Caso Clínico

Presentador:Kenneth Walker

Universidad de ChileFacultad de MedicinaEscuela de Tecnología MédicaCurso de Microscopía Electrónica

Objetivo

Investigadores solicitan nuestra participación para el diseño de un protocolo basado en el uso de la técnica GFP-ImmunoGold con el objetivo de comprobar diferenciación neuronal en modelos murinos post-trasplante intracraneal de células ganglionares

Materiales y métodos

Se dispone de ratones a los que se les realizó un trasplante intracraneano de células ganglionares derivada de la eminencia media.

Surgen las siguientes interrogantes

¿Qué modelo murino se está utilizando para llevar a cabo los procedimientos? ¿Es el típico Mus musculus?

¿Fue un modelo inmunodeprimido?¿Qué edad?

¿Cuál es el origen de las células trasplantadas?¿Es humano?

¿Cuál es el estímulo para que las células se diferencien a neuronas maduras?

¿En qué sitio del cerebro murino se espera observar la diferenciación? ¿Acaso es en la zona de inoculación?

Es esencial conocer al detalle el contexto del estudio que se quiera realizar antes de comenzar el diseño de un protocolo que involucre ME.

Suponiendo que…

El modelo de estudio es Mus musculus.

Acepta el trasplante pues es un modelo inmunodeprimido.

Las células para trasplantar son de origen humano (xenotransplante).

Que el proceso de trasplante es por inoculación.

El estímulo que gatille la diferenciación sea el microambiente producto del daño del procedimiento quirúrgico.

Resultados esperados por investigadores

Al cabo de 30 días se espera observar:

• Diferenciación de células ganglionares humanas trasplantadas a neuronas maduras.

• Se espera ver esta situación en la zona de inoculación.

Se sugiere realizar un muestreo del cerebro del animal para comprobar la migración de las células en caso de que disminuya su cantidad en la zona de inoculación.

Generalidades

La eminencia media se ubica en la base del hipotálamo y sirve como interfaz entre el sistema neural y sistema endocrino periférico.

Es el sitio donde las hormonas hipotalámicas son vertidas al lecho capilar portal para ser transportadas a la pituitaria anterior, que proporciona señales bioquímicas adicionales para dirigirlas a los sistemas endocrinos.

Resultados para estudios de Síndrome de West (SW) demuestran que los progenitores neurales fetales derivados de la eminencia ganglionar media (MGE) se diferencian hacia interneuronas GABAérgicas tras ser implantadas en el cerebro neonatal y adulto en modelos animales (CABIMER. CSIC. Sevilla).

El síndrome de West (SW) o síndrome de los espasmos infantiles es una encefalopatía epiléptica de la infancia, grave y poco frecuente, que debe su nombre a William James West (1793-1848), médico inglés que describió por primera vez el cuadro (presente en su propio hijo)

http://es-cl.invitrogen.com/

GFP; 26,9 kDa; 717 bp

http://zeiss-campus.magnet.fsu.edu/

http://es-cl.invitrogen.com/

http://mouse.brain-map.org/static/atlas

http://mouse.brain-map.org/static/atlas

http://es-cl.invitrogen.com/

Salomé et al.

Comprobar la transfección

http://tissuediagnostics.com/

www.acris-antibodies.com

Trasplante

Salomé et al.

Luego de 30 días…

Procesamiento de muestraAsumiendo que la GFP corresponde a un Ag no lábil, colocar la muestra en la solución fijadora y lavar.

Usar Paraformaldehido al 4% p/v + Glutaraldehído 1% + 0.5 mM clorhidrato de calcio por 3hrs a T° ambiente o 24hrs a 4°C.

Lavado en frío con una solución de sucrosa al 3.5% en buffer fosfato salino 0.1M por 2hrs.

Lavado en una solución de clorhidrato de amonio 50 mM en buffer sucrosa-fosfato + clorhidrato de calcio 0.5mM a pH 7.4 por 1hr a 0°C.

Lavar en frío con buffer maleato 0,1M con sucrosa al 3.5%. Utilizado para la remoción de iones fosfato pH 6.5.

Luego, deshidratar en acetonas ascendentes.

La infiltración y polimerización a baja T° favorece la reactividad antigénica.

Lowicryl: Resina de baja viscosidad a baja T°

La polimerización con radiación UV es independiente de la T° lo que le permite polimerizar a la T° de infiltración en un tiempo mayor o igual a 24hrs.

Estas resinas también pueden polimerizar químicamente a 60°C (2 a 3 días).

Impregnación e inclusión

For Resin Concentration of solvent

Time in min T in°C

KM4 & HM20 30% 30 min 0  50% 60 min -20  70% 60 min -35  100% 2x60min -50

The Progressive Lowering of Temperature (PTL) Method

http://www.emsdiasum.com/

Muestra de la zona de trasplante

Semifino: Usar para la observación al microscopio de

fluorescencia para comprobar si el área seccionada tiene GFP y re-

tallar pirámide trunca.

Fino: Usar para la observación al MET. Se continúa procesando

para obtener GFP visible a través de ImmunoGold.

Cerebro murino

GFP (-)

GFP(+)

ImmunoGold

Bloqueo con suero de cabra o fetal bovino al 5% por 10 min, diluido en TBS

Ac primario contra GFP* en TBS + NGS (2.5% suero de cabra, 2 mM HEPES, pH 7.2) al 1%

Ac secundario contra FC* conjugado con Au en TBS

Pasar por GA al 2% por 5 minutos para estabilizar los complejos Ag-Ac.

Acs. Hechos en especies distintas para evitar reacciones cruzadas.

Nunca olvidar los tejidos controles a lo largo del procedimiento que son necesarios para validar la técnica y el estudio mismo.

Contraste

Acetato de uranilo al 4% por 10 min. y citrato de plomo de Reynolds 5 min.

Tetróxido de osmio 2% por 15min. Y citrato de plomo de Reynold 3min

Montaje

Los cortes siempre son sensibles al haz de electrones. Para mejorar su resistencia, cubrirlos con FORMVAR en una etapa final. Esto permitirá el mejor acceso de los anticuerpos por ambos lados del corte.

Resultados hipotéticos

GFP+ medial ganglionic eminence-derived cells were identified after GFP immunogold staining as mature neurons 30 day after transplantation into the brain. The left picture shows a panoramic view of a mature neuron (scale-bar= 2µm). The right picture is a higher magnification image showing morphoogical details such as RER, mitochondria, synapsis (arrows) or nuclear pores.

Aparato de GolgiEnvoltura nuclear

Cromatina finaNucléolo

MitocondriasRER

Microfotografía electrónica por MET. Se observa una sinapsis en la que el botón sináptico (1) se encuentra cargado de vesículas de secreción (NT).

Conclusiones

El método vela por la mantención de la mejor morfología y antigenicidad.

El método proporciona un buen contraste entre estructuras y marcaje.

La técnica satisface los requerimientos de la investigación.

Se requiere más información inicial para precisar el protocolo a seguir.

El estudio implica más técnicas a parte de la ME.

Bibliografía

1. H.K. Sreepathi, F. Ferraguti, Subpopulations of neurokinin 1 receptor-expressing neurons in the rat lateral amygdala display a differential pattern of innervation from distinct glutamatergic afferents, Neuroscience, Volume 203, 17 February 2012, Pages 59-77, ISSN 0306-4522.

2. Berryman MA, Rodewald RD. An enhanced method for post-embedding immunocytochemical staining which preserves cell membranes. J Histochem Cytochem. 1990 Feb;38(2):159-70.

3. José M. Gallego, Francisco J. Sancho, Sandra Vidueira, Laura Ortiz, Ulises Gómez-Pinedo, Juan A. Barcia, Injection of embryonic median ganglionic eminence cells or fibroblasts within the amygdala in rats kindled from the piriform cortex, Seizure, Volume 19, Issue 8, October 2010, Pages 461-466, ISSN 1059-1311.

4. M. Salomé Sirerol-Piquer, Arantxa Cebrián-Silla, Clara Alfaro-Cervelló, Ulises Gomez-Pinedo, Mario Soriano-Navarro, José-Manuel García Verdugo, GFP immunogold staining, from light to electron microscopy, in mammalian cells, Micron, Volume 43, Issue 5, April 2012, Pages 589-599, ISSN 0968-4328

5. http://mouse.brain-map.org/static/atlas

6. http://es-cl.invitrogen.com/

Stereotactic surgery

• Works on the basis of three main components:

• A stereotactic planning system, including atlas, multimodality image matching tools, coordinates calculator, etc.

• A stereotactic device or apparatus

• A stereotactic localization and placement procedure

• Modern stereotactic planning system are computer based. The stereotactic atlas is a series of cross sections of anatomical structure (for example, a human brain), depicted in reference to a two-coordinate frame. Thus, each brain structure can be easily assigned a range of three coordinate numbers, which will be used for positioning the stereotactic device. In most atlases, the three dimensions are: latero-lateral (x), dorso-ventral (y) and rostro-caudal (z).

• The stereotactic apparatus uses a set of three coordinates (x, y and z) in an orthogonal frame of reference (cartesian coordinates), or, alternatively, a polar coordinates system, also with three coordinates: angle, depth and antero-posterior location. The mechanical device has head-holding clamps and bars which puts the head in a fixed position in reference to the coordinate system (the so-called zero or origin). In small laboratory animals, these are usually bone landmarks which are known to bear a constant spatial relation to soft tissue. For example, brain atlases often use the external auditory meatus, the inferior orbital ridges, the median point of the maxilla between the incisive teeth. or the bregma (confluence of sutures of frontal and parietal bones), as such landmarks. In humans, the reference points, as described above, are intracerebral structures which are clearly discernible in a radiograph or tomograph.

Vibrótomo