Caracterización de Polifenoloxidasa Extraída de Pera (cv. Packam´s Triumph) y Manzana (cv. Red Delicious)

Characterization of Polyphenyloxidase Extracted from Pears (cv. Packam´s Triumph) and Apples (cv . Red Delicious)

Estela Gasull y Daniela Becerra

Cátedra de Fisicoquímica Aplicada (Ing. en Alimentos), Área de Química Física, Facultad de Química, Bioquímica y Farmacia,

Universidad Nacional de San Luis, Ejército de los Andes 950 2° Piso, 5700 San Luis-Argentina (e-mail: esgasu@unsl.edu.ar)

Resumen

Se estudiaron las características de polifenoloxidasa (PFO) extraída de peras Packam´s Triumph y manzanas Red Delicious. El pH óptimo y la temperatura óptima fueron 6,5 y 25°C para pera, 7 y 30°C para manzana, utilizando 50 mM de catecol en buffer fosfato como sustrato. Los valores obtenidos para KM fueron 13,24 mM (pera) y 232,80 mM (manzana), mientras que los valores obtenidos para Vmax fueron 1590 U/mL E (pera) y 5464 U/mL E (manzana), utilizando 50 mM de catecol como sustrato. En este estudio se probaron tres inhibidores del PFO, resultando ser el más efectivo el ácido ascórbico. Estudios cinéticos demostraron que la inactivación térmica de PFO sigue una cinética de primer orden. La entalpía de activación (H#) y la entropía de activación (S#) para la inactivación térmica de PFO (pera) fueron 15309 J/Mol y -102 J/K Mol respectivamente. Para PFO (manzana) H# fue 11582 J/Mol y (S#) fue -196 J/K Mol.

Palabras clave: polifenoloxidasa, cinética enzimática, pera, manzana, inactivación térmica

Abstract

A study was made of the properties of polyphenyloxidase (PPO) extracted from Packam´s Triumph pears and Red Delicious apples. Optimum pH and temperature were 6.5 and 25°C for pears, pH 7

and 30°C for apples, with 50 mM catechol in phosphate buffer as substrate. KM values were 13.24 mM for pears and 232.80 mM for apples, whereas Vmax values were 1590 U/mL E for pears, and 5464 U/mL E for apples, using 50 mM catechol as a substrate. Three PPO inhibitors were tested in this study with the most effective inhibitor being ascorbic acid. Kinetic studies showed that the thermal inactivation of PPO followed first-order kinetics. The activation enthalpy (H#) and activation entropy (S#) for PPO heat inactivation in pears was 15309 J/Mol and -102 J/K Mol respectively. In apples the H# was 11582 while the S# was -196 J/K Mol.

Keywords: polyphenyloxidase, enzymatic kinetics, pears, apples, thermal inactivation

INTRODUCCIÓN

Las polifenoloxidasas (PFO) que se encuentran en las plantas son las responsables de las reacciones de pardeamiento enzimático que ocurren durante el almacenamiento, manipulación y procesamiento de frutas y vegetales. Las polifenoloxidasas, también conocidas como tirosinasas, fenoloxidasasas, monofenoloxidasas o cresolasas, catalizan la hidroxilación de monofenoles a ortodifenoles, posteriormente oxidados a ortoquinonas, las cuales se polimerizan dando lugar a pigmentos que presentan color marrón, rojo o negro, dependiendo de los componentes naturales presentes en los tejidos vegetales. Estas reacciones modifican las características organolépticas y nutricionales del alimento, depreciando su calidad. (McEvily et al., 1992; Friedman, 1996; Matheis & Whitaker, 1984; Sanchez-Ferrer et al., 1995). Ocasionalmente, este cambio de color es deseado.

La actividad de las enzimas polifenoloxidasas presentes en frutas y vegetales puede ser inhibida por calentamiento o por remoción de alguno de sus componentes necesarios: O2, enzima, Cu2+ o sustrato (Guerrero-Beltrán et al., 2005). Agentes reductores, antioxidantes e inhibidores enzimáticos previenen el pardeamiento reduciendo químicamente las ortoquinonas a difenoles coloreados, inhibiendo la actividad de la enzima por disminución del pH, o quelando el Cu2+ en el alimento.

En este trabajo, se aisló y caracterizó la polifenoloxidasa de pera (cv Packam´s Triumph) y de manzana (cv. Red Delicious), cosechadas en Argentina, en términos de activación y estabilidad térmica, pH óptimo y estabilidad, inhibidores y parámetros cinéticos y termodinámicos, con el objetivo de ayudar a predecir el comportamiento de la enzima presente en las mencionadas variedades.

MATERIALES Y MÉTODOS

Preparación del extracto enzimático

Las frutas fueron adquiridas en mercados comunitarios y conservadas a 4°C por 24 horas. La extracción de la enzima para pera y manzana se llevó a cabo siguiendo el procedimiento de Gauillard y Richard-Forget (1997) con algunas modificaciones. Se homogeneizaron a 4°C, 100 gramos de la fruta por 5 minutos en buffer fosfato 50 mM, pH=6,5 conteniendo ácido ascórbico 20 mM, etilenglicol 2% y Tritón X-100, 1%. La mezcla fue agitada a 4°C durante 12 horas. La suspensión fue centrifugada a 4000 rpm durante 15 minutos. Luego de separar el sólido, el líquido colectado se centrifugó nuevamente (15 minutos, 14000 rpm) en una centrífuga refrigerada Beckman J2-HS y el sobrenadante recolectado constituyó el extracto de la enzima utilizado para realizar los ensayos.

Actividad de polifenoloxidasa

La actividad de PFO fue determinada aplicando el método propuesto por Espin et al., (1995) utilizando un espectrofotómetro Shimadzu UV 160-A, de doble haz, con control de temperatura, equipado con celdas de cuarzo de 1 cm de camino óptico. Se determinó experimentalmente la longitud de onda correspondiente a la máxima absorción para ambos pigmentos, formados por la oxidación de catecol por PFO de pera y manzana. Estos valores están de acuerdo con el rango de máxima absorción (390-480 nm) para quinonas reportado por Stauffer (1989).

De esta manera, se determinó la actividad de la enzima midiendo el aumento de absorbancia a 420 nm (pera) y a 400 nm (manzana). La velocidad inicial fue calculada a partir de la pendiente de la curva absorbancia versus tiempo. Se definió una unidad de actividad de PFO como el aumento de 0,001 unidades de absorbancia por minuto y por mL de enzima. Para los distintos ensayos se utilizaron 3 mL de solución buffer a los que se adicionó catecol, de manera tal que la concentración del mismo en la mezcla fue 50 mM, y 200 mL (pera) ó 25 mL (manzana) del extracto de la enzima. Se realizaron medidas de absorbancia a la respectiva longitud de onda de máxima absorbancia, cada 10 segundos, durante 10 minutos, a 25°C.

Estabilidad y pH óptimo

Se determinó en primer lugar el pH óptimo para la polifenoloxidasa de pera y de manzana analizadas en el rango de pH 4-5,5 en 50 mM de buffer acetato, 6,5-7,5 en 50 mM de buffer fosfato y 7,5-9,5 en 50 mM de Tris-HCl. El sustrato fue 50 mM de catecol, y se utilizaron 200 mL (pera) y 25 mL (manzana).La temperatura de trabajo fue 25°C.

Para determinar el pH de estabilidad de la enzima, se incubó el extracto crudo de la misma en 3 mL de solución buffer (pH entre 4 y 9,5) durante 24 horas a 4°C. La actividad residual de la PFO fue determinada como porcentaje respecto de la actividad al pH óptimo, utilizando 50 mM de catecol como sustrato.

Actividad y estabilidad térmica

La actividad de PFO de pera y manzana fue obtenida a distintas temperaturas comprendidas entre 14 y 48°C al pH óptimo de cada una de ellas. La mezcla de buffer y sustrato fue incubada por 15 minutos hasta lograr la temperatura deseada. La actividad de PFO a la temperatura específica fue determinada espectrofotométricamente por adición del extracto de la enzima a la mezcla tan rápidamente como fue posible.

A los efectos de determinar la estabilidad térmica de PFO, se incubó a las temperaturas 30, 40, 50, 60 y 70°C la solución de la enzima en 50 mM de buffer fosfato al pH óptimo de las enzimas analizadas durante 5, 10, 20 y 30 minutos. Luego la mezcla fue enfriada en baño de hielo, y una vez alcanzada la temperatura ambiente, se agregó el sustrato y finalmente se determinó la actividad leyendo absorbancia a 25°C.

Los datos obtenidos a partir de los perfiles de actividad térmica se utilizaron para analizar parámetros termodinámicos relacionados con las reacciones de pardeamiento. Los datos para la inactivación térmica de la enzima fueron calculados comparando los cambios en la actividad luego del calentamiento a las distintas temperaturas respecto de la enzima sin calentar.

Cinética enzimática

Los datos cinéticos fueron representados como la inversa de la actividad versus la inversa de la concentración del sustrato, de acuerdo al método de Lineweaver y Burk (Lineweaver y Burk, 1934). Utilizando catecol como sustrato, trabajando a la temperatura de 25°C, y al pH óptimo de cada enzima, se determinaron los parámetros cinéticos: la constante de Michaelis-Menten (KM) y la velocidad máxima (Vmáx), variando las concentraciones del mismo en la mezcla de la reacción entre 10-90 mM para pera y 21-350 mM para manzana.

Efecto de los inhibidores

Se analizó el efecto inhibitorio de ácido ascórbico (0,03-0,17 mM para pera y 0,03-0,31 mM

para manzana), ácido benzoico (0,21-0,82 mM para pera y 0.20-0.80 mM para manzana) y cloruro de sodio (0,32-10,00 mM para pera y 0,32-2,20 mM para manzana) sobre la actividad de PFO de pera y manzana, frente a catecol como sustrato. Para tal fin, se realizaron experiencias utilizando 3mL de buffer pH óptimo, el extracto enzimático (200 mL - 25 mL) y catecol 50 mM como sustrato, en presencia de las distintas concentraciones de cada uno de los inhibidores, a 25°C.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Estabilidad y pH óptimo

En la figura 1 se muestra el perfil de pH versus actividad para el extracto enzimático de las muestras analizadas. Las curvas obtenidas muestran que la actividad de PFO de pera Packam´s Triumph es máxima a pH 6,5, mientras que PFO de manzana Red Delicious presenta su máxima actividad a pH 7. De acuerdo con los valores informados por la literatura, el rango de pH mas usual para la actividad óptima de PFO de ambas frutas es entre 5 y 7 (Rocha y Morais, 2001; Weemaes et al., 1998). Se observa también que, a pH muy alcalinos, mayores que 8,5, la actividad de la enzima presente en ambas frutas analizadas es prácticamente nula.

En la figura 2 se presenta el perfil de actividad respecto del pH de incubación de la enzima. Los resultados están expresados como actividad residual respecto de la actividad que posee la enzima al pH óptimo. Como se observa en la gráfica, el pH de máxima estabilidad de la enzima es 6,5 para PFO de pera y el intervalo 6,5-7,5 para PFO de manzana.

Efecto de la temperatura sobre la actividad de PFO

En la figura 3 se muestra el comportamiento enzimático respecto de la temperatura. Los datos se representan como actividad residual porcentual respecto de la actividad a la temperatura óptima de la enzima para ambos extractos. Como se puede apreciar, la temperatura óptima para la actividad de PFO de pera es 25°C, mientras que para manzana, la enzima muestra una actividad máxima a 30°C, pero la misma desciende bruscamente a los 35°C, y a los 40°C, permanece prácticamente inactiva. Se han reportado temperaturas óptimas de durazno (Jen y Kahler, 1974), uva (Cash, et al., 1976), ciruela (Siddiq et al., 1992) y níspero (Dincer et al., 2002) en 20, 25, 37 y 35 °C respectivamente.

Fig. 1: Actividad de PFO de pera y manzana en función del pH. Condiciones del ensayo: 50 mM de catecol, 25°C. Pera, Manzana

Fig. 2: Incubación de PFO a distintos pH. Condiciones del ensayo: 50 mM de catecol, 25°C.

Pera Manzana

Se obtuvieron además los parámetros de activación para pera: H#= 15309 J/Mol, S#= -102 J/K Mol, G#298= 45705 J/Mol, mientras que para manzana los valores obtenidos fueron: H#= 11582 J/Mol, S#= -196 J/K Mol, G#298= 69990 J/Mol. En general, se considera H# como una medida del número de enlaces no covalentes destruidos para formar el estado de transición que conduce a la inactivación de la enzima, y S# está relacionado con el cambio que acompaña la formación del estado de transición entre la enzima neta y el desorden del solvente.

La figura 4 presenta la actividad de PFO de pera como función de la temperatura de incubación, para distintos tiempos de calentamiento. Se observa que la inactivación térmica de la enzima sigue una cinética de primer orden. De la gráfica se desprende que incubando la enzima durante 30 minutos a 30°C, la misma permanece inalterada, pero al calentar la enzima durante 20 minutos

a 50°C, la actividad de la misma disminuye un 40 %, y se encuentra prácticamente inactivada calentando durante 10 minutos a 70°C.

Fig. 3: Temperatura óptima de PFO de pera y manzana. Condiciones del ensayo: 50 mM de buffer fosfato (pH óptimo), 50 mM de catecol.

Pera Manzana

Fig. 4: Incubación de PFO de pera. Condiciones del ensayo: 50mM de buffer fosfato pH 6,5, 50 mM de catecol. T=30, 40, 50, 60 y 70°C.

En cuanto a la PFO de manzana, en la figura 5 se observa que la enzima es estable a 30°C, disminuye un 40% calentando durante 20 minutos a 50°C, pero, a diferencia de lo ocurrido con la PFO de pera, la inactivación prácticamente total se produce calentando 30 minutos a 70°C.

Cinética Enzimática

Los parámetros cinéticos obtenidos son: KM=13.27 mM y Vmáx=1590 U/mL E para pera Pakam´s Triumph; KM = 232.80 mM y Vmáx= 5464 U/mL E para manzana Red Delicious. Este último dato coincide con el valor KM= 230 mM, informado por Rocha y Morais (2001) para otra variedad de manzana, utilizando catecol como sustrato.

Fig. 5: Incubación de PFO de manzana. Condiciones del ensayo: 50 mM de buffer fosfato pH 6,5, 50 mM de catecol. T=30, 40, 50, 60 y 70°C.

Los valores determinados para KM indican que PFO de pera tiene mayor afinidad por catecol que PFO de manzana. Además, si tenemos en cuenta que la relación Vmáx/KM mide la eficiencia de la enzima frente a un determinado sustrato, los resultados obtenidos nos permiten afirmar que, en nuestro caso, PFO de pera (Vmáx/KM= 119,8) presentó mayor capacidad de pardeamiento que PFO de manzana (Vmáx/KM= 23,5).

Efecto de los inhibidores sobre la actividad de PFO

El análisis de los datos obtenidos al determinar el efecto inhibitorio, muestra que el inhibidor más potente para PFO de las frutas analizadas es ácido ascórbico, que presenta un I50% de 0.319 mM para pera y 0.500 mM para manzana, mientras que ácido benzoico y ClNa no mostraron efecto inhibitorio en el rango de concentraciones utilizadas. El ácido ascórbico actúa más como un antioxidante que como un inhibidor enzimático porque el mismo reduce la quinona formada inicialmente por la enzima al difenol original, antes que se produzcan las reacciones secundarias, las cuales dan lugar a la formación de los pigmentos. El ácido ascórbico también ha sido reportado como causa irreversible de inhibición enzimática (Golan et al., 1984).

CONCLUSIONES

Las modificaciones realizadas a la técnica de extracción utilizada por Gauillard y Richard-Forget (1997), fundamentalmente el agregado de tritón X-100, permitieron obtener un mejor rendimiento en la extracción PFO de las frutas analizadas. Los parámetros cinéticos obtenidos demuestran que PFO de manzana presenta una menor capacidad de pardeamiento frente a catecol que PFO de pera, mientras que los parámetros termodinámicos para las reacciones de pardeamiento resultaron ser del mismo orden. Estos datos, al igual que los valores de pH óptimo y estabilidad, como así también los de estabilidad y actividad térmica, contribuyen a predecir el comportamiento de la enzima presente en ambas frutas.

AGRADECIMIENTOS

El presente trabajo se realizó con los aportes de la Secretaría de Ciencia y Técnica de la Universidad nacional de San Luis, San Luis, República Argentina.

REFERENCIAS

Cash, J.N., W.A. Sistrunk y C.A Stutte, Characteristics of Concord grape polyphenoloxidase involved in juice color loss, Journal of Food Science, 41, 1398-1402 (1976). [ Links ]

Dincer,B., A. Colak, N. Aydin, A. Kadioglu, S. Guner,Characterization of polyphenoloxidase from medlar fruits (Mespilus germanica L., Rosaceae), Food Chemistry, 77, 1-7 (2002). [ Links ]

Espin, J.C., M. Morales, R. Varon, J. Tudela, y F. García-Casanovas, A continuous spectrophotometric method for determining the monophenolase and diphenolase activities of apple polyphenoloxidase, Analytical Biochemistry, 43, 2807-2812 (1995). [ Links ]

Friedman, M., Food Browning and its prevention: an overview. Journal of Agriculture and Food Chemistry, 45, 1091-1096 (1996). [ Links ]

Gauillard, F. y F. Richard-Forget, Polyphenoloxidase from Williams Pear (Pyrus communis L., Cv Williams): activation, purification and some properties, Journal of Food Science, 74, 49-56 (1997). [ Links ]

Golan, A., A. Goldhirsh y J.R Whitaker, Effect of ascorbic acid, sodium bisulfite and thiol compounds on mushroom polyphenoloxidase, Journal of Agricultural Food Chemistry, 32, 1003-1009 (1984). [ Links ]

Guerrero-Beltrán, J.A., B.G. Swanson y G.V. Barbosa-Cánovas, Inhibition of polyphenoloxidase in mango puree with 4-hexylresorsinol, cysteine and ascorbic acid, LWT, 38, 625-639 (2005). [ Links ]

Jen, J.J., y K.R. Kahler, Characterization of polyphenol oxidase in peaches grown in the Southeast, Hortscience, 9, 590-591 (1974). [ Links ]

Lineweaver, H. y D. Burk, The determination of enzyme dissociation constant, Journal of American Chemist´s Society, 56, 658-661 (1934). [ Links ]

Matheis, G., y J.R. Whitaker, Modification of proteins by polyphenol oxidase and peroxidase and their products, Journal of Food Biochemistry, 8, 137-162 (1984). [ Links ]

McEvily, A., R. Iyengar, y S. Otwell, Inhibition of Enzymatic Browning in Foods and Beverages. Critical Review in Food Science and Nutrition, 32(3), 253-273 (1992). [ Links ]

Rocha, A.M.C.N. y A.M.M.B. Morais, Characterization of polyphenoloxidase (PPO) extracted from �Jonagored � apple, Food Control 12, 85-90 (2001). [ Links ]

Sanchez-Ferrer, A., J.N. Rodríguez-Lopez, F. García-Casanovas y F. García-Carmona, Tyrosinase: a comprensive review of its mechanism, Biochim. Biophys. Acta, 1247, 1-11 (1995). [ Links ]

Siddiq, M., K. Sinha y J.N. Cash, Characterization of polyphenol oxidase from Stanley plums. Journal of Food Science, 57, 1177-1179 (1992). [ Links ]

Stauffer, C.E. �Oxidoreductases � In: Enzyme assays for Food Scientists by R. Van Nostrand, pp 202-205 (Ed), New York: AVI book, (1989). [ Links ]

Weemaes, C.A., L.R. Ludikhuyze, I. Van den Broeck, M.E. Hendrickx, y P.P. Tobback, Activity, Electrophoretic Characteristics and Heat Inactivation of Polyphenoloxidase from Apples, Avocados, Grapes, Pears and Plums, Lebensm-Wiss u.-Technol, 31,44-49 (1998). [ Links ]