Caracterización proteómica de Rhizobium leguminosarum bv. Viciae

Virginia Marugán Hernández (vmaruganhdez@yahoo.es)

Escuela Técnica Superior de Ingenieros Agrónomos Universidad Politécnica de Madrid

Tutores: Juan Imperial Ródenas, Tomás Ruiz Argüeso 1. INTRODUCCIÓN 1.1 LA SIMBIOSIS Rhizobium – LEGUMINOSA

La simbiosis Rhizobium – Leguminosa ha sido objeto de detallados estudios estructurales, fisiológicos y genéticos desde su descubrimiento, debido a la importancia agrícola de muchos de los cultivos de leguminosas, y al aporte nitrogenado derivado de la fijación biológica de nitrógeno.

La familia de las leguminosas es una de las más extensas y diversificadas. Son Angiospermas del orden Rosales y se dividen en tres subfamilias: Mimosoideas, Caesalpinoideas y Papilonoideas. Una característica importante es su capacidad de establecer simbiosis con bacterias del grupo Rhizobium.

Las bacterias del grupo Rhizobium son bacilos Gram negativos, proteobacterias del grupo �, son aeróbicas y en muchos casos aeróbicas estrictas. Son mótiles por medio de flagelos peritricos, y su hábitat natural es el suelo. Se reconocen cinco géneros: Rhizobium y Sinorhizobium (ambas de crecimiento rápido), Bradyrhizobium (de crecimiento lento), Mesorhizobium y Azorhizobium.

Las bacterias del grupo Rhizobium, además de poder desarrollarse como organismos de vida libre en el suelo, son capaces de formar asociaciones fijadoras de nitrógeno con plantas de la familia de las leguminosas. Esta asociación, que conecta la capacidad fotosintética de la planta con la capacidad de las bacterias de reducir el nitrógeno atmosférico, es el resultado de un complejo proceso de desarrollo que requiere la expresión coordinada en el espacio y en el tiempo de un gran número de genes, tanto de la planta como de la bacteria. La simbiosis es altamente específica, y su establecimiento comienza por un intercambio de señales químicas entre ambas partes (Downie, 1994) que permite el reconocimiento e invasión de la leguminosa hospedadora apropiada por el rizobio, seguido por la proliferación y diferenciación de una estructura altamente especializada denominada “nódulo”. Estos nódulos están localizados en las raíces, salvo en el caso de Azorhizobium que también es capaz de

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inducir nódulos en los tallos. En su interior, las bacterias, transformadas en bacteroides, como se denomina la forma simbiótica de los rizobios, fijan nitrógeno, para lo cual reciben fuentes de carbono y energía suministradas por la planta. 1.2 Rhizobium EN LA RIZOSFERA

La rizosfera es la zona del suelo que está modificada por la presencia y actividad de las raíces de las plantas. En ella se establece un microclima cuyas condiciones están alteradas por la presencia de estas raíces. Así, por ejemplo, se produce un cambio en la composición química del suelo debido a exudados radiculares, tales como aminoácidos, ácidos orgánicos, azúcares, factores de crecimiento, nucleótidos, flavonoides y enzimas, que pueden suponer hasta un 20 % del fotosintato de la planta, siendo la exudación mayor en los ápices radiculares. Algunos de los compuestos exudados que aparecen en la rizosfera no sólo son utilizados por los microorganismos como nutrientes sino que además tienen gran importancia en la atracción de microorganismos hacia la raíz. La rizosfera es fundamentalmente heterogénea, existiendo zonas más o menos ricas en determinados compuestos y está condicionada por diversos factores como son el tipo de planta, edad de la raíz y tipo de suelo. Es precisamente en la rizosfera donde tiene lugar el inicio de la interacción Rhizobium – Leguminosa que dará lugar a la formación de nódulos radiculares. 1.3 POSIBLE PAPEL DE LOS SISTEMAS DE AUTOINDUCCIÓN EN LA

RIZOSFERA Durante décadas se ha sabido que las bacterias vivían en colonias, pero se creía que cada miembro de esas colonias actuaba de forma individual sin ninguna necesidad aparente de comunicación con los demás. La primera evidencia de la existencia de comunicación intercelular entre bacterias se obtuvo al estudiar la bioluminiscencia en bacterias simbióticas marinas (Vibrio fischeri). Ésta parecía mostrar una expresión dependiente de la densidad (Nealson et al., 1970). Las investigaciones demostraron que estas especies producen y responden a moléculas señal, N - acil homoserin lactonas, que se acumulan en el exterior y actúan como autoinductores del crecimiento celular (Eberhard et al., 1981). Cuando se alcanza el nivel umbral de concentración de autoinductores se desencadena una serie de acontecimientos que concluyen en la producción de bioluminiscencia. La producción de luz está controlada por dos proteínas: LuxI, responsable de la síntesis del autoinductor, y LuxR, un activador transcripcional que cuando se une al autoinductor promueve la transcripción del operón de la luciferasa (Enegebrecht et al., 1983; Enegebrecht y Silverman, 1984) (Fig. 1.A). A este sistema de regulación dependiente de la densidad celular se le conoce como de “quorum sensing” o autoinducción (Fuqua et al., 1994). La autoinducción consiste en la regulación de la expresión génica en respuesta a las fluctuaciones en la densidad de población celular. Las bacterias producen y liberan

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señales químicas denominadas autoinductores que, por su naturaleza, cruzan libremente las membranas celulares en uno u otro sentido y que, por tanto, incrementan su concentración en función de la densidad celular. Al alcanzar un determinado nivel umbral, se estimula la producción de autoinductor y tiene lugar una alteración en la expresión de genes, ya sea inducción o represión. La mayoría de las bacterias usan circuitos de comunicación de tipo autoinducción para regular diversas actividades fisiológicas. Estos procesos incluyen simbiosis, virulencia, competencia, conjugación, producción de antibióticos, motilidad, esporulación y formación de biofilms, entre otros. En general, las bacterias Gram negativas utilizan N - acil homoserin lactonas como autoinductores, y las bacterias Gram positivas utilizan oligopéptidos modificados para dicha comunicación. Se conocen ejemplos de comunicación interespecífica mediante autoinductores, e incluso parece ser que dichos autoinductores pueden producir respuestas específicas distintas en los diferentes organismos receptores. Muchas bacterias que establecen asociaciones con plantas producen y responden a N - acil homoserin lactonas para regular la expresión de genes específicos. La regulación se produce mediante dos genes que codifican proteínas similares al sistema LuxI/LuxR de Vibrio fischeri (Enegebrecht et al., 1983; Enegebrecht y Silverman, 1984). Para tener éxito en su nicho ecológico las bacterias deben ser capaces de sobrevivir y competir en complejas comunidades microbianas. Esto es especialmente cierto para las interacciones bacteria – bacteria y bacteria – planta en la rizosfera. Estas interacciones dependen de la apropiada expresión de genes específicos involucrados en esas interacciones. Muchas bacterias han desarrollado mecanismos de regulación de genes que les permiten detectar y responder a las diversas condiciones ambientales, incluyendo la presencia de competidores y plantas o animales hospedadores. Entre esos sistemas destacan los sistemas de autoinducción. En varias bacterias del grupo Gram negativo se han identificado diversos sistemas de regulación por autoinducción mediados por AHLs. Entre ellas se encuentran Agrobacterium tumefaciens, Erwinia carotovora, Pantoea stewartii, Ralstonia solanacearum, Pseudomonas aureofaciens y Rhizobium leguminosarum (Tabla 1). Tabla 1. Ejemplos de bacterias asociadas con plantas que utilizan sistemas de autoinducción regulados por acil homoserin lactonas

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Todas estas bacterias utilizan N - acil homoserin lactonas para coordinar el comportamiento de células individuales en una población local. Recientemente se ha descubierto la existencia de estrategias de competencia en el ecosistema del suelo dirigidas específicamente contra los sistemas de autoinducción. Así, Bacillus sp. (240B1) es capaz de producir la inactivación enzimática de estas N - acil homoserin lactonas mediante la expresión del gen aiiA, que codifica una proteína con actividad lactonasa (AiiA) y con capacidad de destruir el anillo lactónico de las AHLs. De esta forma su actividad determinaría bajos niveles de autoinductores, suprimiendo cualquier tipo de regulación por autoinducción. Bacillus sp. no se ve afectado por esta enzima ya que se trata de una bacteria Gram positiva que no posee sistemas de autoinducción regulados por AHLs (Dong et al., 2000).

1.4 SISTEMAS DE AUTOINDUCCIÓN EN Rhizobium leguminosarum Recientemente se ha descrito la existencia de señales de autoinducción en muchas especies de rizobios noduladores de leguminosas. Las estudios más completos se han llevado a cabo con la cepa A34 de Rhizobium leguminosarum bv. viciae. Esta cepa sintetiza una variedad de autoinductores, todos los cuales han sido identificados como N - acil homoserin lactonas.

Bacteria Homólogo LuxI/LuxR

Estructura Cadena lateral Procesos que regulan

Agrobacterium

tumefaciens

TraI/TraR

N-3-

oxooctanol

Transferencia del plásmido Ti

Erwinia carotovora

CarI/CarR; ExpI/ExpR

N-3-

oxohexanol

Factores de virulencia extracelulares, Carbapenem

Pantoea stewartii

EsaI/EsaR

N-3-

oxohexanol

Exopolisacáridos capsulares

Ralstonia

solanacearum

PhcI/PhcR

N-hexanol

N-octanol

?

Pseudomonas

aureofaciens

PhzI/PhzR

N-hexanol

Fenazinas

Rhizobium leguminosar

um

CinI/CinR

N-3-hidroxi-7-cis-tetradecanol

Interacciones en la raíz, nodulación

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Una de esas N - acil homoserin lactonas es la N-(3-hidroxi-7-cis-tetradecanoil)-L-homoserin lactona (Gray et al., 1996; Schripsema et al., 1996), conocida también como bacteriocina small, porque inhibe el crecimiento de varias cepas de Rhizobium leguminosarum. El responsable de la producción de esta bacteriocina es el locus cinI/cinR (homólogo de luxI/luxR) (Tabla 1). CinR induce cinI en respuesta a esta AHL producida por CinI, estableciéndose así un sistema de autoinducción con autorregulación positiva (Lithgow et al., 2000). El locus cinIR controla una compleja cascada de bucles de autoinducción con otros tres sistemas de autoinducción con sus correspondientes AHLs. Estos sistemas incluyen raiI/raiR (Rosemeyer et al., 1998), traI/traR y rhi/rhiR (Fig. 1.B). Otras cepas de rizobios parecen compartir algunos de estos loci de autoinducción, pero no todos los loci han sido encontrados en todas las cepas. Una característica encontrada específicamente en cepas de R. leguminosarum bv. viciae, pero no en otras cepas de rizobios, es su capacidad de producir grandes cantidades de una proteína de una masa molecular de 24.000 Da en la rizosfera (Dibb et al., 1984). Esta proteína es expresada en la rizosfera alrededor de las raíces de las leguminosas pero no en bacteroides en el interior de los nódulos. El gen que codifica para esta proteína se denomina rhiA y se localiza en una región de 10 kb de ADN localizada entre entre los genes nod (de nodulación) y los genes nifHDK (que codifican para el complejo de la nitrogenasa que reduce el nitrógeno atmosférico) (Rodelas et al., 1999). La función de los genes rhiABC aún no esta claramente definida. Mutaciones en rhiA y rhiR no tiene ningún efecto en la eficiencia de nodulación ni en la fijación de nitrógeno (Dibb et al., 1984), pero en cepas mutantes en el operón nodFEL sí se produce una disminución en la eficiencia de nodulación cuando se realizan mutaciones en rhiA o rhiR (Cubo et al., 1992). La capacidad de nodulación de guisante por cepas con mutaciones en rhiI no se ve perjudicada, pero el número de nódulos formados es significativamente menor (Rodelas et al., 1999). 2. OBJETIVOS

Los objetivos de este trabajo se centran en la caracterización del proteoma de

Rhizobium leguminosarum bv. viciae y de sus cambios asociados a tres situaciones experimentales:

1. Comparación del proteoma de dos cepas silvestres: R. leguminosarum bv. viciae UPM791, la cepa de referencia de nuestro laboratorio, y R. leguminosarum bv. viciae 3841, que ha sido escogida por el Sanger Centre para su secuenciación genómica.

2. Efecto sobre el proteoma de la curación de dos de los cuatro plásmidos nativos

de la cepa UPM791, el plásmido simbiótico (pUPM791c) y el plásmido más pequeño (pUPM791d).

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3. Efecto sobre el proteoma de la eliminación de los sistemas de autoinducción de R. leguminosarum bv. viciae UPM791 y cepas derivadas, y de R. leguminosarum bv. viciae 3841.

3. MATERIALES Y METODOS

3.1 CEPAS BACTERIANAS Y PLÁSMIDOS

Las cepas bacterianas y los plásmidos utilizados en este trabajo se recogen en las siguientes tablas. Tabla 2. Cepas bacterianas

Bacterias Características relevantes Fuente o referencia

Rhizobium leguminosarum bv. viciae

UPM791 128C53; Cepa silvestre Strr Nod+ Fix+

Hup+ (EEUU)

Ruiz-Argüeso et al.

(1978)

UPM791.5 128C53.5; Derivada de la cepa UPM791

curada del plásmido simbiótico

(pUPM791c)

Leyva et al. (1987)

UPM791.1 128C53.1; Derivada de la cepa UPM791

curada del plásmido pUPM791d

Leyva et al. (1987)

UPM791.0 128C53.0; Derivada de la cepa UPM791

curada del plásmido simbiótico

(pUPM791c) y del plásmido pUPM791d

Leyva et al. (1987)

3841 Mutante Strr espontaneo de la cepa 300 Johnston y Beringer

(1975)

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Tabla 2. Cepas bacterianas (continuación)

Bacterias Características relevantes Fuente o referencia

Agrobacterium tumefaciens

NTL4 (pZLR4) Curada del plásmido pTiC58 / traG ::

lacZ, traR; Gmr

Cha et al. (1998)

Escherichia coli

DH5� RecA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17

(rk- mk

+ ) supE44 relA1 �(lacZYA-

argF) U169 �80dlac(lacZ)�M15

Hanahan (1983)

S17.1 294::[RP4-2 (Tc::Mu) (Km::Tn7)] pro res �recA, Tpr, mod+, �pir+ ; Spcr

De Lorenzo y Timmis

(1994)

HB101 (pRK2013) Cepa para movilización de plásmidos no transmisibles; Kmr

Ditta et al. (1980)

Tabla 3. Plásmidos

Plásmidos Características relevantes Fuente o referencia

pME6000 Vector de clonación de amplio rango de hospedadores; Tcr

Maurhofer et al. (1998)

pME6863 pME6000 portador del gen aiiA de la cepa Bacillus sp. A24; Tcr

Reimmann et al. (2002)

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3.2 CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA DE ACIL HOMOSERIN LACTONAS 3.2.1 EXTRACCIÓN DE ACIL HOMOSERIN LACTONAS Los cultivos se crecieron en medio TY durante 48 horas hasta alcanzar una densidad óptica (DO600) de aproximadamente 0,8 – 0,9 (momento en que se alcanza una fase estacionaria temprana para una máxima expresión de autoinductores y una mínima producción de derivados celulares). Las células fueron separadas por centrifugación y las AHLs fueron extraídas del sobrenadante del cultivo mediante acetato de etilo con un volumen equivalente �1:1�, se separó posteriormente la fase orgánica de la acuosa y se eliminaron los restos de agua por adición de sulfato de magnesio anhidro. El extracto de AHLs se conservó a – 40 ºC. 3.2.2 SEPARACIÓN DE ACIL HOMOSERIN LACTONAS POR

CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA Las AHLs fueron analizadas por cromatografía en capa fina (TLC) utilizando como organismo indicador Agrobacterium tumefaciens NTL4 (pZLR4).

Se tomaron 2 ó 2,5 mililitros equivalentes de cultivo (un ml equivalente contiene la cantidad de AHLs correspondientes a un ml de cultivo) y se secaron con un flujo de nitrógeno. El extracto se aplicó sobre una placa de C18 – Silica Gel (UNIPLATE RPS Reversed Phase Hydrocarbon Impregnated Silica Gel; Analtech) y se secó en corriente de aire. Las AHLs fueron separadas por capilaridad (utilizando metanol y agua �60:40� como fase móvil) hasta que el frente alcanzó la parte superior de la placa. La placa se sacó del tanque de cromatografía y se secó al aire. Se cubrió con una capa de agar mínimo AB con X-Gal e inoculado con Agrobacterium tumefaciens NTL4 (pZLR4) tal como describen Cha et al. (1998). Después de toda la noche de incubación a 28 ºC las AHLs se detectaron como manchas azules sobre el fondo blanco. 3.3 ELECTROFORESIS BIDIMENSIONAL DE PROTEÍNAS 3.3.1 PREPARACIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE LAS MUESTRAS Las células de Rhizobium se lavaron 4 veces en tampón de lavado LSB (KH2PO4 1,5 mM, NaH2PO4 9,0 mM, KCl 3,0 mM y NaCl 68 mM) y se resuspendieron en 50 �l de tampón de almacenamiento SB (Tris-HCl 10 mM pH 8,0, MgCl2 1,5 mM, KCl 10 mM, DTE 0,5 mM, APMSF 100 �M, SDS 0,1%) por cada 50 ml de cultivo bacteriano inicial y se congelaron a –20 ºC. Las muestras se cuantificaron por el método del bicinconínico tal como describen Smith et al. (1985). Mediante rectas de regresión se determinó el volumen de muestra equivalente a 120 �g de proteína, cantidad utilizada para la electroforesis bidimensional.

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3.3.2 ELECTROFORESIS BIDIMENSIONAL

Los volúmenes correspondientes a 120 �g de proteína se mezclaron con 350 �l de solución de rehidratación (Urea 8 M, CHAPS 4%, DTE 65 mM, pH 3,5-10 2% v/v (Merck), trazas de azul de bromofenol), se agitaron con un aparato Vortex (Heidolph, Alemania) y se centrifugaron a 12.000 x g durante 2 min. Los sobrenadantes se aplicaron a tiras ReadyStripTM IPG Strips (Bio-Rad) de pH 4-7 lineal en una cubeta de rehidratación (Immobiline DryStrip Reswelling Tray, Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia), dejándolas durante 16 horas a temperatura ambiente. La separación de proteínas según su punto isoeléctrico se llevó a cabo en una cubeta Multiphor II (Amersham Pharmacia Biotech). Tras la electroforesis en la primera dimensión se equilibraron las tiras dos veces en 10 ml de tampón de equilibrado (Urea 6 M, Tris-HCl 50 mM pH 6,8, glicerol 30% v/v, SDS 2%) durante 15 min cada una, añadiendo en el primer lavado DTE al 2% y en el segundo iodoacetamida al 2,5%. La separación de las proteínas según su peso molecular se realizó en cubetas PROTEAN� II xi (Bio-Rad), siguiendo esencialmente la técnica descrita por Lämmli (1970). Los geles de poliacrilamida se prepararon al 11,5 %, utilizando diacrililpiperazina (PDA) en lugar de N,N’-metilenbisacrilamida, y se desarrollaron a 6 �C a una intensidad constante de 40 mA por gel.

3.3.3 Tinción de plata

Para la tinción de plata de los geles bidimensionales de poliacrilamida se siguieron los siguientes pasos: un lavado en agua ultrapura durante 5 min, seguido de un lavado en etanol / ácido acético / agua ultrapura (40:10:50) durante 1 hora y etanol /ácido acético / agua ultrapura (5:5:90) durante toda la noche. Después de haber lavado los geles de poliacrilamida en agua ultrapura durante 5 min, se siguió con un lavado en una solución de glutaraldehído al 1% y acetato de sodio 0,5 M durante 30 min, tres lavados en agua ultrapura durante 10 min, dos lavados en una solución de ácido 2,7-naftalen disulfónico al 0,05% de 30 min cada uno y 4 lavados en agua ultrapura durante 15 min. A continuación se incubaron los geles en una solución de nitrato de plata (6 g de nitrato de plata, 10 ml de amoniaco al 25% y 1,5 ml de NaOH 10 N en 750 ml de solución) durante 30 min a temperatura ambiente. Por ultimo se realizaron 4 lavados en agua ultrapura durante 4 min, y se revelaron los geles en una solución de ácido cítrico 0,01% y formaldehído al 0,1% (v/v) durante 5 a 10 min. El revelado se paró incubando los geles en una solución de Tris al 5% y ácido acético al 2% (v/v) durante 30 min.

3.4 ANÁLISIS DE GELES BIDIMENSIONALES

Los geles 2D teñidos con plata se digitalizaron mediante un escáner Astra 4000U (UMAX Systems, Willich, Alemania). Las imágenes obtenidas se analizaron mediante el programa MELANIE 3.0 (Genbio, Suiza) utilizando el % volumen como parámetro de cuantificación de las manchas, que valora tanto el tamaño (en mm2) como la densidad óptica (grado de oscuridad) de las manchas.

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4. RESULTADOS 4.1 TRANSFERENCIA DEL PLÁSMIDO pME6863 A LAS CEPAS DE

Rhizobium leguminosarum bv. viciae Con objeto de identificar proteínas reguladas por autoinducción en Rhizobium

leguminosarum bv. viciae se llevó a cabo la transferencia a las distintas cepas objeto de estudio del plásmido pME6863, que expresa constitutivamente el gen aiiA de Bacillus sp. A24 (Dong et al., 2000). El gen aiiA codifica para una lactonasa con capacidad de destruir el anillo lactónico de las acil homoserin lactonas (AHLs). De esta forma se mantendrían bajos niveles de dichas moléculas, asegurando la supresión de cualquier tipo de regulación por autoinducción.

Dado que el gen aiiA se introducía inserto en un plásmido, se construyeron de forma análoga una serie cepas control portadoras del plásmido control pME6000, el mismo plásmido que el pME6863 pero carente del gen aiiA que codifica para la lactonasa. Estas cepas control se utilizarían para descartar posibles efectos debidos a la presencia del plásmido, independientes de la producción de lactonasa. 4.2 EFECTOS DEL PLÁSMIDO pME6863 SOBRE LOS NIVELES DE ACIL

HOMOSERIN LACTONAS EN CEPAS DE Rhizobium leguminosarum bv. viciae

Las cinco cepas de Rhizobium leguminosarum bv. viciae con las que se trabajó presentan un perfil plasmídico diferente. Las dos cepas silvestres, 3841 y UPM791, poseen seis y cuatro plásmidos, respectivamente. Las cepas UPM791.5, UPM791.1 y UPM791.0 son derivados de la cepa UPM791 por curación de plásmidos, y poseen tres, tres y dos plásmidos, respectivamente. La Figura 2.A muestra el perfil plasmídico de dichas cepas.

El patrón de producción de AHLs en la cepa UPM791 se altera por curación de los plásmidos pUPM791c y pUPM791d en las cepas UPM791.5 y UPM791.0, y UPM791.1 y UPM791.0, respectivamente. Estos patrones se muestran en la Figura 2.B, en la que se muestra la separación por cromatografía en capa fina y posterior revelado de las AHLs. Rhizobium leguminosarum bv. viciae UPM791 produce tres AHLs mayoritarias, que comigran con patrones sintéticos de AHLs con cadenas aciladas de 6, 8 y 14 átomos de carbono (C6, C8, y C14; Fig. 2.B, carril 1). En la otra cepa silvestre, R. leguminosarum bv. viciae 3841, se observó el mismo patrón de producción de autoinductores, aunque los niveles de AHLs resultaron ser bastante inferiores que en la cepa UPM791 (Fig. 2.B, carriles 10 y 1, respectivamente).

La cepa UPM791.5, curada del plásmido simbiótico (pUPM791c) presentaba una variación importante en el patrón de producción de AHLs (Fig. 2.B, carril 3). Se mantuvieron los niveles de AHL C14, disminuyeron de manera importante los de AHL C6 y desapareció por completo la AHL C8. Esto indica que la producción de las AHLs C6 y C8 está regulada o determinada por genes presentes en el plásmido simbiótico.

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En la cepa UPM791.1, curada del plásmido más pequeño (pUPM791d) de nuevo apareció una variación importante en el patrón de AHLs (Fig. 2.B, carril 6). Se mantuvieron los niveles de AHLs C6 y C8, pero desapareció por completo la AHL C14. Esto indica que la producción de la AHL C14 está regulada o determinada por genes presentes en el plásmido pUPM791d.

La pérdida de los dos plásmidos (pUPM791c y pUPM791d) en la cepa UPM791.0 resultó en un patrón de AHLs equivalente a la suma de los patrones de las dos cepas anteriores (Fig. 2.B, carril 8). Los niveles de AHL C8 disminuyeron apreciablemente, mientras que las AHLs C6 y C14 desaparecieron.

La Figura 2.B (carriles 2, 4, 7, 9 y 11) muestra también el efecto de la introducción y expresión del gen de la lactonasa en las distintas cepas. Se observó una clara disminución en la producción de AHLs en todas las cepas en presencia del plásmido pME6863, especialmente en la cepa 3841 (Fig. 2.B, carril 11) en la que desaparecieron por completo (Fig. 2.B, carril 10). También se observó la aparición de una nueva AHL, con movilidad similar a la de la AHL C8, en las cepas que contenían el plásmido pME6863 (Fig. 2.B, carriles 2, 4, 7, 9). Esta nueva AHL, que aparentemente es resistente a la lactonasa codificada en el plásmido pME6863, también se pudo detectar en sobrenadantes de cepas conteniendo el plásmido parental, pME6000 (Fig. 2.B, carril 5). Esto hace pensar que esta nueva AHL, que migra como una AHL C8, podría venir codificada por el vector pME6000. La naturaleza de esta AHL es desconocida. 4.3 ANALISIS PROTEÓMICO Con el fin de estudiar a nivel proteómico el efecto de la presencia o no de AHLs en las distintas cepas de Rhizobium leguminosarum bv. viciae, se separaron mediante geles bidimensionales las proteínas de extractos de cuatro de la cepas portadoras del plásmido pME6863 (aiiA) y de las cuatro cepas control correspondientes, portadoras del plásmido pME6000. Este análisis también permitiría comparar los proteomas de las dos cepas silvestres UPM791 y 3841, de especial interés a causa de la inminente finalización de la secuenciación del genoma de la cepa 3841, así como cuantificar el efecto de la curación de los plásmidos pUPM791c o pUPM791d sobre el proteoma de la cepa UPM791. 4.3.1 Cepas silvestres Rhizobium leguminosarum bv. viciae UPM791 y 3841

En primer lugar se trató de caracterizar el proteoma de las dos cepas silvestres, UPM791 y 3841, para ello se compararon geles bidimensionales de proteínas de ambas cepas (Fig. 3).

Las grandes diferencias existentes en el proteoma “normal” de ambas cepas son distinguibles a simple vista. En un análisis más exhaustivo se trató de buscar la máxima similitud emparejando las manchas que por su posición en el gel e incluso por su forma pudieran corresponder a la misma proteína. En ambos geles se consideraron ca. 500

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manchas mayoritarias, y se pudieron establecer 196 parejas, lo que supone únicamente un 40 % del total de manchas. El 60 % restante corresponde a proteínas cuya migración es lo suficientemente diferente como para no permitir su emparejamiento.

Se realizó además un análisis cuantitativo con el fin de detectar posibles cambios

globales en los niveles de expresión entre manchas idénticas en los distintos geles. El resultado del análisis se expresa en forma de gráfica cartesiana (Fig. 4) en la que cada pareja se representa como un punto correspondiente a la intersección de las intensidades (% volumen) en cada uno de los dos geles representadas en ambos ejes. En este tipo de representación, en el caso ideal de dos geles completamente idénticos, los puntos de la gráfica se dispondrían a lo largo de una recta con un ángulo de 45º en función de sus abundancias relativas. Una dispersión de puntos distinta de la ideal puede estar causada por variaciones experimentales, por cambios globales en los niveles de expresión o por ambas cosas. En general, los cambios producidos por variaciones experimentales deberían producir una dispersión pequeña, mientras que cambios globales en el patrón de expresión del proteoma deberían producir una dispersión mayor. En la gráfica resultante de comparar ambas cepas silvestres (Fig. 4) se indica además el grado de dispersión de los puntos mediante una elipse con origen en la coordenada cero que engloba al 95 % de las proteínas. Esto permite estimar visualmente la dispersión relativa, y por tanto el efecto global de los diferentes tratamientos (curado de plásmidos, lactonasa) sobre el proteoma. También se indican gráficamente los límites de variación de % volumen inferiores y superiores a 2x en los geles comparados. Este es el límite que se ha escogido arbitrariamente para considerar como significativos los cambios en la expresión de proteínas en los geles que se comparan. La Figura 4 y su comparación con el resto de gráficas de dispersión pone de manifiesto que las proteínas comunes a ambas cepas silvestres no sólo son escasas (196), sino que los cambios globales en su abundancia son más importantes que en ninguno de los otros casos, no sólo por el tamaño relativo de la elipse de dispersión, sino por el número de proteínas mayoritarias (% volumen no inferior a 0,1) cuya abundancia supera la barrera 2x en uno de los geles: 18 (9%) para la cepa UPM791, y 20 (10%) para la cepa 3841. 4.3.2 Efectos de la curación de los plásmidos pUPM791c y pUPM791d de la cepa

UPM791 De forma análoga se procedió al análisis del proteoma de las cepas UPM791.5 y UPM791.1, derivadas de la cepa silvestre UPM791 curadas de los plásmidos pUPM791c y pUPM791d, respectivamente. Para ello se corrieron geles bidimensionales de las proteínas de las distintas cepas y posteriormente fueron comparados con los de la cepa silvestre UPM791 en busca de posibles diferencias tanto cualitativas como cuantitativas, debidas a estas variaciones en el perfil plasmídico.

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4.3.2.1 UPM791 vs. UPM791.5 La cepa UPM791.5 carece del plásmido simbiótico (pUPM791c). En este plásmido se encuentran la mayoría de los genes implicados en la simbiosis con la leguminosa huésped, tales como los genes nod, nif, y fix. Las proteínas se separaron en geles bidimensionales de esta cepa, y se comparó con la cepa silvestre UPM791. En el análisis se tuvieron en cuenta ca. 590 manchas mayoritarias en cada uno de los geles. Se pudieron establecer 578 parejas, lo que supone una similitud muy alta entre los geles de ambas cepas. Esto indica que las diferencias en el proteoma “normal” resultantes de la curación del plásmido simbiótico son poco importantes. Estas diferencias se reducen a la desaparición de 4 manchas y a la aparición de 13 nuevas manchas en la cepa UPM791.5. El análisis gráfico de los niveles de abundancia relativa de las proteínas comunes puso de manifiesto que la elipse de dispersión que incluye al 95% de las proteínas comunes es una de las más pequeña de entre todas las comparaciones realizadas en este Trabajo. En cuanto a las proteínas mayoritarias (% volumen no inferior a 0,1) cuya variación supera la barrera de 2x en uno de los geles, fueron 14 (2,4%) en la cepa UPM791, y 17 (2,9%) en la cepa UPM791.5. 4.3.2.2 UPM791 vs. UPM791.1

En segundo lugar se analizó la cepa UPM791.1, curada del plásmido más pequeño (pUPM791d). La comparación del patrón bidimensional de proteínas de esta cepa con el de la cepa silvestre UPM791 permitió establecer la existencia de ca. 420 manchas mayoritarias en cada uno de los geles, de las que 412 estaban presentes en ambos geles, lo que indica que la curación del plásmido pUPM791d no resulta en diferencias globales en el proteoma. Estas diferencias se resumen en la desaparición de 14 manchas y en la aparición de 6 manchas nuevas en la cepa UPM791.1. Asimismo, el análisis gráfico de la dispersión de las abundancias relativas de las manchas comunes sugiere que la curación del plásmido pUPM791d tiene efectos mucho más drásticos sobre el proteoma que la pérdida del plásmido simbiótico pUPM791c. De acuerdo con ello, el número de proteínas mayoritarias (% volumen no inferior a 0,1) cuya abundancia supera la barrera 2x en uno de los geles fue de 22 (5,3%) para la cepa UPM791, y de 23 (5,6%) para la cepa UPM791.1. 4.3.3 Efectos de la introducción del plásmido pME6863 (aiiA) en las distintas

cepas de Rhizobium leguminosarum bv. viciae

Finalmente se separaron en geles bidimensionales las proteínas de todas las cepas de Rhizobium leguminosarum bv. viciae a las que se había transferido el plásmido pME6863 (aiiA) que codifica para la lactonasa.

En los análisis realizados mediante cromatografía de capa fina para observar los efectos del plásmido pME6863 sobre los niveles de AHLs se observó que efectivamente la producción de éstas disminuía notablemente (véanse apartado 4.2 y Fig. 2.B). Esto podría suponer una alteración en procesos regulados por autoinducción, lo cual debería traducirse en diferencias en el proteoma de las cepas portadoras del plásmido pME6863.

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Los geles bidimensionales de las proteínas de las distintas cepas de Rhizobium leguminosarum bv. viciae portadoras del plásmido pME6863 se compararon con los de cepas control portadoras del vector pME6000. La Tabla 4 muestra para cada comparación el número promedio de proteínas en cada uno de los geles, el número de proteínas presentes en ambos geles, el número de proteínas que aparece y desaparece como resultado de la presencia del plásmido pME6863, y el número y porcentaje de proteínas mayoritarias (% volumen no inferior a 0,1) cuya abundancia supera la barrera 2x en uno de los geles. Se realizaron análisis comparativos de las abundancias relativas de las proteínas presentes tanto en la cepa conteniendo el plásmido pME6863 como en la control. Los mayores efectos globales de la presencia del plásmido pME6863 sobre el proteoma se presentaron en las dos cepas silvestres, R. leguminosarum 3841 y UPM791. Este efecto fue progresivamente menor para las cepas UPM791.1 y UPM791.5, respectivamente. No obstante, si consideramos aquellas proteínas comunes a los geles de extractos de las cepas con y sin el plásmido pME6863, que muestran cambios en % volumen superiores a 2x en uno u otro gel, los mayores efectos se apreciaron en la cepa UPM791.1 (8,2% de las proteínas), seguida por UPM791 (6%), 3841 (5,1%), y por último UPM791.5, con sólo un 1, 6% (Tabla 4). Tabla 4. Efectos de la expresión del gen aiiA sobre el proteoma de las cepas de R. leguminosarum bv. viviae.

Cepas Proteínas analizadas

Nº Parejas

Aparecen Desaparecen Aumentanb Disminuyenb

UPM791 (silvestre)

515

482

6

10

14 (2.9)

15 (3.1)

UPM791.5 (pUP791c-

)

848

834

7

13

4 (0.5)

9 (1.1)

UPM791.1 (pUP791d-

)

480

464

14

1

25 (5.4)

13 (2.8)

3841 (silvestre)

538

527

11

6

12 (2.3)

15 (2.8)

a Valores calculados como la media del número de proteínas en los dos geles comparados b Número (porcentaje)

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La Figura 5 presenta un detalle de los geles anteriores, donde se pone de manifiesto la presencia de una proteína mayoritaria que se vió afectada tanto por la curación de plásmidos como por la interrupción de los sistemas de autoinducción. Esta proteína estaba presente en la cepa silvestre R. leguminosarum bv. viciae UPM791 y en

la cepa curada R. leguminosarum bv. viciae UPM791.1 (pUPM791d-), ambas portadoras del plásmido simbiótico, y desaparecía en la cepa R. leguminosarum bv. viciae UPM791.5, que carece de él, lo que podría indicar que es una proteína regulada por genes de dicho plásmido. Esta proteína también desapareció completamente en estas dos primeras cepas cuando se introdujo el gen aiiA y se vieron interrumpidos los sistemas de autoinducción, lo que sugiere que su síntesis está regulada por sistemas de autoinducción. La cepa R. leguminosarum bv. viciae 3841 no presentaba dicha proteína en ningún caso. 5. DISCUSIÓN

5.1 PRODUCCIÓN DE ACIL HOMOSERIN LACTONAS Y EFECTOS DEL

PLÁSMIDO pME6863 SOBRE SUS NIVELES EN CEPAS DE Rhizobium leguminosarum bv. viciae

La cepa R. leguminosarum bv. viciae 3841 presenta esencialmente el mismo patrón

de producción de AHLs que UPM791, pero en una menor cantidad. Debido a esto se podría esperar que ambas presenten los mismos circuitos de autoinducción.

En las cepas derivadas de R. leguminosarum bv. viciae UPM791 por curación de

plásmidos se observan claros efectos en el patrón de producción de AHLs a causa de esta curación.

El patrón que presentan R. leguminosarum bv. viciae UPM791.5 y UPM791.0

parece indicar la existencia de los genes rhiI y traI en el plásmido simbiótico, ya que su curación tiene un efecto drástico sobre las AHLs que comigran con patrones sintéticos de AHLs de cadenas aciladas de 6 y 8 átomos de carbono. En trabajos previos realizados en el laboratorio se ha encontrado rhiI, pero aún no se ha podido demostrar la existencia del gen traI. Al comparar estos resultados con ensayos de producción de AHLs en TLC realizados en otros laboratorios (Lithgow et al., 2001) se puede observar una migración equivalente a la nuestra, que correspondería a esas AHLs con cadenas aciladas de 6 y 8 átomos de carbono, tanto en el caso de la cepa R. leguminosarum bv. viciae 300, de la cual deriva 3841, como en el caso de R. leguminosarum bv. viciae A-34. En esta última, además, se observa una disminución en la producción de todas las AHLs cuando se le cura del plásmido simbiótico (pRL1JI). En estos ensayos aparece también una AHL correspondiente a una C7, la cual no es detectada en nuestro caso posiblemente a causa de la utilización de distintos sistemas para su detección, Chromobacterium violaceum en su caso y Agrobacterium tumefaciens en el nuestro. Además se ha demostrado (L. Cantero, datos no publicados) que rhiI y cinI son esencialmente idénticos en R. leguminosarum bv. viciae UPM791 y en la cepa A-34, luego las AHLs que producen deben serlo también. En R. leguminosarum bv. viciae UPM791 se ha demostrado (L. Cantero, datos no publicados) que no existe raiI donde se supone que tendría que estar a nivel genético, como tampoco en la cepa 3841, lo que hace pensar que ambas carezcan del sistema de autoinducción regulado por los genes rai.

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En el patrón de producción de AHLs de R. leguminosarum bv. viciae UPM791.5 y UPM791.0 sigue apareciendo una AHL correspondiente a una C8, luego debe existir otro sistema de autoinducción distinto de traI y rhiI localizado fuera del plásmido simbiótico posiblemente en alguno de los otros plásmidos.

La AHL de migración equivalente a una C14 podría corresponder a la bacteriocina

small, ya que presenta el mismo tamaño, y además, el gen cinI que determina su producción, ha sido encontrado en el cromosoma (L. Cantero, datos no publicados).

La curación del plásmido pequeño tuvo un efecto drástico sobre todas las AHLs:

desaparece la AHL correspondiente a C14, y aumentan las C6 y C8 del plásmido simbiótico. Pero los genes cin responsables de la producción de la AHL C14 están en el cromosoma (L. Cantero, datos no publicados), luego debe existir algún tipo de regulador de los niveles de dicha AHL en el plásmido pequeño (pUPM791d). Es probable que se trate un sistema de autoinducción que interaccione (Cross-talk, regulación cruzada) con el sistema cin de autoinducción. No parece que este sistema esté relacionado con la AHL correspondiente a una C8 que queda al curar el plámido simbiótico porque ésta sigue apareciendo en R. leguminosarum bv. viciae UPM791.0.

Los efectos de la introducción del gen aiiA que codifica una lactonasa resultaron ser

drásticos. La lactonasa AiiA se expresa y es funcional en R. leguminosarum bv. viciae, y las AHLs de dicha cepa son sensibles a la acción de la lactonasa. Los niveles de AHLs bajan mucho, especialmente en la cepa 3841 en la que desaparecen, seguramente porque los niveles iniciales eran mucho más bajos. La utilización del plásmido pME6863 con el gen aiiA ha sido necesaria porque los intentos previos para hacer disminuir los niveles basales de AHLs mediante cambios en las condiciones de cultivo no habían tenido éxito, las diferencias entre condicciones de inducción y de no inducción de AHL no eran claras.

Al introducir el plásmido pME6863 (aiiA) también nos encontramos con algo

extraño en el caso de R. leguminosarum bv. viciae UPM791 y las cepas que derivan de ella, pero no en R. leguminosarum bv. viciae 3841, tiene lugar la aparición de una nueva AHL. Ésta no es específica de AiiA porque también aparece cuando introducimos el plásmido control pME6000. Se podría pensar que está codificada por el propio plásmido, pero es poco probable, ya que se conoce la secuencia y no hay nada que se parezca a un sistema de autoinducción del tipo LuxI/LuxR. La otra posibilidad es que sea una AHL de R. leguminosarum bv. viciae UPM791 que se induce por la presencia del plásmido, pero esto es también difícilmente explicable. Además, parece que la nueva AHL es parcialmente resistente a la lactonasa. Por ello sería interesante identificarla y caracterizar su origen y regulación.

La introducción del gen aiiA ha permitido conseguir la reducción de los niveles

basales de AHLs, y por tanto, abre la posibilidad de comparar los proteomas con y sin AHLs, de cara a estimar:

1. La contribución global cualitativa y cuantitativa de los sistemas de

autoinducción al proteoma de R. leguminosarum (objeto de este Trabajo)

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2. La identificación de las proteínas pertenecientes a, o reguladas por,

dichos sistemas de autoinducción (objeto de trabajos posteriores del laboratorio basados en este Trabajo)

5.2 ANÁLISIS PROTEÓMICO DE Rhizobium leguminosarum bv. viciae

Para la separación de proteínas en geles bidimensionales se ha utilizado la metodología clásica. No se pretendía hacer un esfuerzo para visualizar el mayor número de proteínas sino para obtener patrones fácilmente identificables y reproducibles. Así, se han usado geles bidimensionales de 20 cm x 20 cm en lugar de otros de mayor tamaño, y pI de 4 - 7 en lugar de otras estrategias, como separar la muestra en dos geles, uno ácido y otro básico. Además, para el análisis de imagen, y también de cara a obtener la máxima reproducibilidad, se han escogido sólo aquellas proteínas cuya aportación al proteoma total supera un umbral determinado (> 0,1 % volumen). Por ello, en la mayor parte de comparaciones se manejaron unas 500 proteínas (oscilando entre ca. 400 y ca. 800).

Los geles se analizaron mediante el programa Melanie 3.0, desarrollado en la

Unidad de Proteómica de la Universidad de Ginebra, por el grupo del Dr. Hochstrasser (Appel et al., 1997). Este software facilita enormemente el análisis de las imágenes generadas por la tinción de plata porque permite corregir las distorsiones debidas a diferencias experimentales en los geles, las muestras o las carreras, la asignación semiáutomática de equivalencias entre los geles comparados, y la generación de geles virtuales fruto de la superposición de varios geles reales.

En nuestras condiciones experimentales aparecen sobre todo problemas con las

proteínas básicas, ya que no se resuelven bien. Esto hace posible que hayamos perdido proteínas que se sitúen en dicha zona. También hemos perdido todas las proteínas de membrana, porque no se ha seguido ninguna metodología específica para solubilizarlas. Debido a esto, las estimaciones que se pueden hacer sobre número y cantidad de proteínas modificadas por diferentes tratamientos objeto de estudio, serán siempre estimaciones muy conservadoras.

La cepa R. leguminosarum bv. viciae UPM791 es la cepa de referencia en nuestro

laboratorio, y los trabajos realizados en él durante los últimos 20 años se han hecho con dicha cepa, sobre la cual se tiene un amplio conocimiento fisiológico y genético. La cepa R. leguminosarum bv. viciae 3841 ha sido elegida por el Sanger Centre (Hinxton, Cambridge, U.K.) para su secuenciación genómica. Esto implica que, para cualquier futuro estudio proteómico, debería escogerse la cepa 3841. La próxima disponibilidad de la secuencia de todos los genes de este organismo permite aplicar técnicas proteómicas avanzadas, como son la espectrometría de masas MALDI-TOF y la secuenciación de extremos de péptidos para determinar la identidad de las proteínas de interés detectadas en los geles. En ausencia de dicha secuencia, como es el caso de la cepa UPM791, la identificación se hace difícil y en muchos casos imposible. En la comparación de las dos cepas se aprecian diferencias notables pese a pertenecer a la misma especie. Esto es aún más sorprendente si se tiene en cuenta que las

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comparaciones se han realizado con extractos de cultivos crecidos en laboratorio en condiciones “normales”, donde se espera que las proteínas mayoritariamente expresadas sean aquellas que constituyen el complemento “normal” que define a la especie Rhizobium leguminosarum bv. viciae, a la que pertenecen ambas cepas. No obstante, existen diferencias importantes en cuanto a la dotación plasmídica de ambas cepas, por un lado, la cepa UPM791 porta cuatro plásmidos, mientras que la cepa 3841 porta seis. El más característico de entre ellos, el plásmido simbiótico, presenta diferencias en tamaño y en composición de genes entre ambas bacterias (datos no publicados de nuestro laboratorio). Puesto que los plásmidos pueden representar ca. 40 – 50 % del genoma, no es de extrañar que los resultados del análisis de los proteomas, obtenidos en este Trabajo, demuestren también diferencias importantes entre ambas cepas. Los resultados del trabajo realizado con la cepa 3841 permiten establecer un “mapa” tipo del proteoma de esta cepa para futuros estudios proteómicos.

Idealmente, este Trabajo se debería haber realizado con cepas curadas en cada uno

de los plásmidos de R. leguminosarum bv. viciae UPM791. No obstante, en el laboratorio sólo se disponía de cepas curadas en los plásmidos pUPM791c (plásmido simbiótico) y pUPM791d (plásmido al que no se le ha asignado ninguna función). El plásmido simbiótico pose un tamaño de ca. 282 kb, lo que implicaría una capacidad de codificación de ca. 280 genes, representando el 3,7 % de la capacidad codificante de la bacteria (suponiendo un tamaño del genoma de 7,7 Mb, calculado para la cepa 3841). El plásmido pUPM791d, el menor de los que porta la cepa UPM791, tiene un tamaño de ca. 190 kb, lo que podría implicar unos 190 genes. Es evidente que una gran parte de los genes que constituyen el genoma de las cepas objeto de estudio no tendría por qué expresarse en las condiciones de cultivo que hemos usado en el laboratorio: genes relacionados con la asimilación y metabolismo de sustratos alternativos, genes relacionados con la vida en el suelo, la rizosfera y la simbiosis. Un gran número de los genes implicados en la simbiosis se localiza en el plásmido simbiótico, y estos genes normalmente no deberían expresarse en cultivo. Por ello no es sorprendente que las diferencias en el proteoma de vida libre de las cepas UPM791 y UPM791.5 (pUPM791c-) sean mínimas, desapareciendo cuatro proteínas y apareciendo trece nuevas. En cambio, en el caso de la cepa UPM791.1 (pUPM791d-) se observan mayores diferencias, desapareciendo catorce proteínas y apareciendo seis nuevas. Estas diferencias resultan aún mayores si tenemos en cuenta el menor tamaño del plásmido pUPM791d. Considerando el total del proteoma, la curación de los plásmidos pUPM791c y pUPM791d, afecta a ca. un 6% y a ca. un 11% de las proteínas, respectivamente (véanse Resultados, apartados 4.3.2.1 y 4.3.2.2).

El efecto de la expresión de la lactonasa, AiiA, se ha estudiado tanto en las dos

cepas silvestres, UPM791 y 3841, como en las derivadas curadas de plásmidos de la cepa UPM791 (UPM791.5 y UPM791.1). La eliminación de las AHLs tuvo su efecto más importante en las cepas silvestres UPM791 y 3841, en las que desaparecieron diez y seis proteínas, respectivamente, mientras que aparecieron seis y once, respectivamente. Estas cifras permiten acotar por primera vez un número mínimo de proteínas (y por tanto genes) reguladas por AHLs en R. leguminosarum bv. viciae, es decir, la importancia del regulón de autoinducción en esta especie (Tabla 4). Esta cifra (16 para la cepa UPM791, y 17 para la cepa 3841) representa una fracción modesta (3,1

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% en ambos casos) de las proteínas expresadas en condiciones normales de cultivo en las cepas UPM791 y 3841. Es posible que algunos de los sistemas de autoinducción no se expresen en las condiciones que hemos escogido (medio TY, aeróbico, 28 ºC), que algunas de las proteínas reguladas sean minoritarias, o que sean de membrana, o que tengan un pI superior o inferior a los analizados. Por ello la cifra apuntada más arriba debe considerarse como una estimación mínima. Además, los resultados del estudio de los niveles de AHLs en las distintas cepas (Fig. 2.B) demuestran que la presencia o ausencia del plásmido pUPM791d tiene un efecto importante sobre los sistemas de autoinducción, por lo que es posible que algunos sistemas regulados por autoindución no se expresen en ausencia de dicho plásmido. Los resultados de las comparaciones de cada cepa sugieren que esto podría en efecto ser así, ya que, a pesar de que los mayores efectos proteómicos de la lactonasa AiiA se encontraron en las cepas silvestres, no todas las proteínas que se vieron afectadas por su presencia en la cepa UPM791.1 (pUPM791d) tenían contrapartida en la cepa silvestre UPM791. Es interesante señalar que los menores efectos de la presencia de la lactonasa AiiA sobre el proteoma se dieron en la cepa UPM791.5 (pUPM791c-). Esto puede estar relacionado con el hecho que dos de los sistemas de autoinducción (rhiI/rhiR y traI/traR) se localizan en el plásmido simbiótico, lo que permite suponer que los genes diana de dichos sistemas se encuentran en dicho plásmido. Esto ha sido demostrado en otra cepa de R. leguminosarum bv. viciae (Rodelas et al., 1999; Wisniewsky – Dyé y Downie, 2002) y, al menos para el sistema rhiI/rhiR (L. Cantero, datos no publicados) en la cepa UPM791.

Una de las proteínas que aparece por efecto de la presencia de la AiiA es la propia

lactonasa. Pese a que no se han llevado a cabo experimentos para demostrar inequívocamente su identidad, prácticamente se podría asegurar que se trata de ella, ya que aparece únicamente en los geles de todas las cepas que portan el gen aiiA, y su Mr y pI son compatibles con los estimados a partir de la secuencia de aminoácidos.

El estudio proteómico llevado a cabo ha permitido definir las bases para etapas posteriores del trabajo de caracterización del regulón de autoinducción en R. leguminosarum bv. viciae. Por ejemplo, gracias a los mapas proteómicos y a las comparaciones elaboradas en este Trabajo debería ser relativamente inmediato pasar a la caracterización de las proteínas cuya expresión se ve drásticamente alterada en ausencia de AHLs. Esto, unido a la próxima disponibilidad de la secuencia genómica de la cepa 3841, debería asegurar la correcta identificación de la identidad de dichas proteínas por análisis de espectrometría de masas MALDI-TOF. Una de las proteínas cuya identificación es más interesante es la que aparece detallada en la Figura 5. Dicha proteína desaparece al curar el plásmido simbiótico de la cepa R. leguminosarum bv. viciae UPM 791, y también al interrumpir sus sistemas de autoinducción, por lo que podría ser una proteína codificada por el plásmido simbiótico y regulada por autoinducción; además es una de las proteínas mayoritarias en los extractos. Por sus características de Mr y pI podría corresponder a RhiA, aunque está ausente en los extractos de la cepa R. leguminosarum bv. viciae 3841, cuya proteína RhiA tiene Mr y pI teóricos muy similares.

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Podría ser interesante correr geles de las mismas cepas en condiciones de inducción en rizosfera para ver la influencia real de los plásmidos en el proceso de simbiosis. También puede ser interesante conseguir buenos geles de la cepa R. leguminosarum bv. viciae UPM791.0, curada del plásmido simbiótico (pUPM791c-) y del mas pequeño (pUPM791d-) para ver si los efectos de la curación son la suma de los efectos de las cepas curadas en sólo uno de ellos.

Entre las estrategias futuras para mejorar los mapas proteómicos determinados en este Trabajo, se pueden citar: la utilización de geles de mayor tamaño, mejorar la resolución de las zonas básicas mediante tratamiento específico, analizar las proteínas de membrana, acumular más geles para que los geles “promedio” tengan más fiabilidad, y pasar a la versión 4.0 de Melanie, que tiene algoritmos matemáticos más evolucionados para el cálculo de las manchas.

6. CONCLUSIONES

1. Existen grandes diferencias a nivel proteómico entre las cepas silvestres R. leguminosarum bv. viciae UPM791 y 3841, pese a pertenecer a la misma especie y haberse cultivado en condiciones “normales”, donde se espera una expresión mayoritaria de las proteínas que constituyen el complemento “normal” de la especie.

2. La curación de plásmidos de la cepa R. leguminosarum bv. viciae UPM791 presenta

un efecto a nivel proteómico. Este efecto es más significativo en el caso de la curación del plásmido pUPM791d que en el de la curación del plásmido simbiótico (pUPM791c). La mayoría de genes asignados al plásmido simbiótico parecen estar directamente relacionados con los procesos de simbiosis; las condiciones de cultivo utilizadas han sido condiciones “normales” de laboratorio y no de inducción en rizosfera. El plásmido simbiótico podría no estar expresándose de forma significativa en dichas condiciones.

3. El gen aiiA de Bacillus sp. que codifica una acil homoserin lactonasa, se expresa y

es funcional en R. leguminosarum bv. viciae. Esta expresión funcional resulta en una disminución drástica de los niveles de AHLs presentes en cultivo.

4. La interrupción de los sistemas de autoinducción como resultado de la expresión del

gen aiiA tiene efectos a nivel proteómico. Globalmente, los efectos mas importantes se dan en las cepas silvestres R. leguminosarum bv. viciae UPM791 y 3841 tanto por el número total de proteínas que aparecen y desaparecen como por aquellas cuya expresión se ve aumentada o disminuida. En las cepas curadas, R. leguminosarum bv. viciae UPM791.5 (pUPM791c-) y UPM791.1 (pUPM791d-) la expresión del gen aiiA tenía efectos cualitativa y cuantitativamente menores, lo que es compatible con la presencia de sistemas de autoinducción en dichos plásmidos.

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5. Se ha detectado la existencia de proteínas mayoritarias cuya síntesis se ve afectada

reproduciblemente por la curación de plásmidos o por la presencia o ausencia de AHLs. Estas proteínas son candidatas para su identificación mediante técnicas de espectrometría de masas por MALDI-TOF.

FIGURAS

Figura 1. A. Sistema LuxI/LuxR de autoinducción. Genes reguladores: luxR y luxI. La proteína LuxI sintetiza el autoinductor (AHL). LuxR es una proteína reguladora de la transcripción. Cuando se une al autoinductor activa la transcripción del operon luxICDABE, que codifica para la luciferasa y permite por tanto la producción de luz. B. Cascada de regulación por autoinducción en R. leguminosarum (A-34). 1. CinR induce la expresión de cinI permitiendo la producción de 3-OH-C14:1-HLS, que al unirse a CinR activa cinI por un sistema de retroalimentación positivo. 2. 3-OH-C14:1-HLS influencia la producción de rhiI, gen situado en el pSym (pRL1JI) y que codifica RhiI

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que produce AHLs de cadena corta (C6-C8); estas AHLs junto con RhiR induce la transcripción de rhiI y rhiABC (genes expresados en la rizosfera y que tienen influencia en la nodulación). 3. 3-OH-C14:1-HLS también tiene influencia en la expresión de traI, también situado en el pSym, que dirige la transcripción de AHLs de cadena corta (C6-C8); estas junto con TraR permite la expresión de los genes trb (genes relacionados con la transferencia del pSym y con la inhibición del crecimiento). 4. También existe una influencia de 3-OH-C14:1-HLS fuera del pSym, RaiI produce AHLs de cadena corta (C6-C8), que junto con RaiR regulan una serie de genes que todavía no han sido identificados. 5. Existen unas funciones localizadas dentro del pSym responsables de de la represión de 3-OH-C14:1-HLS.

Figura 2. A. Perfil plasmídico de R. leguminosarum bv. viciae UPM791 en gel de tipo “Eckhardt” junto con las cepas curadas en diferentes plásmidos. Carriles: 1. UPM791.5 (pUPM791c-). 2. UPM791.0 (pUPM791c- y pUPM791d-). 3. UPM791.1 (pUPM791d-). 4. UPM791 (silvestre). Las flechas indican cada uno de los plásmidos que porta la cepa silvestre. B. Efecto de la expresión del gen aiiA sobre los niveles de AHLs en distintas cepas de R. leguminosarum bv viciae separadas por cromatografía en capa fina. Carriles: 1. UPM791. 2. UPM791 (pME6863). 3. UPM791.5. 4. UPM791.5 (pME6863). 5. UPM791.5 (pME6000). 6. UPM791.1. 7. UPM791.1 (pME6863). 8. UPM791.0. 9. UPM791.0 (pME6863). 10. 3841. 11. 3841 (pME6863). 12. 3841 (pME6000). A la izquierda se indica la posición de marcadores sintéticos de composición conocida. En la parte inferior se indican los mililitros equivalentes de sobrenadante de cultivo que se cargaron para cada cepa.

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Figura 3. A. Separación bidimensional de proteinas de las cepas de Rhizobium leguminosarum bv.viciae: A. UPM791 (silvestre). B. 3841 (silvestre). A la izquierda se indica la posición de migración de marcadores de masa molecular conocida, y debajo se indica la escala de pI estimada.

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Figura 4. Análisis de los cambios globales entre el proteoma de R. leguminosarum bv. viciae UPM791 y R. leguminosarum bv. viciae 3841. En las gráficas se comparan las proteínas de ambas cepas distribuidas a lo largo de un eje en función de su abundancia (en % volumen). Para las comparaciones se utilizaron aproximadamente 200 proteínas presentes en ambos geles. En cada una de las gráficas la elipse de dispersión de tramo continuo delimita el área que ocupa el 95 % de las proteínas. La elipse de tramo discontinuo es una transformación de la anterior para hacer comparables las diferentes gráficas entre si. Las rectas de tramo discontinuo excluyen las proteínas cuya expresión (en % volumen) resulta ser del doble o la mitad de una cepa respecto a la otra.

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Figura 5. Detalle de variaciones en el proteoma de R. leguminosarum bv viciae UPM791 debidos a los efectos de la curación de plásmidos y de la expresión del gen aiiA. Parejas de ventanas: A. UPM791 (pME6000) y B. UPM791 (pME6863). C. UPM791.5 (pME6000) y D. UPM791.5 (pME6863). E. UPM791.1 (pME6000) y F. UPM791.1 (pME6863). En la figura aparece la ampliación correspondiente a la zona recuadrada en Figura 3. A. comparada con la misma región de las geles de las otras cepas. Las proteínas que sólo se encontraron en una de las ventanas de cada pareja se indican mediante flechas negras. Las proteínas cuya expresión se vio aumentada en una de las ventanas de cada pareja respecto a la otra se indican mediante elipses de color rojo. La flecha azul indica una proteína mayoritaria que desaparece al curar el plásmido pUPM791c y al intoducir el gen aiiA.

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