro

i161313

24

7

107. F. o

xysporu

m

7

104. F. o

xysporum

7

101. F. o

xysporum

7

98. F. v

erticillio

des

7

92. F. o

xysporum

7

89. F. oxysporum

7

86. F. oxysporum

7

83. F. verticillio

ides

7


7


7


7

71. F.verticillioides

7


7

65. F. verticillioides7


59. F. verticiollioides 753.F. equiseti 750. F. verticillioides 747. F. verticillioides


7

41. F. fujikuroi

7


7

32. F. graminearum

7

35. F. decemcellulare56.F. solani

95. F. solani

131 F. proliferatum

146 F. solani

152 F. proliferatum

158 F. solani

164 F. solani


176 F. solani

188 F. solani

24. F. solani

114 F. solani

126 F. solani




112 F. solani

127 F. solani

142 F. solani

160 F. solani

163 F. solani

169 F. solani

175 F. solani

178 F. solani

29. F. graminearum

190 F. solani

9

77

77

77

77

77

77777777777771059

7

23. F. incarnatum


17. F. sacchari

14. F

. oxysp

oru

m

11. F

.oxysp

oru

m

8. F

.oxysp

oru

m

148 F

. oxysp

oru

m

185 F

. oxysp

oru

m

91

2. F

.oxysp

oru

m

33

81. F

. vertic

illioid

es

147 F

. oxysporu

m

153 F

. oxysporu

m

4613207

777

77

26. F

. oxysporu

m


La región ITS es sin duda la más usada a nivel mundial para determinar diferencias inter e

intra específicas. El NCBI (2016) registra alrededor de 444.000 secuencias de nucleótidos

de las cuales 285.000 corresponden a hospedantes de plantas. Encontrándose cerca de

5248 artículos publicados hasta la fecha. Sin embargo, el número de estos en los últimos

cinco años se ha reducido debido a la introducción de nuevos primers que ofrecen mayor

especificidad en los genes de interés. Lo que se corrobora con estudios realizados por

Balagee et al., (2009) quienes afirman que en algunos casos ITS ADNr los datos de las

secuencias no se resuelve a nivel de especie; por lo tanto, no se debe utilizar cuando se

trabaja con una especie desconocida. El árbol conceso correspondiente a TEF-1α para el

coeficiente del vecino más cercano NJ muestra las amplias distancias generadas en las

especies especialmente cuando se pasa de una especie a otra.

Se observa al interior de la población de F. oxysporum, F. verticillioides y F. solani

reflejando solo el grado de similaridad entre sus terminales. De ahí que se observa grupos

aislados debido a su alto nivel de semejanza. Sin embargo, este método no toma en cuenta

la relación ancestro descendiente y no refleja relaciones evolutivas por lo tanto no puede

considerarse que formen clados ni grupos monofileticos (Figura 1-6). El uso de la región

del gen TEF-1α es específica para Fusarium el cual es altamente informativo a nivel de

especie, ya que su secuencia tiene un alto polimorfismo en el genoma (O’ Donnell, 1998).

El gen EF-1α muestra una estructura primaria altamente conservada entre procariotas y

eucariotas, agrupando una parte esencial de la maquinaria de traducción de proteínas, a

su vez codifica la proteína G la cual entrega el aminoacil-tRNA al sitio A del ribosoma, que

se forma en el proceso de traducción proteica (Mateyak y Kinzy, 2010; Eltschinger et al.,

2012). El gen EF-1α se basa en que cerca del 6% de los nucleótidos que lo conforman son

considerados cladísticamente significativos (39/656 nucleótidos), además el 95 % de estos

nucleótidos se encuentran en regiones exónicas, en donde se han detectado procesos de

transición de bases, lo que genera un 50% de información extra altamente confiable que

otros genes utilizados para Fusarium (mtSSU, β-tubulina, Calmodulina) (Geiser et al.,

2004). Por lo tanto, las pocas restricciones evolutivas obtenidas de los patrones de

mutación como delecciones de bases y la presencia de una única copia en el genoma

sitúan en ventaja a este cebador (O’Donnell et al., 1998; Geiser et al., 2004;).

Capítulo 1 31

Figura 0-6: Árbol filogenético de las secuencias de Fusarium con el primer TEF-1α (Factor de elongación de la traducción) usando el coeficiente de similitud de Neighbor joining NJ, el árbol se elaboró con un bootstrap de 1000 réplicas. Universidad Nacional de Colombia-Sede Palmira, Marzo, 2016.

45.

F.

vert

icillioid

es

54

. F

. ve

rtic

illio

ide

s

36

81

. F

. ve

rtic

illio

ide

s10

6.

F. ve

rtic

illio

ide

s

89

13

58

. F

. vert

icill

ioid

es

3

57. F

. vert

icill

ioid

es

1

144. F

. vert

icill

ioid

es

0

184 F

. vert

icill

ioid

es

0

88. F

. vert

icill

lioid

es

0

87. F

. vert

icill

ioid

es

0

77. F

. vert

icill

ioid

es

0

73. F

. vert

icill

ioid

es

0

69. F

. vert

icill

ioid

es

0

63. F

. vert

icill

ioid

es

0

55. F

. vert

icill

ioid

es

0

48. F

. ve

rtic

illio

ides

0

39. F. ve

rtic

illio

ides

0

20. F. ve

rtic

illio

ides

0

19. F. ve

rtic

illio

ides

36. F. ca

mpto

cera

s

44. F. ve

rtic

illio

ides

52. F

. vertic

illio

ides

62. F

. ver

ticillio

ides

68. F

. ver

ticillio

ides

72. F

. ver

ticillio

ides

76. F

. ver

ticillio

ides

83. F

. ver

ticillio

ides

98. F

. ver

ticillio

ides

000000000

0

21. F

. ver

ticillioid

es

40. F

. ver

ticilli

oide

s

50. F

. ver

ticilli

oide

s

59. F. v

erticil

lioid

es

64. F. v

erticil

lioid

es

70. F. v

erticil

lioides

74. F. v

erticil

lioides

79. F. p

rolife

ratum

47. F. v

erticillio

ides

96. F. v

erticillio

ides

000000000

0 18. F. v

erticillio

ides

0

33. F. g

raminearum

0

42. F. napiform

e

0

51. F. verticillio

ides

0

60. F. verticillio

ides

0


0


0


0


0


1

1. F.oxysporum

3. F.oxysporum4. F. oxysporum cf oxysporum

6. F.oxysporum

7. F. sacchari

8. F.oxysporum

10. F.oxysporum11. F.oxysporum12. F.oxysporum14. F.oxysporum15. F.oxysporum16. F.oxysporum22. F. oxysporum25. F. oxysporum84. F. oxysporum102. F. oxysporum

118 F. oxysporum f.sp. opuntiarum

124 F. oxysporum

148 F.oxysporum100000000000

00

00

032

0

105. F. oxysporum

113 F. equiseti

9 30. F. oxysporum

3 34. F. guttiforme

128 F. equiseti

135 F. proliferatum

145 F. equiseti

91. F. oxysporum

Trichoderma gamsii

Trichoderma viride

99 46. F. coeruleum

29

Acremonium

dichromosporum


3 2. F.oxysporum

31. F. incarnataum

3243.F. oxysporum

155 F. oxysporum

98

121 F. incarnatum

199 F. oxysporum

9233

6

1

0

00000

0

85. F. oxysporum

26. F. oxysporum

41. F. fujikuroi

195. F

. oxysporum

198. F

. oxysp

oru

m

154

31

0

90. F

. oxysp

oru

m

0

92. F

. oxysp

oru

m

0

93. F

. sola

ni

0

108. F

. oxysp

oru

m

0

111 F

. oxysp

oru

m

0

117 F

. oxysporu

m

0

137 F

. oxysporu

m

0

147 F

. oxysporu

m

0

162 F

. oxysporu

m

0

174 F

. oxysporu

m

0

177 F

. oxysporu

m

0

186 F

. oxysporu

m

0

189 F

. oxysporu

m

0

192. F

. oxysporu

m

0

193. F

. oxysporu

m

0

19

4. F

. oxysp

oru

m

0

19

7. F

. oxysp

oru

m

0

5. F

. oxysp

oru

m

9. F

.sa

cch

ari

17

. F.s

acch

ari

94

. F. o

xysp

oru

m

13

4 F

. pro

lifera

tum

8 3

4

50

0

20

1.

F. oxysp

oru

m

0

10

3. F

. oxysp

oru

m

109. F

. oxysporu

m

110. F

. oxysporu

m

149 F

. oxysporu

m

205. F

. oxysporu

m 8 3 654

0

28. F

. oxysporu

m

107. F

. oxysporu

m

129 F

. oxysporu

m

187 F

. oxysporu

m 14

955

0

138 F

. oxysporu

m

2

104. F

. oxysporu

m

153 F

. oxy

sporu

m

191. F. oxy

sporu

m

196 F

.oxy

sporu

m

200. F. oxy

sporu

m

202. F. oxy

sporu

m fs.

lyco

pers

ici

203. F. oxy

sporu

m

204 F

. oxy

sporu

m

206.

F. o

xysp

orum

3 0 0 0 0 0 141

3

86. F

. oxy

spor

um

185.

F.

oxys

poru

m

89. F

. oxy

spor

um

99. F

. oxy

spor

um

101.

F. o

xysp

orum

8 3 549

2

13. F

.fujik

uroi

133

F. fuj

ikur

oi

51

49. F

. pro

lifer

atum

61. F. p

rolif

eratu

m

97. F. p

rolife

ratu

m

100. F. p

rolife

ratu

m

131 F. p

rolife

ratu

m

151 F. p

rolife

ratum

78. F. v

erticillio

ides

152 F. prolife

ratum

1031 0 1 767

38

8

67. F. g

raminearum

125 F. graminearum

1932. F. g

raminearum

1629. F. graminearum


116 F. chamydosporum

120 F. chamydosporum

2784

36

140 F. incarnatum


53173 F. incarnatum



17

53. F. equiseti

48

27. F. camptoceras37. F. oxysporum38. F. verticillioides66. F. verticillioides119 F. incarnatum130 F. incarnatum-equiseti


157 F. incarnatum




171 F. incarnatum

172 F. incarnatum

179 F. incarnatum

180 F. proliferatum


183 F. incarnatum

1

23. F. incarnatum

122 F. equiseti

123 F. equiseti


7424000000000000000791013

162

35. F. decemcellulare


74

56. F. solani

112 F. solani

114 F. solani

127 F. solani

142 F. solani

143 F. solani

146 F. solani

158 F. solani

164 F. solani

169 F. solani

24. F. solani

163 F. solani

6295. F

. solani

126 F. solani

139 F. cf. solani

160 F. solani

188 F

. sola

ni

72

439171

0

000002324920

2

170 F

. dece

mce

llula

re

5

190 F

. sola

ni

4

178. F

. sola

ni

8

175 F

. sola

ni

9

176 F

. sola

ni

16

168 F

. incarn

atu

m91

181 F

. incarn

atu

m

182 F

. incarn

atu

m

91


Para TEF-1α se genera un árbol que delimita las especies en grupos y muestra la mínima

cantidad de cambios evolutivos que se pueden generar entre las secuencias (Figura 1-7).

Sin embargo, para algunas secuencias de F. oxysporum se observa una división del grupo

generando relaciones falsas cuando las cantidades de los caracteres homoplásticos

afectan a los caracteres homólogos (Felsentein, 1978).

En ese sentido, el árbol consenso de Máxima parsimonia genera grupos correctamente

delimitados que conducen a disertar sobre la distribución de las especies en complejos lo

que permite un acercamiento a la propuesta de Aoki et al., 2014 y O´Donnell et al., 2016,

los cuales establecen cuatro complejos de especies, donde se incluyen aquellas que

afectan a la mayoría de plantas. Estos son: Complejo de especies de Fusarium fujikuroi

(FFSC): En este estudio se incluyen a 74 especies (F. verticillioides, F. proliferatum, F.

guttiforme, F. fujikuroi, F. sacchari). En la figura 1-8A las secuencias de la especie F.

verticillioides generan ramas por fuera del grupo lo que permite inferir que se forma un

subgrupo con caracteres diferentes y drásticos cambios evolutivos que pueden estar

involucrados con la presencia de micotoxinas (Fumonisinas) ya que provienen de la

colección de maíz en campo. También se observa valores altos en especies de F.

proliferatum que al igual que F. verticillioides son las especies que producen mayor

cantidad de fumonisinas.

Dentro de este complejo las especies inducen la enfermedad de “Bakanae” del arroz,

pudrición de mazorca en maíz, el cáncer prieto del pino, además, de contaminantes del

maíz y otros cereales con micotoxinas como las fumonisinas. Inicialmente Snyder y

Hansem (1941), las clasificaron dentro de la sección Liseola, por sus caracteres

morfológicos. Sin embargo, hace una década se menciona la especie F. moniliforme como

F. verticillioides y recientemente el teleomorfo de Giberella fujikuroi, se nombra como F.

fujikuroi. Esta nueva denominación también ha permitido incluir a las especies de este

complejo por la presencia del gen FUM involucrado en la producción de fumonisina. Así

mismo, Proctor et al., 2004 reconocen que no necesariamente especies que producen

fumonisinas tengan en su genoma el gen FUM. El estudio de Proctor y colaboradores

establece que el cluster del gen FUM está distribuido de manera discontinua dentro del

FFSC, por lo tanto, la presencia del gen FUM y la capacidad de producir fumonisinas puede

variar dentro de sus especies (Ma et al., 2010)

Capítulo 1 33

Figura 0-7: Árbol filogenético de las secuencias de Fusarium con el primer TEF-1α (Factor de elongación de la traducción) usando el coeficiente de similitud de Máxima parsimonia, el árbol se elaboró con un bootstrap de 1000 réplicas. Universidad Nacional de Colombia-Sede Palmira, Marzo, 2016

104.

F.

oxysporu

m20

6.

F.

oxysp

oru

m

13

20

4 F

. oxysp

oru

m

12

20

3.

F. oxysp

oru

m

11

20

2. F

. oxysp

oru

m

11

200. F

. oxysporu

m

11

196 F

.oxysporu

m

12

191. F

. oxysporu

m

17

153 F

. oxysporu

m

61

107. F

. oxysporu

m129 F

. oxysporu

m28. F

. oxysporu

m

187 F

. oxysporu

m

20

22

69

12

109. F

. oxy

sporu

m

110. F

. oxy

sporu

m

149 F

. oxy

sporu

m

103. F. oxy

sporu

m

205. F. oxy

sporu

m

15

15

19

70

11

185. F. oxy

sporu

m

11

92. F. oxy

sporu

m

11

90. F

. oxy

spor

um

11

199.

F. o

xysp

orum

89. F

. oxy

spor

um

99. F

. oxy

spor

um

86. F

. oxy

spor

um

101.

F. o

xysp

orum

17163064

11

108.

F. o

xysp

orum

111

F. oxy

spor

um

117

F. oxy

spor

um

137

F. oxy

spor

um

138 F. o

xysp

orum

147 F. o

xysp

orum

162 F. o

xysp

orum

174 F. o

xysp

orum

177 F. o

xysp

orum

186 F. o

xysporum

189 F. oxysporum

192. F. o

xysporum

193. F. o

xysporum

194. F. o

xysporum

197. F. oxysporum

85. F. oxysporum

201. F. oxysporum

17171111111111111111111111111111

17

30. F. oxysporum

37. F. oxysporum

1491 F. oxysporum

11 105 F. oxysporum

12 94. F. oxysporum

13 105. F. oxysporum

15 2. F. oxysporum

15 155. F. oxysporum

53180 F. proliferatum

135 F. proliferatum82

61. F. proliferatum

79. F. proliferatum97. F. proliferatum100. F. proliferatum131 F. proliferatum151 F. proliferatum49. F. proliferatum152 F. proliferatum12

1111

1813

2574

4511

11

24. F. solani163 F. solani

75158 F. solani

11

146 F. solani

11

143 F. solani

11

142 F. solani

11

127 F. solani

11

114 F. solani

11

112 F. solani

11

126 F. solani

139 F. cf. solani

160 F. solani

95. F. solani

188 F. solani

14151646

11

164 F. solani

169 F. solani

56. F. solani

190 F. solani

93 F. solani

175 F. solani

176 F. solani

180 F. solani

182 F. solani

82

39262112111111

11




1857

15

29. F. gram

inearum

125 F. gram

inearum

30

67. F. gram

inearum

27

32. F

. gra

min

earu

m

99

115 F

. chla

myd

osp

oru

m

120 F

. cham

ydosp

oru

m

51

116 F

. cham

ydosp

oru

m

93

173 F

. inca

rnatu

m e

quise

ti

23. F

. inca

rnatu

m e

quise

ti

136 F

. inca

rnatu

m-e

quise

ti

15

123 F

. incarn

atu

m e

quise

ti

15

122 F

. incarn

atu

m e

quis

eti

33

141 F

. incarn

atu

m-e

quis

eti

53. F

. incarn

atu

m e

quis

eti

150 F

. incarn

atu

m-e

quis

eti

36

72

54

113 F

. incarn

atu

m e

quis

eti

11

145. F

. incarn

atu

m e

quis

eti

11

128 . F

. incarn

atu

m e

quis

eti

119 F

. incarn

atu

m e

quis

eti

13

0 F

. incarn

atu

m-e

quis

eti

14

0 F

. incarn

atu

m e

quis

eti

16

1 F

. incarn

atu

m-e

quis

eti

82

15

4 F

. incarn

atu

m-e

quis

eti

16

8 F

. incarn

atu

m e

quis

eti

39

15

6 F

. incarn

atu

m-e

quis

eti

15

7 F

. incarn

atu

m e

quis

eti

16

5 F

. incarn

atu

m-e

quis

eti

166 F

. incarn

atu

m-e

quis

eti

167 F

. incarn

atu

m-e

quis

eti

171 F

. incarn

atu

m e

quis

eti

172 F

. incarn

atu

m e

quis

eti

179 F

. incarn

atu

m e

quis

eti

183 F

. incarn

atu

m e

quis

eti

31. F

.incarn

atu

m e

quis

eti

183 F

. incarn

atu

m e

quis

eti

22 20 11 11 11 11 11 11 11 11 11

11

11

11

11

30

34

30

35

32

11

9. F

.sacchari

17. F

.sacc

hari

94. F

. oxy

sporu

m

5. F. oxy

sporu

m

134 F

. oxy

sporu

m

15 22 23 58

11

4. F. oxy

sporu

m c

f oxy

sporu

m

1. F.o

xysp

oru

m

84. F. oxy

sporu

m

102.

F. o

xysp

orum

118

F. o

xysp

orum

124

F. o

xysp

orum

3. F

.oxy

spor

um

148

F.ox

yspo

rum

111111 11 11

11 11

11

6. F

.oxy

spor

um

11

7. F

. oxy

spor

um

11

8. F

.oxy

spor

um

11

10. F

.oxy

spor

um

11

11. F

.oxy

spor

um

11

12. F.o

xysp

orum

11

14. F.o

xysp

orum

11

15. F.o

xysp

orum

11

16. F.o

xysp

orum

11

19. F. v

erticilli

oides

20. F. v

erticillio

ides

21. F. v

erticillio

ides

80. F. v

erticillio

ides

195. F. v

erticillio

ides

39. F. vertic

illioides

40. F. verticillio

ides

13. F. fujikuroi

133. F. fujikuroi

3641. F. fujikuroi



11


44. F. verticillioides47. F. verticillioides48. F. verticillioides50. F. verticillioides51. F. verticillioides52. F. verticillioides55. F. verticillioides57. F. verticillioides59. F. verticillioides



























11111111111111111111111111111111111111

1111111111111111111111111111111111

11111111111111

11

22. F. oxysporum

11

25. F. oxysporum

11

26. F. oxysporum

14



31Trichoderm

a gamsii

Trichoderm

a viride

100A

cremonium

dichromospo

rum

20

46. F

. coeru

leum

21

2. F

.oxysp

oru

m

27. F

. cam

pto

cera

s

33. F

. gra

min

aru

m

42. F

. napifo

rme

34 F

. guttifo

rme

100

121 F

. inca

rnatu

m144 F

. vertic

illioid

es

725

6432

8211

9


El complejo de especies de F. oxysporum abarca genética y fenotípicamente distintas

cepas encontrándose en una amplia gama de ecosistemas. La mayoría de especies del

complejo FOSC se han centrado en cepas patogénicas de plantas debido a que causan

enfermedades como pudriciones vasculares, damping off y pudriciones de corona y raíz

en un amplio rango de hospedantes. En Japón, en el año 2012 se reconocieron cerca de

120 hospedantes económicamente importantes, 100 formas especiales y razas han sido

registradas (Armstrong y Armstrong, 1981; Michielse y Rep, 2009: Aoki, 2014).

Gran parte de las especies de Fusarium que se derivan de las formas especiales se basan

principalmente en la patogenicidad de su hospedante en particular, este concepto fue

introducido por Snyder y Hansen (1941) y aceptado por la mayoría de fitopatólogos que

trabajan con FOCS y con el complejo de especies de Fusarium solani (FSSC). (Armstrong

and Armstrong, 1981; Booth, 1971). Para esta especie es importante destacar los grupos

de compatibilidad vegetativa (VCGs) la cual es mediada por múltiples loci, lo cual explica

como los grupos de genes que determinan la compatibilidad vegetativa y los genes para

patogenicidad evolucionaron de tal manera que dieron origen a los VCGs de F. oxysporum.

En la actualidad se conocen 125 VCGs de 30 formas especiales (Aoki et al., 2014) que se

utilizan como criterio biológico utilizado en la clasificación taxonómica de las especies.

En este estudio se logró determinar con esta región (74) secuencias que corresponden al

complejo de especies de F. oxysporum la cual representa a nivel mundial el grupo más

diverso dentro del género. Como se observa en la figura 1-8B se ubica un segundo grupo

que sólo corresponde a aislamientos de Fusarium provenientes de frutales de pitaya, ají,

mora vid y tomate de árbol indicando la alta diversidad de especies que se pueden generar

posiblemente en el grupo ya sea por el tipo de hospedante o por transferencia horizontal

que dentro de las especies parece haber contribuido potencialmente a la generación de

variantes y en particular a generar nuevos patógenos (Ma et al., 2010).

La figura 1-9A muestra la diversidad de especies que hacen parte del complejo de especies

de F. solani FSSC. A pesar de ser una muestra de 22 secuencias, se observa la formación

de cinco grupos con diferencias altamente marcadas en tres de sus secuencias. Las

variaciones encontradas al interior de este grupo se explican por la complejidad que se

genera no solo en la morfología, sino que este complejo agrupa sus especies teniendo en

cuenta el origen geográfico y el hospedante afectado. Se clasificó inicialmente dentro de

la sección Martiella (Booth, 1985) que produce enfermedades como pudrición de raíz y

tallo de arveja, el síndrome de muerte súbita en soya, pudrición de pie en fríjol y pudrición

húmeda en papa. En esta morfoespecie, se estima que existen alrededor de 60 especies

filogenéticamente distintas (Nalim, et al., 2011; O´Donnell et al., 2008; O´Donnell et al.,

2015).

Capítulo 1 35

Figura 0-8: Árbol filogenético de los complejos de especies de F. fujikuroi (A) y F. oxysporum (B) con el primer del Factor de elongación de la traducción (TEF-1α) usando el coeficiente de similitud de Máxima parsimonia, el árbol se elaboró con un bootstrap de 1000 réplicas. Universidad Nacional de Colombia-Sede Palmira, marzo, 2016.

. A B

Figura 0-9: Árbol filogenético de los complejos de especies de F. solani (A) y F. graminearum (B) con el primer del Factor de elongación de la traducción (TEF-1 α) usando

21._F._verticillioides

79._F._proliferatum


87._f._verticillioides


77._F._verticillioides_














42._F._napiforme

36._F._camptoceras

184_F._verticillioides
























135_F._proliferatum

34._F._guttiforme

7._F._sacchari

134_F._proliferatum

17._F.sacchari

9._F.sacchari


13._F.fujikuroi

133_F._fujikuroi

180_F._proliferatum

27._F._camptoceras



151_F._proliferatum

152_F._proliferatum

61._F._proliferatum

97._F._proliferatum

131_F._proliferatum

49._F._proliferatum


100._F._proliferatum


41._F._fujikuroi


Acremonium_dichromosporum

Trichoderma_gamsii

Trichoderma_viride

5._F.oxysporum

205._F._oxysporum

202._F._oxysporum

199._F._oxysporum

196._F._oxysporum

193._F._oxysporum

162_F._oxysporum

138_F._oxysporum

124_F._oxysporum

111_F._oxysporum

104._F._oxysporum

92._F._oxysporum

12._F.oxysporum_fs_cumini

4._F.oxysporum

1._F.oxysporum

204._F._oxysporum

198._F._oxysporum

195._F._oxysporum

192._F._oxysporum

187_F._oxysporum

137_F._oxysporum

118_F._oxysporum

108._F.oxysporum

110._F.oxysporum

107._F._oxysporum

103._F._oxysporum

15._F.oxysporum

11._F.oxysporum

3._F.oxysporum

206._F._oxysporum

203._F._oxysporum

200._F._oxysporum

197._F._oxysporum

194._F._oxysporum

191._F._oxysporum

186_F._oxysporum

117_F._oxysporum

30_F._oxysporum

86._F._oxysporum

91._F._oxysporum

99._F._oxysporum

26._F._oxysporum

89._F._oxysporum

101._F._oxysporum

105._F._oxysporum

149_F._oxysporum

102._F._oxysporum

94.F._oxysporum

90._F._oxysporum

84._F._oxysporum

22._F._oxysporum

14._F._oxysporum

10._F.oxysporum_fs_cumini

129_F._oxysporum

155_F._oxysporum

28._F._oxysporum

37._F._oxysporum

201._F._oxysporum

177_F._oxysporum

6._F._oxysporum

16._F.oxysporum

174_F._oxysporum

185_F._oxysporum

8._F.oxysporum

25_F._oxysporum

147_F._oxysporum

153_F._oxysporum

148_F._oxysporum

189_F._oxysporum

2._F.oxysporum

109._F._oxysporum



el coeficiente de similitud de Máxima parsimonia, el árbol se elaboró con un bootstrap de 1000 réplicas. Universidad Nacional de Colombia-Sede Palmira, marzo, 2016.

A B

En un estudio filogenético, morfológico y fenotípico en muerte súbita de la soya se había

clasificado a las especies inicialmente dentro de formas especiales de F. solani f.sp.

glycines, se demostró que estas no correspondían a las formas especiales sino a siete

nuevas especies filogenéticamente diferentes. Esto agrupó a las especies de F. solani en

clados los cuales estaban geográficamente delimitados generando un sistema

alfanumérico de nomenclatura (Nalim et al., 2011; O’Donnell 2000; O’Donnell et al., 2008;

Zhang et al., 2006). Los estados teleomorficos, por ejemplo, F. striatum Sherb.

[sin.=Haematonectria ipomoeae (Halst.) Samuels & Nirenberg] y F. neocosmosporiellum

(sin.= Neocosmospora vasinfecta), se ubican en un cuarto clado y Nectria haematococca

fue transferido a un nuevo género, Haematonectria. (Rossman et al., 1999).

Posteriomente, H. haematococca (Berk. & Br.) Samuels & Rossman fue recombinada

como Neocosmospora haematococca (Berk. & Br.) Samuels, Nalim & Geiser, y finalmente

su anamorfo fue descrito como Fusarium haematococcum Nalim, Samuels & Geiser, con

diferencias filogenéticas distintas a F. solani (Nalim et al. 2011). Esta serie de confusiones

y desacuerdos en cuanto a la clasificación de especies del complejo de F. solani han

provocado propuestas para formar un nuevo género (Geiser et al., 2013; O´Donnell et al.,

2015).

112_F._solani

158_F._solani

146_F._solani

143_F._solani

142_F.__solani

127_F._solani

114_F._solani

126_F._solani

139_F._cf._solani

160_F._solani

56._F._solani

188_F._solani

95._F._solani

24._F._solani

163_F._solani

164_F._solani

169_F._solani

93._F._solani

178_F._solani


Trichoderma_gamsii

Trichoderma_viride

175_F._solani

190_F._solani

176_F._solani

Trichoderma_gamsii

Trichoderma_viride


33._F._graminearum

32._F._graminearum

29._F._graminearum

125_F._graminearum

67._F._graminearum

Capítulo 1 37

En la figura 1-9B se observa que las secuencias encontradas del complejo de especies de

F. graminearum (FGSC) las cuales son homólogas sin cambios evolutivos notables en su

estructura. Las especies de este complejo incluyen a las que causan la fusariosis de la

espiga en trigo y cebada FHB (Fusarium head blight) y contaminación de granos con

micotoxinas del grupo de los tricótesenos como son deoxinivalenol (DON) y Nivalenol

(NIV). Estas micotoxinas son inadecuadas para consumo humano y animal y a su vez,

actúan como factores de virulencia en plantas susceptibles (Proctor et al., 1995). Las

especies del FGSC producen tricótesenos de tipo B tales como deoxinivalenol (DON,

conocido como vomitoxina), el nivalenol (NIV) y sus derivados acetilados, es decir, 3-

acetildeoxinivalenol (3ADON) y 15-acetildeoxinivalenol (15 ADON) (Ward et al. 2002). El

cluster de genes TRI reúne 12 genes que están involucrados en la producción de

tricótesenos tipo B. Muchos de los genes de la biosíntesis de los tricotecenos se han

identificado a través de investigaciones bioquímicas y genéticas de la especie F.

sporotrichioides. Todos los genes conocidos para tricotecenos están localizados dentro de

un grupo de genes TRI, a excepción del 3-O-acetiltransferasa (TRI101, TRI1 y TRI16

(Proctor et al. 2009).

Los estudios de las especies productoras de tricotecenos tipo A y B indican que la historia

evolutiva de los loci TRI es compleja y que no siempre reflejan la evolución de las especies

(O´Donnell et al., 2000 y Ward et al., 2002). Análisis del FGSC indican que la falta de

correlación entre las filogenias de especies y filogenias basadas en algunos genes del

grupo TRI son el resultado del equilibrio en la selección de alelos ancestrales del cluster

TRI que confieren diferentes fenotipos de tricotecenos tipo B (quimotipo). Por otro lado, la

organización de los genes TRI en un segundo linaje de las especies productoras de

tricotecenos del complejo especies de Fusarium incarnatum (FIESC) sugiere una completa

historia evolutiva de estos genes que incluya la pérdida, no funcionalidad y translocación

dentro y entre los loci TRI (Proctor et al., 2009).

En este estudio, las secuencias correspondientes a los diferentes clados y subclados son

generados a partir de secuencias homólogas con alto grado de similitud, además la

distancia más cercana y la longitud de las ramas encontradas en los árboles filogenéticos

agrupan a las secuencias en 7 clados y 13 especies. Varios autores han señalado la

confusión filogenética del género Fusarium dentro de los complejos de especies que

actualmente se han propuesto (O´Donnell et al., 2004; Leslie y Summerell, 2006; O´Donnell

et al., 2008; Geisser, et al., 2013; Aoki et al., 2014; O´Donnell et al., 2015).

Sin embargo, el hecho de que todos los aislamientos que pertenecen a un mismo complejo

de especies pueden presentar grandes diferencias genéticas derivado de un origen

filogenético diferente, tal como sucede en los complejos de especies de F. oxysporum y F.

solani donde las formas especiales son derivadas del hospedante afectado, marca

contrastes altamente visibles en las secuencias evaluadas (Nelson et al., 1994; Leslie et

al., 2006; O´Donnell et al., 2008; Balaje et al., 2009). Esto es posible debido a que algunos

o varios de los aislamientos de los complejos de especies obtenidos en el presente estudio

deriven de linajes diferentes.


La documentación de los últimos años dada por grupos de investigadores liderados por

Geiser y colaboradores (2013), Aoki et al., 2014 y O´Donnell et al., 2015 determinan un

análisis de la taxonomía de Fusarium, considerando hacer cambios en el Código

Internacional de Nomenclatura de las algas y hongos, con el fin de proponer el uso

exclusivo del nombre Fusarium para el clado que representa el clado terminal del mismo.

La ventaja de esta propuesta está enmarcada en utilizar al menos ocho nombres genéricos

para cada linaje (Geiser et al., 2013) mientras que O´Donnell et al. (2015) presentan veinte

complejos de especies. Los autores se oponen a propuestas que incluyan subclados con

el rango de género dentro de este clado a pesar de encontrar diferencias en linajes

morfológicos y filogenéticos dentro del clado Gibberella necesitando precisar en los

nombres dados a las especies para poder reunir la historia evolutiva del hongo.

A pesar de estos desafíos, el futuro de la sistemática de Fusarium debe ser vista con gran

optimismo. Un alto grado de claridad ha surgido en las últimas décadas en materia de los

límites de las especies, grupos subgenéricos y los límites genéricos. El diluvio de datos

genómicos, que está en el camino permitirá reevaluar la filogenia de Fusarium y examinar

mecanismos que subyacen su evolución en la escala del genoma, combinando a su vez

herramientas bioinformáticas que con la ayuda de Internet promuevan un acercamiento de

a la verdadera taxonomía del hongo.

El concepto de Fusarium ha evolucionado para representar un grande y diverso conjunto

de taxones en el último siglo. Si bien, este tamaño y diversidad puede presentar desafíos,

y los argumentos han abundado sobre conceptos de especie en el género, ninguna

información ha generado concordancia de manera significativa. Junto con el concepto

genérico la gran y diversa comunidad de investigadores ha evolucionado, dando lugar a

una larga lista de descubrimientos que han tenido un gran impacto en fitopatología,

micología médica y biología de hongos. Al lograr unificar los conceptos morfológicos,

biológicos y filogenéticos se conducirá a esclarecer la verdadera diversidad del género.

Conclusiones

Se encontró una alta diversidad intra e inter específica en los aislamientos, las 14 especies

caracterizadas en este estudio se agruparon en siete complejos, siendo las de mayor

frecuencia F. oxysporum y F. verticillioides. Se hallaron 13 especies de Fusarium spp.

posiblemente asociadas a hospedantes no registrados a nivel mundial y 35 especies no

registradas en Colombia.

F. oxysporum se presentó en 25 de los 30 hospedantes evaluados con los porcentajes

más altos en las colecciones de pitaya y pimentón–ají. F. verticillioides alcanzó un alto

porcentaje en las colecciones de maíz. Tres aislamientos con características aun no bien

definidas F. cf. solani, F. cf. oxysporum y F. cf. incarnatum se presentaron en plantas de

pitaya maracuyá y guanábana.

Capítulo 1 39

Bibliografia

Agrios, G. 2005. Plant Pathology. University of Florida. Fifth Edition.356 p.

Aldana La Torre, R., Aldana de La Torre, J. Calvache, H. y. F. Bautista. 2010. Manual de plagas dela palma de aceite en Colombia. Cuarta Edición. SENA, CENIPALMA.

Alexoupolus, J. y Blackwell, M. 1996. Introductory micology. New York: Willey y Sons, 1378p.

Alzate, A., Angarita, A. y V. Montes. 1990. Estudios preliminares para la inducción de variación somoclonal en clavel (Dianthus caryophyllus), y selección "in vitro" de calles y plántulas tolerantes a F. oxysporum f. sp. dianthi. Agronomía Colombiana. 7: 8-27.

Angulo, R., Cooman, A., Niño, N. y L. Espinosa. 2005. El cultivo de Uchuva. Universidad Jorge Tadeo Lozano-COLClENCIAS-CIAA, Colombia. 49 pp.

Aoki, T., O’Donnell, K., & Geiser, D. M. 2014. Systematics of key phytopathogenic Fusarium species: current status and future challenges. Journal of General Plant Pathology, 80, 189–201.

Arango, E. 1982. Determinación de la capacidad antagónica de diferentes aislamientos del hongo Trichoderma sobre Fusarium oxysporum forma phaseoli en el municipio de Pasto, departamento de Nariño, Tesis de ingeniería agronómica Facultad de Ciencias Agropecuarias, Universidad de Nariño, Pasto.

Arbeláez, G. 1987. Enfermedades fungosas y Bacterianas del Clavel en Colombia. Agronomía Colombiana. 1987. Volumen IV: 3-8 PP.

Arbeláez, G. 2000. Algunos aspectos de los hongos del género Fusarium y de la especie Fusarium oxysporum. Agronomía colombiana (17): 11-22.

Arizala, M., Monsalvo, A. y G. Betancourth. 2011. Evaluación de solanáceas silvestres como patrones de Lulo (Solanum quitoense Lam) y su reacción a Fusarium sp. Revista de Ciencias Agrícolas. 28 (1): 1-21.

Armstrong GM, Armstrong JK. 1981. Formae speciales and races of Fusarium oxysporum causing wilt diseases. In: Nelson PE, Toussoun TA, Cook RJ (eds) Fusarium: diseases, biology, and taxonomy. Pennsylvania State University, University Park, pp 391–399

Balajee, S. A., Borman, A. M., Brandt, M. E., Cano, J., Cuenca Estrella, M., Dannaoui, E., 2009. Sequence-based identification of Aspergillus, Fusarium, and Mucorales species in the clinical mycology laboratory: Where are we and where should we go from here? Journal of Clinical Microbiology, 47, 877

Barnett, H. 1960. Illustrated genera of imperfect fungi. Burgess Publishing Co., Minneapollis. 215p.

Bernal, J. 1996. Plagas y enfermedades de la granadilla (Passiflora ligularis). En: Instituto colombiano Agropecuario- ICA. Plagas y enfermedades en frutas tropicales. División de sanidad vegetal, Colombia. 29-36.


Betancourth García, C., Narvaez y Zambrano, M. 2007. Reacción de diferentes genotipos de lulo (Solanum quitoense) al ataque de Fusarium oxysporum. Fitotecnia Colombiana., 1, 43-50.

Boehm E., Ploetz R, Kistler H. 1994. Statistical analysis of electrophoretic karyotype variation among vegetative compatibility groups of Fusarium oxysporum f. sp. cubense. Mol Plant-Microbe Interact 7:196–207

Borda F. Arbeláez G, 1993. Determination of the antagonism of Trichoderma harzianum isolate T 95 against Fusarium oxysporum f.sp. cucumerinum on cucumber plants. Agronomia Colombiana. 10(1):45-51; 29 ref.

Bosland, P. W. 1988. Fusarium oxysporum a pathogen of many plant species. Advances in plant pathology. 6: 281- 289.

Bravo-Ruíz, G., Ruíz-Roldán, C., & Roncero, M. I. G. 2013. Lipolytic System of the Tomato Pathogen Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici. Molecular Plant-Microbe Interactions, 26(9), 1054-1067.

Buriticá, P. 1999. Directorio de Patógenos y Enfermedades de las Plantas de Importancia Económica en Colombia. Produmedios, Bogotá. Colombia. 329pp.

Castaño. J.J. 1978. Trayectoria de la fitopatología en Colombia. 1ra edición. Editorial letras. Medellín-Colombia. pp. 163.

Castella, G., Bragulat, M., Bubiales, M., Cabañes, F. 1997. Development of a selective culture medium for Fusarium moniliforme. Microbiol. Vol 13(4): 493-498.


Chittem, K., Mathew, F. M., Gregoire, M., Lamppa, R. S., Chang, Y. W., Markell, S. G., & Goswami, R. S. (2015). Identification and characterization of Fusarium spp. associated with root rots of field pea in North Dakota. European Journal of Plant Pathology, 143(4), 641-649.

Cook, J. y Barker, K. 1989. The nature and practice of biological control of plant pathogens. St. Paul, Minnesota. The Americam Phytopathological Society. 539 p.

Darvas, J. M., & Kotze, J. M. 1987. Avocado fruit diseases and their control in South Africa. South African Avocado Growers' Association Yearbook, 10, 117-119.

Delgadillo, J; Rincón, R; Silva, M; Orduz, J. 2003. Reconocimiento e identificación de enfermedades fungosas presentes en el cultivo de cítricos en tres localidades del departamento del Meta. Revista Achagua, publicación Técnico Científica 7(9) Enero-diciembre. Colombia.

Desjardins, A. and Proctor, R. 2007. Molecular biology of Fusarium mycotoxins. International Journal of Food Microbiology 119:47-50.

Capítulo 1 41

De Rossi, R.L.; Guerra, F.A.; Vuletic, E.; Plazas, M.C.; Brücher, E.; Guerra, G.D. Informes fitosanitarios región Centro Norte de Córdoba. Argentina. (2013, 2014, 2015, 2016). ISSN: 2451-5949.

Echavarría, P. 1974. Curso producción de hortalizas Instituto Colombiano Agropecuario, Medellín (Colombia) Secretarla de Agricultura y Fomento de Antioquia, Medellín-Colombia Medellín (Colombia). Pp. 66-72.

Entz, M., Bellotti W., Powell J., Angadi, S., Chen, W., Ominski, K., y Boelt, B. 2005. Evolution of integrated crop–livestock production systems. In D.A. McGilloway (ed.) Grassland: A global resource. Wageningen Academic Publ., Wageningen, Netherlands. p.137–148.

Eraso Insuasty, C., Acosta Rodríguez, J., Salazar González, C., & Betancourth García, C. (2014). Evaluation of Trichoderma spp. strains for control yellowing pea caused by Fusarium oxysporum. Corpoica Ciencia y Tecnología Agropecuaria, 15(2), 237-249.

Escobar, H. y R. Lee. 2009. Manual de producción de tomate bajo invernadero. Segunda edición. Fundación universitaria Jorge Tadeo Lozano. Cuadernos del Centro de Investigaciones y Asesorías Agroindustriales. Bogotá D.C. 180pp.

Fandohan, P., Hell, K., Marasas, W. F. O., & Wingfield, M. J. 2004. Infection of Maíze by Fusarium species and contamination with fumonisin in Africa. African Journal of Biotechnology, 2(12), 570-579.

Fanelli, F., Iversen, A., Logrieco, A.., Mulè G., 2013 Relationship between fumonisin production and FUM gene expression in Fusarium verticillioides under different environmental conditions Food Additives & Contaminants: Part A Vol. 30, Iss. 2, 365-371.

Felsenstein, J. 1978. Cases in which parsimony or compatibility methods will be positively misleading. Systematic Biology, 27(4), 401-410.

Fernández Barbosa, R. J., & Suárez Meza, C. L. 2009. Antagonismo In Vitro De Trichoderma harzianum Rifai Sobre Fusarium oxysporum Schlecht F. Sp Passiflorae En Maracuyá (Passiflora edulis Sims Var. Flavicarpa) Del Municipio Zona Bananera Colombiana. Revista Facultad Nacional De Agronomía, Medellín, 62(1), 4743-4748.

García-Bastidas, F., Ordóñez, N., Konkol, J., Al-Qasim, M., Naser, Z., Abdelwali, M., ... & Kema, G. H. J. 2015. First report of Fusarium oxysporum f. sp. cubense tropical race 4 associated with Panama disease of banana outside Southeast Asia. Annual Review of Phytopathology, 53, 269-288.

Geiser, D. M., Aoki, T., Bacon, C. W., Baker, S. E., Bhattacharyya, M. K., Brandt, M. E. & Short, D. P. 2013. One fungus, one name: defining the genus Fusarium in a scientifically robust way that preserves longstanding use. Phytopathology, 103(5), 400-408.http://dx.DOI.org/10.1094/PHYTO-07-12-0150-






Geiser, D., Jiménez-Gasco, M., Kang, S., Makalowska, I., Veeraraghavan, N., Ward, J.,& O’donnell, K. 2004. FUSARIUM-ID v. 1.0: a ADN sequence database for identifying Fusarium. Molecular Diversity and PCR-detection of Toxigenic Fusarium Species and Ochratoxigenic Fungi, 473-479. DOI: 10.1007/978-1-4020-2285-2_2

Ghosh, A., & Shamsi, S. 2014. Fungal diseases of Rose plant in Bangladesh. Journal of Bangladesh Academy of Sciences, 38(2), 225-233.

Gómez, E. 2008. Caracterización de cepas toxigénicas del género Fusarium mediante técnicas de biología molecular. Tesis Doctoral. Universidad Politécnica de Valencia. 226p.

Gómez. L., Caicedo, G., Ocampo. L., Barrios. J., Pérez, N. y J. Segura. 2003. Enfermedades de la guayaba común (Psidium guajava L.) en los departamentos del Tolima y Huila. Guía de reconocimiento manejo. Espinal (Colombia). CORPPOICA-PRONATTA. Corporación Colombiana de Investigación Agropecuaria Regional 6: 1-14.

Gordon, T., Kirkpatrick, S. C., Henry, P., Kong, M., & Broome, J. 2015. First report of a wilt disease of blackberry caused by Fusarium oxysporum in California. Plant Disease, (ja).

Granett, J., Omer, A. D., Pessereau, P., & Walker, M. A. 2015. Fungal infections of grapevine roots in phylloxera-infested vineyards. VITIS-Journal of Grapevine Research, 37(1), 39.

Guerra, G., Betancourth, C. y C. Salazar. 2011. Antagonismo de Pseudomonas fluorescens Migula frente a Fusarium oxysporum f.sp. phisi Schtdl en Arveja Pisum sativum L. Revista UDCA. Actualidad y divulgación científica. 14 (2): 33-42

Guerrero. O. y N. Angulo. 1990. Evaluación de germoplasma de frijol voluble por resistencia a Fusarium oxysporum f.sp. phaseoli. Ascolfi Informa Vol 16 No 6. 52-54 pp.

Hernández, L., Castillo, M., Ocampo, J. y K. Wyckhuys. 2011. Guía de identificación de plagas y enfermedades para el maracuyá, la gulupa y la granadilla. Centro de Bio-Sistemas. Fundación Universitaria de Bogotá Jorge Tadeo Lozano. Colombia. 50pp.

Herrera, L., del Valle, N., & Grande, J. 1995. Fusarium solani (Mart.) (Appel y Wr.) Snyd. y Hans, agente causal de la pudrición seca de las raíces de los cítricos en Cuba. Centro Agrícola.

Hibbett, D.S. 1992. Ribosomal RNA and fungal systematics. Trans. Mycol. Soc. 33, 533556.

Hirata, T., Kimishima, E., Aoki, T., Nirenberg, H. I., & O'Donnell, K. 2001. Morphological and molecular characterization ofFusarium verticillioides from rotten banana imported into Japan. Mycoscience, 42(2), 155

Capítulo 1 43

Instituto Nacional Autónomo de Investigaciones Agropecuarias INIAP, Quito (Ecuador). Estacion Experimental Santa Catalina. Departamento Nacional de Proteccion Vegetal. 2004. Enfermedades, nematodos e insectos plaga del tomate de arbol (Solanum betaceum Cav.).32 p

Jacobson, D. J. ana TR Gordon. 1991. Fusarium oxysporum f. sp. melonis-. A case study of diversity within a forma specialis. Phytopathology, 81, 1064-1067.

Jiménez, J. V.y Granados, X. M. (2014). Diagnosis of Fusarium oxysporum in the cultivation of pineapple Ananas comosus (L) Merr. Net Journal of Agricultural Science, 2(3), 107-112.

Kasson, M. T., O’Donnell, K., Rooney, A. P., Sink, S., Ploetz, R. C., Ploetz, J. N., ... & Smith, J. A. 2013. An inordinate fondness for Fusarium: phylogenetic diversity of fusaria cultivated by ambrosia beetles in the genus Euwallacea on avocado and other plant hosts. Fungal Genetics and Biology, 56, 147-157.

Kvas, M., Marasas, W. F. O., Wingfield, B. D., Wingfield, M. J., & Steenkamp, E. T. 2009. Diversity and evolution of Fusarium species in the Gibberella fujikuroi complex. Fungal divers, 34, 1-21.

Lee, S, and Taylor, J. 1992. "Phylogeny of five fungus-like protoctistan Phytophthora species, inferred from the internal transcribed spacers of ribosomal ADN." Molecular Biology and Evolution 9.4: 636-653.

Leslie J, Summerell B (2006) The Fusarium laboratory manual. 1st ed. Blackwell Publishing Ltd, Oxford, London. 170p.

Lima, C. S., Pfenning, L. H., Costa, S. S., Campos, M. A., & Leslie, J. F. 2009. A new Fusarium lineage within the Gibberella fujikuroi species complex is the main causal agent of mango malformation disease in Brazil. Plant Pathology, 58(1), 33-42.

Llanos, C. y Sanchez, M. 1982. Experimentos con microorganismos. Palmira, Ed. Universidad Nacional de Colombia. p. 77-80.

Logrieco, A., Mule, G., Moretti, A., & Bottalico, A.2002. Toxigenic Fusarium species and mycotoxins associated with Maíze ear rot in Europe. European Journal of Plant Pathology, 108(7), 597-609.

Londoño Aramburo, J. 2012. Evaluación de la resistencia genética de especies de Passiflora spp A Fusarium spp, agente causal de la “Secadera” Tesis de Maestria, Universidad Nacional de Colombia Sede Palmira.

López, J., Bernal. J., Tamayo, P. y R. Gómez. 2009. Tecnología para la producción de frutales de clima frio moderado. Corporación Colombiana de Investigación Agropecuaria- Corpoica. Produmedios. Colombia. 128pp.


Ma L-J, van der Does HC, Borkovich KA, Coleman JJ, Daboussi M-J, Di Pietro A, Dufresne M, Freitag M, Grabherr M, Henrissat B, Houterman PM, Kang S, Shim W-B, Woloshuk C, Xie X, Xu J-R, Antoniw J, Baker SE, Bluhm BH, Breakspear A, Brown DW, Butchko RAE, Chapman S, Coulson R, Coutinho PM, Danchin EGJ, Diener A, Gale LR, Gardiner DM, Goff S, Hammond-Kosack KE, Hilburn K, Hua-Van A, Jonkers W, Kazan K, Kodira CD, Koehrsen M, Kumar L, Lee Y-H, Li L, Manners JM, MirandaSaavedra D, Mukherjee M, Park G, Park J, Park S-Y, Proctor RH, Regev A, Ruiz-Roldan MC, Sain D, Sakthikumar S, Sykes S, Schwartz DC, Turgeon BG, Wapinski I, Yoder O, Young S, Zeng Q, Zhou S, Galagan J, Cuomo CA, Kistler HC, Rep M. 2010. Comparative genomics reveals mobile pathogenicity chromosomes in Fusarium. Nature 464:367–373

Ma, L., Qiao, X., Gao, F., & Hao, B. 2001. Control of sweet pepper Fusarium wilt with compost extracts and its mechanism. Chinese Journal of Applied & Environmental Biology, 7(1), 84-87.

Madania, A., Altawil, M., Naffaa, W., Volker, P. H. and Hawat, M. 2013. Morphological and Molecular Characterization of Fusarium Isolated From Maíze in Syria. Journal of Phytopathology, 161: 452–458. doi: 10.1111/jph.12085

Magan, N., Aldred, D., Mylona, K. and Lambert, R.J.W. 2010. Limiting mycotoxins in stored wheat. Food Addit. Contam. A, 27, 644–650.

Marasas, W. F. O., Ploetz, R. C., Wingfield, M. J., Wingfield, B. D., & Steenkamp, E. T. 2006. Mango malformation disease and the associated Fusarium species. Phytopathology, 96(6), 667-672.

Marupov, A., Stipanovic, R., Turamuratova, G., Mambetnazarov, A., & Marupova, M. 2013. Fusarium verticillioides: A new cotton wilt pathogen in Uzbekistan. International Journal, 1(1), 1-5.

Marziano, F., Nanni, B., & Noviello, C. 1993. A fruit rot of Melón of Fusarium incarnatum [in Italy]. Informatore Fitopatologico (Italy).

McDonald, F. D., Porras, V. H., Sánchez, J. A., Mignucci, J., Torres, L., Hepperly, P. R., ... & Clarke, A. D. 1992. Diseases of economic importance in citrus (grapefruit) and avocado. Passion fruit, avocado and citrus. 1. Regional Workshop on Tropical Fruit Crops (No. IICA-PM A2/DM No. 92-01). IICA, Roseau (Dominica).

Menke, J., Weber J., Broz, K, Kistler, H. 2013. Cellular Development Associated with Induced Mycotoxin Synthesis in the Filamentous Fungus Fusarium graminearum. PLoS ONE 8(5): e63077. doi:10.1371/journal.pone.0063077

Michielse CB, Rep M. 2009 Pathogen profile update: Fusarium oxysporum. Mol Plant Pathol 10:311-324

Michielse, C. B., Reijnen, L., Olivain, C., Alabouvette, C., & Rep, M. 2012. Degradation of aromatic compounds through the β‐ketoadipate pathway is required for pathogenicity of the tomato wilt pathogen Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici. Molecular plant pathology, 13(9), 1089-1100.

Capítulo 1 45

Mikušová, P., Šrobárová, A., Sulyok, M., & Santini, A. 2013. Fusarium fungi and associated metabolites presence on grapes from Slovakia. Mycotoxin research, 29(2), 97-102.

Miller, Sally A.; Rowe, R.C.; Riedel, R.M. 1996. “Fusarium and Verticillium Wilts of Tomato, Potato, Pepper, and Eggplant”. Extension Fact Sheet. The Ohio State University.HYG-3122-96. 3p.

Molina, J. C., Pereira, P. G., & de González, M. Q. 2002. Insectos y ácaros del guayabo Psidium guajava L. en plantaciones comerciales del estado Zulia, Venezuela. Revista de la Facultad de Agronomía, 19(2).

Mosquera. R., Abisambra, A., Cárdenas, J., Kleefeld, C., Echeverry, E. y H. Arévalo. 2001. Informe de gestión. Proyecto de protección sanitaria del cafeto. Convenio Instituto Colombiano Agropecuario lCA- Federación nacional de cafeteros. Produmedios. Colombia 23.93 pp.

Nalim, F. A., Samuels, G. J., Wijesundera, R. L., & Geiser, D. M. 2011. New species from the Fusarium solani species complex derived from perithecia and soil in the Old World tropics. Mycologia, 103(6), 1302-1330.

Nelson, P. E., Desjardins, A. E., & Plattner, R. D. 1993. Fumonisins, mycotoxins produced by Fusarium species: biology, chemistry, and significance. Annual review of phytopathology, 31(1), 233-252.

Nelson, P.; Tousson, T. y Marasas, F. 1983. An Illustrated Manual for Identification. Penn State Press University. Pennsylvania. United State of America.

Nwaogu, A. G., Ononuju, C. C., & Wokocha, R. C. 2015. Evaluation of Growth Inhibition Capacity of Some Plant Extracts Against Three Fungal Isolates Infecting Cocoa Pods In Abia State, Nigeria. Journal of Biopesticides and Agriculture, 1, 61-67.

O’Donnell K, Sutton D, Fothergill A, Mccarthy D, Rinaldi M, Brandt M, 2008. Molecular Phylogenetic Diversity, Multilocus Haplotype Nomenclature, and In Vitro Antifungal Resistance within the Fusarium solani Species Complex. J. Clin. Microbiol.; 46:2477-2490. DOI: 10.1128/JCM.02371-07

O’Donnell, K., Kistler, H., Cigelnik, E., & Ploetz, R. 1998. Multiple evolutionary origins of the fungus causing Panama disease of banana: concordant evidence from nuclear and mitochondrial gene genealogies. Proceedings of the National Academy of Sciences, 95(5), 2044-2049.

O’Donnell, K., Kistler, H., Tacke, B. Casper HH, 2000. Gene genealogies reveal global phylogeographic structure and reproductive isolation among lineages of Fusarium graminearum, the fungus causing wheat scab. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 97, 7905–10.

O’Donnell, K., Ward, T. J., Robert, V. A., Crous, P. W., Geiser, D. M., & Kang, S. 2015. DNA sequence-based identification of Fusarium: Current status and future directions. Phytoparasitica, 43(5), 583-595.

Oelke, L. M. And Bosland, P. W. 2001. Fusarium Disease of Capsicum. Capsicum & Eggplant Newsletter, No. 20, pp. 86-89, 19 ref.


Pardo-Cardona, V. 1995. Hongos Fitopatógenos de Colombia Universidad Nacional de Colombia Sede Medellín 298pp.

Pegg, K. G., Whiley, A. W., Saranah, J. B., & Glass, R. J. 1985. Control of Phytophthora root rot of avocado with phosphorus acid. Australasian Plant Pathology, 14(2), 25-29.

Peña, R. E. 2000. Plagas y enfermedades del chontaduro. In: R. Reyes.; E. Peña.; J. Gómez (eds). El cultivo de chontaduro (Bactris gasipaes K) para palmito. Tumaco, Colombia. Manual técnico Nº 4. Publicación de CORPOICA REGIONALCINCO. p. 73-80

Petrovic, T., Burgess, L. W., Cowie, I., Warren, R. A., & Harvey, P. R. (2013). Diversity and fertility of Fusarium sacchari from wild rice (Oryza australiensis) in Northern Australia, and pathogenicity tests with wild rice, rice, sorghum and Maíze. European journal of plant pathology, 136(4), 773-788.

Pinto, M., Guzmán, N., Baquero, C., Rebolledo, N. y A. Páez. 2012. Módulo del cultivo del melón. Corporación Colombiana de investigación Agropecuaria Corpoica. 66pp.

Proctor, R. H., Desjardins, A. E., & Moretti, A. 2009. Biological and chemical complexity of Fusarium proliferatum. In The role of plant pathology in food safety and food security (pp. 97-111). Springer Netherlands.

Proctor, R.H.; McCormick, S.P.; Alexander, N.J.; Desjardins, A.E. 2009. Evidence that a secondary metabolic biosynthetic gene cluster has grown by gene relocation during evolution of the filamentous fungus Fusarium. Mol. Microbiol., 74, 1128–1142.

Reynoso, M. M., Ramírez, M. L., Farnochi, M. C., Torres, A. M., & Chulze, S. N. 2013. Population Structure of Fusarium graminearum Species Complex Genotypes and Chemotypes in Relation to Trichothecenes Production. In Fusarium Head Blight in Latin America (pp. 3-13). Springer Netherlands.

Rojas, C. M., Muñoz, L. A., Terán, V. F., Prado, F. A., & Magally, A. Q. 2010. Evaluación de patógenos en clones de lulo (Solanum quitoense Lam.). Acta Agronómica, 59(2), 144-149.

Rojas, T., & Rondón, A. 1995. Control químico in vitro de Fusarium decemcellulare Brick aislado de mango; [In vitro chemical control of Fusarium decemcellulare Brick isolated from mango]. Agronomía Tropical. Venezuela. Jul-Sep, 45(3), 417-428.

Salleh, B. 1994. Diversity of pathogenic and toxigenic fusaria in Southeast Asia. Soil Microorganisms Tsukuba Office of MAFF Research Council 1994. 12. 5-7, 135.

Samson, R., Hoesktra, E., y Frisvad, J. 2004. Introduction to food borne fungi. 7th edition. Central bureau voor Schimmecultures. Ultrecht.

Sañudo, B. 1993. Problemas fungosos de la Lenteja (Lens sculents L.) en el departamento de Nariño. Rev. Ciencias Agrícolas. 12(2) pp. 95-114.

Sañudo, B., Arteaga, M., Vallejo, W., Figueroa, R., Burbano, E. 2003. Fundamentos de Micología agrícola. Ed. Universidad de Nariño. Colombia: Pasto. 201p.

Capítulo 1 47

Silva, M. 2010. Principales enfermedades en los cultivos de importancia económica en los Llanos Orientales. Editorial Universidad de los Llanos. Villavicencio (Colombia). 190pp.

Steenkamp, E., Rodas, C., Kvas, M., y Wingfield, M. 2012. Fusarium circinatum and pitch canker of Pinus in Colombia. Australas. Pl. Pathol. 41: 483-491

Steindorff, A. S., do Nascimento Silva, R., Coelho, A. S. G., Nagata, T., Noronha, E. F., & Ulhoa, C. J. 2012. Trichoderma harzianum expressed sequence tags for identification of genes with putative roles in mycoparasitism against Fusarium solani. Biological Control, 61(2), 134-140.

Tamura K, Stecher G, Peterson D, Filipski A, And Kumar S. 2013 MEGA6: Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 6.0. Molecular Biology and Evolution: 30 2725-2729. DOI:10.1093/molbev/mst197

Turner, P. 1971. Micro-Organisms associated with oil palm (Elaeis guíneensis Jacq.). Pl, Phytopalthological Papers, No. 14. pp.58.

Valcárcel, F. 1995. Enfermedades causadas por patógenos del suelo en crisantemo. Ll Simposio Nacional del Crisantemo, Rionegro (Antioquia). Colombia, p. 29.

Varón de Agudelo, F y Sarria, G. 2007. Enfermedades del maíz y su manejo. Compendio ilustrado. Instituto Colombiano Agropecuario - ICA y Federación Nacional de Cultivadores de Cereales y Leguminosas - FENALCE. Edición grupo Ciencia y Tecnología, Produmedios. Palmira (Valle del Cauca) Colombia. pp.55. Link: http://www.ica.gov.co/getattachment/f1c1f3f1-d775-4216-a5d0-d9d4a67b7943/Publicacion-8.aspx.

Varón, F. 2006. Enfermedades de la pitahaya y su manejo. En: Revista Asiava, 73:19-21

Victoria, J. I. Guzmán, M. L. Ángel, J. C. 1995. Enfermedades de la Caña de Azúcar en Colombia. En: El cultivo de la Caña Azucarera en Colombia. Centro de investigación de la Caña de Azúcar en Colombia - CENICAÑA - Cali, Colombia. P. 265-293.

Wang, Y., Wang, C. W., & Gao, J. 2015. First report of Fusarium proliferatum causing fruit rot on grape (Vitis vinifera) in China. Plant Disease, 99(8).

Ward, T., Bielawski, J., Kistler, H., Sullivan, E., O’Donnell, K. 2002. Ancestral polymorphism and adaptive evolution in the trichothecene mycotoxin gene cluster of phytopathogenic Fusarium. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 99, 9278–83.

Ward, T.J.; Bielawski, J.P.; Kistler, H.C.; Sullivan, E.; O’Donnell, K. 2002. Ancestral polymorphism and adaptive evolution in the trichothecene mycotoxin gene cluster of phytopathogenic Fusarium. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99, 9278–9283.

White, T, Bruns T, Lee S, Y Taylor J. 1990. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. p. 315-322. In M.A. Innis, D.H. Gelfand, J.J. Sninsky and T.J. White (Eds.). PCR Protocols. A guide to methods and applications. Academic Press, London, England.

http://www.ica.gov.co/getattachment/f1c1f3f1-d775-4216-a5d0-d9d4a67b7943/Publicacion-8.aspx

http://www.ica.gov.co/getattachment/f1c1f3f1-d775-4216-a5d0-d9d4a67b7943/Publicacion-8.aspx


White, T., Bruns, T., Lee, S., Taylor, J. 1990. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. In: Innis MA, Gelfand DH, Sninsky JJ, White TJ eds.PCR protocols, a guide to methods and applications. San Diego, California: Academic Press.p 315-322

Wilson, K. 1987. Preparation of genomic ADN from bacteria. In current protocols in molecular biology N. Y. USA. Vol. 1. Brooklyn, N.Y: Wiley Interscience; 1987. pp. 2.4.1–2.4.5.

Woo SL, Zoina A. Sorbo Gdel. Lorito M, Nanni B, Scala F, Noviello C. 1996. Characterization of Fusarium oxysporum f.sp. phaseoli by pathogenic races. VCGs, RFLPS, and RAPD. Phytopathology, 86(9): 966-973; 52 ref. Link: http://www.apsnet.org/publ¡cations/phytopathoIogy/backissues/Documents/1996Articles/Phyto86n09_966.pdf.

Yu, X., Ai, C., Xin, L., & Zhou, G. 2011. The siderophore-producing bacterium, Bacillus subtilis CAS15, has a biocontrol effect on Fusarium wilt and promotes the growth of pepper. European Journal of Soil Biology, 47(2), 138-145.

Zakaria, L., Chik, M. W., Heng, K. W., & Salleh, B. 2012. Fusarium species associated with fruit rot of banana (Musa spp.), papaya (Carica papaya) and guayava (Psidium guajava). Malaysian Journal of Microbiology, 8(2), 127-130.

Capítulo 1 49

A. Anexo: Lista de aislamientos caracterizados molecularmente (Junio 2013 a Diciembre 2014)

No hospedante Parte planta Procedencia Georreferenciación msnm

1 Pitaya Fruto El Dobio /Valle N 4° 30´ 29,635´´ -w 76° 14´ 14,781´´ 1438

2 Pitaya Fruto Fusagasugá /Cundinamarca N 4° 20´ 42,547´´ -w 74° 21´ 42,562´´ 1727

3 Pitaya Fruto Palmira/Valle N 3° 31´ 55,247´´ -w 76° 17´ 43,53´´ 1012



6 Pitaya Fruto Berbeo /Boyacá N 5° 13´ 37,106´´ -w 73° 7´ 38,132´´ 1335


8 Pitaya Fruto Belén De Umbría /Risaralda N 5° 12´ 3,251´´ -w 75° 52´ 9,339´´ 1496


10 Pitaya Fruto Belén De Umbría /Risaralda N 5° 12´ 3,251´´ -w 75° 52´ 9,339´´ 1496



13 Pitaya Fruto Berbeo /Boyacá N 5° 13´ 37,106´´ -w 73° 7´ 38,132´´ 1335





No. hospedante Parte planta Procedencia Georreferenciación msnm

18 Maíz Grano Fundación/Magdalena N 10° 31´ 1,844´´ -w 74° 10´ 55,192´´ 50

19 Maíz Grano Sibundoy/ Putumayo N 1° 12´ 9,05´´ -w 76° 55´ 16,409´´ 2104

20 Maíz Grano Zambrano /Bolívar N 9° 44´ 3,90´´ -w 74° 48´ 5,80´´ 10

21 Maíz Grano Ocaña / N. Santander N 8° 13´ 5,86´´ -w 73° 19´ 2,61´´ 1201

22 Maíz Grano San Fco /Putumayo N 1° 10´ 3,09´´ -w 76° 53´ 1,69´´ 2137

23 Maíz Grano Rio Sucio/ Caldas N 5° 25´ 14,462´´ -w 75° 42´ 19,396´´ 1793

24 Maíz Grano Riohacha /Guajira N 11° 14´ 5,07´´ -w 73° 03´ 1,22´´ 42

25 Maíz Grano Guayata/ Boyacá N 4° 58´ 0,05´´ -w 73° 29´ 2,98´´ 1699

26 Maíz Grano Fundación/Magdalena N 10° 31´ 2,36´´ -w 74° 11´ 0,70´´ 62

27 Maíz Grano Tierraalta /Córdoba N 8° 08´ 1,09´´ -w 76° 03´ 4,76´´ 63

28 Maíz Grano Bochalema /N. Santander/ N 7° 36´ 4,59´´ -w 72° 38´ 5,04´´ 1068

29 Maíz Grano Carmen De Viboral/ Antioquia N 6° 05´ 4,25´´ -w 75° 22´ 5,92´´ 2127

30 Maíz Grano Polo Nuevo /Atlántico N 10° 46´ 3,50´´ -w 74° 51´ 0,50´´ 89

31 Maíz Grano Belén de los Andaquies /Caq. N 1° 25´ 12,05´´ -w 75° 52´ 20,344´´ 306

32 Maíz Grano Las Piedras/ Tolima N 4° 3´ 2,44´´ -w 74° 5´ 2,43´´ 387

33 Maíz Grano Juan De Acosta/ Atlántico N 10° 48´ 4,00´´ -w 75° 06´ 4,40´´ 30

34 Maíz Grano Sin registro en banco

35 Maíz Grano Tierraalta/Córdoba N °3 13´ 1,95´´ -w 76° 24´ 5,33´´ 63

36 Maíz Grano Campo De La Cruz/ Atlántico N 10° 2´ 2,44´´ -w 74° 5´ 2,1´´ 9

37 Maíz Grano El Cairo/Valle N 4° 45´ 5,10´´ -w 76° 14´ 0,60´´ 1727

38 Maíz Grano Tierralta /Córdoba N 8° 08´ 1,09´´ -w 76° 03´ 4,76´´ 63

39 Maíz Grano La Palma/ Cundinamarca N 5° 30´ 1,14´´ -w 74° 23´ 1,27´´ 1125

40 Maíz Grano San Agustín/Huila N 1° 52´ 4,92´´ -w 76° 16´ 1,70´´ 1650

41 Maíz Grano Choachi /Cundinamarca N 4° 30´ 1,95´´ -w 76° 54´ 3,87´´ 1765


42 Maíz Grano Unal/Palmira/Valle N 3°30'42,0669"- w76°18'26,6796" 999


43 Maíz Grano Unal/Palmira/Valle N 3°30'42,0669"- w76°18'26,6796" 999

44 Maíz Grano Corpoica/Palmira/Valle N 3°31'16,0248"- w76°18'24,7032" 998







51 Maíz Grano Patía -Cauca N 2°4'9,4836"- w77°3'11,142" 617



54 Maíz Grano Rozo/Palmira/Valle N 3°36'56,7432"- w 76°23'17,142" 967




58 Maíz Grano Bolívar/Valle N 4°20'19,0536"-w76° 11'12,3468" 993





63 Maíz Grano Candelaria/Valle N3°24'50,454"- w76°21'3,1644 972




67 Maíz Grano Versalles/Valle N4°34'24,15"-w76°11'54,3336 1883




71 Maíz Grano Cerrito/Valle N3°37'37,5456" -w76°23'17,1636 965




75 Maíz Grano Guacari/Valle N 3°45'36,6516"- w 76°20'15,414" 969



78 Maíz Grano Riofrío/Valle N 4°9'23,868"- w 76°17'15,9432" 943



81 Maíz Grano Corpoica/Palmira/Valle N 3°31'16,0248- w76°18'24,7038 996




84 Piñuela Fruto Mercaderes /Cauca N 1º 47' 44,884" -w 77º 9' 48,229" 1160

85 Maracuyá Raíz Unión /Valle N 4° 33´ 0,564´´ -w 76° 6´ 13,017´´ 962

86 Pitaya Fruto Palmira /Valle N 3° 31´ 55,247´´ -w 76° 17´ 43,53´´ 1001

87 Pimentón Raíz Yumbo /Valle N 3° 34´ 50,559´´ -w 76° 29´ 34,022´´ 994

88 Maracuyá Raíz- La Unión /Valle/ N 4° 33´ 0,564´´ -w 76° 6´ 13,017´´ 962

89 Maracuyá Raíz La Unión/Valle N 4° 33´ 0,564´´ -w 76° 6´ 13,017´´ 962

90 Maracuyá Raíz LA Unión/Valle N 4° 33´ 0,564´´ -w 76° 6´ 13,017´´ 962

91 Heliconia Raíz Pereira /Risaralda N 4° 48´ 17,186´´ -w 75° 42´ 49,539´´ 1317

92 Suelo Boyacá/Boyacá N 5° 27´ 16,24´´ -w 73° 21´ 43,21´´ 10

93 Suelo Miraflores /Boyacá N 5° 11´ 47,022´´ -w 73° 8´ 35,019´´ 1510

94 Guayaba Fruto La Unión/Valle N 4° 32´ 0,564´´ -w 76° 6´ 13,017´´ 962

95 Cacao Raíz Palmira/Valle N 3° 31´ 55,247´´ -w 76° 17´ 43,53´´ 1001

96 Pimentón Raíz Darién /Valle N 3° 55´ 52,759´´ -w 76° 29´ 13,923´´ 1531

97 Maracuyá Tallo La Unión/Valle N 4° 33´ 0,564´´ -w 76° 6´ 13,017´´ 962

Capítulo 1 51

98 Algodón Raíz Palmira /Valle N 3° 31´ 55,247´´ -w 76° 17´ 43,53´´ 1001

99 Algodón Raíz Cerete/Córdoba N 8° 2´ 57,455´´ -w 75° 34´ 26,579´´ 69

100 Maracuyá Tallo Palmira/ Valle N 3° 31´ 55,247´´ -w 76° 17´ 43,53´´ 1001

101 Piñuela Fruto La Cumbre/ Valle N 3° 38´ 57,991´´ -w 76° 34´ 4,641´´ 1576

102 Suelo Riohacha/Guajira N 11° 32´ 10,932´´ -w 72° 55´ 8,364´´ 11

103 Rosa Tallo Bogotá/ Cundinamarca N 4° 37´ 22,058´´ -w 74° 5´ 27,456´´ 2563

104 Suelo Bravo /Santander N 3° 38´ 37,347´´ -w 73° 39´ 13,035´´ 705

105 Papaya Fruto La Unión /Valle N 4° 33´ 0,564´´ -w 76° 6´ 13,017´´ 962

106 Lulo Tallo Sibundoy/Putumayo N 1° 12´ 9,05´´ -w 76° 55´ 16,409´´ 2104

107 Laurel Tallo Pasto /El Encano/ Nariño N 1° 12´ 37,678´´ -w 77° 16´ 58,9´´ 2561

108 Tomate de árbol Raíz Samaniego/ Nariño N 1° 20´ 12,858´´ -w 77° 35´ 32,366´´ 1505

109 Arveja Raíz Pasto /Nariño N 1° 12´ 37,678´´ -w 77° 16´ 58,9´´ 2561

110 Tomate tallo Tallo Unal /Palmira/Valle N 3° 31´ 55,247´´ -w 76° 17´ 43,53´´ 1001


111 Vid Fruto Ginebra/Valle N 3° 43´ 33.276´´ -w 76° 17´ 23,1´´ 1004

112 Papaya Raíz Zarzal/Valle N 4° 24´ 38,088´´ -w 76° 4´ 50,087´´ 907

113 Melón Tallo Roldanillo/Valle N 4° 24´ 30,06´´ -w 76° 6´ 25,019´´ 910

114 Papaya Raíz Zarzal/Valle N 4° 24´ 38,088´´ -w 76° 4´ 50,087´´ 907

115 Lulo Fruto Tuluá/Valle N 3° 58´ 9,264´´ -w 76° 4´ 47,927´´ 1815

116 Lulo Fruto Tuluá/Valle N 3° 58´ 9,264´´ -w 76° 4´ 47,927´´ 1815

117 Aguacate Fruto Yotoco/Valle N 3° 51´ 36,983´´ -w 76° 23´ 4,668´´ 959

118 Piña Raíz Dagua/Valle N 3° 44´ 16,224´´ -w 76° 40´ 35,111´´ 908

119 Maracuyá Fruto Roldanillo/Valle N 4° 28´ 41,092´´ -w 76° 6´ 54,025´´ 920

120 Aguacate Fruto Versalles/Valle N 4° 39´ 0,18´´ -w 76° 8´ 0,095´´ 1763

121 Lulo Tallo Cali/Valle N 3° 27´ 8,856´´ -w 76° 32´ 8.728´´ 2086

122 Maracuyá Fruto Trujillo/Valle N 4° 15´ 3,996´´ -w 76° 13´ 39,683´´ 926

123 Maracuyá Punteros Trujillo/Valle N 4° 15´ 3,996´´ -w 76° 13´ 39,683´´ 926

124 Piña Raíz Dagua/Valle N 3° 44´ 16,224´´ -w 76° 40´ 35,111´´ 908

125 Aguacate Fruto Sevilla/Valle N 4° 16´ 27,76´´ -w 75° 55´ 51,614´´ 1615

126 Aguacate Raíz Cali/Valle N 3° 27´ 8,856´´ -w 76° 32´ 8.728´´ 2086

127 Aguacate Fruto Argelia/Valle N 4° 43´ 39,983´´ -w 76° 7´ 17,45´´ 1522

128 Lulo Hojas Restrepo/Valle N 3° 49´ 18,192´´ -w 76° 31´ 13,691´´ 1394

129 Mora Tallo Ginebra/Valle N 3° 43´ 30,842´´ -w 76° 16´ 9,404´´ 1034

130 Maracuyá Fruto Andalucía/Valle N 4° 10´ 7,36´´ -w 76° 10´ 2,549´´ 961

131 Mora Fruto Ginebra/Valle N 3° 43´ 30,842´´ -w 76° 16´ 9,404´ 1034

132 Vid Hojas Roldanillo/Valle N 4° 29´ 45,02´´ -w 76° 6´ 8,092´´ 910

133 Mango Flores La Unión/Valle N 4° 32´ 0,564´´ -w 76° 6´ 13,017´´ 1163

134 Maracuyá Frutos Bolívar/Valle N 4° 16´ 18,156´´ -w 76° 12´ 40,068´´ 922

135 Mora Frutos Ginebra/Valle N 3° 43´ 30,842´´ -w 76° 16´ 9,404´´ 1034

136 Maracuyá Frutos Jamundí/Valle N 3° 7´ 38,644´´ -w 76° 35´ 35,397´´ 973

137 Mango Hojas Obando/Valle N 4° 34´ 32,164´´ -w 75° 58´ 21,608´´ 933

138 Banano Tallo Sevilla/Valle N 4° 16´ 27,76´´ -w 75° 55´ 51,614´´ 1615

139 Guanábana Fruto La Paila/Valle N 4° 19´ 14,84´´ -w 76° 4´ 19,469´´ 935

140 Aguacate Hojas Argelia/Valle N 4° 43´ 39,983´´ -w 76° 7´ 17,45´´ 1522

141 Fresa Hojas Ginebra/Valle N 3° 39´ 27,765´´ -w 76° 13´ 28,23´ 1034


143 Mora Hojas Tuluá/Valle N 3° 58´ 9,264´´ -w 76° 4´ 47,927´´ 969

144 Mora Hojas Ginebra/Valle N 3° 39´ 27,765´´ -w 76° 13´ 28,23´ 1034

145 Aguacate Hojas Argelia/Valle N 4° 43´ 39,983´´ -w 76° 7´ 17,45´´ 1522

146 Mora Ramas Cali/Valle N 3° 28´ 17,272´´ -w 76° 29´ 53,655´´ 1006

147 Pitahaya Fruto La Unión/Valle N 4° 32´ 0,564´´ -w 76° 6´ 13,017´´ 962

148 Mora Fruto Ginebra/Valle N 3° 43´ 30,842´´ -w 76° 16´ 9,404´´ 1034

149 Aguacate Fruto El Cairo/Valle N 4° 45´ 39,722´´ -w 76° 13´ 19,725´´ 1917

150 Mora Tallo Tuluá/Valle N 4° 5´ 28,831´´ -w 76° 11´ 46,611´´ 969

151 Vid Hojas Ginebra/Valle N 3° 43´ 30,842´´ -w 76° 16´ 9,404´´ 1034

152 Maracuyá Frutos Bolívar/Valle N 4° 16´ 18,156´´ -w 76° 12´ 40,068´´ 922


153 Ají Tallo Palmira/Valle N 3° 31´ 55,247´´ -w 76° 17´ 43,53´´ 1012

154 Melón Fruto La Unión/Valle N 4° 36´ 40,633´´ -w 76° 4´ 42,934´´ 950

155 Maracuyá Fruto Roldanillo/Valle N 4° 9´ 58,703´´ -w 76° 18´ 59,987´´ 972

156 Uva Hojas Ginebra/Valle N 4° 43´ 39,983´´ -w 76° 7´ 17,45´´ 1522

157 Piña Hojas Santander De Quilichao/Valle N 4° 16´ 27,76´´ -w 75° 55´ 51,614´´ 1615


159 Aguacate Fruto Argelia/Valle 4° 43´ 39,983´´ -w 76° 7´ 17,45´´ 1522

160 Aguacate Hojas Palmira/Valle N 4° 32´ 0,564´´ -w 76° 6´ 13,017´´ 962

161 Uva Pedúnculo Ginebra /Valle N 3° 39´ 27,765´´ -w 76° 13´ 28,23´ 1034

162 Guama Fruto Cali/Valle N 4° 32´ 0,564´´ -w 76° 6´ 13,017´´ 962

163 Aguacate Pedúnculo Argelia/Valle N 3° 49´ 18,192´´ -w 76° 31´ 13,691´´ 1394


165 Melón Hojas Roldanillo/Valle N 3° 43´ 30,842´´ -w 76° 16´ 9,404´´ 972

166 Mora Tallo El Águila/Valle N 3° 49´ 18,192´´ -w 76° 31´ 13,691´´ 1394

167 Maracuyá Fruto Toro/Valle N 3° 43´ 33,276´´ -w 76° 17´ 23,1´´ 1004

168 Vid Fruto Ginebra/Valle N 4° 24´ 50,897´´ -w 76° 9´ 7,822´´ 939

169 Lulo Hojas Guacari/Valle N 4° 16´ 18,156´´ -w 76° 12´ 40,068´´ 922

170 Mango Fruto La Unión/Valle N 4° 20´ 19,054´´ -w 76° 11´ 12,346´´ 933

171 Piña Raíz Restrepo/Valle N 3° 39´ 27,765´´ -w 76° 13´ 28,23´ 973


173 Vid Hojas Ginebra/Valle N 4° 24´ 50,897´´ -w 76° 9´ 7,822´´ 1034

174 Chontaduro Hojas Buenaventura/Valle N 3° 25´ 5,47´´ -w 76° 14´ 32,19´´ 1061

175 Cítricos Raíz Jamundí/Valle N 3° 7´ 38,644´´ -w 76° 35´ 35,397´´ 973

176 Maracuyá Fruto Bolívar/Valle N 3° 41´ 2,702´´ -w 76° 18´ 46,785´´ 994

177 Mora Fruto Tenerife/Valle N 3° 44´ 45,888´´ -w 76° 10´ 40,799´´ 1618

178 Aguacate Fruto Caicedonia/Valle N 4° 19´ 58,486´´ -w 75° 49´ 37,585´´ 1165

179 Maracuyá Hojas Bolívar/Valle N 4° 16´ 18,156´´ -w 76° 12´ 40,068´´ 933

180 Chontaduro Hojas Buenaventura/Valle N 3° 53´ 26,073´´ -w 77° 4´ 43,647´´ 7

181 Maracuyá Fruto Bolívar/Valle N 3° 43´ 33,276´´ -w 76° 17´ 23,1´´ 1004

182 Mango Tallo La Unión/Valle N 4° 21´ 26,986´´ -w 76° 21´ 16,048´´ 1163

183 Maracuyá Hojas Obando/Valle N 4° 34´ 32,164´´ -w 75° 58´ 21,608´´ 933

184 Aguacate Fruto El Cerrito/Valle N 4° 32´ 0,564´´ -w 76° 6´ 13,017´´ 994

185 Pitaya Fruto La Unión/Valle N 4° 21´ 26,986´´ -w 76° 21´ 16,048´´ 1163

186 Mora Hojas Tuluá/Valle N 3° 58´ 9,264´´ -w 76° 4´ 47,927´´ 969

187 Vid Fruto Ginebra/Valle N 3° 39´ 27,765´´ -w 76° 13´ 28,23´ 1034

188 Lulo Tallo Guacari/Valle N 3° 45´ 46,732´´ -w 76° 19´ 56,895´´ 976

189 Vid Hojas Ginebra/Valle N 3° 39´ 27,765´´ -w 76° 13´ 28,23´ 1034

190 Ají Tallo Guacari/Valle N 3° 45´ 46,732´´ -w 76° 19´ 56,895´´ 976


191 Pimentón Fruto Bolívar/Valle N 4º 22' 9,5" -w 76º 14' 53,1" 1629

192 Pimentón Fruto Bolívar/Valle N 4º 22' 9,5" - w 76º 14' 53,1" 1629

193 Ají Fruto Darién/Valle N 3º 58' 5,8" -w 76º 25' 50,1" 1534

194 Ají Fruto Darién/Valle N 3º 56' 51,6" -w76º 29' 11,1" 1638

195 Ají Fruto Darién/Valle N 3º 56' 51,6" -w 76º 29' 11,1" 1638

196 Ají Fruto Darién/Valle N 3º 56'5 1,1"-w 76º 29' 11,1" 1638

197 Ají Fruto Darién/Valle N 3º 56'5 1,1"-w 76º 29' 1638

198 Ají Fruto Santa Helena/Palmira/Valle N 3º 30' 59,04"-w 76º 23' 16,908" 960

199 Pimentón Fruto Yumbo/Valle N 3º 38' 15,3" -w 76º 28' 52,3" 1021

200 Ají Fruto Yumbo/Valle N 3º 38' 15,3" -w 76º 28' 52,3" 1021



203 Ají Fruto Yotoco/Valle N 3º 58' 26,3" -w 76º 23' 25" 1636

204 Ají Fruto Ceunp/Palmira/Valle N 3º 41' 53,96" -w 76º 43' 84,19" 980



2. Capítulo 2

Caracterización molecular de aislamientos de Fusarium productores de micotoxinas

Molecular characterization of isolates of Fusarium mycotoxin producers

2.1 Resumen

Las micotoxinas son metabolitos secundarios originados de forma natural y producida principalmente por hongos de los géneros Aspegillus, Penicillium y Fusarium. Las contaminaciones por Fusarium son consideradas como uno de los mayores problemas agrícolas no solo por afectar el rendimiento y la calidad de los productos sino también por causar daños en la salud de los animales y el hombre. Con el objetivo de caracterizar aislamientos de Fusarium productores de micotoxinas se evaluó una colección de trabajo perteneciente al Grupo de investigación de Protección vegetal para el mejoramiento de la productividad de la Universidad Nacional de Colombia, con 206 individuos procedentes de diversos cultivos y regiones de Colombia. La caracterización molecular se realizó haciendo uso de PCR con los cebadores ITS1 – ITS4 y TEF1α. Las secuencias de los productos de PCR se compararon con el National Center for Biotecnology Information (NCBI) y el programa Fusarium ID y se alinearon usando Clustal W2, se construyeron las relaciones filogenéticas con el programa MEGA 6 con el coeficiente de similitud del vecino más cercano y Máxima parsimonia con un bootstrap de 1000 réplicas. Los árboles filogenéticos y las comparaciones del NCBI y Fusarium ID permitieron escoger 33 aislamientos que fueron caracterizados molecularmente con cebadores específicos para las micotoxinas del grupo de los tricotecenos, fumonisinas y zearalenonas. Las especies F. graminearum y F. equiseti amplificaron para tricotecenos y zearalenona, F. verticillioides y F. proliferatum fueron las especies más representativas del grupo de fumonisinas. Se registra también presencia de fumonisinas en la especie como F. oxysporum aun sin registro en Colombia.

Palabras clave: Fusarium, fumonisinas, tricotecenos, zearalenona.

2.2 Abstract

Mycotoxins are secondary metabolites originated naturally and produced mainly by fungi of

the genera Aspergillus, Penicillium and Fusarium. Contamination by Fusarium are

considered as one of the biggest agricultural problems not only affect the yield and quality

of products but also affecting the health of animals and man. With the objetive of

characterizing isolates of Fusarium producing mycotoxin a work collection belonging to the

Research Group Plant protection for improving productivity of the National University of

Colombia, with 206 individuals from various crops and regions of Colombia was evaluated.

The molecular characterization was performed using PCR primers ITS1 - ITS4 and TEF1α.

54 Caracterización molecular de aislamientos de Fusarium productores de

micotoxinas

The sequences of the PCR products were compared with the National Center for

Biotechnology Information (NCBI) and the Fusarium ID program and aligned using Clustal

W2, phylogenetic relationships with the MEGA program 6 were constructed with the

similarity coefficient of nearest neighbor and maximum parsimony with 1000 bootstrap

replicates. Phylogenetic trees and comparisons whit Fusarium ID and NCBI allowed to

choose 33 isolates that were characterized molecularly with primers specific for mycotoxins

group of trichothecenes, fumonisin and zearalenones. F. graminearum species and F.

equiseti for trichothecenes and zearalenone amplified, F. verticillioides and F. proliferatum

were the most representative species of the group of fumonisin. presence of fumonisin is

also recorded in the species as F. oxysporum species even without registration in

Colombia.

Keywords: Fusarium, fumonisins, trichothecenes, zearalenone.

2.3 Introducción

Fusarium es considerado uno de los géneros de hongos más importantes del mundo, puesto que sus especies pueden afectar principalmente la calidad y rendimiento de las cosechas, la salud humana y animal. En plantas, 81 de las 101 especies económicamente importantes se ven afectadas por marchitamiento vascular, necrosamiento, amarillamiento y enfermedades conocidas como fusariosis. Además de estos síntomas también se han registrado como productoras de metabolitos secundarios que pueden causar cáncer y otros efectos deletéreos en humanos y animales (Leslie y Summerell, 2006; Awad et al., 2013; Sumalan et al., 2013).

A partir de la década de los 60’s, las investigaciones se orientaron a determinar los principales metabolitos secundarios, hasta el momento se conocen a los tricotecenos, fumonisinas, zearalenonas, beauvercinas, enniatinas, butenolidas, equisetinas y las fusarinas como micotoxinas producidas por algunas especies de Fusarium. En su mayoría se han registrado como causantes de daños severos en el hombre y animales (Desjardins y Proctor, 2001; Desjardins y Proctor, 2007; Magan et al., 2010).

Las micotoxinas producidas por el género Fusarium tienen lugar a partir de un número reducido de precursores derivados de intermediarios del metabolismo primario del hongo, dando origen a pequeñas cantidades de toxinas que resultan dañinas para los organismos. Es así, como el estudio de los metabolitos secundarios asociados al hongo, han permitido descifrar las rutas metabólicas que los producen e identificar y secuenciar los genes responsables de su biosíntesis. Con este conocimiento se han generado también oligonucleótidos que facilitan el estudio de nuevos aislamientos toxigénicos dentro del género, los cuales tienen mayor relevancia puesto que se conocen cuáles de éstos desencadenan intoxicaciones agudas o crónicas para la salud humana y animal (Díaz, 1997; Jestoi, 2005; Desjardins, 2006; Zhang et al., 2013; Chakrabarti, 2013).

Estudios de última generación se enfocan en caracterizar molecularmente los genes involucrados en la biosíntesis de las rutas metabólicas de las micotoxinas, entre ellas, las causantes de enfermedades en cereales de importancia económica como el maíz, trigo y centeno. Grupos de investigadores norteamericanos, europeos y asiáticos han demostrado que el proceso evolutivo de los genes involucrados en la biosíntesis de micotoxinas ha sido

Capítulo 2 55

independiente del resto del genoma de los hongos (O’ Donnell et al., 2000; Ward, et al., 2002; Aoki, 2012; Menke et al., 2013).

El desarrollo más significativo en investigación del género Fusarium ha sido la obtención de secuencias del genoma. En el año 2007 se secuenció el genoma de F. graminearum (Cuomo et al., 2007) y dos años más tarde el instituto Broad liberó una base de datos del genoma comparativo que contenía las secuencias de F. verticillioides y F. oxysporum (http:broadinstitute.org/annotation/genome/fusarium_group/multihome.htlm), luego, se secuenció F. solani (Teleomorfo de Nectria haematococcoa); esto ha permitido conocer la evolución de las especies del género y ampliar el conocimiento en sistemática y filogenia (Chakrabarti, 2013).

Desde hace veinte años el método usado para detectar e identificar micotoxinas es la reacción en cadena de la polimerasa PCR, a partir del 2007 la literatura empieza a documentar trabajos modernos de diagnóstico, detección y cuantificación de toxinas de Fusarium como sistemas múltiples de PCR en tiempo real y PCR en tiempo real (Gong et al., 2015).

En los últimos años trabajos de biología molecular se han orientado a estudiar los grupos más importantes de micotoxinas que causan enfermedades al hombre y animales entre ellos están: tricotecenos, fumonisinas y zearalenonas. Micotoxinas como beauvericinas, eniatinas equisetinas y fusarinas a pesar de producir metabolitos que son carcinogénicos y tóxicos se han estudiado en menor proporción (Desjardins y Proctor, 2007).

Los tricotecenos son el grupo de compuestos más numerosos de micotoxinas hasta ahora descubierto, son producidos por varias especies de géneros entre ellos están Fusarium, Cryptomela, Myrothecium, Stachybrotys, Trichoderma/Hipocrea, Trichotecium y Verticimonosporium (Turner y Aldridge 1983: Frisvad y Thrane, 2004). Están estrechamente relacionados en cuanto a su estructura química y molecular que tienen en común poseer un anillo tetraciclico 12,13 epoxi-tricoticeno clasificándose en macrocíclicos y no macrocíclicos dependiendo de la presencia o no del anillo en su estructura. La vía de biosíntesis de los tricotecenos es la péptido sintasa (Dejardins y Proctor, 2006; Awad, et al., 2013; Stepien, 2013; Geng et al., 2014).

Para el caso del Fusarium, los tricotecenos no macrocíclicos se dividen en tricotecenos tipo A y B; el grupo A incluye la toxina T-2 y la toxina HT-2, el diacetoxiscirpenol (DAS) y el neosolaniol (NEO) y el grupo B, incluye: deoxinivalenol (DON), nivalenol (NIV) y fusarenon X; los cuales son producidos principalmente por las especies F. verticililoides, F. graminearum y F. culmorun. La toxicidad de este grupo de toxinas está caracterizada por alteraciones gastrointestinales como vómito y diarrea; además, son extremadamente tóxicas a nivel celular (citotóxicas) así como altamente inmunosupresoras (Desjardins y Proctor, 2007; Zhang et al., 2013). La biosíntesis de tricotecenos está constituida por un proceso de múltiples etapas y controlada por 12 genes que forman un cluster de 25 kb de longitud, éste, está ligado al gen TRI5 que codifica la enzima tricodiene sintasa capaz de inhibir la síntesis de proteína ribosomal (Desjardins y Proctor, 2007; Dawidziuk et al., 2014).

Las Fumonisinas (FUM) son un grupo de al menos 15 micotoxinas producidas principalmente por F. verticillioides (F. moniliforme) y F. proliferatum, la toxicidad ha sido documentada por más de 20 años, aunque fueron descritas inicialmente en 1988 por investigadores africanos (Desjardins y Hohn, 1997). Aunque las fumonisinas tienen una estructura química simple la inhibición del metabolismo de los esfingolipidos causa efectos complejos en los animales. A la fecha los genes de biosíntesis de fumonisina han sido

http://fusarium_/


micotoxinas

mapeados para un locus en el genoma de F. verticillioides. Estas producen efectos en los animales como leucoencefalomalacia en equinos (Reblandecimiento de la mielina del encéfalo) edema pulmonar en cerdos, así como toxicidad del riñón y cáncer del hígado en ratas. Su efecto en humanos ha sido difícil de determinar, sin embargo, se han asociado con una alta incidencia de cáncer de esófago y cáncer hepático en ciertas áreas endémicas de China (Desjardins y Proctor, 2007). La mayoría de fumonisinas están presentes en cereales, en maíz la fumonisina B1 es la más sobresaliente (Proctor et al., 2006; Fanelli et al., 2013).

Zearalenona (ZEA) También conocida como toxina F-2 o ZEN. Es una micotoxina de distribución mundial, los principales cultivos afectados son trigo, maíz, sorgo, cebada y pastos. Se ha encontrado en cerveza, fríjoles, plátano y soya (Mendez y Moreno, 2009). Es producida por F. graminearum, F. equiseti, F. crookwellense y F. colmorum. Químicamente, corresponde a una lactona ácida resorcilica, aunque su estructura química no es de tipo esteroidal, su mecanismo bioquímico de acción consiste en estimular los receptores celulares incolucrados en la producción de estrógenos, causando síntomas de hiperestrogenismo en especies susceptibles como humanos y cerdos. La capacidad de la ZEA para acoplarse a los receptores del 17-ß-estradiol ha determinado la acción tóxica de esta micotoxina, que compite con los estrógenos por los receptores citosólicos de las células de los órganos blanco y se une a estos, comportándose como un disruptor endocrino. Es parcialmente degradada por efecto de temperatura, (120-140°C) y por tanto, siempre existirá un remanente en los alimentos, aun después del procesamiento. En humanos se ha relacionado el consumo de ZEA con la presentación de pubertad precoz en niñas y aumento del tamaño de los órganos reproductores en niños (Duarte y Villamil, 2006; Awad et al., 2013). En Colombia, han sido encontradas en maíz, sorgo, harina de arroz, torta de algodón y alimentos completos (Díaz, 2005).

En Colombia, el estudio de micotoxinas en productos procesados se inició en la década de los noventa y abordó investigaciones tendientes a determinar la problemática en alimentos de consumo humano y animal, como los desarrollados por el Grupo de investigación en toxicología y nutrición Aviar de La Universidad Nacional de Colombia, en investigaciones relacionadas con micotoxinas como: aflatoxinas, tricotecenos, zearalenonas y fumonisinas, indican que la incidencia de estos compuestos está por encima de los niveles permitidos; por lo tanto sugieren llevar a cabo monitoreos con el fin de determinar su relevancia en el país en términos económicos y de salud (Perilla y Díaz 1998; Díaz, 2005).

De otra parte, los niveles de tolerancia admitidos para algunas micotoxinas han sido motivo de un estudio detallado en Norteamérica y en países de Europa y Asia. No obstante, la información respecto a la incidencia y niveles de contaminación en América Latina es muy limitada. En Colombia la situación es similar, ya que el desarrollo investigativo en esta área es deficiente; por lo tanto, los pocos estudios realizados con micotoxinas demuestran una alta incidencia de fumonisina B1 en muestras de maíz de consumo animal y humano (Perilla y Díaz, 1998). Otro registro de micotoxinas del grupo de las aflatoxinas lo presentan en revisión Duarte y Villamil (2006).

Con los antecedentes expuestos, el objetivo de este trabajo fue determinar mediante marcadores moleculares, especies del género Fusarium con capacidad toxigénica, procedentes de diversos cultivos y localidades de Colombia.

Capítulo 2 57

2.4 Materiales y métodos

El trabajo se desarrolló en el laboratorio de Diagnóstico Vegetal de la Universidad Nacional de Colombia, sede Palmira y en los laboratorios de fitopatología y biotecnología del Centro de Investigación C.I. Corpoica Palmira. Esta investigación hace parte de los proyectos del Grupo de investigación en Protección Vegetal para el Mejoramiento de la Productividad de la Universidad Nacional de Colombia.

2.4.1 Aislamiento, medio y condiciones de cultivo

Se partió de una colección de trabajo perteneciente al grupo de Investigación de Protección de cultivos para el mejoramiento de la productividad de la Universidad Nacional de Colombia sede Palmira compuesta por 206 aislamientos, estos fueron procesados e identificados de acuerdo con su procedencia, parte de la planta afectada y hospedante. Los cuales se conservaron en glicerol al 10% a -4°C en el laboratorio de Diagnóstico Vegetal de la Universidad Nacional de Colombia sede Palmira.

Los aislamientos se purificaron y se llevaron a cultivos monospóricos con el fin extraer el ADN y ser caracterizados por métodos moleculares con los cebadores ITS1-ITS4 y TEF1α como se detalla en el capítulo uno de este documento.

Los productos de PCR se secuenciaron mediante el método de Sanger en MACROGEN, Corea. La identidad a nivel de especie se determinó mediante el programa BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) del NCBI (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) y el programa Fusarium ID Versión 1 (Geisser et al., 2004)

Las secuencias fueron alineadas con el programa ClustalW. Los análisis filogenéticos se realizaron con el coeficiente de similitud de Neighbor joining (NJ) y Máxima parsimonia (MP) con un bootstrap de 1000 réplicas, usando el programa MEGA 6 (Tamura et al., 2013).

Con los árboles filogenéticos obtenidos en el capítulo uno se determinó la población de aislamientos que presentaron diferencias entre y dentro de cada especie de Fusarium (Tabla 2-1).

Tabla 0-1: Especie, hospedante y procedencia de aislamientos obtenidos por análisis filogenéticos de la colección de la Universidad Nacional de Colombia—Sede Palmira.

Aislamiento Especie Hospedante Procedencia

27 F. camptoceras Maíz Tierraalta /Córdoba

32 F. graminearum Maíz Las Piedras/ Tolima

34 F. guttiforme Maíz Sin registro en banco

35 F. decemcellulare Maíz Tierraalta /Córdoba

37 F. oxysporum Maíz El Cairo/Valle

38 F. verticillioides Maíz Tierralta /Córdoba

40 F. verticillioides Maíz San Agustín/Huila

42 F. verticillioides Maíz Unal/Palmira/Valle

46 F. oxysporum Maíz Corpoica/Palmira/Valle

56 F. solani Maíz Rozo/Palmira/Valle

61 F. proliferatum Maíz Bolívar/Valle

67 F. graminearum Maíz Versalles/Valle

73 F. verticillioides Maíz Cerrito/Valle

75 F. verticillioides Maíz Guacarí/Valle


micotoxinas

80 F. verticillioides Maíz Riofrío/Valle

83 F. verticillioides Maíz Corpoica/Palmira/Valle

88 F. oxysporum Maracuyá La Unión /Valle/

107 F. oxysporum Laurel San Pablo/Nariño

112 F. solani Papaya Zarzal/Valle

113 F. equiseti Melón Roldanillo/Valle

115 F. chlamydosporium Lulo Tuluá/Valle

126 F. solani Aguacate Sevilla/Valle

127 F. solani Aguacate Cali/Valle

128 F. equiseti Lulo Argelia/Valle

130 F. cf incarnatum Maracuyá Andalucía/Valle

132 F. verticillioides Vid Roldanillo/Valle

134 F. proliferatum Maracuyá Bolívar/Valle

139 F. cf solani Guanábana La Paila/Valle

144 F. verticillioides Mora Ginebra/Valle

145 F. incarnatum Aguacate Argelia/Valle

153 F. oxysporum Ají Palmira/Valle

159 F. decemcellulare Aguacate Argelia/Valle

202 F. oxysporum Pimentón Palmira/Valle

2.4.2 PCR para detección de las micotoxinas

Deoxynivalenol

La reacción de PCR se realizó en un volumen final de 25 µl, se adicionaron 12.5 µL de

Green Master mix (Thermo scientific®), 1 µL de cada primer (10pmol/µL), 2µL de ADN

(20ng) y se completó con el agua libre de nucleasas que contenía el kit. El programa de

PCR para esta micotoxina comprendió una desnaturación inicial a 94 °C por 2 min, seguido

de 35 ciclos de desnaturación a 94 °C por 60 segundos, hibridación a 59°C por 45

segundos, extensión de 72°C por 90 segundos y una elongación final de 72 °C por 8

minutos.

Nivalenol

La PCR se realizó en un volumen final de 25 µl, se adicionaron 12.5µLde Green Master

mix (Thermo scientific®), 0.5 µL de cada primer (10pmol/µL), 2µL de ADN (20ng) y se

completó con el agua libre de nucleasas que contiene el kit. El programa alcanzó una

desnaturación inicial a 94 °C en 25 segundos, seguido de 30 ciclos de desnaturación a 94

°C por 30 segundos, hibridación a 57°C por 30 segundos, extensión de 72°C por 1 min y

una elongación final de 72°C por 5 min.

Fumonisina

Para este marcador la reacción de PCR se realizó en un volumen final de 25 µl, se

adicionaron 12.5µLde Green Master mix (Thermo scientific®), 0.5 µL de cada primer

(10pmol/µL), 2µL de ADN (20ng) y se completó con el agua libre de nucleasas que contiene

el kit. El programa de PCR tuvo una desnaturación inicial a 95°C por 3 min, seguido de 32

ciclos de desnaturación a 95°C por 1 min., hibridación a 58°C por 30 segundos, extensión

de 72°C por 3 min y una elongación final de 72°C por 5 min.

Capítulo 2 59

Zearalenona

El volumen final de la reacción de PCR fue de 25 µl, se adicionaron 12.5µLde Green Master

mix (Thermo scientific®), 1 µL (10pmol/µL) de cada primer, 2µL de ADN (20ng) y se

completó con el agua libre de nucleasas que contiene el kit. El programa de PCR inició con

una desnaturación inicial a 94°C por 15 min, seguido de 35 ciclos de desnaturación a 94°C

por 45 segundos, hibridación a 59°C por 45 segundos, extensión de 72°C por 1 min y una

elongación final de 72 °C por 10 min.

Las amplificaciones se llevaron a cabo en un termociclador de 96 pozos (Agilent

Technologies Sure cycler 8800 (USA). En una cámara de electroforesis horizontal se corrió

un gel de agarosa al 1.2% con Sybr safe® y TBE al 1X con un marcador de peso molecular

de 100pb (Thermo scientific gene ruler 100pb®), Para su visualización se usó un

fotodocumentador (Enduro GDS Labnet, USA) observando la presencia de fragmentos

para cada micotoxina (Tabla 2-2).

Tabla 0-2: Cebadores usados para detección de micotoxinas en aislamientos de Fusarium.

2.4.3 Caracterización Morfológica

Los aislamientos fueron caracterizados morfológicamente empleando las claves de Nelson et al. (1983) y Leslie y Summerell (2006) a partir de microcultivos conservados en placas selladas, permitiendo la clasificación de los aislamientos por características macro y microscópicas provenientes de medio agar CLA (carnation, leaf Agar), con un período de incubación de 15 días a 25 °C con intermitencia de luz clara y oscura. Los macroconidios se evaluaron en forma general, forma de la célula apical y célula basal y número de septos. Los microconidios se evaluaron de forma general, número de septos y tipo de célula conidiogénica. Las clamidosporas se evaluaron por presencia o ausencia de estas estructuras. Para evaluar la morfología de colonia (tipo de micelio y coloración), los aislamientos se incubaron por un tiempo adicional de 4 días. La pigmentación se evaluó por el anverso y el reverso, comparando los colores con el catálogo de colores de Auction Color Chart® (2004).

Micotoxina

Primer

Secuencia 5’-3’

Tamaño Pb

°T de hibridació

n

Genotipo

Referencia

Deoxinivalenol

TRI 5 F TRI 5 R

5´-AGCGACTACAGGCTTCCCTC -3´ 5´-AAACCAATCCAGTTCTCCATCT-3´

545 59 TRI Li et al. 2005; Jiao et al., 2008

Nivalenol TOX P1 TOX P2

5´-CTCGCTGAAGTTGGACGTAA´-3 5´-GTCTATGCTCTCAACGGACAAC´-3

360 57 TRI Jennings et al., 2004

Fumonisinas FUM 1F FUM 4R

5´-GAGGCCCGAGCGAGCACTGG-3' 5´-CCAGCCGCGGAAATTAGGGATGTG-3'

1456 58 FUM Bluhm et al., 2004

Zearalenona PKS13F PKS13R

5’-CCCAGCCAAGCCCAGTACGC-3´ 5´-ACAGCGGCTGACCTGGGTCA-3´

532 59 PKS Stepien et al., 2012


micotoxinas

2.5 Resultados y Discusión

2.5.1 Análisis Filogenético de especies seleccionadas

El árbol filogenético muestra la distribución y la distancia de las especies del género Fusarium (Figura 2-1). Este análisis permite observar la variabilidad que presentó el grupo de aislamientos evaluados entre especies y dentro de las especies. Es decir, se nota un agrupamiento para las especies de F. oxysporum (153, 202, 107) sin embargo, el aislamiento 37 se ubica por fuera del grupo con cercanía a F. verticillioides (38). Este criterio de selección permitió determinar la caracterización morfológica y molecular de los aislamientos productores de micotoxinas.

Capítulo 2 61

Figura 0-1: Árbol filogenético de las secuencias de Fusarium con el primer TEF 1α (Factor de elongación de la traducción), usando el coeficiente de similitud del vecino más cercano.

153 F. oxysporum

202. F. oxysporum fs. lycopersici

107. F. oxysporum

46. F. oxysporum

88. F. oxysporum

61. F. proliferatum

134 F. proliferatum

34. F. guttiforme

113 F. equiseti

128 F. equiseti

145 F. equiseti



42. F. verticilliodes







126 F. solani

139 F. cf. solani

56. F. solani

112 F. solani

142 F. solani

127 F. solani

143 F. solani

32. F. graminearum

67. F. graminearum


141 F. incarnatum

140 F. incarnatum

130 F. cf incarnatum

27. F. camptoceras




Trichoderma gamsii

Trichoderma viride

37. F. oxysporum

Acremonium dichromosporum


micotoxinas

2.5.2 Caracterización molecular

Deoxinivalenol

Deoxynivalenol/ Nivalenol. El producto de PCR obtenido con el cebador TRI5 R y TRI5F amplificó a la banda esperada 545 pb. Los aislamientos que amplificaron correspoden a F. graminearum (32 y 67) y F. equiseti (113) (Figura 2-2). En las demás especies no hubo presencia de la banda. No se encontró representación de nivalenol (NIV) en los aislamientos evaluados. Figura 0-2: Amplificación de las especies F. graminearum y F. equiseti en un gel de agarosa al 1.2% en TBE 0.5 X con el gen TRI5 P: Marcador de peso (GeneRuler 100 pb DNA ladder Thermo Scientific).

Los tricotecenos son producidos por numerosas especies de Fusarium spp. incluidos: F. acuminatum, F. crookwellense, F. culmorum, F. equiseti, F. graminearum, F. lateritium, F. poae, F. sambucinum, F. solani y F. sporotrichoides. DON o vomitoxina es producida principalmente por las especies F. graminearum y F. culmorum (Liddell, 2003), en menor proporción puede ser producida por F. equiseti y F. pseudograminearum (Bottalico y Perrone, 2002; Moss y Thrane, 2004)

La presencia de deoxinivalenol (DON) en F. graminearum procedente de cultivos de maíz está ampliamente registrada (Brown et al., 2001; Kimura et al., 2003; Desjardins, 2006; Dawidziuk et al., 2014). La mayoría de genes que biosintetizan tricotecenos están localizados en un cluster que comprende al menos 10 genes. Estos genes incluyen los que codifican la tricodieno sintasa como el TRI5 que cataliza el primer paso en la biosíntesis de tricotecenos (Hohn y Beremand, 1989; Desjardins y Hohn, 1997). Este proceso, está constituido por múltiples pasos y controlada por al menos 12 genes esenciales que en F. graminearum forman un cluster de 25 kb de longitud (Gong et al., 2014). Estudios realizados por Desjardins y Proctor (2007) han demostrado que los genes TRI5, TRI6 y TRI10 están involucrados en la interrupción completa de la producción de tricotecenos, esto ha permitido realizar experimentos que concluyen que al mutar estos genes se logra disminuir la producción de la micotoxina y se evidencia que esta toxina es un factor de virulencia en la enfermedad conocida como la roña de la espiga del trigo causada por F. graminearum La biosíntesis de tricotecenos es regulada por condiciones ambientales como la temperatura, actividad del agua y composición del substrato. Esto hace que algunas cepas produzcan pequeñas o altas cantidades de tricotecenos (O´Neill et al., 1993; Gómez, 2008; Marín et al., 2015).

Capítulo 2 63

Varios estudios muestran que la concentración de ADN y la producción de tricotecenos está altamente correlacionada (Dawidziuk et al., 2014). De igual forma, se ha demostrado bajo condiciones de campo, que la presencia de tricotecenos esté ligado al incremento de virulencia y por ende al desarrollo de la enfermedad causada por F. graminearum.

F. equiseti ha sido registrado en la mayoría de cereales como arroz, avena, trigo, Maíz y triticale participando en menor escala en la fusariosis de la espiga. (Xu et al., 2008), también se ha encontrado en cultivos como melón, algodón, papa, tomate, cebolla, fríjol, garbanzo, caupi, arveja, canola y alfalfa (Gordon,1989, Palmero, 2011). La presencia de deoxinivanol en esta especie ha sido registrado por Ueno y colaboradores desde 1975, hasta la actualidad donde solamente se menciona en cereales (Stępień et al., 2015).

Zearalenona.

Los cebadores usados para la amplificación de esta micotoxina fueron PKS13F y PKS13R, la banda amplificó a 532 pb. Los aislamientos que amplificaron correspoden a F. graminearum (32 y 67) y F. equiseti (113) (Figura 2-3), aislamientos similares a los amplificados con el gen TRI para la toxina deoxinivalenol.

Figura 0-3: Amplificación de las especies F. graminearum y F. equiseti en un gel de agarosa al 1.2% en TBE 0.5 X con el gel P: Marcador de peso (GeneRuler 100 pb ADN ladder Thermo Scientific).

La zearalenona es la toxina comúnmente asociada a F. graminearum, aunque también se ha registrado en otras especies como F. culmorum, F. crookwellense, F. equiseti, F. heterosporum, F. sambucinum y F. semitectum (sin.= de F. incarnatum) (Leslie y Summerell, 2006; Logrieco et al., 2002). Se ha encontrado en especies de Fusarium afectando a cereales de grano pequeño y en otros cultivos como soya, fríjol y plátano y en futas tropicales (Mendez y Moreno 2009; Stępień et al., 2011).

El genoma de F. graminearum está totalmente secuenciado y es la base para determinar los genes requeridos en la biosíntesis de zearalenona este tiene cuatro genes principales que requiere para la biosíntesis de la toxina (ZEA1, ZEA2 ZEB1 Y ZEB2) (Kim et al., 2005; Gaffor y Trail, 2006) El cluster de biosíntesis de zearalenona abarca 25 kb de la secuencia genómica. Los genes PKS4 (ZEA2) y PKS13 (ZEA1) tienen cuatro dominios funcionales y participan en la pérdida de motivos de carbonilo del policetido, que a su vez es sintetizado por el policetido sintasa que son proteínas de dominios múltiples relacionados con la síntesis de ácidos grasos en eucariotas A pesar de que estos genes participan en la biosíntesis de zearalenona, sus funciones son aún desconocidas. También se conoce que


micotoxinas

los genes (ZEB2) regulan la transcripción de otros tres genes (Kim et al., 2005; Graffoor y Trail, 2006).

En los últimos años se le ha dado particular importancia a esta micotoxina debido a que presenta propiedades estrogénicas, además tiene la habilidad de acumular altos niveles de la toxina en infecciones en campo especialmente en cereales (Gromadzaka et al., 2008). Estudios realizados por Stępień y colaboradores (2011) con la especie F. equiseti, mencionan que existen pocas publicaciones relacionadas con la biosíntesis de ZEA, recientemente se consideró que esta especie era capaz de iniciar la síntesis de ZEA siendo su principal metabolito la fusacromanona y los tricotecenos. Es común encontrar que aislamientos que presentan producción de tricotecenos también presenten ZEA, sin embargo, los mismos autores explican que existe divergencia de los genes de esta especie al observarse que en algunos aislamientos se pueden presentar tanto los genes TRI como los PKS que inducen la biosíntesis de tricotecenos y zearalenona o se presenta uno de los dos.

Fumonisinas

De los treinta y tres aislamientos evaluados, 12 amplificaron para el cebador FUM1F y FUM4R, la banda esperada fue de 1456 pb. Los aislamientos que amplificaron correspoden a F. proliferatum (61, 134), F. verticillioides (40,42, 38, 73,75, 80, 83, 132, 144) y F. oxysporum (202). En las especies F. guttiforme, F. graminearum, F. equiseti, F. solani, F. coeruleum, F. oxysporum, F. decemcellulare, F. chlamydosporium, F. cf solani y F. cf incarnatum no hubo presencia de la banda (Figura 2-4).

Ocho aislamientos de F. verticillioides amplificaron a la banda de 1456pb. Las fumonisinas son micotoxinas producidas por especies del complejo Gibberella fujikuroi (GFCS). Los mayores productores son F. verticillioides, F. proliferatum, F. subglutinans, y F. nigamai (Bennet y Klich, 2003).

Figura 0-4: Amplificación del gen FUM de las especies productoras de fumonisinas en un gel de agarosa al 1.2% en TBE 0.5 X MP: Marcador de peso (GeneRuler 100 pb ADN ladder Thermo Scientific).

La mayoría de registros de especies productoras de fumonisinas son de F. verticillioides, sin embargo, varios trabajos muestran que otras especies están involucradas en la producción de esta micotoxina. Para esto Thiel et al. (1991) realizaron ensayos para determinar la micotoxina en las diferentes especies como: F. decemcellulare C. Brick, F. sporotrichioides Sherb., F. poae (Peck) Wollenweb., F. tricinctum (Corda) Sacc., F. avenaceum (Fr.: Fr.) Sacc., F. semitectum Berk. & Ravenel, F. camptoceras Wollenweb. &

Capítulo 2 65

Reinking, F. equiseti (Corda) Sacc., F. acuminatum Ellis. & Everh., F. scirpi Lambotte & Fautr., F. longipes Wollenweb. & Reinking, F. sambucinum Fuckel, F. graminearum Schwabe, F. reticulatum Mont., F. compactum (Wollenweb.) Gordon, F. lateritium Nees:Fr., F. moniliforme, F. proliferatum (T. Matsushima) Nirenberg, F. subglutinans (Wollenweb. & Reinking) P.E. Nelson, T.A. Toussoun, & Marasas, F. anthophilum (A. Braun) Wollenweb., F. oxysporum Schlechtend.: Fr., F. nygamai Burgess & Trimboli, y F. napiforme Marasas, P.E. Nelson & Rabie. De estas especies solamente F. moniliforme, F. proliferatum, y F. nygamai produjeron fumonisinas.

Por otro lado, Rheeder et al., (2002) mencionan que quince especies son las productoras de fumonisinas entre las que se encuentran ocho de la sección Liseola: F. verticillioides; F. sacchari; F. fujikuroi, F. proliferatum F. subglutinans, F. thapsinum F. anthophilum, F. globosum. Otras cinco especies que están altamente relacionadas con la Sección Liseola y que pertenecen a la sección Dlaminia como son: F. nygamai, F. dlamini, F. napiforme, F. andiyazi, F. pseudonygamai. El resto de pertenecen a la sección Elegans, como F. oxysporum y otra a la sección Arthrosporiella, como F. polyphialidicum. Existen registros de F. oxysporum var. redolens y F. polyphialidicum aún sin confirmar.

Los mismos autores también hacen un listado de las especies que no producen esta micotoxina, en la mayoría de casos pocos aislamientos han sido analizados. Estas especies son: F. acuminatum, F. annulatum, F. avenaceum, F. beomiforme, F. camptoceras, F. circinatum, F. subglutinans f. sp. pini, F. compactum, F. concolor, F. crookwellense, F. cereales, F. culmorum, F. decemcellulare, F. dimerum; F. equiseti, F. graminearum, F. lateritium, F. poae, F. pseudograminearum, F. reticulatum, F. sambucinum, F. scirpi, F. semitectum, F. solani, F. sporotrichioides y F. tricinctum.

La biosíntesis de fumonisinas depende de una serie de genes agrupados en una región de 46 kb. estos se encuentran en el cromosoma 1 formando el locus FUM (Proctor et al., 1999; Proctor et al., 2003). Los genes son los que codifican las enzimas que intervienen en la síntesis de micotoxinas y de las proteínas que median la resistencia y la secreción de las mismas. La fumonisina se sintetiza a partir de unidades de acetato y forma un policetido lineal dimetilado. El gen FUM1 es el encargado de catalizar la policetido sintasa e iniciar el proceso.

Siendo la Fumonisina B1 (FB1) la más común, su función es bloquear la síntesis de esfingolípidos que son elementos esenciales en la estructura de la membrana celular, los cuales controlan los mecanismos de regulación de la célula, a su vez, actúan como segundos mensajeros en los procesos de diferenciación, crecimiento y muerte celular. La alteración de la biosíntesis de esfingolípidos ocurre como consecuencia de la inhibición de la enzima policetido sintasa, lo que genera la acumulación de compuestos como son esfingonina y esfingosina generando neurotoxicidad, nefrotoxicidad y hepatoxicidad (Merril et al., 2001; Soriano et al., 2005).

En Colombia, la detección de micotoxinas se ha realizado directamente en alimentos de consumo animal y humano, la información que existe hasta el momento de especies y hospedantes es escasa, en este estudio se destaca la presencia de micotoxinas en maíz como fumonisinas, tricotecenos y zearalenona. Siendo las fumonisinas la más abundante, a su vez se registra por primera vez en el país, su presencia a partir de estudios moleculares en F. napiforme en maíz (Fandohan et al., 2004); F. oxysporum en pimentón, Heperkan y Ermis, 2004; Santos et al., 2008), F. verticillioides en mora y vid de los cuales no hay registro (Tabla 2-3).


micotoxinas

De igual manera se observa una alta coincidencia con la literatura mundial que no registra la presencia de esta micotoxina en especies como F. coeruleum, F. graminearum, F. solani y F. equiseti (Thiel et al., 1991; Rheeder et al., 2002).

Tabla 0-3: Detección de micotoxinas presentes en aislamientos obtenidos por análisis filogenéticos de la colección de la Universidad Nacional de Colombia—Sede Palmira

Aislamiento Especie Hospedante Micotoxina

27 F. camptoceras Maíz -

32 F. graminearum Maíz TRI-ZEA

34 F. guttiforme Maíz -

35 F. decemcellulare Maíz -

37 F. oxysporum Maíz -

38 F. verticillioides Maíz FUM



46 F. oxysporum Maíz -

56 F. solani Maíz -

61 F. proliferatum Maíz FUM






88 F. oxysporum Maracuyá -

107 F. oxysporum Laurel -

112 F. solani Papaya -

113 F. equiseti Melón TRI-ZEA

115 F. chlamydosporium Lulo -

126 F. solani Aguacate -

127 F. solani Aguacate -

128 F. equiseti Lulo -

130 F. cf incarnatum Maracuyá -

132 F. verticillioides Vid FUM

134 F. proliferatum Maracuyá -

139 F. cf solani Guanábana -

144 F. verticillioides Mora FUM

145 F. incarnatum Aguacate -

153 F. oxysporum Ají -

159 F. decemcellulare Aguacate -

202 F. oxysporum Pimentón FUM

Capítulo 2 67

2.5.3 Caracterización morfológica

Los caracteres morfológicos se evaluaron teniendo en cuenta las claves de Booth y colaboradores (1983) y Leslie y Summerell (2006). Anexo A. De acuerdo con esto, se encontraron 12 especies distribuidas en las secciones: Liseola (F. verticillioides, F. proliferatum), Elegans (F. oxysporum), Martiella (F. solani), Sporotrichiella (F. chlamydosporum), Arthrosporiella (F. camptoceras, F. incarnatum), Gibbosun (F. equiseti), Spicariodes (F. decemcellulare) y Discolor (F. graminearum) (Booth et al., 1983). La especie F. guttiforme no aparece descrita en esa fecha, debido a que Nieremberg y O´Donnell la registraron como una nueva especie en 1998.

Actualmente, las especies se ubican en complejos de especies tal como lo menciona Geiser et al., 2013; Aoki et al., 2014 y O´Donnell et al., 2015, agrupando a las especies de acuerdo con los caracteres morfológicos, biológicos y filogenéticos así: Complejo de especies de F. graminearum CSFG (F. graminearum); Complejo de especies de F. oxysporum CSFO (F. oxysporum); Complejo de especies de F. solani CSFS (F. solani); Complejo de especies de F. fujikuroi CSFF (F. proliferatum, perteneciente al subclado Asiático, F. verticillioides, perteneciente al subclado Africano, F. guttiforme perteneciente al subclado Americano) complejo de especies de F. chlamydosporum; Complejo de especies de F. incarnatum-equiseti (F. incarnatum, F. equiseti) y Complejo de especies de F. decemcellulare.

2.6 Conclusiones

La técnica de PCR y los cebadores específicos permitieron encontrar aislamientos con presencia de micotoxinas. En las especies F. graminearum y F. equiseti se detectó zearalenona y tricotecenos. En cultivos de maíz, vid y mora, se presentó la especie F. verticillioides y a su vez presencia de fumonisinas.

La metodología evaluada es un indicador sensible y rápido en la detección de micotoxinas de Fusarium. A futuro, es posible determinar mediante la combinación de otros cebadores la detección de otras micotoxinas producidas por Fusarium.

Las técnicas moleculares y la caracterización morfológica generan conjuntamente una condición más acertada en la identificación de aislamientos. La presencia de micotoxinas de algunos aislamientos, puede ser tenido en cuenta como criterio taxonómico de especies del género Fusarium.

2.7 Bibliografía

Aoki, T., O’Donnell, K., & Geiser, D. M. 2014. Systematics of key phytopathogenic Fusarium

species: current status and future challenges. Journal of General Plant Pathology, 80, 189–201.


Bennett, J.W., Klich, M., 2003. Mycotoxins. Clinical Microbiological Reviews 16, 497–516.


micotoxinas

Bluhm, B. H., Flaherty J. E., Cousin M. A. and Woloshuk C. P. 2004. Multiplex polymerase chain reaction assay for the differential detection of trichothecene- and fumonisin-producing species of Fusarium in cornmeal. Journal Food Protection. 65, 1955-1961.

Bottalico, A., & Perrone, G. 2002. Toxigenic Fusarium species and mycotoxins associated with head Moss, M. O., & Thrane, U. (2004). Fusarium taxonomy with relation to trichothecene formation. Toxicology letters, 153(1), 23-28. blight in small-grain cereals in Europe. European Journal of Plant Pathology, 108(7), 611-624.

Brown, R., Cleveland, T., Woloshuk, C., Payne, G., & Bhatnagar, D. 2001. Growth inhibition of a Fusarium verticillioides GUS strain in corn kernels of aflatoxin-resistant genotypes. Applied microbiology and biotechnology, 57(5-6), 708-711.


Chittem, K., Mathew, F. M., Gregoire, M., Lamppa, R. S., Chang, Y. W., Markell, S. G., ... & Goswami, R. S. 2015. Identification and characterization of Fusarium spp. associated with root rots of field pea in North Dakota. European Journal of Plant Pathology, 143(4), 641-649.

Cuomo CA, Güldener U, Xu JR, Trail F, Turgeon BG, Di PA, WaltonJD, Ma LJ, Baker SE, Rep M, Adam G, Antoniw J, Baldwin T, Calvo S, Chang YL, DeCaprio D, Gale LR, Gnerre S, Goswami RS, HammondKosackK, Harris LJ, Hilburn K, Kennell JC, Kroken S, Magnuson JK, Mannhaupt G, Mauceli E, Mewes H, Mitterbauer R, Muehlbauer G, Munsterkotter M, Nelson D, O’Donnell K, Ouellet T, Qi W, Quesneville H, Roncero MIG, Seong KY, Tetko IV, Urban M, Waalwijk C, WardTJ, Yao J, Birren BW, Kistler HC. 2007. The Fusarium graminearum genome reveals a link between localized polymorphism and pathogen specialization. Science 317:1400–1402.

Dawidziuk, A., Koczyk, G., Popiel, D., Kaczmarek, J., & Buśko, M. 2014. Molecular diagnostics on the toxigenic potential of Fusarium spp. plant pathogens. Journal of applied microbiology, 116(6), 1607-1620.

Desjardins, A. E., & Proctor, R. H. 2001. Biochemistry and genetics of Fusarium toxins. In Fusarium: Paul E. Nelson memorial symposium. American Phytopathology Society Press, St. Paul, MN (pp. 50-69).

Desjardins, A. 2006. Fusarium micotoxyn: chemistry, genetics and biology. Americam Phytopathology Society Press, St. Paul. MN. 260p.


Desjardins, A., and Hohn, T. 1997. "Mycotoxins in plant pathogenesis”. Molecular Plant-Microbe Interactions 10.2 :147-152

Diaz G. 2005. Micotoxinas y Micotoxicosis de importancia en salud humana en Colombia. Ponencia VII Congreso Latinoamericano de Microbiología e higiene de alimentos COLMIC, 2005. Mayo 18-25. Bogotá, Colombia.

Capítulo 2 69

Diaz G. and Céspedes, A. 1997. Natural occurrence of zearalenone in feeds and feedstuffs used in poultry and pig nutrition in Colombia. Mycotoxin Research; 13: 81-8738

Duarte, S. y Villamil, L. 2006. Micotoxinas en la Salud pública. Rev. Salud pública. Sup 8(1):129-135.

Fandohan, P., Hell, K., Marasas, W. F. O., & Wingfield, M. J. 2004. Infection of Maíze by Fusarium species and contamination with fumonisin in Africa. African Journal of Biotechnology, 2(12), 570-579.

Fanelli, F., Iversen, A., Logrieco, A., Mulè G., 2013 Relationship between fumonisin production and FUM gene expression in Fusarium verticillioides under different environmental conditions Food Additives & Contaminants: Part A Vol. 30, Iss. 2, 365-371

Frisvad, J. C., Thrane, U., Samson, R. A., & Hoekstra, E. S. 2004. Mycotoxin production by common filamentous fungi. Introduction to food-and airborne fungi, (Ed. 7), 321-331.

Gaffoor, I., Trail, F., 2006. Characterization of two polyketide synthase genes involved in zearalenone biosynthesis in Gibberella zeae. Appl Environ Microbiol;72(3):1793-9.


Geng, Z., Zhu, W., Su, H., Zhao, Y., Zhang, K. Q., & Yang, J. 2014. Recent advances in genes involved in secondary metabolite synthesis, hyphal development, energy metabolism and pathogenicity in Fusarium graminearum (teleomorph Gibberella zeae). Biotechnology advances 32(2), 390-402.


Gong, L., Jiang, Y., & Chen, F. 2015. Molecular strategies for detection and quantification of mycotoxin‐producing Fusarium species: a review. Journal of the Science of Food and Agriculture, 95(9), 1767-1776.

Gordon, T. R., Okamoto, D., & Jacobson, D. J. 1989. Colonization of muskMelón and nonsusceptible crops by Fusarium oxysporum f.sp. Melónis and other species of Fusarium. Phytopathology, 79(10), 1095-1100.

Heperkan, D., & Ermis, Ö. C. 2004. Mycotoxins in spices: red pepper. In Barug D, Van Egmond H, Lopez-Garcia R, Van Osenbruggen T and Visconti A, Meeting the Mycotoxin Menace, Wageningen, Academic Publishers (pp. 197-219).

Hohn T. M., y Beremand P. D. 1989. Isolation and nucleotide sequence of a esquiterpene cyclase gene from trichothecene-producing fungus Fusarium sporotrichioides. Gene 79:131–138.






micotoxinas

Jennings, P., Coates, M. E., Walsh, K., Turner, J. A., & Nicholson, P. 2004. Determination of deoxynivalenol‐and nivalenol‐producing chemotypes of Fusarium graminearum isolated from wheat crops in England and Wales. Plant Pathology, 53(5), 643-652.

Jestoi, M. 2005. Emerging Fusarium mycotoxins in Finland. Academic dissertation. National veterinary and food Research Institute (EELA), Departament of chemistry and department of biochemistry and food chemistry. University of Turkey. p123.

Jiao, F., Kawakami, A., & Nakajíma, T. 2008. Effects of different carbon sources on trichothecene production and Tri gene expression by Fusarium graminearum in liquid culture. FEMS microbiology letters, 2 Environ. Microbiol. 57: 1089-93 52.

Kim, Y. H., Ahn, J. Y., Moon, S. H., & Lee, J. 2005. Biodegradation and detoxification of organophosphate insecticide, malathion by Fusarium oxysporum f. sp. pisi cutinase. Chemosphere, 60(10), 1349-1355.

Kimura, M., Tokai, T., O’Donnell, K., Ward, T.J., Fujimura, M., Hamamoto, H., Shibata, T. and Yamaguchi, I. 2003. The trichothecene biosynthesis gene cluster of Fusarium graminearum F15 contains a limited number of essential pathway genes and expressed non-essential genes. FEBS Lett. 539, 105–110.

Leslie J, Summerell B (2006) The Fusarium laboratory manual. 1st ed. Blackwell Publishing Ltd, Oxford, London. 170p.

Li, H. P., Wu, A. B., Zhao, C. S., Scholten, O., Löffler, H., & Liao, Y. C. 2005. Development of a generic PCR detection of deoxynivalenol-and nivalenol-chemotypes of Fusarium graminearum. FEMS microbiology letters, 243(2), 505-511.

Liddell, C.M. 2003. Systematics of Fusarium species and allies associated with Fusarium head blight. Pages 35-43 in: Fusarium Head Blight of Wheat and Barley. K.J. Leonard & W.R. Bushnell, eds. APS Press.

Logrieco, A., Rizzo, A., Ferracane, R., & Ritieni, A. 2002. Occurrence of beauvericin and enniatins in wheat affected by Fusarium avenaceum head blight. Applied and Environmental Microbiology, 68(1), 82-85.

Magan, N., Aldred, D., Mylona, K. and Lambert, R.J.W. 2010 Limiting mycotoxins in stored wheat. Food Addit. Contam. A, 27, 644–650.

Marín, P., Jurado, M., & González-Jaén, M. T. 2005. Growth rate and TRI5 gene expression profiles of Fusarium equiseti strains isolated from Spanish cereals cultivated on wheat and barley media at different environmental conditions. International journal of food microbiology, 195, 40-47.

Mendez, A y Moreno, E. 2009. Las micotoxinas: contaminantes naturales de los alimentos. Ciencia: Julio Sepiembre 1-7.


Capítulo 2 71

Merrill AH, Sullards MC, Wang E, Voss KA, Riley RT. 2001.Sphingolipid metabolism: roles in signal transduction and disruption by fumonisins. Environ Health Perspect.;109 Suppl 2:283-9.

Moss, M. O., & Thrane, U. 2004. Fusarium taxonomy with relation to trichothecene formation. Toxicology letters, 153(1), 23-28.

Nelson, P., Toussoun, T., and Marasas, W. 1983. Fusarium species. An Illustrated Manual for Identification. The Pennsylvania State University Press, University Park. 30. 192p.


O’Donnell, K., Ward, T. J., Robert, V. A., Crous, P. W., Geiser, D. M., & Kang, S. 2015. ADN sequence-based identification of Fusarium: Current status and future directions. Phytoparasitica, 43(5), 583-595.

O'Neill, K., Damoglou, A. P., & Patterson, M. F. 1993. Toxin production by Fusarium culmorum IMI 309344 and F. graminearum NRRL 5883 on grain substrates. Journal of applied bacteriology, 74(6), 625-628.

Palmero, D., de Cara, M., Iglesias, C., Gálvez, L., Tello, J.C., 2011. Comparative study of the pathogenicity of seabed isolates of Fusarium equiseti and the effect of the composition of the mineral salt medium and temperature on mycelial growth. Braz. J. Microbiol. 42, 948–953.

Perilla, N., Diaz, G. 1998. Incidence and levels of fumonisins contamination in Colombian corn and corn products. Mycotoxin Research. 14: 74-82.

Proctor, R., Plattner, D., Desjardins, A., Busman, M. and Butchko, R. 2006. Fumonisin Production in the Maíze Pathogen Fusarium verticillioides: Genetic Basis of Naturally Occurring Chemical Variation. J. Agric. Food Chem. 54 (6), 2424–2430

Proctor, R.H., Brown, D.W., Plattner, R.D. & Desjardins, A.E. 2003. Co-expression of 15 contiguous genes delineates a fumonisin biosynthetic gene cluster in Gibberella moniliformis. Fungal Genet. Biol. 38, 237-249

Proctor, R.H., Desjardins, A.E., Plattner, R.D. & Hohn, T.M. 1999.A poliketide synthase gene required for biosynthesis of fumonisin mycotoxins in Gibberella fujikuroi mating population A. Fungal Genet. Biol. 27, 100-112.

Rheeder, J. P., Marasas, W. F., & Vismer, H. F. 2002. Production of fumonisin analogs by Fusarium species. Applied and Environmental Microbiology, 68(5), 2101-2105.

Santos, L., Marín, S., Sanchis, V., & Ramos, A. J. 2008. Capsicum and mycotoxin contamination: state of the art in a global context. Food Science and Technology International, 14(1), 5-20.

Soriano JM, González L, Catalá AI. 2005.Mechanism of action of sphingolipids and their metabolites in the toxicity of fumonisin B1. Prog Lipid Res.;44(6):345-56.


micotoxinas

Stępień, Ł., Koczyk, G., & Waśkiewicz, A. 2011. Genetic and phenotypic variation of Fusarium proliferatum isolates from different host species. Journal of applied genetics, 52(4), 487-496.

Stępień, Ł., Koczyk, G., & Waśkiewicz, A. 2013. Diversity of Fusarium species and mycotoxins contaminating pineapple. Journal of applied genetics, 54(3), 367-380.

Stępień, Ł., Waśkiewicz, A., & Urbaniak, M. 2015. Wildly Growing Asparagus (Asparagus officinalis L.) Hosts Pathogenic Fusarium Species and Accumulates Their Mycotoxins. Microbial ecology, 1-11.

Sumalan, R. M., Alexa, E., & Poiana, M. A. (2013). Assessment of inhibitory potential of essential oils on natural mycoflora and Fusarium mycotoxins production in wheat. Chemistry Central Journal, 7(1), 1-12.

Thiel, P. G., Marasas, W. F., Sydenham, E. W., Shephard, G. S., Gelderblom, W. C., & Nieuwenhuis, J. J. 1991. Survey of fumonisin production by Fusarium species. Applied and Environmental Microbiology, 57(4), 1089-1093.

Thiel, P. G., Shephard, G. S., Sydenham, E. W., Marasas, W. F. 0., Nelson, P. E., Wilson, T. M. 1991. Levels of fumonisins Bland B2 in feeds associated with confirmed cases of equine leukoencephalomalacia. J. Agric. Food Chem. 39:109-11 53 85(2), 212-219.

Turner, W. B. & Aldridge, D. C. 1983. Fungal Metabolites II. Academic Press, London

Ueno, y., m. Sawano, y k. Ishii. 1975. Production of' trichothecene mycotoxins by Fusarium species in shake cultwe. Appl. Microbiol. 30: 4-9.

Ward, T.J.; Bielawski, J.P.; Kistler, H.C.; Sullivan, E.; O’Donnell, K. 2002. Ancestral polymorphism and adaptive evolution in the trichothecene mycotoxin gene cluster of phytopathogenic Fusarium. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99, 9278–9283.

Waskiewicz, A., Gromadzka, K., Wisniewska, H., & Golinski, P. 2008. Accumulation of zearalenone in genotypes of spring wheat after inoculation with Fusarium culmorum. Cereal research communications, 36, 401-403.

Xu, X. M., Nicholson, P., Thomsett, M. A., Simpson, D., Cooke, B. M., Doohan, F. M., ... & Hornok, L. 2008. Relationship between the fungal complex causing Fusarium head blight of wheat and environmental conditions. Phytopathology, 98(1), 69-78.

Zhang, J., Li, H., Dang, F. 2007. Determination of the trichothecene mycotoxin chemotypes and associated geographical distribution and phylogenetic species of the Fusarium graminearum clade from China. Mycological Research111, 967–75.

B. ANEXO. Caracterización morfológica de aislamientos de Fusarium evaluados para detección molecular de micotoxinas

Ais

lam

ien

to

Macroconidia Microconidias

Cla

mid

os

po

ras

Color de la Colonia

Especie

Foto

No

. sep

tos

Fo

rma

Ap

ical

pie

No

. sep

tos

Fo

rma

Fiá

lid

e

An

vers

o

Revers

o

27

4-5

curvada Punta Sin pie. Escasa. No definida

Mono y polifialides

Presentes

Oac717

Oac579

F. camptoceras

32

5 curvada cono Pie definido

-- -- - abundantes

Oac710

Oac621

F. graminearum


micotoxinas

34

3 Ligeramente curvada

estrecha Pie definido

1 ovalada polifialides ausentes

Oac909

Oac480

F. guttiforme

35

7-9 Larga y robusta

redonda Pie definido

0 ovalada monofialides ausente

Oac909

Oac899

F. decemcellulare

37

3 Medianas ligera/ curvada

Estrechamente redonda

punto 0 Ovalada Monofialides cortas

abundantes

Oac465

Oac478

F. oxysporum

38

3 Larga delgadas y falcadas

redonda No se forma pie

0 ovalada monofialide ausente

Oac478

Oac494

F. verticillioides

40




Oac477

Oac476

F. verticillioides

42

5-7 Estrecha y elongada

estilizada

Prominente

- -- - Abundantes en cadena

Oac479

Oac475

F. napiforme

Capítulo 2 75

46

3 ancha redondeada

Poca definición

0/1/2

Ovalada monofialide abundantes

Oac472

Oac486

F. coeruleum/F. solani

56

3-7 ancha redondeada

Poca definición

0/1/2

elipsoidal, monofialide abundantes

Oac909

Oac900

F. solani

61

3-5 Alargada curva Pobremente desarrollada

0 Redondas en cadena

Monofialides

polifialides

Ausente

Oac542

Oac542

F. proliferatum

67

5-6

curvada cono Pie definido

- -- - abundantes

Oac710

Oac621

F. graminearum

73




Oac477

Oac476

F. verticillioides

75




abundantes

Oac909

Oac847

F. oxysporum


micotoxinas

80




Oac479

Oac475

F. verticillioides

83




Oac477

Oac465

F. verticillioides

88



punto 0 Ovaladas Monofialides cortas

abundantes

Oac491

Oac506

F. oxysporum

107




abundantes

Oac465

Oac478

F. oxysporum

112


Poca definición

0/1/2

Ovalada, monofialide abundantes

Oac857

Oac856

F. solani

113


estilizada

Prominente


Oac634

Oac655

F. equisetti

Capítulo 2 77

115

5 Ligeramente curva

chata Forma pie

1-2 Delgadas y ovoides

polifialides abundante

Oac549

Oac548

F. chlamydosporium

126


Poca definición

0/1/2


Oac857

Oac856

F. solani

127


Poca definición

0/1/2


Oac909

Oac857

F. solani

128


estilizada

Prominente


Oac909

Oac896

F. equisetti

130

3 alargada curva pie - - -- -

Oac909

Oac814

F. cf. incarnatum

132




Oac554

Oac601

F. verticillioides


micotoxinas

134 3-5 Alargada curva Pobremente desarrollada

0 Redondas en cadena

Monofialides

polifialides

Ausente

Oac909

Oac847

F. proliferatum

145

3-5 alargada curva Pie bien definido

3-5 piriforme Monofialides

polifialides

Abundantes

Oac909

Oac899

F. incarnatum

153



punto 0 reniforme Monofialides cortas

abundantes

Oac501

Oac575

F. oxysporum

159

5-9 alargada redonda Forma pie

0 ovalada monofialide ausente

Oac909

Oac899

F. decemcellulare

202



punto 0 redonda Monofialides cortas

abundantes

Oac465

Oac478

F. oxysporum

144



0 ovalada monofialides ausente Oac542

0ac542

F. verticillioides

- Ausente

3. Capítulo

Detección y Cuantificación de micotoxinas producidas por especies del género Fusarium

Detection and quantification of mycotoxins produced by Fusarium species

3.1 Resumen

Las micotoxinas producidas por el hongo Fusarium son metabolitos secundarios de bajo peso molecular que afectan la calidad de los cultivos y especialmente la salud de humanos y animales. Entre las que causan mayores deterioros en la salud, se encuentran los tricotecenos, las fumonisinas y las zearalenonas. El objetivo de este capítulo fue cuantificar las micotoxinas producidas por especies del género Fusarium de una población de aislamientos obtenida de diferentes cultivos y localidades de Colombia. De 206 aislamientos se seleccionaron 33 que amplificaron por PCR regiones asociadas a las micotoxinas (deoxinivalenol, fumonisina y zearalenona). Cada uno de los aislamientos con presencia de micotoxinas se sembraron en medio PDA; ocho días después de la siembra se procesaron las muestras para realizar el análisis cuantitativo de deoxinivalenol DON, zearalenona ZEA y fumonisina FUM utilizando un kit de ELISA, basado en ensayos de inmunoabsorción ligado a una enzima. Los resultados revelan que en los aislamientos evaluados en medio PDA se encontraron altas concentraciones de micotoxinas en relación a los controles del kit de ELISA. El uso de ensayos de inmunoabsorción por medio de la técnica de ELISA se convierte en una técnica útil para detectar y cuantificar micotoxinas de especies del género Fusarium que afectan diferentes cultivos en Colombia.

Palabras clave: Fusarium, fumonisinas, tricotecenos, zearalenona, ELISA, concentración

80 Detección y Cuantificación de micotoxinas producidas por especies del género Fusarium

3.2 Abstract

Mycotoxins produced by Fusarium are secondary metabolites of low molecular weight that

affect the quality of crops and especially the health of humans and animals. Among those

that cause further deterioration in health are trichothecenes, fumonisin and zearalenones.

The aim of this work was to quantify mycotoxins produced by Fusarium species from a

population of isolates obtained from different cultures and locations in Colombia. To this

molecularly characterized that a population of 33 isolates achieved by PCR amplification

with primers specifics each mycotoxin (deoxynivalenol, fumonisin and zearalenone). Each

of the isolates with mycotoxins were seeded on PDA medium; eight days after sowing the

samples were processed for quantitative analysis of DON deoxynivalenol, zearalenone and

fumonisin using an ELISA kit, The results reveal that isolates tested mycotoxins are present

which are above the standards regulated by Mercosur and the European Union. Using

assays inmunoabsoción by ELISA becomes a technique useful for detecting mycotoxins

Fusarium species affecting different crops in Colombia.

Keywords: Fusarium, fumonisins, trichothecenes, zearalenone, ELISA, concentration

3.3 Introducción

Las micotoxinas se consideran como el producto del metabolismo secundario de un amplio número de hongos que en pequeñas cantidades son capaces de desencadenar alteraciones y cuadros patológicos en el hombre y los animales. Son moléculas relativamente pequeñas, de bajo peso molecular (PM < 700) y suelen ser genéticamente específicas para un grupo de especies de un mismo género. El mismo compuesto, no obstante, puede ser también sintetizado por hongos pertenecientes a géneros distintos. En general, cuanto más compleja es la ruta biosintética de una micotoxina, menor será el número de especies fúngicas capaces de producirla (Moss, 1991; Dejardins y Hohn, 1997; Geiser et al., 2004; Marín, 2010; Aoki et al., 2012; Menke, 2012 Chakrabarti., 2013; Daren et al., 2013; Bruns, et al., 2013; Zhang, 2013).

Según Pitt (1996), las micotoxinas son “metabolitos fúngicos cuya ingestión, inhalación o absorción cutánea reduce la actividad metabólica, hace enfermar o causa la muerte de animales y personas”.

En otra definición, las micotoxinas son producidas por hongos capaces de crecer en gran variedad de sustratos, contaminando con frecuencia alimentos. La biosíntesis la realizan pocos precursores, derivados de intermediarios de su metabolismo primario. La producción ocurre durante la fase estacionaria de crecimiento, y poca o ninguna tienen lugar durante la fase de crecimiento activo (Moss, 1991; Moss, 1996; O’Donnell et al., 1998; O’Donnell et al., 2000; Geiser et al., 2001; Ward et al., 2002; Aoki et al., 2012; Bruns, 2012; Zhang et al., 2013; Chakrabarti, 2013; Menke et al., 2013). En uno de los primeros reportes sobre contaminación de alimentos por micotoxinas publicado en 1984 por la Organización de Agricultura y Alimentos de las Naciones Unidas, encontraron que por lo menos el 25% de las reservas mundiales de granos están contaminadas por micotoxinas. (WHO/FAO, 2008). Evaluaciones en algunas regiones de

Capítulo 3 81

Europa, muestran que el 80-100% de los granos se encontraba contaminados. Esas altas incidencias ocurrían en regiones donde los cultivos fueron afectados por la sequía, infestados por insectos, o porque se utilizaron equipos de cosecha o depósitos inadecuadamente mantenidos. El aspecto más preocupante es que algunos de los altos niveles de contaminación ocurrieron en países con los más avanzados sistemas agrícolas (Pohland, 1993). En el caso de Fusarium, esencialmente como patógeno de campo, las micotoxinas son sintetizadas principalmente durante la infección de la planta, y en el caso de los cereales, se pueden acumular en el grano en la etapa de producción, en la cosecha y almacenamiento. Las especies de este género contaminantes de estos vegetales son capaces de producir una gran variedad de micotoxinas. El perfil micotoxígeno puede variar a nivel inter e intra-específico y a menudo incluye un amplio rango de micotoxinas. Las fumonisinas y los tricotecenos son las micotoxinas más frecuentes y tóxicas producidas por Fusarium, aunque son capaces de producir otras importantes como son la zearalenona, las eniantinas y la moniliformina (Jestoi, 2005; Desjardins, 2006; Zhang et al., 2013; Chakrabarti, 2013) Las condiciones ambientales, hospederos susceptibles y la capacidad genética del patógeno son los factores que propician el crecimiento del hongo y por ende la producción de toxinas. Por lo tanto, los productos agrícolas afectados por dichos microorganismos pueden ser susceptibles de contaminación en el proceso de producción, cosecha, transporte y almacenamiento (Nelson et al., 1993; Desjardins, y Hohn, 1997; Desjardins y Proctor, 2007; Gómez, 2008; Zhang et al., 2013). A comienzos del siglo XX se empezaron a generar los primeros reportes relacionados con la producción de enfermedades en caballos causadas por toxinas provenientes de granos de maíz almacenados. Desde entonces, se abordaron técnicas y metodologías relacionadas con el reconocimiento de toxinas involucradas en los procesos de micotoxicosis (Desjardins, 2006; Bruns, 2011; Awad et al., 2013). El estudio de micotoxinas ha sido en los últimos veinte años objeto de interés mundial no sólo por las cuantiosas pérdidas en la productividad de los cultivos y animales sino también por sus efectos deletéreos. Las micotoxinas se consideran como el producto del metabolismo secundario de un amplio número de hongos que en pequeñas cantidades son capaces de desencadenar alteraciones y cuadros patológicos en el hombre y los animales. La ingesta de alimentos contaminados con micotoxinas puede ocasionar micotoxicosis aguda o crónica. Dependiendo de la toxina su toxicidad es muy variada pueden afectar el sistema nervioso, digestivo, cardiovascular y pulmonar, así mismo desencadenar enfermedades cancerígenas, produce daños mutagénicos, teratogéneicos y se comportan como inmunodepresores (Bennett y Klich, 2003; Marín, 2010).

De otra parte, con la puesta en marcha de la apertura económica se abrieron oportunidades comerciales de exportación e importación de variados productos industriales, pero también agrícolas y pecuarios. Esta situación representa, además, riesgos fitosanitarios para los países participantes. A nivel mundial la regulación de los niveles de micotoxinas, está mediada por el Codex Alimentarius (Código de alimentos); siendo una dependencia de la OEA y la ONU las entidades a nivel internacional quienes determinan los estándares de calidad de productos de importación y exportación. En América Latina y el Caribe es El Comité Coordinador (CCLAC) y Mercosur (Brasil, Uruguay, Argentina y Paraguay), con el acompañamiento de la FAO/OMS quienes


desarrollan esta función, regulando la inocuidad de los alimentos. Sin embargo, para Colombia (CCI, 2011; FAO-OMS, 2007); es realmente poco lo que se conoce del Codex Alimentarius y la labor que cumple a nivel internacional. Incluso en el propio sector de alimentos del país, como empresas productoras, entidades oficiales, instituciones académicas o asociaciones científicas y tecnológicas existe un desconocimiento de sus actividades, no obstante, el trabajo desarrollado por la Comisión del Codex Alimentarius es reconocido en el mundo entero por su invaluable aporte a la protección del consumidor y al comercio internacional.

Al respecto, en el año 2013 se emitió la resolución No. 4506 del 30 de octubre emanada por el Ministerio de Salud y Protección Social en el cual se establecen los niveles máximos de contaminantes de alimentos destinados a consumo humano. En el documento se encuentran los límites máximos permitidos para Deoxinivalenol (DON) 100-1750 µg/Kg, Fumonisinas (FUM) 200-4000 µg/Kg y Zearalenona (ZEA) 20 - 350 µg/Kg; estos rangos dependen del tipo de alimento, el tamaño de partículas generadas en el proceso industrial y la edad de los consumidores. Estos valores son muy similares a los manejados por la Unión Europea y Mercosur los cuales se basan en el Documento de la FAO, 2003 (WHO, 2008). En Roma, en el año 2014, la segunda Conferencia Internacional de la ONU y la OMS, trató como tema central, la importancia de la inocuidad de los alimentos. Este último como la seguridad alimentaria son esenciales para conseguir un desarrollo sostenible, en la reunión se concluyó que las normas emitidas por el Codex alimentarius y organismos como la Comisión Europea regulen y vigilen la calidad de los productos dirigidos a los consumidores para evitar una serie de enfermedades producidas por contaminantes de origen fúngico (FAO, 2015).

Para determinar la cantidad de micotoxinas presentes en los alimentos, se han evaluado diferentes métodos de análisis que permiten detectar y cuantificar los diferentes tipos de toxinas producidas por Fusarium. La selección de éstos se basa en que el método a utilizar sea confiable, aplicable y práctico (Horwitz, 1982). La confiabilidad se refiere a su exactitud en la determinación y a su variabilidad o precisión y son los parámetros más importantes a considerar desde el punto de vista analítico. Además, es necesario que el método se aplique a una variedad amplia de muestras y que sea práctico con respecto al costo, tiempo de análisis y capacitación para su realización. El método de cromatografía de líquidos de alta presión (HPLC) es un método exacto y preciso que ha sido aceptado como método oficial y como método de referencia para algunas micotoxinas (Martin y Guiochon, 2005; Liu y Lee, 2006). Otros métodos de referencia son la Cromatografía de Gases (GC), que se utiliza para el análisis de Tricotecenos y la Cromatografía de Capa Fina (TLC). Sin embargo, estos métodos no son, ampliamente utilizados, pues requieren de instrumentación de elevado costo y de una alta capacitación del usuario. Por consiguiente, en los últimos años se han desarrollado métodos inmunoquímicos para facilitar el análisis. La ventaja de estos métodos es que son rápidos, simples y de bajos requerimientos instrumentales. Por consiguiente, en el caso de un gran número de análisis a realizar, los métodos inmunoquímicos representan una buena alternativa. Sin embargo, su mayor desventaja es que se presentan interferencias que ocasionan falsos positivos que conllevan a una interpretación problemática. Por lo tanto, los valores positivos obtenidos con estos métodos convienen que sean confirmados mediante un método de referencia (Liu y Lee, 2006).

Capítulo 3 83

La mayoría de métodos inmunoquímicos comerciales se pueden dividir en los que utilizan columna de inmunoafinidad y los de ELISA. A pesar de que el método de columna de inmunoafinidad se desarrolló para cuantificación mediante fluorometría, actualmente, las columnas se utilizan para purificar y concentrar la micotoxina, luego su detección se hace mediante HPLC, GC y TLC. El método ELISA se utiliza generalmente para monitoreo rápido. Es importante que el método analítico utilizado por el laboratorio haya sido desarrollado y validado para el tipo de insumo analizado (Bergh y Breytenbach, 1997; Liu y Lee, 2006).

ELISA (ensayo de inmunoabsorción ligado a una enzima) como método para detección de micotoxinas está disponible en el mercado hace más de quince años. Esta tecnología se basa en la capacidad de un anticuerpo específico que reconoce la estructura tridimensional de una micotoxina determinada. La metodología consiste en utilizar una fase cinética de unión antígeno-anticuerpo, utilizando una placa de microtitulación reduciendo el tiempo de incubación a unos pocos minutos y obteniendo resultados por colorimetría o en un lector de ELISA. A pesar que esta técnica genera una reducción en el tiempo de incubación, puede conllevar a una mínima pérdida de la sensibilidad del ensayo, la técnica de ELISA, puede generar resultados exactos y reproducibles de bajo costo y con resultados similares a los presentados con HPLC, GC y TLC (Barna et al., 1994; Zengh et al., 2006; Turner et al., 2009).

El objetivo de este capítulo fue cuantificar las micotoxinas presentes en aislamientos Fusarium provenientes de una colección de trabajo de la Universidad Nacional de Colombia, sede Palmira.

3.4 Materiales y métodos

El trabajo se desarrolló en el laboratorio de Diagnóstico Vegetal de la Universidad Nacional de Colombia, sede Palmira. Esta investigación hace parte de los proyectos del Grupo de investigación en Protección Vegetal para el Mejoramiento de la Productividad de la Universidad Nacional de Colombia.

Se seleccionaron catorce aislamientos previamente evaluados por PCR con el gen TRI, FUM y PKS los cuales amplificaron para detección de tricotecenos (DON), fumonisinas (FUM) y zearalenonas (ZEA) (Tabla 3-1).


Tabla 0-1: Detección de micotoxinas presentes en aislamientos obtenidos por análisis filogenéticos de la colección de la Universidad Nacional de Colombia—Sede Palmira

Aislamiento Especie Hospedante Micotoxina





61 F. proliferatum Maíz FUM






113 F. equiseti Melón TRI-ZEA

132 F. verticillioides Vid FUM

144 F. verticillioides Mora FUM

202 F. oxysporum Pimentón FUM

3.4.1 Cuantificación de Micotoxinas

Para determinar la cantidad de micotoxina, los aislamientos se sembraron en cajas de Petri con medio PDA. Micelio procedente de cada aislamiento se extrajo con un sacabocados formando discos de aproximadamente 0.5 mm de diámetro. Luego se conservaron e incubaron con 12 horas de luz y 12 de oscuridad. Una vez el micelio alcanzó un crecimiento en el medio (15 días) se procedió a extraerlo agregando 10 mL de metanol al 70%, el cual se desprendió con una varilla de agitación, luego se filtró con papel Watman No.1, tomando 100µL con una micropipeta y se adicionaron a los controles y a las muestras siguiendo el protocolo del kit Veratox de NEOGEN® de acuerdo con la concentración establecida para cada micotoxina (Figura 3-1), finalmente, se hizo la lectura en un lector de micropocillos o espectofotómetro Neogen 4700 Reader 9303 con una longitud de onda de 650 nm. Las curvas de calibración para la cuantificación de Deoxinivalenol, Zearalenona y Fumonisinas se realizaron con los controles establecidos por el kit (Tabla 3-2).

Capítulo 3 85

Figura 0-1: Metodología usada en la cuantificación de micotoxinas de Fusarium con un lector de micropocillos Neogen. A. Aislamientos. B: Filtración con embudo. C: Controles, D: Mezcla del conjugado. E. Transferir el conjugado a los micropocillos F. Mezclar el conjugado con el anticuerpo. G. Reacción colorimétrica H. Uso del lector ELISA I: Lectura de la concentración.

A B C

D E F

G H I


Tabla 0-2: Valores de los controles usados en los ensayos de cuantificación de micotoxinas

Micotoxina Concentración C1 C2 C3 C4 C5

Deoxinivalenol ppm 0 0.5 1 2.0 5.0

Fumonisina ppm 0 1.0 2 4.0 6.0

Zearalenona ppb 0 25 75 150 500

C= X=log (Conc)

3.5 Resultados y Discusión

3.5.1 Deoxinivalenol

Los resultados muestran que los aislamientos que amplificaron para el gen TRI en el análisis molecular también lo hicieron con la técnica utilizada en esta evaluación (Tabla 3-3). Con esta metodología se demuestra que existe una alta sensibilidad de la prueba siendo esta la más utilizada para detección de tricotecenos en diferentes alimentos tanto de consumo humano como animal (Meneely et al., 2011). Tabla 0-3: Valores de absorbancia y Concentración en ppm de aislamientos productores de deoxinivalenol en medio de cultivo PDA.

Aislamiento Absorbancia Concentración (ppm)

C1 1.0589 0.0

C2 1.0169 0.5

C3 0.755 1.0

C4 0.489 2.0

C5 0.244 6.0

32 F. graminearum 0.545 2.0

67 F. graminearum 0.657 1.5

113 F. equiseti 0.990 0.6

Estudios de cuantificación de tricotecenos son realizados con métodos aceptados universalmente por la Association Official of Analytical Chemists International (AOAC International), organismo a nivel internacional reconocido por la Food and Drug Administration (FDA) para determinarción micotoxinas (Yoshizawa et al., 2004). Desde el momento en que las micotoxinas fueron reconocidas como un problema de salud pública la cuantificación por técnicas analíticas ha mejorado continuamente. La cromatografía de gases CG y cromatografía liquida de alta presión HPLC son las técnicas analíticas más empleadas en la actualidad. Estas determinan varios tricotecenos de forma simultánea con bajos niveles de concentración ng/g de las muestras evaluadas, requiriendo alta rigurosidad especialmente en los procesos de limpieza. La técnica de ELISA permite medir un gran número de muestras de forma rutinaria con alta precisión comparada con los métodos de CG y HPLC, estos últimos son costosos y se necesita de mayor tiempo para obtener resultados (Escobar y Fragas, 2004; Pleadin et al., 2012).

Capítulo 3 87

Los resultados obtenidos en esta evaluación indican que los valores se encuentran por encima de los niveles permitidos para alimentos de consumo directo en Colombia y la Unión Europea relacionados con la presencia de tricotecenos (Rojas y Wilches, 2011). Valores superiores a 750 µg/kg (0.75ppm) encontrados en los aislamientos de F. graminearum en maíz indican una alta concentración de la micotoxina en las muestras evaluadas. En Argentina muestras de maíz han sido monitoreadas encontrando una alta incidencia de contaminación por DON de 0.93 ppm (Pacin et al., 1997). En Brasil los valores no superaron 0.6 ppm (Furlong et al., 1995). No existen valores universalers determinados para medir el daño causado por DON en alimentos de consumo humano, sin embargo, cada país o grupo de países como la Unión Europea UE y Mercosur manejan rangos que oscilan entre 300-2000 ppb, siendo los más bajos los de la UE (Pleadin et al., 2012)

En Colombia, estudios de detección y cuantificación de DON han sido registrados desde el año 1995 (Diaz y Cespedes., 1995; Duarte y Villamil, 2006; Wilches y Contreras 2011; Rojas y Wilches, 2011; Rojas et al., 2015). Estos trabajos muestran los altos niveles de concentración de DON en alimentos de consumo humano, especialmente productos procesados provenientes de maíz y trigo. Este hecho es preocupante ya que en el país a pesar de que la resolución del Ministerio de Salud y Protección Social está vigente a partir del año 2014, a la fecha no se realizan los controles y la aplicación de la norma, sobre todo cuando en el país la puesta en marcha del TLC generó importaciones de cereales como maíz superan el 85% de grano consumido (Ministerio de Comercio Exterior, 2013)

Los riesgos causados por deoxinivalenol se inician cuando entra a la cadena alimentaria transmitiéndose al ser humano directamente a través del consumo de cereales y productos a base de cereales. Alimentos como maíz y trigo son los más susceptibles a ser contaminados con DON, la estabilidad de la toxina puede permanecer en alimentos elaborados a base de cereal contaminado, como por ejemplo pan, pasta, galletas, etc. La toxicidad se puede presentar por contacto (provocando irritaciones en piel, ojos y garganta) como por ingesta directa, de acuerdo con la cantidad ingerida, puede provocar vómitos, diarrea, taquicardia, leucopenia (efecto inmunosupresor por la disminución de leucocitos), o efectos teratogéneicos (asociado con enfermedades congénitas) (Sudakin, 2003; Pietsch et al., 2014; Yang et al., 2014).

Por otro lado, es importante destacar que los tricotecenos como DON son translocados en los tejidos de la planta antes de producirse síntomas de la enfermedad y signos del hongo. Es decir, los metabolitos actúan disminuyendo la síntesis proteica de la planta y son capaces de suprimir o retrasar la respuesta de defensa. Se ha encontrado que los aislamientos que no producen tricotecenos son menos patogénicos y afectan en menor proporción el desarrollo productivo de la planta (Desjardins et al., 1992; Desjardins y Hohn, 1997).

3.5.2 Zearalenona

En los aislamientos 32 y 67 correspondientes a F. graminearum y 113 F. equiseti amplificaron con el gen PKS por PCR también hubo la presencia de la micotoxina zearalenona mediante la prueba serológica de ELISA (Tabla 3-4). F. graminearum predomina en ambientes con temperaturas de 25°C y humedad relativa mayor al 88%. En cambio, F. equiseti se desarrolla en áreas tropicales y subtropicales afectado diversos cultivos, apareciendo principalmente en época de cosecha y poscosecha. Varios estudios


han demostrado que la producción de zearalenona en alimentos almacenados se incrementa con la actividad de agua, es decir, la cantidad de agua libre que está disponible para el crecimiento de los microorganismos siendo óptima a 0.98, esta condición facilita la biosíntesis de la toxina (Lacey y Magan, 1991; Marín et al., 2010; Velluti et al., 2000)

Para esta micotoxina los valores máximos permisibles en alimentos para humanos son de 0.1 ppm (Ministerio de Salud y Protección Social, 2016), los valores encontrados en los aislamientos evaluados están por encima de los rangos establecidos para Colombia (Tabla 3-4).

Tabla 0-4: Valores de absorbancia y Concentración en ppm de aislamientos productores de zearalenona en medio de cultivo PDA.

Aislamiento Absorbancia Concentración (ppb) Concentración (ppm)

C1 1.866 0.0 0.0

C2 1.400 25.0 0.025

C3 0.996 75.0 0.075

C4 0.748 150.0 0.15

C5 0.471 500.0 0.5

32 F. graminearum 0.534 349.4 0.349

67 F. graminearum 0.628 253.1 0.253

113 F. equiseti 0.763 165.5 0.165

En ese sentido, se observa que las micotoxinas DON y ZEA aparecen de manera simultánea en las especies F. graminearum y F. equiseti, siendo esta condición un agravante más, puesto que aún no se conoce bien los posibles efectos sinérgicos asociados con la ingesta de alimentos contaminados con varias micotoxinas, tal como lo mencionan Muthomi et al., (2008) cuando asocia la presencia de DON y ZEA en granos de trigo en Kenia, Li et al. 2014, detalla la ocurrencia simultánea de DON, ZEA, OTA (ocratoxinas) y AFs (aflatoxinas) en cereales y cultivos productores de aceite. En estudios realizados por Rojas et al., 2015 sobre co-ocurrencia de micotoxinas en alimentos infantiles encontraron que ZEA presentó altas concentraciones entre 421,34 y 1518,22µg/kg, (0.421-1.5 ppm) los cuales superan los valores legales establecidos para Colombia y de la UE (20µg/kg). En un estudio realizado en 1999 (Díaz, 2005), se halló en maíz valores que oscilaron entre 35 y 134µg/kg (0.035-0.134 ppm) los cuales están por encima de los rangos actuales, así como los encontrados en este estudio. La toxina zearalenona es termoestable, esta situación le permite sobrevivir en condiciones adversas, se metaboliza rápidamente una vez ingresa al cuerpo, produciendo sustancias estrogénicas como α-zearalenol y β-zearalenol, estas al poseer en su estructura una lactona que inicia la actividad estrogénica y es capaz de competir e interactuar con receptores de estrógenos los cuales activan y desactivan las rutas metabólicas (Li et al., 2014). La información relacionada sobre los daños causados por la zearalenona en los seres humanos es escasa. Sin embargo, estudios concernientes con altas concentraciones de zearalenona en los alimentos y la aparición de enfermedades conexas con los estrógenos tales como pubertad precoz y cáncer de mama ha permitido creer que esta toxina desencadena una serie de eventos que conducen a la formación de células cancerígenas,

Capítulo 3 89

también afecta el sistema inmunológico (EFSA, Scientific opinion on the risk for public health related to the presence of Zearalenona in food, 2011). La organización Mundial de la Salud (OMS) y la agencia internacional para investigaciones en Cáncer (IARC) categorizan a la zearalenona ZEA y a deoxinivalenol DON producidas por F. graminearum en el grupo 3, es decir no clasifica como agente cancerígeno para humanos (IARC, 2015). Sin embargo, los daños causados por esta toxina en humanos se reflejan en daños de tipo estrogénico (Rojas y Wilches, 2011).

3.5.3 Fumonisina

Se encontraron altas concentraciones de fumonisina en la especie F. verticillioides, los aislamientos 38, 40, 73 y 75 provenientes de maíz, superaron los valores del control de 6ppm (Tabla 3-5). En Colombia los límites permitidos de fumonisinas es de 3 ppm, sin embargo, para la UE los valores oscilan entre 0.2 y 4 ppm. Para la especie F. proliferatum los valores también exceden los rangos permitidos. En las especies F. verticillioides y F. oxysporum, (80, 83,144 y 202) la concentración de FUM no supera esos rangos

Tabla 0-5: Valores de absorbancia y concentración en ppm de aislamientos productores de fumonisinas en medio de cultivo PDA.

Aislamiento Absorbancia Concentración (ppm)

C1 1.548 0.0

C2 1.043 1.0

C3 0.851 2.0

C4 0.618 4.0

C5 0.478 6.0

38 F. verticillioides 0.297 13.0



61 F. proliferatum 0.523 5.3







202 F. oxysporum 0.594 3.0

Siendo el maíz un alimento de consumo diario para Colombia, las concentraciones encontradas en medio de cultivo son altas en comparación a los rangos estimados para alimentos de consumo directo y procesado. Estudios realizados en México, donde se evaluó la concentración de fumonisinas en maíz en campo y bajo condiciones controladas se encontró una alta cantidad de fumonisinas (5 ppm) por encima de los estándares establecidos convirtiéndose en un riesgo potencial tanto para la salud de humanos y animales (Gallardo-Reyes et al., 2006). En un estudio realizado en Brasil por Ono et al. (1999), encontraron que una alta humedad relativa y temperatura eran claves para el crecimiento del hongo y la posterior contaminación con fumonisinas en campo. Así mismo, el periodo cercano a la madurez de la mazorca o llenado de grano genera los más altos


niveles de fumonisinas (Martínez et al., 2010). Periodos secos antes y durante el llenado de granos también favorecen la severidad de la enfermedad e incrementa la acumulación de fumonisinas (Munkvold, 2003). Las fumonisinas también son producidas por algunas especies del complejo de especies de F. fujikuroi (FFCS) como F. proliferatum y F. napiforme y el complejo de especies de F. oxysporum, la cantidad de la toxina encontrada juega un papel importante en la patogenicidad de las plantas (Winter et al., 1996). La formación de fumonisinas se presenta por la expresión del gen FUM (Waalwijk et al., 2004; Stępień et al., 2011). El cluster de genes FUM está altamente correlacionado entre F. oxysporum, F. verticillioides y F, proliferatum en relación con el número de genes, orientación y orden (Proctor et al., 2008). La cantidad de Fumonisina FB1 depende del substrato, el genotipo y las condiciones ambientales, estas últimas juegan un papel importante en los factores de trascripción del gen FUM (Jurado et al., 2008) La especie F. verticillioides es conocida a nivel mundial como la mayor productora de fumonisinas. Además, se ha documentado por más de 100 años la toxicidad en maíz (Desjardins y Hohn, 1997). Los estudios sobre la toxicidad de fumonisinas se iniciaron en 1988 cuando se presentó una devastadora enfermedad que afectaba animales de granja especialmente caballos, burros, mulas y conejos. En estudios realizados en el sur de África se determinó que la especie F. verticillioides era el agente causal de la leucoencefalomacia, esta investigación condujo a realizar estudios pertinentes con esta micotoxina al demostrar que dosis orales e intravenosas conllevan al desarrollo de dicha enfermedad en caballos y cáncer de hígado en ratas (Marassas, 1995). La organización mundial de la salud (OMS) y la Agencia internacional para investigaciones de cáncer (IARC) categorizan a esta micotoxina en el grupo 2B, es decir posiblemente cancerígeno. Sin embargo, se cree que existe una relación entre la ocurrencia de F. verticillioides y el cáncer de esófago. Estudios epidemiológicos realizados en Italia, Irán, Zimbawue, China, Estados Unidos, Brasil relacionan a este tipo de cáncer con altas concentraciones de fumonisina B1, B2 producidas por F. verticillioides y a su vez la alta ingesta de maíz y trigo con dietas con bajos contenidos de minerales como manganeso, molibdeno, selenio, folato y vitaminas A, C, E y B12 favorecen el desarrollo de enfermedades (Cao et al., 2013). Estudios realizados en México asocian defectos del tubo neural a los altos consumos de maíz en regiones de China, Sudáfrica y la frontera entre Texas y México (Mutchinick et al., 1999; Gueant et al., 2006) En Colombia, el cáncer de esófago es considerado como uno de los más agresivos ya que causa el 90% de muerte en los casos detectados, su causa está asociada a virus y bacterias y en algunos casos consumo de tabaco, siendo Antioquia el departamento con mayor incidencia, los registros y diagnósticos no lo asocian a la presencia de fumonisinas en alimentos como lo verifican estudios en América Latina y en Asia (Pardo y Cendales, 2015; Cao et al., 2013). Se requiere para Colombia realizar estudios de detección de micotoxinas en alimentos de consumo directo, materias primas y productos procesados que generen la información necesaria para determinar la inocuidad de los alimentos consumidos.

Capítulo 3 91

3.6 Conclusiones

La técnica ELISA utilizada en este estudio permitió cuantificar las micotoxinas deoxinivalenol, zearalenona y fumonisina en los aislamientos detectados previamente por PCR. Los altos niveles de micotoxinas detectados y cuantificados con el método de extracción usado y la prueba de inmunoabsorción permitieron obtener niveles por encima de los controles del kit.

3.7 Bibliografía

Aoki, T., Ward. T., Kistler, H., O'Donnell, K. 2012. Systematics, phylogeny and

trichothecene mycotoxin potential of Fusarium head blight cereal pathogens Mycotoxin vol 62(2) 2012. 91-102p.


Barna-Vetró, I., Solti, L., Téren, J., Gyöngyösi, Á., Szabó, E., & Wölfling, A. 1996. Sensitive ELISA test for determination of ochratoxin A. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 44(12), 4071-4074.

Bruns, T., Proctor, R., Munkvold, G. 2011, June. The role of mycotoxins produced by Fusarium verticillioides and Fusarium graminearum in Maíze seedling infection. In Phytopathology vol. 101, No. 6, pp.

Bergh, J. J., Breytenbach, J. C., & Breet, E. L. J. 1997. Kinetics and pH profile of thermal decomposition of trimethoprim in aqueous solution. Pharmazie, 52(4), 290-294.

Butrón, A., Santiago, R., Mansilla, P., Pintos-Varela, C., Ordás, A., & Malvar, R. A. 2006. Maíze (Zea mays L.) genetic factors for preventing fumonisin contamination. Journal of agricultural and food chemistry, 54(16), 6113-6117.

Cao A, Santiago R, Ramos AJ, Marín S, Reid LM, Butrón A, 2013. Environmental factors related to fungal infection and fumonisin accumulation during the development and drying of white Maíze kernels. International journal of food microbiology, 164(1), 15-22


CORPORACIÓN COLOMBIA INTERNACIONAL CCI. 2011. Manual del exportador de frutas, hortalizas y tubérculos en Colombia. Disponible desde Internet en: http://es.scribd.com/doc/75714245/fertilizacion-foliar (Consultado 15/03/16).

Daren W. Brown, & Robert H. Proctor (Eds.). (2013). Fusarium: Genomics, Molecular and Cellular Biology. Horizon Scientific Press.

http://scholar.google.es/citations?user=5FyqzXAAAAAJ&hl=es&oi=sra

http://scholar.google.es/citations?user=93PeNdgAAAAJ&hl=es&oi=sra



http://es.scribd.com/doc/75714245/fertilizacion-foliar


Desjardins A., and Proctor R. 2001. Biochemistry and genetics of Fusarium toxins. En: Fusarium. Summerell, A. et al., eds. APS Press. St. Paul, Minnesota. pp. 122 – 137.

Desjardins, A. 2006. Fusarium micotoxyn: chemistry, genetics and biology. Americam Phytopathology Society Press, St. Paul. MN. 260p.


Desjardins, A. E., Hohn, T. M., & McCormick, S. P. 1992. Effect of gene disruption of

trichodiene synthase on the virulence of Gibberella pulicaris. Mol. Plant-Microbe

Interact, 5, 214-222.

Desjardins, A., and Hohn, T. 1997. "Mycotoxins in plant pathogenesis." Molecular Plant-Microbe Interactions 10.2 :147-152

Diaz G. 2005. Micotoxinas y Micotoxicosis de importancia en salud humana en Colombia. Ponencia VII Congreso Latinoamericano de Microbiología e higiene de alimentos COLMIC, 2005. Mayo 18-25. Bogotá, Colombia.

Diaz G. and Céspedes, A. 1995. Natural occurrence of zearalenone in feeds and feedstuffs used in poultry and pig nutrition in Colombia. Mycotoxin Research; 13: 81-8738

Diaz G., Perilla N., Rojas Y. 2001.Ocurrence of aflatoxins in selected Colombian foods. Mycotoxin Research.; 17: 15-20.


EC. European Comission. Joint Research Centre. Institute for reference material and measurements. ERDA, D. Mycotoxins Factsheet. 4 ed. JRC Technical Notes 2011.

EFSA. European Food Safety. 2011. Panel on Contaminants in the Food Chain (CONTAM);

Scientific Opinion on the evaluation of contaminats in the food.

www.efsa.europa.eu/sites /default/files/scientific.../2482.pdf. Consultado

1/04/2016.

Escobar, A., & Fragas, I. 2004. Determinación de deoxinivalenol (vomitoxina) en muestras de trigo por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). Rev. Salud Anim. Vol, 26(2), 116-120.

FAO, I. 2015. WFP. 2015. The State of Food Insecurity in the World.

FAO. 2007. Mycotoxins. http://www.fao.org/docrep/005/y1390s/y1390s02.htm. Consultado. 05/03/2016

Furlong, E.B., Soares, L.M.V., Lasca, C.C., Kohara, E.Y., 1995. Mycotoxins and fungi in wheat harvested during 1990 in test plots in the state of Sao Paulo Brazil. Mycopathologia 131, 185-190.

http://www.efsa.europa.eu/sites%20/default/files/scientific.../2482.pdf

http://www.fao.org/docrep/005/y1390s/y1390s02.htm.%20Consultado.%2005/03/2016

http://www.fao.org/docrep/005/y1390s/y1390s02.htm.%20Consultado.%2005/03/2016

Capítulo 3 93

Gallardo-Reyes, E. D., Ibarra-Moreno, G. M., Sánchez-Mariñez, R. I., Cuamea-Cruz, G., Molina-Gil, D., Parra-Vergara, N. V., ... & Cortez-Rocha, M. O. 2006. Micobiota de maíz (Zea mays L.) recién cosechado y producción de fumonisina B1 por cepas de Fusarium verticillioides (Sacc.) Nirenb. Revista Mexicana de Fitopatología, 24(1), 27-34.

Geiser, D., Jiménez-Gasco, M., Kang, S., Makalowska, I., Veeraraghavan, N., Ward, J., & O’Donnell, K. 2004. FUSARIUM-ID v. 1.0: a ADN sequence database for identifying Fusarium. Molecular Diversity and PCR-detection of Toxigenic Fusarium Species and Ochratoxigenic Fungi, 473-479.

Geiser, D., Juba, J., Wang, B. and Jeffers, S. 2001. Fusarium hostae sp nov., a relative of F. redolens with a Gibberella teleomorph. Mycologia 93 (4):670-678.


Guéant-Rodriguez RM, Guéant JL, Debard R, Thirion S, Hong LX, Bronowicki JP, 2006.Prevalence of methylenetetrahydrofolate reductase 677T and 1298C alleles and folate status: a comparative study in Mexican, West African, and European populations. Am J Clin Nutr; 83:701-707

Horwitz, W. 1982. Evaluation of analytical methods used for regulation of foods and drugs. Analytical Chemistry, 54(1), 67A-76A.

IARC .1993. Monographs 56: Same naturally-ocurring substances: same food items and constituents, heterocyclic aromatic amines and mycotoxins. International Agency for Research on Cancer, Lyon France, págs. 397-443

Jestoi, M. 2005. Emerging Fusarium mycotoxins in Finland. Academic dissertation. National veterinary and food Research Institute (EELA), Departament of chemistry and department of biochemistry and food chemistry. University of Turkye. p123.

Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives. Meeting, & World Health Organization. 2001. Safety evaluation of certain mycotoxins in food (Vol. 74). Food & Agriculture Org.

Jurado M, Marín P, Magan N, González-Jaén MT 2008 Relationship between solute and matric potential stress, temperature, growth, and FUM1 gene expression in two Fusarium verticillioides strains from Spain. Appl Environ Microbiol 74:2032

Li, R., Wang, X., Zhou, T., Yang, D., Wang, Q., & Zhou, Y. 2014. Occurrence of four mycotoxins in cereal and oil products in Yangtze Delta region of China and their food safety risks. Food Control, 35(1), 117-122.

Liu Y., Lee, M. 2006. Ultrahigh pressure liquid chromatography using elevated temperature.

Journal of Chromatography. 2006; 1104 (1-2):198–202.


Marasas, W. F., Kellerman, T. S., Gelderblom, W. C., Coetzer, J. A., Thiel, P. G., & Van

der Lugt, J. J. (1988). Leukoencephalomalacia in a horse induced by fumonisin B1

isolated from Fusarium moniliforme. The Onderstepoort journal of veterinary

research, 55(4), 197-203.

Marín, P. 2010. Análisis de factores ecofisiológicos que influyen en la expresión de genes

relacionados con la biosíntesis de toxinas en especies de" Fusarium". Tesis

Doctoral Universidad Complutense de Madrid. España.233p

Martin, M., & Guiochon, G. 2005. Effects of high pressure in liquid chromatography. Journal of Chromatography A, 1090(1), 16-38.

Martínez, M., Moschini, R., Barreto, D., Bodega, J., Comerio, R., Forjan, H., ... & Valentinuz, O. R. 2010. Factores ambientales que afectan el contenido de fumonisina en granos de maíz. Tropical Plant Pathology, 35(5), 277-284.

Meneely, J. P., Ricci, F., van Egmond, H. P., & Elliott, C. T. 2011. Current methods of analysis for the determination of trichothecene mycotoxins in food. TrAC Trends in Analytical Chemistry, 30(2), 192-203.


Ministerio de Comercio Exterior. Cadena Productiva Del Maíz. 2013. Superintendencia de Industria y Comercio. Colombia.En: www.sic.go.co.drupal.masive.datos Consultado 12/04/2016.

Moss M. 1996. Centenary Review.Mycotoxins. Mycol Res; 100: 513-523.

Moss, M. 1991. The environmental factors controlling mycotoxin formation. En: Smith JE Henderson RS (Eds.) Mycotoxins and animal foods. Boca Raton, CRC Press Inc,: 37-56.

Munkvold, G.P. 2003. Epidemiology of Fusarium diseases and their mycotoxins in Maíze ears. European Journal of Plant Pathology 109:705-713.

Mutchinick OM, López MA, Luna L, Waxman J, Babinsky VE. 1999. High prevalence of the thermolabile methylenetetrahydrofolate reductase variant in Mexico: a country with a very high prevalence of neural tube defects. Mol Genet Metab; 68:461-467.

Muthomi JW, Ndung'u KK, Gathumbi JK, Mutitu EW, Wagacha JM. 2008. The occurrence of Fusarium species and mycotoxins in Kenyan wheat. Crop Protection; 27: 1215-1219


http://www.sic.go.co.drupal.masive/

Capítulo 3 95



Ono E, Sugiura Y, Homechin M, Kamogae M, Vizzoni E, Ueno Y, Hirooka E.1999. Effect of climatic conditions on natural mycoflora and fumonisins in freshly harvested corn of the State of Paraná, Brazil. Mycopathologia 147:139-148.

Pacin, A.M., Resnik, S.L., Neira, M.S., Molto, G., Martinez, E., 1997. Natural occurrence of deoxynivalenol in wheat, wheat flour and bakery products in Argentina. Food Addit. Contam. 14, 327±331.

Pardo C, Cendales R. Incidencia, mortalidad y prevalencia de cáncer en Colombia, 2007-2011. 2015. Primera edición. Bogotá. D.C. Instituto Nacional de Cancerología, v.1. p. 148

Pietsch, C., Schulz, C., Rovira, P., Kloas, W., & Burkhardt-Holm, P. 2014. Organ damage and hepatic lipid accumulation in carp (Cyprinus carpio L.) after feed-borne exposure to the mycotoxin, deoxynivalenol (DON). Toxins, 6(2), 756-778.

Pitt, J. 1996. What are mycotoxins? Australian Mycotoxin Newsletter. 7(4), página 1.

Pleadin, J., Sokolović, M., Perši, N., Zadravec, M., Jaki, V., & Vulić, A. 2012. Contamination of Maíze with deoxynivalenol and zearalenone in Croatia. Food Control, 28(1), 94-98.

Pleadin, J., Sokolović, M., Perši, N., Zadravec, M., Jaki, V., & Vulić, A. 2012. Contamination of Maíze with deoxynivalenol and zearalenone in Croatia. Food Control, 28(1), 94-98.

Pohland, A. 1993. Mycotoxins in review. Food Addit Contam 10: 17-28.3.

Proctor RH, Busman M, Seo J-A, Lee YW, Plattner RD. 2008. A fumonisin biosynthetic gene cluster in Fusarium oxysporum strain O-1890 and the genetic basis for B versus C fumonisin production. Fungal Genet Biol 45:1016–1026

Rojas, C., Wilches, F., & Darghan, C. 2015. Co-ocurrence of microorganisms and toxic metabolites in food for children. Revista UDCA Actualidad & Divulgación Científica, 18(1), 3-12.

Rojas, L., & Wilches, A. M. 2011. Coexistencia de aflatoxinas, zearalenona y deoxinivalenol en alimentos de consumo infantil. @ limentech, Ciencia y Tecnología Alimentaria, 10(1).

Salvat, A. E., Balbuena, O., Ricca, A., Rosello Brajovich, J. E., Rojas, D., Berretta, M. F., & Salerno, J. C. 2013. Presencia de zearalenona en pasturas del este de Chaco. RIA. Revista de investigaciones agropecuarias, 39(1), 31-36.


Stępień Ł, Koczyk G, Waśkiewicz A 2011 Genetic and phenotypic variation of Fusarium proliferatum isolates from different host species. J Appl Genet 52:487–496

Sudakin, D. L. 2003. Trichothecenes in the environment: relevance to human health. Toxicology letters, 143(2), 97-107.

Turner, N. W., Subrahmanyam, S., & Piletsky, S. A. (2009). Analytical methods for determination of mycotoxins: a review. Analytica Chimica Acta, 632(2), 168-180.

Velluti, A. (2002). Ecofisiología de especies de Fusarium productoras de fumonisinas, zearalenona y deoxinivalenol en maíz: aceites esenciales como inhibidores fúngicos.

Waalwijk C, van der Lee T, de Vries I, Hesselink T, Arts J, Kema GHJ. 2004. Synteny in toxigenic Fusarium species: the fumonisin gene cluster and the mating type region as examples. Eur J Plant Pathol 110:533–544

Ward, T., Bielawski, J., Kistler, H., Sullivan, E., O’Donnell, K. 2002. Ancestral polymorphism and adaptive evolution in the trichothecene mycotoxin gene cluster of phytopathogenic Fusarium. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 99 9278–83.

Wilches, A. M., & Contreras, L. R. 2011. Detección y cuantificación de deoxinivalenol en productos de consumo infantil comercializados en Pamplona, Norte de Santander. Alimentos Hoy, 16(16), 9-18.

World Health Organization (WHO). 2008. Food and Agriculture Organization of the United Nations (FAO). 2003. Diet, Nutrition, and the Prevention of Chronic Disease. Geneva: WHO.

Yang, W., Yu, M., Fu, J., Bao, W., Wang, D., Hao, L., ... & Liu, L. 2014. Deoxynivalenol induced oxidative stress and genotoxicity in human peripheral blood lymphocytes. Food and Chemical Toxicology, 64, 383-396.

Yoshizawa, T., Kohno, H., Ikeda, K., Shinoda, T., Yokohama, H., Morita, K., ... & Kobayashi, Y. 2004. A practical method for measuring deoxynivalenol, nivalenol, and T-2+ HT-2 toxin in foods by an enzyme-linked immunosorbent assay using monoclonal antibodies. Bioscience, biotechnology, and biochemistry, 68(10), 2076-2085.

Zhang, J. Wang, J. Gong, F., Song, B., Li, X., Li, H., Peng, C. y Liao, C. 2013. Natural occurrence of Fusarium head bligt, mycotoxins and mycotoxin-producing isolate of Fusarium in commercial fields of wheat in Hubei. Plant Pathology Vol 62, 1, p. 92–102.

Zheng, M. Z.; Richard, J. L. y Binder, J. 2006. A review of rapid methods for the analysis of

mycotoxins. Mycopathologia. 161:261–273.

http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/ppa.2012.62.issue-1/issuetoc

4. Capítulo 4

Consideraciones Finales

En este estudio se planteó contribuir en la caracterización morfológica y molecular de aislamientos de Fusarium productores de micotoxinas. La información obtenida permitió generar una aproximación en la organización taxonómica y sistemática de las especies del género Fusarium colectadas en diferentes regiones de Colombia y en diversidad de cultivos.

Dentro de la colección de aislamientos de Fusarium de la Universidad Nacional de Colombia se encontró una alta variabilidad intra e inter especies, esto permitió agrupar a catorce especies en siete complejos así: complejos de especies de F. graminearum CSFG (F. graminearum, F. coeruleum); Complejo de especies de F. oxysporum CSFO (F. oxysporum); Complejo de especies de F. solani CSFS (F. solani); Complejo de especies de F. fujikuroi CSFF (F. fujikuroi, F. sacchari, F. proliferatum, perteneciente al subclado Asiático, F. verticillioides, perteneciente al subclado Africano, F, guttiforme perteneciente al subclado Americano) complejo de especies de F. chlamydosporum; Complejo de especies de F. incarnatum-equiseti y Complejo de especies de F. decemcellulare (Geiser et al., 2013; Aoki et al., 2014; O´Donnell et al., 2015).

Es de resaltar que la especie F. oxysporum fue la más predominante; llegando en algunos casos a clasificarlas hasta formas especiales (F. oxysporum f. sp. lycopersici). Se considera que la fuente de variabilidad para esta especie que no presenta reproducción sexual, estaría asociada con mutaciones, este fenómeno le facilita al hongo la transferencia genética vía anastomosis de hifas y a su vez la presencia de elementos transposones; lo cual permite que con la reproducción asexual se establezcan linajes clónales dentro de la población (Jacobson y Gordon, 1991; Klister, 1997). Los elementos transposones actúan como generadores de la diversidad debido a que su actividad produce mutaciones espontáneas y por consiguiente variabilidad en el genoma (McDonald, 1993; Daboussi y Langin, 1994).

También se considera que la transferencia cromosómica horizontal dentro de las especies parece haber contribuido potencialmente a la generación de variantes y en particular a generar los nuevos patógenos (Ma et al., 2010). Por lo tanto, bajo condiciones naturales, la presión de selección recíproca entre el hospedante y el patógeno, así como la acción del medio ambiente, son los mecanismos responsables de la frecuencia y variabilidad encontrada en los genes de resistencia y virulencia del patosistema (Anikster & Whal, 1979; Thompson & Burdon, 1992).

En el caso particular de aislamientos de Fusarium procedente de plantas de maíz se encontró un total de doce especies aisladas en este cultivo. En ese sentido y teniendo en cuenta que la coevolución en patosistemas agrícolas está basado en el principio básico de la teoría gen a gen propuesta por Flor (1971), en la cual se da la interacción de genes que condicionan resistencia en el hospedante y sus correspondientes genes que regulan la patogenicidad en el patógeno, puede estar condicionada por otros factores tal como lo expresan otros autores como Thompson & Burdon, (1992); Leonard, (1994) donde hay una interacción específica de polimorfismos de una serie de genes de resistencia en el hospedante y los correspondientes genes de avirulencia en el patógeno.

98 Consideraciones Finales

En ese sentido, cabe aclarar que la variabilidad genética es una condición presente en patosistemas silvestres que se ha preservado e incrementado en los agroecosistemas. Por lo tanto, las modificaciones genéticas de los cultivos introducida por mejoramiento convencional, la introducción de cultivos a nuevos ambientes, la ampliación de las fronteras agrícolas, y el uso indiscriminado de fungicidas sistémicos, son los factores que han aumentado la fuerza de selección ejercida sobre poblaciones de patógenos presentes en esos sistemas intervenidos por el hombre que a su vez favorecen la expresión de nuevos genes de virulencia y polimorfismos de patógenos.

Uno de los cebadores utilizados en este estudio fue el gen TEF-1α el cual es específico para Fusarium, es altamente informativo a nivel de especie, ya que su secuencia tiene un alto polimorfismo en el genoma (O’ Donnell, 1998). El gen EF-1α se basa en que cerca del 6% de los nucleótidos que lo conforman son considerados cladísticamente significativos (39/656 nucleótidos), además el 95 % de estos nucleótidos se encuentran en regiones exónicas, en donde se han detectado procesos de transición de bases, lo que genera un 50% de información extra altamente confiable que otros genes utilizados para Fusarium (mtSSU, β-tubulina, Calmodulina) (Geiser et al., 2004). Por lo tanto, las pocas restricciones evolutivas obtenidas de los patrones de mutación como delecciones de bases y la presencia de una única copia en el genoma sitúan en ventaja a este cebador. (O’Donnell et al., 1998; Geiser et al., 2004).

Los árboles filogenéticos generados a partir de TEF-1α delimitan las especies en grupos y muestran la mínima cantidad de cambios evolutivos que se pueden generar entre las secuencias. Sin embargo, para algunas secuencias de F. oxysporum se observa una división del grupo generando relaciones falsas cuando las cantidades de los caracteres homoplásticos afectan a los caracteres homólogos (Felsentein, 1978).

Para TEF-1α se genera un árbol que delimita las especies en grupos y muestra la mínima cantidad de cambios evolutivos que se pueden generar entre las secuencias. En ese sentido, el árbol consenso de Máxima parsimonia genera grupos correctamente delimitados que conducen a disertar sobre la distribución de las especies en complejos lo que permite un acercamiento a la propuesta de Aoki et al., 2014 y O´Donnell et al., 2015, los cuales establecen cuatro complejos de especies, donde se incluyen aquellas que afectan a la mayoría de plantas. Estos son: Complejo de especies de Fusarium fujikuroi (FFSC) (F. verticillioides, F. proliferatum, F. guttiforme, F. fujikuroi, F. sacchari); Complejo de especies de especies de F. solani (FSSC); Complejo de especies de especies de F. graminearum (FGSC); y Complejo de especies de especies de F. oxysporum (FOSC).

Dentro del complejo de especies de F. fujikuroi las secuencias de la especie F. verticillioides generan ramas por fuera del grupo lo que permite inferir que se forma un subgrupo con caracteres diferentes y drásticos cambios evolutivos que pueden estar involucrados con la presencia de micotoxinas (fumonisinas) ya que provienen de la colección de maíz en campo. También se observa valores altos en especies de F. proliferatum que al igual que F. verticillioides son las especies que producen mayor cantidad de fumonisinas.

El complejo de especies de F. oxysporum representa a nivel mundial el grupo más diverso dentro del género. En este estudio los aislamientos procedentes de pitaya, ají, mora vid y tomate de árbol indican una alta diversidad de especies que se pueden generar ya sea por el tipo de hospedante o por transferencia horizontal que dentro de las especies parece haber contribuido potencialmente a la generación de variantes y en particular a generar nuevos patógenos (Ma et al., 2010).

Capítulo 4 99

En el complejo de especies de F. solani, las variaciones encontradas al interior de este grupo se explican por la complejidad que se genera no solo en la morfología, sino que este complejo agrupa sus especies teniendo en cuenta el origen geográfico y el hospedante afectado. En esta morfoespecie, se estima que existen alrededor de 60 especies filogenéticamente distintas (Nalim, et al., 2011; O´Donnell et al., 2008; O´Donnell et al., 2015).

Varios autores han señalado la confusión filogenética del género Fusarium dentro de los complejos de especies que actualmente se han propuesto (O´Donnell et al., 2004; Leslie y Summerell, 2006; O´Donnell et al., 2008; Geisser, et al., 2013; Aoki et al., 2014; O´Donnell, et al., 2015). Sin embargo, el hecho de que todos los aislamientos que pertenecen a un mismo complejo de especies pueden presentar grandes diferencias genéticas derivado de un origen filogenético diferente tal como sucede en los complejos de especies de F. oxysporum y F. solani donde las formas especiales son derivadas del hospedante afectado, marca contrastes altamente visibles en las secuencias evaluadas. (Nelson et al., 1993; Leslie et al., 2006; O´Donnell et al., 2008; Balaje et al., 2009). Esto es posible debido a que algunos o varios de los aislamientos de los complejos de especies obtenidos en el presente estudio deriven de linajes diferentes.

La documentación de los últimos años dada por grupos de investigadores liderados por Geiser y colaboradores (2013), Aoki et al. (2014) y O´Donnell et al. (2015) determinan un análisis de la taxonomía de Fusarium, considerando hacer cambios en el Código Internacional de Nomenclatura de las algas y hongos, con el fin de proponer el uso exclusivo del nombre Fusarium para el clado que representa el clado terminal del mismo. La ventaja de esta propuesta está enmarcada en utilizar al menos ocho nombres genéricos para cada linaje (Geiser et al., 2013) mientras que O´Donnell et al. (2015) proponen veinte especies. Los autores se oponen a propuestas que incluyan subclados con el rango de género dentro de este clado a pesar de encontrar diferencias en linajes morfológicos y filogenéticos dentro del clado Gibberella necesitando precisar en los nombres dados a las especies para poder reunir la historia evolutiva del hongo.

A pesar de estos desafíos, el futuro de la sistemática de Fusarium debe ser vista con gran optimismo. Un alto grado de claridad ha surgido en las últimas décadas en materia de los límites de las especies, grupos subgenéricos y los límites genéricos. El diluvio de datos genómicos, que está en el camino permitirá reevaluar la filogenia de Fusarium y examinar mecanismos que subyacen su evolución en la escala del genoma, combinando a su vez herramientas bioinformáticas que con la ayuda de Internet promuevan un acercamiento de a la verdadera taxonomía del hongo.

El concepto de Fusarium ha evolucionado para representar un grande y diverso conjunto de taxones en el último siglo. Si bien, este tamaño y diversidad puede presentar desafíos, y los argumentos han abundado sobre conceptos de especie en el género, ninguna información ha generado concordancia de manera significativa. Junto con el concepto genérico la gran y diversa comunidad de investigadores ha evolucionado, dando lugar a una larga lista de descubrimientos que han tenido un impacto en fitopatología, micología médica y biología de hongos. Al lograr unificar los conceptos morfológicos, biológicos y filogenéticos se conducirá a esclarecer la verdadera diversidad del género.

Otro aspecto importante de este estudio fue la detección por métodos moleculares de micotoxinas presentes en los aislamientos de la colección de Fusarium de la Universidad Nacional de Colombia. En las 14 especies evaluadas se logró detectar su presencia en cinco especies (F. graminearum, F. equiseti, F. verticillioides, F. proliferatum y F.


oxysporum). En el país, la detección de micotoxinas se ha realizado directamente en alimentos de consumo animal y humano, la información que existía hasta el momento de especies y hospedantes era escasa, en este estudio se destaca la presencia de micotoxinas especialmente en maíz como fumonisinas, tricotecenos y zearalenona. Siendo las fumonisinas la más abundante, a su vez se registra por primera vez en el país, su presencia a partir de estudios moleculares en F. oxysporum en pimentón, Heperkan y Ermis, 2004; Santos et al., 2008), F. verticillioides en mora y vid de los cuales no hay registro

De igual manera se observa una alta coincidencia con la literatura mundial que no registra la presencia de fumonisinas en especies como F. coeruleum, F. graminearum, F. solani y F. equiseti (Thiel et al., 1991; Rheeder et al., 2002).

La caracterización morfológica realizada en este estudio con las especies que amplificaron con los genes de micotoxinas ubican a estas en complejos tal como lo menciona Geiser et al., 2013; Aoki et al., 2014 y O´Donnell et al., 2015, agrupando a las especies de acuerdo con los caracteres morfológicos y filogenéticos así: Complejo de especies de F. graminearum CSFG (F. graminearum); Complejo de especies de F. oxysporum CSFO (F. oxysporum); Complejo de especies de F. solani CSFS (F. solani); Complejo de especies de F. fujikuroi CSFF (F. proliferatum, perteneciente al subclado Asiático, F. verticillioides, perteneciente al subclado Africano, F. guttiforme perteneciente al subclado Americano) complejo de especies de F. chlamydosporum; Complejo de especies de F. incarnatum-equiseti (F. incarnatum, F. equiseti) y Complejo de especies de F. decemcellulare.

Finalmente, se ha encontrado que los aislamientos que no producen micotoxinas son menos patogénicos y afectan en menor proporción el desarrollo productivo de la planta (Desjardins et al., 1992; Desjardins y Hohn, 1997). Desde el momento en que las micotoxinas fueron reconocidas como un problema de salud pública la cuantificación por técnicas analíticas ha mejorado continuamente, los estudios de cuantificación de micotoxinas son realizados con métodos aceptados universalmente por la Association Official of Analytical Chemists International (AOAC International), organismo a nivel internacional reconocido por la Food and Drug Administration (FDA) para determinarción micotoxinas (Yoshizawa et al., 2004). La técnica de ELISA usada en este trabajo de investigación permitió medir un gran número de muestras de forma rutinaria con alta precisión a partir de aislamientos de Fusarium provenientes de medio de PDA. Con esta metodología, los resultados obtenidos indican que los valores se encuentran por encima de los niveles permitidos para Colombia y la Unión Europea relacionados con la presencia de tricotecenos y fumonisinas en alimentos de consumo humano (Rojas y Wilches, 2011). En Colombia, estudios de detección y cuantificación de deoxinivalenol, zearalenonas y fumonisinas han sido registrados desde el año 1995 (Diaz y Cespedes., 1997; Duarte y Villamil, 2006; Wilches y Contreras 2011; Rojas y Wilches, 2011; Rojas et al., 2015). Estos trabajos muestran los altos niveles de concentración de DON, ZEA y FUM en alimentos de consumo humano, especialmente productos procesados provenientes de maíz y trigo. Este hecho es preocupante ya que en el país a pesar de que la resolución del Ministerio de Salud y Protección Social está vigente a partir del año 2014, a la fecha no se realizan los controles y la aplicación de la norma, sobre todo cuando en el país la puesta en marcha del TLC generó importaciones de cereales como maíz superan el 85% de grano consumido (Ministerio de Comercio Exterior, 2013).

Capítulo 4 101

Además, se encontró que las micotoxinas DON y ZEA aparecen de manera simultánea en las especies F. graminearum y F. equiseti, siendo esta condición un agravante más, puesto que aún no se conoce bien los posibles efectos sinérgicos asociados con la ingesta de alimentos contaminados con varias micotoxinas, tal como lo mencionan Muthomi et al., (2008) cuando asocia la presencia de DON y ZEA en granos de trigo en Kenia, Li et al. 2014, detalla la ocurrencia simultánea de DON, ZEA, OTA (ocratoxinas) y AFs (aflatoxinas) en cereales y cultivos productores de aceite. En Colombia, se necesita realizar estudios de detección de micotoxinas en alimentos de consumo directo, materias primas y productos procesados que generen la información para determinar la inocuidad de los alimentos consumidos.

4.1 Bibliografía

Anikster, Y., & Wahl, I. (1979). Coevolution of the rust fungi on Gramineae and Liliaceae and their hosts. Annual Review of Phytopathology, 17(1), 367-403.

Aoki, T., O’Donnell, K., & Geiser, D. M. 2014. Systematics of key phytopathogenic Fusarium species: current status and future challenges. Journal of General Plant Pathology, 80, 189–201.

Balajee, S. A., Borman, A. M., Brandt, M. E., Cano, J., Cuenca Estrella, M., Dannaoui, E., 2009. Sequence-based identification of Aspergillus, Fusarium, and Mucorales species in the clinical mycology laboratory: Where are we and where should we go from here? Journal of Clinical Microbiology, 47, 877

Daboussi, M. J., & Langin, T. (1994). Transposable elements in the fungal plant pathogen Fusarium oxysporum. Genetica, 93(1-3), 49-59.

Desjardins, A. E., Hohn, T. M., & McCormick, S. P. (1992). Effect of gene disruption of trichodiene synthase on the virulence of Gibberella pulicaris. Mol. Plant-Microbe Interact, 5, 214-222.

Desjardins, A., and Hohn, T. 1997. "Mycotoxins in plant pathogenesis”. Molecular Plant-Microbe Interactions 10.2 :147-152

Diaz G. and Céspedes, A. 1997. Natural occurrence of zearalenone in feeds and feedstuffs used in poultry and pig nutrition in Colombia. Mycotoxin Research; 13: 81-8738.


Felsenstein, J. 1978. Cases in which parsimony or compatibility methods will be positively misleading. Systematic Biology, 27(4), 401-410.

Flor, H. H. 1971. Current status of the gene-for-gene concept. Annual review of phytopathology, 9(1), 275-296.



Geiser, D., Jiménez-Gasco, M., Kang, S., Makalowska, I., Veeraraghavan, N., Ward, J.,& O’donnell, K. 2004. FUSARIUM-ID v. 1.0: a ADN sequence database for identifying Fusarium. Molecular Diversity and PCR-detection of Toxigenic Fusarium Species and Ochratoxigenic Fungi, 473-479. DOI: 10.1007/978-1-4020-2285-2_2

Geiser, D., Juba, J., Wang, B. and Jeffers, S. 2001. Fusarium hostae sp nov., a relative of F. redolens with a Gibberella teleomorph. Mycologia 93 (4):670-678.

Heperkan, D., & Ermis, Ö. C. 2004. Mycotoxins in spices: red pepper. In Barug D, Van Egmond H, Lopez-Garcia R, Van Osenbruggen T and Visconti A, Meeting the Mycotoxin Menace, Wageningen, Academic Publishers (pp. 197-219).

Jacobson, D. J. ana TR Gordon. 1991. Fusarium oxysporum f. sp. melonis-. A case study of diversity within a forma specialis. Phytopathology, 81, 1064-1067.

Leonard, K. J. (1994). Stability of equilibria in a gene-for-gene coevolution model of host-parasite interactions. Phytopathology, 84(1), 70-77.

Leslie J, Summerell B. 2006. The Fusarium laboratory manual. 1st ed. Blackwell Publishing Ltd, Oxford, London. 170p.

Ma L-J, van der Does HC, Borkovich KA, Coleman JJ, Daboussi M-J, Di Pietro A, Dufresne M, Freitag M, Grabherr M, Henrissat B, Houterman PM, Kang S, Shim W-B, Woloshuk C, Xie X, Xu J-R, Antoniw J, Baker SE, Bluhm BH, Breakspear A, Brown DW, Butchko RAE, Chapman S, Coulson R, Coutinho PM, Danchin EGJ, Diener A, Gale LR, Gardiner DM, Goff S, Hammond-Kosack KE, Hilburn K, Hua-Van A, Jonkers W, Kazan K, Kodira CD, Koehrsen M, Kumar L, Lee Y-H, Li L, Manners JM, MirandaSaavedra D, Mukherjee M, Park G, Park J, Park S-Y, Proctor RH, Regev A, Ruiz-Roldan MC, Sain D, Sakthikumar S, Sykes S, Schwartz DC, Turgeon BG, Wapinski I, Yoder O, Young S, Zeng Q, Zhou S, Galagan J, Cuomo CA, Kistler HC, Rep M. 2010. Comparative genomics reveals mobile pathogenicity chromosomes in Fusarium. Nature 464:367–373

Ministerio de Comercio Exterior. Cadena Productiva Del Maíz. 2013. Superintendencia de Industria y Comercio. Colombia.En: www.sic.go.co.drupal.masive.datos Consultado 12/04/2016.

Nalim, F. A., Samuels, G. J., Wijesundera, R. L., & Geiser, D. M. (2011). New species from the Fusarium solani species complex derived from perithecia and soil in the Old World tropics. Mycologia, 103(6), 1302-1330.


http://www.sic.go.co.drupal.masive/

Capítulo 4 103


O’Donnell, K., Ward, T. J., Robert, V. A., Crous, P. W., Geiser, D. M., & Kang, S. 2015. ADN sequence-based identification of Fusarium: Current status and future directions. Phytoparasitica, 43(5), 583-595.

Rheeder, J. P., Marasas, W. F., & Vismer, H. F. 2002. Production of fumonisin analogs by Fusarium species. Applied and Environmental Microbiology, 68(5), 2101-2105.

Rojas, C., Wilches, F., & Darghan, C. 2015. Co-ocurrence of microorganisms and toxic metabolites in food for children. Revista UDCA Actualidad & Divulgación Científica, 18(1), 3-12.

Rojas, L., & Wilches, A. M. 2011. Coexistencia de aflatoxinas, zearalenona y deoxinivalenol en alimentos de consumo infantil. @ limentech, Ciencia y Tecnología Alimentaria, 10(1).

Santos, L., Marín, S., Sanchis, V., & Ramos, A. J. 2008. Capsicum and mycotoxin contamination: state of the art in a global context. Food Science and Technology International, 14(1), 5-20.

Thiel, P. G., Marasas, W. F., Sydenham, E. W., Shephard, G. S., Gelderblom, W. C., & Nieuwenhuis, J. J. 1991. Survey of fumonisin production by Fusarium species. Applied and Environmental Microbiology, 57(4), 1089-1093.

Thompson, J. N., & Burdon, J. J. 1992. Gene-for-gene coevolution between plants and parasites. Nature, 360(6400), 121-125.

Wilches, A. M., & Contreras, L. R. 2011. Detección y cuantificación de deoxinivalenol en productos de consumo infantil comercializados en Pamplona, Norte de Santander. Alimentos Hoy, 16(16), 9-18.

Yoshizawa, T., Kohno, H., Ikeda, K., Shinoda, T., Yokohama, H., Morita, K., ... & Kobayashi, Y. 2004. A practical method for measuring deoxynivalenol, nivalenol, and T-2+ HT-2 toxin in foods by an enzyme-linked immunosorbent assay using monoclonal antibodies. Bioscience, biotechnology, and biochemistry, 68(10), 2076-2085.

Caracterización molecular y morfológica de aislamientos de ...

Documents

Transcript of Caracterización molecular y morfológica de aislamientos de ...