CARRERA DE ESPECIALIZACION EN BIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL FCEyN-INTI

Materia de Articulación CEBI-E5

BIOCATÁLISIS APLICADA

Docente a cargo: Dra. Cristina dos Santos Ferreiracrisdossantosf@gmail.com

CEBI- E5-2 : Cinética de los biocatalizadores/Estabilidad Enzimas/Inactivación enzimas/Métodos de estabilización

Proteínas formadas por los 21 aa(raramente aa como la selenocisteínaformada por reacción enzimática de deshidrogenasas o la glutation peroxidasa)

Forman cadenas lineales de aminoácidosunidas por puentes S-S de las cisteínas

Se estabilizan con los sustratos porinteracciones no covalentes o covalentestransitorias que actuan sinérgicamente(solo se desestabiliza el complejo E-S porfuerzas coulómbicas de igual signo)

ENZIMAS

Otras proteínas que no son enzimaspueden catalizar reacciones: anticuerpos catalíticos o las ribozimas

Existen muchas proteínas sin funcionescatalíticas:

Ej.Transporte de oxígeno (hemoglobina y mioglobina)

CARACTERÍSTICAS DE LOS BIOCATALIZADORES

Clase 1….Estabilidad de enzimas

Un biocatalizador puede ser caracterizado por:

1. Actividad: productividad

2. Estabilidad: condiciones de operación, vida útil

3. Selectividad: frente a reacciones no deseadas

La estabilidad de la enzima afecta la velocidad de la reacción.

CARACTERÍSTICAS DE LOS BIOCATALIZADORES

FACTORES AFECTAN LA VELOCIDAD DE REACCIÓN

Velocidad de la reacción catalizada depende de…

TEMPERATURA

pH

INHIBIDORES

Competitivos

No competitivos

Acompetitivos

SUSTRATO

AGENTES DESNATURALIZANTES

ALMACENAMIENTO

COFACTORES

ENZIMAS: ESTRUCTURA QUÍMICA

TIPOS ENZIMAS

PROTEÍNAS SIMPLES

Solo aminoácidos

PROTEÍNAS CONJUGADAS

Heterogéneas

APOENZIMA`

(parte proteíca)

COFACTOR

(COMPONENTE NO PROTEÍCO)

ORGÁNICOS

COENZIMAS

Unión no covalenteGRUPO PROSTÉTICO

Unión covalente

INORGÁNICOS

Cationes Metálicos Zn2+ Cu2+Ca2+ Fe2+ Mg2+

INACTIVA SIN

COFACTOR

ENZIMAS: ESTRUCTURA QUÍMICA

GRUPO PROSTÉTICO

Es un grupo covalentemente unido a la proteína y coordinado a algún ión metálico.

ENZIMAS: Metalenzimas

Anhidrasa carbónica(balance de pH en riñon)

Nitratoreductasa

PROTEÍNAS: no son enzimas

TIPOS DE ENZIMASEjemplos de enzimas que requieren cofactor

Iones metálicos como cofactores Coenzimas

Coenzimas Enzima

Pirofosfato de tiamina Piruvato deshidrogenasa

Flavin adenin nucléotido Monoaminooxidasa

Nicotiadenin nucleótido NAD

Lactato deshidrogenasa

Coenzima A AcetilCodescarboxilasa

Biotina Piruvatodescarboxilasa

Cofactor Enzima

Fe(II) o Fe(III) Citocromo oxidasaCatalasaPeroxidasa

Zn(II) Anhidrasa carbónicaCarboxipeptidasas

Ni(II) Ureasa

Mn(II) Superoxidodismutasa

Mg(II) HexoquinasasGlucosa-6-fosfatasa

TIPOS DE ENZIMASEjemplos de enzimas que requieren coenzimas

Coenzimas TIPO REACCIÓN (+)requiere regeneración cofactor)“f” fácil“c” complicado

NAD+/NADHNADH+/NADPH

Reducción carbonilosOxidación de alcoholes

+, f

ATP Fosforilaciones +,f

Acetil coenzima A Alquilaciones +, c

Flavilos (FAV) C=C reducciones No req.

Biotina Carboxilaciones No req.

ENZIMAS: ESTRUCTURA QUÍMICACOFACTORES

Ejemplos de coenzimas son vitaminas y derivados.

No todas las vitaminas son coenzimas.Vitaminas B: coenzima A, que es un derivado del ácido pantoténico (vitamina B5), o los cofactores NAD+ y NADP+, que son derivados de la niacina (vitamina B3).

ENZIMAS

dinucleótido de nicotinamida y adenina

Reducción de SUSTRATO, Oxidación de NADH o NADPH

Oxidación de SUSTRATOReducción de NAD+ o NADP+

CARACTERÍSTICAS DE LOS BIOCATALIZADORES

Estabilidad térmica caracterizada por Tm

Temperatura del equilibrio entre 50%proteína nativa y 50% desnaturalizada Depende de - Cadena de aminoácidos de la proteína (Est.1ª)-puentes S-S-Solvente-presencia de sales (Tm= To+K.[S])

FACTORES AFECTAN LA VELOCIDAD DE REACCIÓN DE LA CATÁLISIS: TEMPERATURA

CARACTERÍSTICAS DE LOS BIOCATALIZADORES

FACTORES AFECTAN LA VELOCIDAD DE REACCIÓN DE LA CATÁLISIS: TEMPERATURA

Lactoperoxidasabovina

Grupos químicos ionizables presentes en las proteínas (-COOH;-NH2; -SH ) Estabilidad al pH depende de la composición de AA de la proteína.

CARACTERÍSTICAS DE LOS BIOCATALIZADORES

FACTORES AFECTAN LA VELOCIDAD DE REACCIÓN DE LA CATÁLISIS : pH

No polares

Polares

BásicosÁcidos

CARACTERÍSTICAS DE LOS BIOCATALIZADORES

FACTORES AFECTAN LA VELOCIDAD DE REACCIÓN DE LA CATÁLISIS : pH

pH óptimo= pH en el cual la actividad catalítica es máxima depende de• interacciones entre sustrato y enzima necesarias para dar el producto.• de cada enzima y reacción catalizada

CARACTERÍSTICAS DE LOS BIOCATALIZADORES

FACTORES AFECTAN LA VELOCIDAD DE REACCIÓN DE LA CATÁLISIS: Agentes desnaturalizantes

AGENTES DESNATURALIZANTES

Ácidos y bases fuertes (ΔpH)

Solventes orgánicos

Agente reductores urea y beta-mercaptoetanol.

Sales

Iones metálicos (Hg(II); Pb(II)

Agresión mecánica

CARACTERÍSTICAS DE LOS BIOCATALIZADORES

pHOP

Temperatura TOP

Concentración cofactoresEstabilidad en el tiempo durante el almacenamiento puede expresarse como un decaimiento de 1ªorden

[E]t = [E]0 exp(–kd · t)

[E]t y [E]0 son la concentración de enzima en el tiempo t e inicial y kd es la constante de velocidad de desactivación

Kd determinada a partir de factores estadístico

Boltzmann

FACTORES AFECTAN LA VELOCIDAD DE REACCIÓN DE LA CATÁLISIS: Tiempo almacenamiento

FACTORES AFECTAN LA VELOCIDAD DE REACCIÓN DE LA CATÁLISIS: Tiempo almacenamiento

FACTORES AFECTAN LA VELOCIDAD DE REACCIÓN DE LA CATÁLISIS: Tiempo almacenamiento

CINÉTICA DE REACCIÓN

MM supone que existen 3 pasos elementales1ª formación del complejo E-S y esto se plantea como un equilibrio2ª disociación del complejo3ª formación irreversible del P (paso limitante)

FACTORES AFECTAN LA VELOCIDAD DE REACCIÓN DE LA CATÁLISIS: SUSTRATO

CINÉTICA DE REACCIÓN

MM supone que existen 3 pasos elementales1ª formación del complejo E-S y esto se plantea como un equilibrio2ª disociación del complejo3ª formación irreversible del P (paso limitante)

FACTORES AFECTAN LA VELOCIDAD DE REACCIÓN DE LA CATÁLISIS: SUSTRATO

No cumplen MyMENZIMAS ALOSTÉRICAS O COOPERATIVAS

• Tienen más de un sitio de unión para el substrato y la unión de una molécula facilita la de las posteriores.

• Son Proteínas cuaternarias

n: coeficiente de

cooperación; n > 1 indica

cooperación positivaRegulación por inhibiciónpor producto

• REVERSIBLES: la enzima recupera su actividad al eliminarlos.

• IRREVERSIBLES: la enzima continúa inhibida

• REVERSIBLESCompetitivos

No-competitivos

Acompetitivos

FACTORES AFECTAN LA VELOCIDAD DE REACCIÓN DE LA CATÁLISIS: INHIBIDORES

• Interactúa con algún grupo esencial de la enzima, formando un complejo E-I.

FACTORES AFECTAN LA VELOCIDAD DE REACCIÓN DE LA CATÁLISIS: INHIBIDORES COMPETITIVOS

INHIBIDOR COMPETITIVO reacciona en el sitio activo del sustrato.Afecta Km no la Vmax

INHIBIDOR COMPETITIVO reacciona en el sitio activo del sustrato.Afecta Km no la Vmax

En este tipo de inhibidores, se

incluyen sustancias

estructuralmente muy parecidas

al substrato

FACTORES AFECTAN LA VELOCIDAD DE REACCIÓN DE LA CATÁLISIS: INHIBIDORES COMPETITIVOS

FACTORES AFECTAN LA VELOCIDAD DE REACCIÓN DE LA CATÁLISIS: INHIBIDORES NO COMPETITIVOS

• El inhibidor se une en otro sitio. El substrato aún puede unirse a la enzima y formarse un complejo E-S-I, catalíticamente inactivo y el complejo E-I.

Se definen dos constantes:

• Si KI1= KI2inhibición no-competitiva pura.

• Si KI1≠ KI2inhibición parcialmente competitiva o mixta

FACTORES AFECTAN LA VELOCIDAD DE REACCIÓN DE LA CATÁLISIS: INHIBIDORES NO COMPETITIVOS PUROS

INHIBIDOR NO COMPETITIVONo afecta Km si afecta la Vmax

• El inhibidor se une al complejo E-S para dar un complejo E-S-I incapaz de transformarse en productos.

FACTORES AFECTAN LA VELOCIDAD DE REACCIÓN DE LA CATÁLISIS: INHIBIDORES ACOMPETITIVOS

Inhibidor acompetitivo no se une al sitio activo de S.Cuando I se une a E genera mayor afinidad de S por E entonces se forma un complejo E-S muy estable y no da PEsquema cinético sencillo : “ I se une a ES dando ESI que es improductivo”

Varía tanto Vmax (↓) como Km

(↓) aumenta la afinidad por estabilización del complejo al formarse [E-S-I] según:

FACTORES AFECTAN LA VELOCIDAD DE REACCIÓN DE LA CATÁLISIS: INHIBIDORES ACOMPETITIVOS

• Altas [S] pueden causar inhibición de algunas reacciones enzimáticas.

La [S] que hace máxima la velocidad

de reacción se determina evaluando

dr/d[S] = 0, con lo cual:

Cte de inhibición

que depende del

sustrato.

FACTORES AFECTAN LA VELOCIDAD DE REACCIÓN DE LA CATÁLISIS: INHIBICIÓN POR SUSTRATO

RESUMEN

• Las mayoría de las reacciones catalizadas por enzimas tienen una cinética

de acuerdo al modelo de M-M.

• Algunas sustancias presentes en el medio de reacción, pueden tener un

efecto inhibitorio del tipo:

• Competitivo

• No Competitivo

• Acompetitiva.

• A veces es el propio sustrato de la reacción el que inhibe.

• Algunas enzimas no siguen M-M y deben ajustarse a otros modelos

empíricos. Uno de los más habituales es el comportamiento alostérico.

MECANISMO DE ACCIÓN DE LAS ENZIMAS

El proceso de catálisis tiene lugar al exponerse residuos de aaespecíficos de la enzima al sustrato. La alta especificidad depende de la forma, tamaño de la región de la enzima llamada sitio activo y de las propiedades de los aa en la misma.

MECANISMO DE ACCIÓN DE LAS ENZIMAS

-interacciones no covalentes -reacciones ácido base -uniones covalentes transitorias-reacciones nucleofílicas-reacciones electrofílicas-reacciones de oxidoreduccionde cofactores

MECANISMOS DE CATÁLISIS

1. Catálisis ácido base2. Catálisis covalente3. Catálisis íón metálica4. Catálisis por efectos de proximidad5. Catálisis por efectos de orientación6. Catálisis por unión preferencial en el

estado de transición

MECANISMO DE ACCIÓN DE LAS ENZIMAS

1.CATÁLISIS ÁCIDO BASE

Las enzimas trasfieren un protón desde o hacia el sustrato,

provocando ruptura de un enlace covalente

MECANISMO DE ACCIÓN DE LAS ENZIMAS

2. CATÁLISIS COVALENTEC

OV

ALE

NTE

Ataque Nucleofílico(dador de electrones) o electrofílico(aceptor electrones) del centro activo de la enzima sobre el sustrato

Estado transitorio por enlace covalente inestable

Ruptura enlace covalente liberación del

producto

MECANISMO DE ACCIÓN DE LAS ENZIMAS

Ejemplo: Hidrólisis de proteínasQuimotripsina (proteasa)

MECANISMO DE ACCIÓN DE LAS ENZIMAS

MECANISMO DE ACCIÓN DE LAS ENZIMAS

2. CATÁLISIS COVALENTE

CO

VA

LEN

TE Enzimas denominadas SERINA proteasas

Utilizan el grupo CH2OH de la serinacomo nucleófilo para hidrolizar enlaces peptídicotris.

Ej. enzimas tripsina y quimiotripsina

Grupo HO de la Serina

Grupo imidazol de la Histidina

Grupo SH de la Cisteína

Paso 1: Sustrato (PP ) se introduce en sitioactivo (SA) de la quimotripsina (QT).Se traslada H+de Ser-195 a His-57 y se forma C=O

Paso 2: q+ de His-57 se neutraliza con la q- del áciaspártico (Asp-102). CuandoC=O se forma en el PP, se rompe la C-N. El grupo con N se estabiliza unido a H de His-57.

Paso 3:la porción de PP con el N se mueve fuera del SA.

MECANISMO DE ACCIÓN DE LAS ENZIMAS2. CATÁLISIS COVALENTEEjemplo Quimotripsina

.

Paso 4: H2O ingresaSA.O del agua cede H+ al N de His-57 y se une al C del PP. Se rompe C=O

Paso 5: se rompe C-O con Ser-195y se restablece elO-H de la serina.Ser-195 y His-57 vuelven a su conformación original.

Paso 6: la porción de PP con El O-H sale del SA.La QT está lista para recibirotra molécula de sustrato

MECANISMO DE ACCIÓN DE LAS ENZIMAS2. CATÁLISIS COVALENTEEjemplo Quimotripsina

MECANISMO DE ACCIÓN DE LAS ENZIMAS2. CATÁLISIS COVALENTE

• Tripsina- Quimiotripsina

• ElastanaSERINA

• PapaínaCISTEÍNA

• Glucosa -6-fosfatasaHISTIDINA

Evaluación del rendimiento en procesos BIO

CONVERSIÓN DE REACTIVOS