Cèl lules mare i Parkinson
Transcript of Cèl lules mare i Parkinson
Cèl·lules mare i Parkinson
Autor: Julián Bobis Camacho
2n Batxillerat, B
Departament de Ciències
Tutora: Rosa Díaz
INS Santa Eulàlia
L’Hospitalet, gener 2015
Cèl·lules mare i Parkinson Autor: Julián Bobis Camacho
2
ÍNDEX
1. Introducció.....................................................................................................p.4
2. Recull documental
2.1. Cèl·lules mare...........................................................................................p.8
2.1.1. Definició de cèl·lula mare.................................................................p.8
2.1.2. Tipus de cèl·lules mare....................................................................p.8
2.1.2.1. Segons la potencialitat..........................................................p.8
2.1.2.1.1. Cèl·lules mare de pluripotència induïda.....................p.9
2.1.2.2. Segons l’origen....................................................................p.11
2.1.3. Descobriment i dècada dels 60......................................................p.11
2.1.4. Investigacions als 80 i 90...............................................................p.13
2.1.5. Segle XXI.......................................................................................p.13
2.1.5.1. Descobriment de les iPSC..................................................p.13
2.1.5.2. Investigacions posteriors al 2006........................................p.14
2.1.6. Medecina regenerativa..................................................................p.16
2.1.7. Legislació, ètica i controvèrsies.....................................................p.17
2.2. Malaltia del Parkinson.............................................................................p.19
2.2.1. Què és el Parkinson?.....................................................................p.19
2.2.2. Història del Parkinson....................................................................p.22
2.2.3. Causes...........................................................................................p.24
2.2.4. Tractaments...................................................................................p.25
2.2.4.1. Fàrmacs..............................................................................p.25
2.2.4.2. Tractaments no farmacològics............................................p.26
2.2.4.3. Altres tractaments...............................................................p.26
2.3. Malaltia del Parkinson i cèl·lules mare....................................................p.28
Objectius e hipòtesis del treball pràctic: Cèl·lules mare i Parkinson..................p. 29
Cèl·lules mare i Parkinson Autor: Julián Bobis Camacho
3
3. Treball de camp
3.1. Estada al Centre Medicina Regenerativa de Barcelona (CMRB)............p.31
3.1.1. Conceptes teòrics adquirits............................................................p.32
3.1.1.1. Unitat de cultius. El cultiu in vitro de cèl·lules mare............p.32
3.1.1.2. Unitat de histologia. Caracterització de cèl·lules mare.......p.36
3.1.1.3. Unitat de bioimatge. Microscòpia i tincions.........................p.38
3.1.2. Pràctiques realitzades en la Unitat de Cultius...............................p.39
3.1.2.1. Canvi de medi de cultiu en colònies de iPSC......................p.40
3.1.2.2. Diferenciació de iPSC a NPs...............................................p.43
3.1.3. Pràctiques de la Unitat de Histologia i Bioimatge..........................p.46
3.1.3.1. Immunodetecció de diferenciació d’un teratoma.................p.47
3.1.3.2. Observació de iPSC en un microscopi confocal.................p.55
3.1.3.3. Observació d’EBS en un microscopi confocal.....................p.62
3.2. Entrevistes...............................................................................................p.66
3.2.1. El Parkinson des de la recerca i la situació econòmica de la
investigació: doctora Cristina Malagelada, directora de grup a la
UB.....................................................................................................p.66
3.2.2. El Parkinson segons els afectats: president de l’Associació de
malalts de Parkinson de L’Hospitalet................................................p.72
4. Conclusions.................................................................................................p.78
5. Fonts.............................................................................................................p.82
Cèl·lules mare i Parkinson Autor: Julián Bobis Camacho
4
1. Introducció
El Parkinson és la segona malaltia degenerativa en nombre de malalts. Està
present en la societat i afecta a persones del nostre voltant.
Sabem de gent que la pateix o, potser, l’hem sentida dir en alguna notícia o
article, però mai s’aprofundeix suficientment en la malaltia com per conèixer-la i
entendre-la completament.
Per una altra banda, segur que hem sentit parlar de les cèl·lules mare. Aquestes
sí que són protagonistes de molts reportatges, notícies i documentals. Tot i això,
els passa el mateix que a la malaltia del Parkinson: hi ha molt desconeixement.
Semblen eines miraculoses que guareixen qualsevol dolença i que es poden
aplicar a tort i a dret.
D’aquesta certa ignorància en els dos temes, en tenim la culpa una mica tots. Per
aquest motiu vaig escollir aquest tema: les cèl·lules mare i el Parkinson.
El Parkinson perquè és una malaltia que afecta bastanta gent, que la societat
generalment no la coneix, i perquè cada cop més s’avança en la seva
investigació. No tinc cap parent o persona propera que la pateixi però em
semblava interessant pels símptomes que manifesta (notables si més no) i la
incertesa que envolta les seves causes i mecanismes.
Vaig escollir les cèl·lules mare com a tema perquè havia escoltat moltes coses
sobre elles. Tenia una idea molt etèria i volia definir-les en la meva ment.
Aquestes tenen moltes expectatives en diferents camps de la biologia, doncs per
què no investigar-les?
Després de pensar aquests dos temes, vaig arribar a la conclusió d’unir-los:
aplicar les cèl·lules mare al Parkinson.
Els dos temes eren molt interessants, tenia ganes de saber-ne més i també volia
veure si certament hi ha una possible aplicació de les cèl·lules mare al Parkinson
o només era una idea sense futur.
A més, degut al meu interès en la investigació, en les biociències i els nous
avenços que es realitzen en aquest àmbit, vaig establir com a temes una malaltia
(més propera a la societat i palpable) i un element relativament nou en la recerca
biològica (cèl·lules mare).
Cèl·lules mare i Parkinson Autor: Julián Bobis Camacho
5
Una vegada escollit el tema vaig plantejar-me una sèrie de preguntes per
desenvolupar el meu Treball de Recerca, en forma d’objectiu.
L’objectiu principal del meu Treball de Recerca és determinar si la medecina
regenerativa, ús de cèl·lules mare, majoritàriament, és una solució per al
Parkinson i esbrinar si la reprogramació (tornar a ser cèl·lules mare) de
cèl·lules d’un malalt de Parkinson pot generar neurones sanes, és a dir,
utilitzant cèl·lules mare i modificant els gens que provoquen el Parkinson amb la
teràpia gènica.
Amb aquest objectiu es vol trobar si aquesta és una possible solució a la
enfermetat del Parkinson i si és viable el seu ús com a tractament en el futur.
Les preguntes que hem vaig fer a l’inici del Treball van ser:
La teràpia cel·lular millora la qualitat de vida de pacients de
Parkinson?
És l’aplicació de la teràpia cel·lular segura per a persones?
Quines són les eines o tècniques que s’utilitzen amb cèl·lules mare?
És Catalunya un lloc on s’investiga amb cèl·lules mare?
Per contestar aquestes preguntes vaig començar a recopilar d’informació sobre
cèl·lules mare i Parkinson:
1) Consulta de pàgines web, generals del tipus enciclopèdiques i especialitzades
(centres de recerca, associacions...), quasi sempre en anglès ja que aquesta és la
llengua majoritària en la investigació i la publicació.
2) Lectura de llibres sobre cèl·lules mare, com per exemple Òrgans a la carta.
Cèl·lules mare, clonatge terapèutic i medicina regenerativa, d’en doctor David
Bueno. La lectura d’aquest llibre em va introduir de ple en les cèl·lules mare i
m’ajudà a tenir una idea més que general de que són i les seves propietats i
avantatges.
3) Recollida de informació de xerrades, lectures i investigacions penjades en la
xarxa amb molta informació valuosa. Vaig cercar les investigacions més important
sobre cèl·lules mare i Parkinson, i les vaig ordenar segons els anys en què es van
realitzar.
Cèl·lules mare i Parkinson Autor: Julián Bobis Camacho
6
Les hipòtesis del meu treball, doncs són:
1. La teràpia cel·lular ajuda a millorar la qualitat de vida de les persones
que pateixen Parkinson.
2. Pot ser que la teràpia cel·lular sigui segura per a aplicar a persones
sense efectes secundaris.
3. És difícil tractar amb cèl·lules mare i les seves tècniques.
4. Pot ser que Catalunya, en el conjunt del món, sigui un focus important
d’investigació sobre cèl·lules mare.
5. És necessari continuar la investigació sobre cèl·lules mare i malalties
neurodegeneratives.
Per realitzar el meu treball de camp, vaig cercar i aconseguir per mi mateix entrar
en contacte amb un centre de recerca de Barcelona, el CMRB (Centre de
Medicina Regenerativa de Barcelona) que em va oferir la possibilitat de realitzar
una estada d’uns dies en ell per conèixer millor un laboratori, les cèl·lules mare i
tot el món que les envolta.
Gran part del meu treball de camp correspon a aquestes pràctiques, de les quals
vaig extreure molta informació i m’han ajudat extraordinàriament a respondre a les
preguntes inicials.
Una vegada que vaig recollir tota la informació i tot just després de fer les
pràctiques, vaig començar a redactar la part pràctica perquè tenia molt present
encara en la meva ment els processos que havia fet al centre de recerca.
També, he realitzat dues entrevistes per conèixer els diferents punts de vista
sobre el Parkinson i l’ús de les cèl·lules mare en la malaltia. Les dues entrevistes
van ser efectuades després de l’estiu.
Una de les entrevistes estava dirigida a un pacient de Parkinson i alhora president
de l’Associació de Malalts de Parkinson de L’Hospitalet, per completar el meu
Treball. A més vaig emprendre la feina d’organitzar tota la informació i traspassar-
la.
Finalment, vaig aconseguir una entrevista a una investigadora, la doctora Cristina
Malagelada, que treballa al departament de farmacologia de la Universitat de
Barcelona, i he redactat les conclusions com a resum de la meva investigació i
Treball.
Cèl·lules mare i Parkinson Autor: Julián Bobis Camacho
7
Un dels problemes que m’he trobat és la gran quantitat d’informació que hi ha (a
internet i provinent de revistes especialitzades en anglès). Vaig haver de
seleccionar les recerques més importants i resumir-les, per després condensar-les
amb la intenció d’utilitzar-les com a font d’informació.
També, el redactat ha estat una mica dificultós perquè és la primera vegada que
he completat un treball d’aquestes dimensions. La gran quantitat de paraules
noves i concretes el dificultava una mica més.
D’altra banda i en primer lloc, voldria agrair a la meva tutora del Treball de
Recerca Sra. Rosa Díaz per la seva ajuda i orientar-me en la llarga i dificultosa
redacció del Treball. Moltes gràcies per la paciència al corregir, ja que aquest
treball és dens i especialitzat, i per les idees que m’ha donat per millorar-lo.
Voldria donar gràcies a tot al CMRB per oferir-me la possibilitat de fer unes
pràctiques de laboratori en les instal·lacions. No ho oblidaré mai de veritat, m’han
enriquit com a persona i han elevat el meu Treball. Va ser la primera vegada que
visitava un laboratori complert i professional, i la primera vegada que realitzava
pràctiques complexes amb passos complicats, però no deixava mai de ser
emocionant. Vull destacar particularment a la Sra. Mercè Martí, ja que és a qui li
dec l’oportunitat d’haver-hi assistit, i era la meva referència en el CMRB i
m’orientava: moltíssimes gràcies. També vull remarcar la resta de professionals
del Core Facility del CMRB que no només em guiaven a través dels processos i
pràctiques de cada secció, sinó que també em donaven suport i m’explicaven
qualsevol dubte que tingués. Ells són Lola Mulero, Bernd Kuebler, Cristina
Morera, Cristina Pardo i Laia Miquel.
També gràcies a la doctora Cristina Malagelada i al seu equip del departament de
farmacologia de la UB per l’entrevista que em van permetre fer-los i per la visita a
les instal·lacions. Em van rebre cordialment i van respondre a totes les preguntes
que tenia, fins i tot van donar-me més informació en forma de papers i anècdotes.
Cal esmentar també a l’Associació de Malalts de Parkinson de L’Hospitalet, i en
especial al seu president, per deixar que m’apropés i conegués malalts de
Parkinson, a més de realitzar una entrevista i estar present en una sessió de
fisioteràpia.
Cèl·lules mare i Parkinson Autor: Julián Bobis Camacho
8
2. Recull documental
2.1 Cèl·lules mare
2.1.1. Definició de cèl·lula mare
Les cèl·lules mare són cèl·lules que tenen la
capacitat d’autorenovar-se, és a dir, de fer
“còpies” d’ella mateixa per generar més cèl·lules
com ella; i poden donar lloc a tipus cel·lulars més
especialitzats (diferenciació), com cèl·lules del cor
o de l’intestí.
Aquestes dues característiques les fan úniques i
les distingeixen de la resta de cèl·lules i, degut a elles, tenen una importància vital
en un organisme ja que renoven les cèl·lules mortes dels teixits o òrgans, fent
possible, així, la regeneració del teixit i el creixement d’aquest.
Hi ha teixits que en tenen en menor mesura, cosa que dificulta la seva
regeneració, com el teixit neuronal, o altres en tenen en quantitats altes, com la
medul·la òssia, on es produeixen les cèl·lules sanguínies.
Des del seu descobriment a la dècada dels 60, han estat subjecte de
investigacions per les seves úniques capacitats i per les seves possibles
aplicacions en biomedicina.
2.1.2 Tipus de cèl·lules mare
Les cèl·lules mare s’acostumen a classificar segons d’on provenen o segons el
grau que tenen de generar cèl·lules diferenciades (potencialitat).
2.1.2.1. Segons la potencialitat
Trobem:
Totipotents: tenen la capacitat d’originar tant l’organisme en si com les
estructures extraembrionàries durant la gestació. La cèl·lula totipotent per
excel·lència és el zigot, la primera cèl·lula de l’organisme després de la unió de
l’espermatozoide i l’òvul. També són totipotents les espores.
Cèl·lules mare humanes
Cèl·lules mare i Parkinson Autor: Julián Bobis Camacho
9
Pluripotents: generen tots el tipus cel·lulars de l’individu adult o de l’embrió, però
no les estructures foranies a aquest, com la placenta. Són pluripotents les
cèl·lules embrionàries, ESC, capaces de diferenciar-se en les tres capes
germinals o tipus cel·lulars (endoderm, ectoderm i mesoderm). També ho són les
cèl·lules de pluripotència induïda, iPSC, un tipus especial de cèl·lula mare.
Multipotents: tenen potencial de produir un quants tipus cel·lulars propers en el
seu desenvolupament, però no l’organisme sencer com abans. Es restringeixen
(també es diu que estan compromeses) a cèl·lules d’un teixit o òrgan específic.
L’exemple més utilitzat són les cèl·lules hematopoiètiques, que originen les
cèl·lules sanguínies.
Oligopotents: amb capacitat de donar lloc a un determinat tipus de cèl·lules, més
restringit que en l’anterior cas. Ex: cèl·lules mare vasculars (vasos sanguinis).
Unipotents: d’elles només es deriven un únic tipus cel·lular. Ex: cèl·lules mare
espermatogèniques. Estarien quasi bé especialitzades perquè estan molt
restringides, però mantenen les característiques de les cèl·lules mare.
2.1.2.1.1. Cèl·lules mare de pluripotència induïda
Aquestes cèl·lules, també anomenades iPSC, són cèl·lules produïdes en un
laboratori que tenen característiques similars a les cèl·lules mare embrionàries.
Són cèl·lules pluripotents produïdes a partir d’una cèl·lula especialitzada, que es
converteix en cèl·lula mare a través de la reprogramació fins a arribar a un estadi
pluripotent.
Tenen una forma molt similar a les cèl·lules embrionàries, tenen la mateixa
velocitat de divisió, els gens que transcriuen són semblants i s’ha comprovat que
es diferencien als mateixos tipus cel·lulars.
L’avantatge d’aquestes és que es poden utilitzar com a model d’una malaltia, ja
que han estat generades a partir de cèl·lules que contenen la malaltia o tenen els
gens, cosa que permet l’estudi in vitro de la malaltia. A més, al ser cèl·lules d’una
persona, no provocarien rebuig immunològic en aquesta si s’utilitzessin com a
teràpia cel·lular perquè són cèl·lules del cos, pròpies.
Cèl·lules mare i Parkinson Autor: Julián Bobis Camacho
10
També, amb el seu ús, s’estalvia la utilització de cèl·lules d’un embrió amb totes
les controvèrsies ètiques que comporta, i permeten realitzar teràpia gènica, és a
dir, modificar genèticament la cèl·lula per corregir l’alteració i implantar-la de nou
al pacient.
Van ser obtingudes per primera vegada al 2006 per l’equip de Shinya Yamanaka
a partir de fibroblasts de ratolins i al 2007 amb cèl·lules humanes, fet pel qual va
rebre el Nobel de Medicina al 2012. Les van aconseguir gràcies a introduir i
sobreexpressar uns factors de transcripció, induint així a l’expressió de gens de
pluripotència, ja que bloquegen els factors propis de la cèl·lula.
Per generar iPSC, primer es fa una biòpsia per aconseguir cèl·lules de la pell,
fibroblasts, o queratinòcits, del cabell, i es posen en cultiu. S’empren, normalment
no sempre, aquests dos tipus de cèl·lules perquè la seva obtenció és molt fàcil.
Després es reprogramen les cèl·lules activant els gens de pluripotència.
Normalment aquests són l’Oct3, el Sox2, el Klf4 i el c-Myc. Per introduir els factors
de transcripció s’utilitzen virus, que infecten la cèl·lula inserint-hi els factors, amb
mRNA (ARN missatger), proteïnes, molècules o a través de les condicions del
medi, que contindria els factors que ens interessen.
En el cas dels virus, es donen dues possibilitats: si el virus es queda dins la
cèl·lula, manera integrativa (lentivirus i adenovirus), o la forma no integrativa, no
es queda dins.
Les cèl·lules reprogramades amb la primera forma no poden ser utilitzades per a
la teràpia cel·lular perquè podrien causar tumors, infeccions i la enfermetat en el
pacient. En la forma no integrativa, on s’utilitza el virus Sendai, un gen exogen
produeix la proteïna, fent feedback al gen endogen. El gen exogen es degrada en
la divisió cel·lular quan el gen passa al citoplasma ja que és detectat com a no
propi.
Després de cada reprogramació cal realitzar una caracterització a les cèl·lules per
assegurar les seves propietats pluripotents amb una prova de pluripotència.
Uns dels principals problemes de la producció de iPSC i de la reprogramació és
que, sovint, originen cèl·lules cancerígenes que després es divideixen sense
control perquè alguns dels factors que s’introdueixen són oncògens, i es
produeixen mutacions en el material genètic, fets que dificulten el seu ús en
persones.
Cèl·lules mare i Parkinson Autor: Julián Bobis Camacho
11
2.1.2.2. Segons l’origen
Segons aquesta classificació trobem dos tipus de cèl·lules mare: adultes i
embrionàries.
Les cèl·lules mare adultes o cèl·lules mare somàtiques són cèl·lules mare
presents en un organisme adult, ja desenvolupat. Aquestes són les responsables
de la regeneració periòdica dels nostres òrgans i teixits.
Poden donar lloc a pocs tipus cel·lulars, són multipotents, normalment del teixit
en el qual es troben i s’utilitzen àmpliament contra malalties, com la leucèmia, on
es fan trasplantaments de cèl·lules mare sanguínies de la medul·la òssia.
Les cèl·lules embrionàries, ESC, són cèl·lules d’embrions procedents de
fecundacions in vitro sobrants. Són les cèl·lules pluripotents per excel·lència
perquè es diferencien en les tres capes germinals i en tots els tipus cel·lulars de
l’organisme adult i s’empren per estudiar el desenvolupament embrionari,
malalties in vitro i per a farmacologia.
Es formen al blastocist, un conjunt de cèl·lules que es forma a partir del tercer o
cinquè dia de desenvolupament. Aquest està format pel trofoblast, que recobreix
les ESC i donarà lloc a la placenta, i la ICM (inner cell mass), massa cel·lular
interna, que són les ESC.
El seu ús es troba envoltat de moltes controvèrsies, ja que en resulten de la
destrucció de l’embrió, un potencial ésser humà.
2.1.3. Descobriment i dècada dels 60
Ja abans del descobriment de les cèl·lules mare, s’havien fet experiments
traspassant nuclis de cèl·lules somàtiques a citoplasmes de cèl·lules
primerenques, com l’experiment d’en John Gurdon que, al 1958, va clonar una
granota utilitzant el nucli d’una de les seves cèl·lules somàtiques diferenciades.
També s’havien realitzat investigacions sobre les cèl·lules tumorals, però sense
saber els motius de la seva producció.
Cèl·lules mare i Parkinson Autor: Julián Bobis Camacho
12
Però el vertader punt d’inflexió va ser al 1963, quan Ernest McCulloch i James Till
van descobrir les cèl·lules mare, concretament van aïllar cèl·lules
hematopoiètiques, i van confirmar la seva capacitat de generar altres cèl·lules
mare. Pensaven que aquestes cèl·lules eren les que mantenien el nombre de
cèl·lules especialitzades i les causants de la seva producció.
Provaren la capacitat de dividir-se en models animals (ratolins) i obtingueren
masses cel·lulars que van confirmar les propietats de divisió, especialització i
autorrenovació. Van anomenar-les “cèl·lules formadores de colònies”.
Van injectar “cèl·lules formadores de colònies” a la melsa de ratolins i després
extirparen les masses formades. Trobaren que aquestes masses tenien
naturalesa heterogènia i que s’havien format més “cèl·lules formadores”.
Van observar que al originar-se una colònia a partir d’una “cèl·lula formadora”, al
mateix temps que es formava la colònia, també apareixia una petita quantitat de
“cèl·lules formadores” i un gran nombre de cèl·lules especialitzades. Aquestes
cèl·lules especialitzades perdien la capacitat de produir altres cèl·lules quan
aprofundien en el procés d’especialització.
Al finalitzar la seva investigació, van concloure que les “cèl·lules formadores de
colònies” es dividien o en dues cèl·lules iguals que ella o en una ·cèl·lula
formadora” i en un especialitzada; i que aquest procés es produïa de manera
aleatòria.
Durant la dècada dels 60 es continuà investigant la capacitat d’aquestes cèl·lules
capaces de formar colònies i cèl·lules amb les mateixes propietats que ella.
Sobretot s’utilitzaven ratolins i la melsa d’aquests per realitzar les investigacions,
injectant-hi cèl·lules mare hematopoiètiques i exposant l’animal a radiacions per
modificar el material genètic de les cèl·lules i disminuir la capacitat de divisió de
les pròpies cèl·lules del ratolí.
A les cèl·lules formadores de colònies, van batejar-les com cèl·lules mare, per
la capacitat de “donar vida” a noves cèl·lules.
Cèl·lules mare i Parkinson Autor: Julián Bobis Camacho
13
2.1.4. Investigacions als 80 i 90
Durant les dècades de 1980 i 1990, els investigadors ja tenien un coneixement
relativament profund de les propietats de les cèl·lules mare.
Descobriren que aquestes podien formar teratomes en les condicions adequades i
que, per tant, les cèl·lules embrionàries de les quals es partia tenen la capacitat
de formar tots els teixits de l’organisme adult (cèl·lula pluripotent). A més, van
observar que les cèl·lules mare expressaven uns factors determinats, similars a
aquells que expressen les cèl·lules tumorals.
Aquests avenços van ser possibles gràcies a la millora de les tècniques de cultiu
in vitro, però també per l’augment en el coneixement de les cèl·lules i els
processos que les originen.
Aprofundiren en el desenvolupament embrionari amb l’ús de ESC i derivant
cèl·lules mare en cèl·lules especialitzades, com en l’origen del teixit nerviós i la
generació de neurones del cervell.
En aquestes dècades, es va començar a pensar en les seves possibles
aplicacions en malalties que suposen la pèrdua de cèl·lules o la pèrdua de
funcionalitat d’aquestes, a través de reemplaçar aquestes cèl·lules mortes o
danyades per cèl·lules “sanes”.
2.1.5. Segle XXI
2.1.5.1. Descobriment de les iPSC
Ja abans de la primera vegada que es van generar iPSC, s’havien aconseguit
cèl·lules amb un estat similar a les ESC mitjançant la transferència de nuclis de
cèl·lules somàtiques a òvuls (Gurdon als 60 o la clonació de l’ovella Dolly al
1997) o fusionant-les amb ESC.
Però el 2006 va ser la primera vegada que es van generar cèl·lules pluripotents a
partir de cèl·lules especialitzades amb la reprogramació (una mena de “reset” de
la cèl·lula). Aquesta fita va ser duta a terme per Shinya Yamanaka i Kazutoshi
Takahashi de la universitat de Kyoto al Japó.
Cèl·lules mare i Parkinson Autor: Julián Bobis Camacho
14
Partint de fibroblasts de ratolí, arribaren a cèl·lules de naturalesa pluripotent
inserint factors propis de ESC i cèl·lules tumorals tals com l’Oct3/4 i el Sox2, el
funcionament dels quals no coneixien amb exactitud.
Van utilitzar retrovirus per introduir aquests factors però obtingueren un nombre
petit de cèl·lules autènticament iPSC, pluripotents, per tant, l’efectivitat del mètode
no era alta.
Aquest mètode es va millorar en investigacions posteriors, sobretot amb el
millorament de les tècniques in vitro per mantenir les cèl·lules pluripotents i es va
aprofundir en el funcionament dels factors, sobretot es van deixar d’utilitzar factors
oncògens.
Aquest mateix equip va realitzar la reprogramació en fibroblasts humans amb
vistes d’utilitzar les iPSC contra malalties.
Va representar un punt d’inflexió en les investigacions de cèl·lules mare perquè
van obrir noves vies de recerca, i les seves possibles aplicacions eren i són
nombroses, sobretot amb vistes de l’ús en persones.
2.1.5.2. Investigacions posteriors al 2006
Després del descobriment de les iPSC, el món de les investigacions amb cèl·lules
mare va viure una petita revolució. Es van començar a utilitzar en gran quantitat
perquè permetien veure el desenvolupament d’una cèl·lula malalta, entre moltes
altres raons.
També es perfeccionà la tècnica d’obtenir iPSC amb mètodes més eficients i es
van produir iPSC de cèl·lules que encara no s’havien reprogramat, com els
queratinòcits, realitzat al 2008 amb participació del CMRB (Centre de Medicina
Regenerativa de Barcelona).
En aquest mètode, partien de queratinòcits humans recollits de la pell i van obtenir
iPSC de manera més eficient i ràpida que amb l’ús de fibroblasts (més facilitat per
reprogramar-se).
Van introduir els mateixos quatre factors que havia utilitzat al 2006 Yamanaka
amb un retrovirus i van provar la seva eficàcia amb una caracterització: les
cèl·lules obtingudes tenien les mateixes característiques que una ESC, o si més
no, similars.
Cèl·lules mare i Parkinson Autor: Julián Bobis Camacho
15
Un dels reptes per emprar les iPSC en pacients era corregir els gens mutats o
alterats per aconseguir “sanar” la cèl·lula. Aquesta fita, es va aconseguir al 2009
amb la reprogramació de cèl·lules d’un malalt d’anèmia de Falconi (que afecta a
les cèl·lules de la sang).
A partir de fibroblasts i queratinòcits d’un pacient van arribar fins a un estat
pluripotent en forma de iPSC. Van corregir la mutació en l’ADN mitjançant un
vector viral que introduïa el gen correcte a la cèl·lula i substituïa el defectuós i,
seguidament, van derivar les iPSC obtingudes a cèl·lules mare hematopoiètiques,
que podien formar cèl·lules sanguínies funcionals i correctes, sense la presència
de la malaltia.
El problema d’aquesta investigació és que els factors introduïts pel virus poden
portar a la formació de tumors perquè tenen caràcter oncogen, a més que
afavoreixen la mutació del genoma ja que no es controla acuradament la posició
del nou gen.
Una de les novetats del nou segle és l’estudi d’animals que tenen la capacitat de
regenerar teixits i òrgans sencers (model animal). Un d’aquests animals únics és
el peix zebra, capaç de regenerar una part del cor després d’una amputació.
Aquests models animals, encara que no són mamífers, permeten estudiar com es
produeix la regeneració d’un òrgan, fet clau per esbrinar com funcionen les
cèl·lules mare tissulars i com es podrien utilitzar en el propi ésser humà en el
futur, ja que nosaltres tenim els gens per la regeneració però no s’expressen.
Entre altres avenços, s’ha aconseguit reprogramar cèl·lules especialitzades a un
estat totipotent però in vivo, sobretot en ratolins. S’introdueixen els factors
necessaris per la reprogramació a un teixit concret del ratolí i s’observa la seva
reprogramació. El mètode, tot i ser innovador perquè assegura que es poden
formar cèl·lules mare en l’individu sense emprar tècniques ex vivo, necessita
millores ja que és font de teratomes en el ratolí i és poc eficient perquè genera
poques cèl·lules mare per teixit.
Recentment, s’ha començat a utilitzar les iPSC com a teràpia contra malalties. Es
reprogramen cèl·lules del malalt (normalment queratinòcits i fibroblasts) corregint
l’alteració a l’ADN i es fan especialitzar les iPSC obtingudes al tipus de cèl·lula
desitjada, que s’implantarà de nou en el pacient, aquest cop sense mutació.
Cèl·lules mare i Parkinson Autor: Julián Bobis Camacho
16
Amb aquest pas es comencen a emprar cèl·lules pluripotents, més concretament
les iPSC, per a fins clínics en humans.
A inicis del 2014, es va començar a dissenyar proves clíniques en humans al Japó
amb iPSC. En aquest cas es vol utilitzar cèl·lules sanes per substituir-ne a la
màcula de l’ull que pateix una degeneració, normalment a causa de l’edat.
Així, amb el trasplantament de cèl·lules sanes a la retina, els pacients
aconseguirien una visió del detalls normals. Però aquesta investigació es troba
encara en la fase preclínica i falta el beneplàcit del govern del Japó per començar
les proves en humans.
2.1.6. Medicina regenerativa
La medicina regenerativa és una ciència biomèdica que té per objectiu reparar o
reemplaçar teixits o òrgans que han perdut la seva funció habitual, per causa
d’una malaltia, envelliment, una lesió...
No només investiga possibles tractaments, sinó que també estudia l’origen i
desenvolupament del deteriorament de la cèl·lula, teixit o òrgan per poder arribar
més fàcilment a una solució.
Actualment, l’ús de cèl·lules mare ha obert grans expectatives en aquest camp,
però el principal problema que s’oposa és el rebuig immunològic: al ser cèl·lules
d’una altre organisme, el sistema immunològic les detecta com antígens i les
ataca (no compatibilitat).
Per solucionar-lo, s’empren iPSC, que al ser cèl·lules del pacient, no causen
rebuig.
Moltes de les tècniques de la medicina regenerativa no es poden aplicar encara
als éssers humans perquè és necessari que passin un fase preclínica en animals
per provar la seva validesa. Aquest pas pot durar molt de temps fins que les
autoritats sanitàries aprovin el pas a la fase clínica.
Una branca de la medicina regenerativa és la teràpia cel·lular: ús de cèl·lules, tant
mares com especialitzades, per tractar una malaltia. Un exemple molt habitual de
teràpia cel·lular són els trasplantaments de cèl·lules del moll de l’os, de còrnia de
l’ull i pell. Totes aquestes utilitzen o bé cèl·lules mare adultes o ESC, per tant, no
hi ha teràpies amb iPSC, encara que estan en desenvolupament.
Cèl·lules mare i Parkinson Autor: Julián Bobis Camacho
17
Cal no confondre la teràpia cel·lular amb la teràpia gènica. Aquesta és l’alteració
del genoma d’una cèl·lula o organisme per corregir una mutació, alterar l’ADN o
aconseguir una substància interessant des del punt de vista biològic. Normalment,
la teràpia cel·lular es combina amb teràpia gènica per emmenar una alteració que
causa una malaltia (sobretot amb l’ús de vectors que introdueixen el nou material
genètic i crear organismes transgènics).
Hi ha, actualment, molts assajos clínics amb vistes d’aplicar teràpia cel·lular a
humans. La majoria, però, estan en vies de desenvolupament perquè moltes
d’aquestes teràpies produeixen rebuig, tumors (per la reprogramació cel·lular) o
una no correcta correcció del genoma.
La teràpia amb iPSC obre moltes esperances en el tractament de malalties
neurodegeneratives, com el Parkinson, càncer, i, sobretot, malalties hereditàries o
causades per mutacions, encara que també s’estan fent investigacions per tractar-
ne malalties infeccioses.
A pesar dels grans avenços que es produeixen en cèl·lules mare i medicina
regenerativa, queda temps per a la seva aplicació total i molts interrogants per
resoldre.
2.1.7. Legislació, ètica i controvèrsies
En aquests moments, hi ha un seguit de lleis estatals i catalanes que regulen la
investigació i ús de cèl·lules mare. La Unió Europea no té una legislació comuna
sinó que cada país té
autonomia per legislar.
Hi ha països bastant
permissius com
Espanya, el Regne
Unit, Suècia, Bèlgica o
Austràlia; i altres que
prohibeixen l’ús i
derivació de ESC com
Alemanya, Itàlia,
Dinamarca o Polònia.
Cèl·lules mare i Parkinson Autor: Julián Bobis Camacho
18
A l’Estat espanyol, s’han publicat un seguit de lleis estatals recollides al BOE o
reials decrets que les regulen. Les més importants són:
- Reial Decret del 2011: regula l’autorització i funcionament dels biobancs per a la
investigació biomèdica amb mostres d’origen humà. Es crea el Registro Nacional
de Biobancos. Permet el desenvolupament de línies cel·lulars al país i el seu
emmagatzematge o ús en investigacions amb fins teòrics o terapèutics.
- Llei 14 del 2007: sobre la investigació biomèdica. Reglamenta la creació
d’investigacions amb cèl·lules mare i embrions.
- Llei 45/2003: llei que permet l’ús d’embrions per a investigació, amb prèvia
informació dels progenitors. Aquesta llei va ser modificada al 2006 (Ley 14/2006,
sobre les tècniques de reproducció assistida).
A Catalunya, la Generalitat té competències en matèria d’investigació, per la qual
també hi ha una llei específica que regula les investigacions, mitjançant els
comitès d’ètica d’investigació clínica (Decret 406/2006). Per tant, en el moment
d’iniciar una investigació o fase preclínica i clínica, cal posar-se en contacte amb
un comitè de bioètica.
Però a part de les lleis i decrets dels governs, entra en escena l’ètica de la
societat, majoritàriament amb influència de l’Església.
Des del punt de vista religiós cristià, l’ús d’ESC és moralment incorrecte perquè
constitueix la destrucció d’un ésser humà (ja es considera ésser humà des del
moment de gestació); però no s’oposen a l’ús de cèl·lules mare adultes o del
cordo umbilical com a tractament.
Des del punt de vista jueu, la investigació amb ESC està permesa i encoratjada.
Israel, per exemple, permet les investigacions amb ESC.
A banda de les idees religioses, l’ètica pròpia de la societat és important. Sobretot
influeix en el pensament si la persona considera que l’embrió del qual s’extreuen
les ESC és un ésser humà amb tots els drets d’un adult o només un de potencial.
La clonació també té controvèrsies, perquè es pot considerar que s’utilitza l’humà
com a objecte i per fer clonació reproductiva (fet prohibit a Espanya).
Cèl·lules mare i Parkinson Autor: Julián Bobis Camacho
19
2.2. Malaltia del Parkinson
2.2.1. Què és el Parkinson?
El Parkinson és una malaltia neurodegenerativa, és a dir, una malaltia que afecta
a les neurones i que causa en ells una pèrdua progressiva de la seva funció o la
mort.
Afecta les neurones del cervell, concretament de la substància negra, a l’interior
d’aquest, provocant la disminució del neurotransmissor dopamina. Aquest
neurotransmissor és essencial en el moviment del cos, per això, uns dels
símptomes més coneguts del Parkinson és la tremolor i la lentitud, encara que es
manifesten altres símptomes perquè hi ha altres neurotransmissors afectats.
Tant homes com dones la pateixen i, normalment, apareix a partir dels 55 anys,
tot i que hi ha casos de Parkinson abans dels 40.
És la segona malaltia neurodegenerativa en nombre de malalts després de
d’Alzheimer. Es calcula que hi ha uns 150000 malalts de Parkinson a Espanya, i
uns 6,3 milions a tot el món.
El Parkinson s’expressa de manera diferent en cada persona, per això els
tractaments que es fan són personalitzats i segons els transcurs de la malaltia
perquè no hi ha cap factor que ens predigui el seu curs.
Els símptomes del Parkinson són molt nombrosos, però no tots els pacients
desenvolupen tots i sempre amb graus diferents. Els símptomes motors són:
Tremolor: és un dels signes més evidents del Parkinson. És una tremolor de
repòs, en el moment que no es fa cap feina o moviment. Normalment, comença
en una de les extremitats i s’estén a la resta del cos quan avança la malaltia.
Bradicinèsia: és la lentitud alhora de fer moviments. Els malalts de Parkinson
necessiten més temps per fer un gest i és més ampli. Es pot veure reflectit en
l’escriptura, que es fa més petita. També causa el caminar típic parkinsonià: una
marxa lenta, amb passos curts i sense balancejar els braços.
Rigidesa: és una de les conseqüència però al mateix temps causa de la resta. Els
músculs estan tensos tota l’estona. Això produeix l’amplitud dels moviments,
dificultat per fer-los, dolors i menys expressivitat facial.
Inestabilitat en la posició: es manifesta sobretot quan la malaltia ha avançat. Els
malalts tenen una postura encorbada, el que fa més propens el desequilibri.
Cèl·lules mare i Parkinson Autor: Julián Bobis Camacho
20
Els símptomes no motors són:
Trastorns del son: és molt freqüent l’insomni i les alteracions del cicle vigília-son.
Pensament i memòria: poden presentar lentitud en el pensament i canvis en la
memòria i la concentració. El deteriorament cognitiu afecta a les àrees del cervell
que controlen les funcions executives i atenció, i no tant la memòria com
l’Alzheimer.
Psiquiatria: es poden manifestar alteracions de l’estat d’ànim, com depressió,
al·lucinacions, no control sobre els impulsos o realitzar una feina una i altra
vegada, entre d’altres.
A vegades, també es pot presentar en el pacient: estrenyiment, sudoració, pèrdua
d’olfacte, fatiga i problemes en la parla i la deglució.
Cal insistir en el fet que tots aquests símptomes no s’expressen ni a la vegada ni
en la mateixa persona. El Parkinson es manifesta de manera diferent i amb
símptomes diferents, apareixent-ne d’uns i no d’altres, i en graus diferents.
El Parkinson es diagnostica de manera clínica, en base a la història clínica i una
exploració neurològica i física, i segons la presència o no de símptomes (han
d’aparèixer tres dels quatre símptomes motors); ja que no existeixen proves
específiques per al Parkinson i que el confirmin al 100%.
Un neuròleg, normalment és ell qui fa la diagnosi, pot demanar proves com
anàlisi, TACs i proves neurològiques, que descarten altres malalties del cervell i
confirmen el Parkinson.
La diagnosi es veu complicada per altres afeccions com la malaltia per cossos de
Lewy, l’atrofia multisistemàtica o només l’envelliment, que també causen
parkinsonismes però no són Parkinson.
Algunes empreses ofereixen la possibilitat de seqüenciar els gens que s’han
descobert relacionats amb el Parkinson però no determinen el desenvolupament
del Parkinson en el futur. La proba més habitual és sotmetre al pacient duran 30
dies a Levodopa (el medicament bàsic per al Parkinson) i, si respon
afirmativament, se l’hi diagnostica.
Cèl·lules mare i Parkinson Autor: Julián Bobis Camacho
21
Patologia
La característica cel·lular principal del Parkinson és la mort de neurones en la
pars compacta, una àrea de la substància negra (interior del cervell) on es troben
les neurones dopaminèrgiques (neurones que utilitzen la dopamina com a
neurotransmissor principal).
L’àrea cerebral afectada majoritàriament pel Parkinson és el gangli basal.
El Parkinson es caracteritza per la pèrdua de neuromelanina, un pigment present
a les neurones del gangli basal, i la presència de cossos de Lewy a l’interior de les
neurones que no han mort.
La mort de neurones, a més, va acompanyada de la mort d’astròcits i l’activació
de micròglies, un tipus de cèl·lula glials.
La dopamina, neurotransmissor molt reduït al Parkinson, intervé en el moviment
de forma que té un efecte inhibitori, és a dir, permet o impedeix la realització de
certs moviments segons la voluntat de la persona. Com que en la malaltia del
Parkinson els seus nivells disminueixen, augmenten els moviments involuntaris,
disminueix el control sobre ells i es redueix el moviment voluntari global o costa
més esforç.
La disminució de la dopamina està causada per aquesta mort de les neurones de
la substància negra. A més, la mort de neurones afecta totes les connexions del
gangli basal amb la resta del cervell: el circuit motor, l’oculomotor, l’associatiu, el
límbic i l’orbito frontal.
Aquest fet explica els símptomes del Parkinson, ja que són àrees implicades per
exemple en el moviment, aprenentatge i atenció.
La mort de les neurones es pensa que pot estar relacionada amb l’aparició dels
cossos de Lewy.
Els cossos de Lewy són una acumulació anormal de la proteïna alfa-sinucleïna,
que al ser insoluble i no degradar-se de forma normal, s’acumula dins la neurona.
Aquestes acumulacions, primer, es formen en altres àrees del cervell com la que
regula l’olfacte, per després estendre’s al gangli basal. Però encara no s’ha provat
la relació directa entre el Parkinson, la mort de neurones que succeeix i l’aparició
dels cossos de Lewy.
Cèl·lules mare i Parkinson Autor: Julián Bobis Camacho
22
Es pensa que la mort neuronal pot ser conseqüència de un incorrecte
funcionament de les proteases (enzims que degraden les proteïnes innecessàries)
i els lisosomes, i una reducció de l’activitat dels mitocondris, causant així
l’acumulació de substàncies perjudicials per la neurona i disminuint l’energia per
fer les funcions vitals.
També s’ha observat que s’hi manifesta estrès oxidatiu, és a dir, es produeix un
desequilibri en la naturalesa reductora de la cèl·lula. Així, es formen peròxids i
radicals lliures que danyen molts components cel·lulars imprescindibles, com
l’ADN, proteïnes i lípids, que la cèl·lula (en aquest cas neurona) no pot reparar
perquè es produeixen amb molta velocitat. Finalment, la neurona pot morir per
apoptosi o per necrosi, en els casos més greus.
El nucli de les neurones, al estar estressat, desenvolupa formes no usuals i la
membrana nuclear es deforma. Això pot causar problemes en la síntesi de
proteïnes, al material genètic i al pas de substàncies per la membrana. Encara es
desconeixen les raons d’aquesta deformació (mutacions, factors externs...).
Cal esmentar de nou que els mecanismes que causen la mort de les neurones
dopaminèrgiques i l’aparició dels cossos de Lewy no es coneixen i tot això són
possibles explicacions.
2.2.2. Història del Parkinson
Abans de la descripció detallada de James Parkinson al 1817, la malaltia del
Parkinson ja era coneguda. En trobem referències a la Bíblia, a papirs egipcis i a
un tractat mèdic indi de l’any 1000 aC. Galè de Pèrgam ja va distingir entre el
tremor voluntari i el de repòs causat pel Parkinson.
No és fins el segle XVII que es reprèn el Parkinson, amb comentaris sobre els
efectes del Parkinson (sobretot el tremolor en les mans) però mai descrivint-lo
totalment o buscant les causes.
Al 1817, el metge anglès James L. Parkinson va descriure la malaltia del
Parkinson de manera acurada i amb casos particulars en el seu document An
essay on the shacking palsy.
Cèl·lules mare i Parkinson Autor: Julián Bobis Camacho
23
Hi va explicar el tremor característica en el repòs, la postura corbada al caminar,
la pèrdua de força muscular i la progressió del pacient al llarg de la malaltia en sis
casos concrets. Pensava que aquesta tremolor estava causada per danys en la
medul·la espinal cervical.
Al segle XIX també va destacar Jean-Martin Charcot, metge els estudis del qual
van diferenciar entre rigidesa, feblesa muscular i la lentitud al fer el moviments
(bradicinèsia), i va canviar el nom de la malaltia per Parkinson en honor de James
Parkinson.
Al 1912, Frederic Lewy va descobrir unes acumulacions patològiques en cervells
de pacients afectats, que un temps després serien anomenades cossos de Lewy i
al 1998 es descobrirà que estan compostos majoritàriament de alfa-sinucleïna,
una proteïna.
A la dècada dels 30, es va trobar que la substància negra del cervell era la part
més afectada en aquest, i a la dècada dels 50, gràcies en part al treball d’Arvid
Carlsson (que va guanyar el Nobel per això), es van descriure els canvis
bioquímics en el Parkinson i en la dopamina.
Al 1995, un grup nord-americà d’investigació va reportar que la primera mutació
que causava Parkinson al gen PARK1 i que afectava a la proteïna alfa-sinucleïna.
Al llarg de la primera dècada del segle XXI es van descriure les diferents
mutacions relacionades amb l’aparició dels cossos de Lewy i la pèrdua neuronal i,
per tant, relacionades amb el desenvolupament del Parkinson. També es
coneixeren més detalls sobre la reducció de les connexions sinàptiques entre
neurones i la neurodegeneració a causa d’agregats minúsculs d’alfa-sinucleïna.
Últimament, s’han realitzat proves clíniques per aplicar la teràpia gènica a malalts
de Parkinson. Tot i ser eficaces en models animals i in vitro, en el moment de
realitzar l’assaig clínic no mostraven ser eficients i no aportaven una millora.
Aquest és un problema que s’ha de sobrepassar si es vol aplicar teràpies
correctives a pacients de Parkinson.
Cèl·lules mare i Parkinson Autor: Julián Bobis Camacho
24
2.2.3. Causes
Poc es sap sobre les causes de la malaltia del Parkinson, com ja que he indicat
en l’apartat anterior. Tot i això, múltiples fets han estat descoberts, aportant llum
en el problema.
Es creu que alguns factors genètics (mutacions i gens), l’envelliment, l’estrès
oxidatiu i l’ambient intervenen en el Parkinson. Els pacients no presenten una
causa clara que la produeixi, només en alguns es manifesten o s’hi troben els
gens que la generen en molts casos. És un grau molt petit, però, únicament un 5-
10% dels malalts.
Els gens que es pensa que intervenen en el Parkinson són: SNCA, que codifica
per la alfa-sinucleïna (que forma els cossos de Lewy ja explicats), PKRN, que
codifica per la parkina, i el PARK8, per el LRRK2 o dardarina, un enzim present al
citoplasma i la membrana mitocondrial externa principalment de neurones i que
constitueix la principal causa genètica del Parkinson.
La duplicació o triplicació del locus on es situa el gen SNCA o la modificació d’un
sol nucleòtid poden donar lloc a Parkinson de tipus hereditari. Ha estat trobat en
persones portadores que no han patit Parkinson, per la qual cosa, fa pensar que
la seva relació és incompleta i que no depèn de l’edat. La mutació en el LRRK2
és la major causa de Parkinson genètic i esporàdic (5% i 3%, respectivament).
Les seves modificacions poden causar disfunció del mitocondri i aparició de
Parkinson en el portador.
L’envelliment també és un element a tenir en compte. És un clar factor de risc en
el Parkinson perquè, juntament amb l’augment de l’edat, augmenta la prevalença
de Parkinson.
Els factors ambientals i toxines, com metalls, pesticides i altres elements al medi
poden afavorir el desenvolupament de la malaltia. Hi ha aminoàcids, trobat en
peixos, aigua potable i platges o rius contaminats, i pesticides que podrien ser
factors que predisposen l’aparició, causant una errònia agregació proteica, el que
desembocaria en la formació dels cossos de Lewy, o mutacions en el genoma.
L’origen del Parkinson és encara incert però tot indica cap al camí de la interacció
entre causes genètiques i factors de l’entorn. Aquesta relació complicaria el
diagnosi del Parkinson per la quantitat de proves necessàries.
Cèl·lules mare i Parkinson Autor: Julián Bobis Camacho
25
2.2.4. Tractaments
El tractament del Parkinson hauria de ser un tractament neuroprotector i que
evités la pèrdua de neurones millorant la progressió de la malaltia. Fins el
moment, però, cap tractament ha demostrat un efecte neuroprotector, sinó que la
majoria actuen per contrarestar els símptomes.
Les teràpies neuroprotectores no es desenvolupen a causa de la baixa
comprensió del funcionament del Parkinson, la falta de models animals, que no
reprodueixen exactament la malaltia però sí ajuden a entendre el seu
funcionament, i marcadors biològics acurats, i mals resultats en els assajos
clínics, al ser focs sensibles i específics.
2.2.4.1. Fàrmacs
El principal medicament que es subministra als pacients és la levodopa, un fàrmac
que actua contra la rigidesa, el tremor i la lentitud dels moviments. Quan arriba a
les neurones dopaminèrgiques, es transforma en dopamina per a utilitzar-se com
a neurotransmissor.
Els seus efectes secundaris són pocs, per això és un medicament bastant efectiu,
sobretot en les etapes inicials de la malaltia. Quan aquesta ja està més avançada,
la levodopa és contraproductiva: augmenten els moviments involuntaris i els
períodes on-off ( moments on els símptomes milloren però seguidament es passa
a una etapa de símptomes més intensos).Per evitar aquestes fluctuacions la dosi
de levodopa és la més baixa ideal per reduir els símptomes motors.
A vegades es subministra amb la infusió intestinal contínua. És una bomba
d’infusió que introdueix un gel format per levodopa i carbidopa (una altre fàrmac
utilitzat en el Parkinson) directament a l’intestí. Substitueix la medicació oral i
redueix els períodes on-off, i no té límit d’edat per a implantar-se.
Altres fàrmacs importants són:
La amantadina: un antigripal que disminueix els símptomes motors per a etapes
inicials.
Els agonistes dopaminèrgics: fàrmacs que provoquen reaccions similars a les de
la dopamina (substituents de la levodopa) i tenen una vida útil més llarga que
aquesta, tot i que són menys eficaços.
Cèl·lules mare i Parkinson Autor: Julián Bobis Camacho
26
Els inhibidors de la MAO-B: incrementen els nivells de dopamina reduint la seva
metabolització, tenen bons resultats i disminueixen la quantitat de levodopa
necessària, però tenen més efectes secundaris i són menys efectius.
2.2.4.2. Tractaments no farmacològics
Principalment són intervencions quirúrgiques, però pocs pacients de Parkinson
són candidats per a aquestes intervencions degut a la seva complicació i els
riscos que comporten.
La estimulació cranial profunda és la implantació d’uns elèctrodes al cervell per
donar descàrregues elèctriques i modular els símptomes motors del Parkinson.
Aquests elèctrodes estan connectats a un neuroestimulador situat al tòrax i reben
l’estimulació amb extensions sota la pell fins el cap. Normalment, s’utilitza en
casos amb períodes prolongats d’off i si són pacients menors de 70 anys sense
contraindicacions.
A banda de tractaments quirúrgics hi ha un seguit de teràpies que estan en vies
de desenvolupament: són el trasplantament neuronal, tractaments
neuroprotectors i teràpia gènica.
També s’investiguen tractaments neuroprotector que protegeixen les neurones
dopaminèrgiques de la degeneració i mort a través de fàrmacs o molècules. En
aquest moments no hi ha cap substància neuroprotectora que actuï contra el
Parkinson.
Finalment, la teràpia gènica té com a objectiu corregir les mutacions relacionades
amb el desenvolupament del Parkinson, introduint els gens correctes per
modificar-ne l’expressió. Utilitza virus no integratius per inserir el gen en les
neurones i produir una enzima que protegeix el cervell de la degeneració i dels
símptomes. Es troba sota investigació en aquest moments.
2.2.4.3. Altres tractaments
Els malalts de Parkinson també realitzen teràpies rehabilitadores per alleujar els
símptomes i les seves conseqüències. No curen la malaltia, però milloren les
condicions de vida dels pacients, que aconsegueixen més autonomia.
Cèl·lules mare i Parkinson Autor: Julián Bobis Camacho
27
La fisioteràpia juntament amb exercici físic diari milloren la mobilitat i l’equilibri,
dues facultats afectades en el Parkinson. Poden retardar els símptomes motors i
altres com les alteracions del somni.
La logoteràpia té com a objectiu millorar la parla i la deglució dels pacients, ja que
totes dues es veuen afectades per la rigidesa muscular. Sol estar composta
d’exercicis respiratoris, dels músculs facials, sobre la veu i la laringe.
Entre altres teràpies trobem: l’estimulació cognitiva, la musicoteràpia (estimular el
moviment, la flexibilitat i la psicologia a través de la música), la teràpia
ocupacionals, risoteràpia...
Cèl·lules mare i Parkinson Autor: Julián Bobis Camacho
28
2.3. Malaltia del Parkinson i cèl·lules mare
La pèrdua de neurones a les substància negra del cervell és una de les
característiques de la malaltia del Parkinson. Aquesta neurodegeneració provoca
els símptomes motors i no motors de la malaltia, tot i que se’n desconeixen
encara els motius i perquè progressa al llarg del Parkinson.
Una de les línies d’investigació per tractar aquesta pèrdua neuronal és la
substitució amb neurones dopaminèrgiques foranies.
El trasplantament neuronal ja es va iniciar a la dècada dels 80. Els primers
assajos van mostrar que tenien un benefici en la producció de dopamina, però
estudis posteriors van demostrar que les noves neurones produïen massa
dopamina, cosa que conduïa a contraccions involuntàries dels músculs o no
tenien efectes a llarg termini.
Actualment, s’està dirigint la investigació cap a les cèl·lules mare. Aquestes, per la
capacitat de generar tots el tipus cel·lulars i dividir-se, podrien ser una solució per
a la mort neuronal.
Algunes proves, consistents en trasplantar cèl·lules mare diferenciades a cèl·lules
dopaminèrgiques en cervells de ratolins i primats, han mostrat que les cèl·lules
trasplantades sobrevivien i milloraven els símptomes sense efectes secundaris.
Malgrat aquesta esperançadora descoberta, l’ús de cèl·lules mare presenta
diferents problemàtiques.
D’una banda, existeix el risc de desenvolupar teratomes per una divisió
descontrolada, el tractament del quan es faria molt difícil per la posició de la
substància negra en el cervell (massa interior per fer cirurgia).
D’altra banda, obtenir cèl·lules dopaminèrgiques a partir de cèl·lules mare és un
camí llarg i costós, i que podrien provocar rebuig immunitari. Per aquests motius,
es treballa amb iPSC que evitarien el rebuig del pacient al ser cèl·lules de la
persona, i tenen totes les característiques de les ESC.
A més, hi ha substàncies tòxiques, que formen els cossos de Lewy i els agregats
de proteïnes, que són emeses per les neurones a l’espai intercel·lular i són
captades per les altres neurones, per tant, passen d’una neurona a l’altra.
Cèl·lules mare i Parkinson Autor: Julián Bobis Camacho
29
Així, a causa d’aquesta transmissió de molècules tòxiques, la implantació de
noves neurones es veuria afectada i no tindria efectes en la malaltia.
Per implantar cèl·lules mare diferenciades que milloressin la progressió de la
malaltia, es fa necessari conèixer els mecanismes que desencadenen la malaltia
per tal de corregir-los i donar lloc a una neurona sana i funcional. Cal saber les
mutacions o les raons genètiques que la provoquen i així corregir-les amb la
teràpia gènica.
Les cèl·lules mare s’utilitzen, també, com a model del Parkinson, sobretot les
iPSC perquè contenen els gens o “errors” que causen la malaltia i permeten
l’estudi in vitro de les proteïnes que intervenen visualitzant-hi la progressió.
Objectius e hipòtesis del treball pràctic de recerca: Cèl·lules mare i
Parkinson
Arribats a aquest punt, una vegada desenvolupada la part teòrica del meu Treball
de Recerca amb els coneixements necessaris sobre cèl·lules mare i la malaltia de
Parkinson (exposats als apartats anteriors), començaré el meu treball pràctic de
recerca Cèl·lules mare i Parkinson.
Els interrogants que em plantejo són: - Les cèl·lules mare, amb les seves
característiques, podrien ser una solució per a la mort neuronal?; - El
trasplantament de cèl·lules dopaminèrgiques en cervells permetria millorar els
símptomes del Parkinson?; - Coneixem els mecanismes que desencadenen la
malaltia per tal de corregir-los i donar lloc a una neurona sana i funcional, a través
de la teràpia gènica o la cel·lular?
A partir d’aquests interrogants, vull arribar a l’objectiu principal que és determinar
si la medecina regenerativa, ús de cèl·lules mare, majoritàriament, és una
solució per al Parkinson i esbrinar si la reprogramació (tornar a ser cèl·lules
mare) de cèl·lules d’un malalt de Parkinson pot generar neurones sanes, és a
dir, utilitzant cèl·lules mare i modificant els gens que provoquen el Parkinson amb
la teràpia gènica.
Cèl·lules mare i Parkinson Autor: Julián Bobis Camacho
30
Les hipòtesis del meu treball, doncs, són:
1. La teràpia cel·lular ajuda a millorar la qualitat de vida de les persones
que pateixen Parkinson.
2. Pot ser que la teràpia cel·lular sigui segura per a aplicar a persones
sense efectes secundaris.
3. És difícil tractar amb cèl·lules mare i les seves tècniques.
4. Pot ser que Catalunya, en el conjunt del món, sigui un focus important
d’investigació sobre cèl·lules mare.
5. És necessari continuar la investigació sobre cèl·lules mare i malalties
neurodegeneratives.
Per trobar les respostes m’he plantejat com a treball de camp l’estada al CMRB i
la realització de dues entrevistes. Amb l’estada espero trobar la resposta a les
hipòtesis relacionades amb les cèl·lules mare, és a dir, la número 1 (“la teràpia
cel·lular ajuda a millorar la qualitat de vida dels pacients de Parkinson), la número
2 (“pot ser que la teràpia cel·lular sigui segura per aplicar a persones”), la número
3 (“és difícil tractar amb cèl·lules mare”) i la número 5 ( és necessari continuar la
investigació sobre cèl·lules mare”). Amb les dues entrevistes vull respondre a la
primera, la quarta (“pot ser que Catalunya sigui un focus important d’investigació) i
la cinquena hipòtesi.
A continuació detallaré les experiències.
L’autor d’aquest Treball realitzant uns talls d’una mostra amb volum en el CMRB
Cèl·lules mare i Parkinson Autor: Julián Bobis Camacho
31
3. Treball de camp
3.1 Estada al CMRB
Entre els dies 8 i 11 de juliol del 2014 des de les 9 del matí a les 6 de la tarda,
vaig realitzar una estada al CMRB (Centre de Medicina Regenerativa de
Barcelona), juntament només amb altra estudiant de Batxillerat de Barcelona.
Aquestes pràctiques les vaig buscar per tal de donar resposta a algunes de les
hipòtesis que he plantejat, però també pel meu interès en les cèl·lules mare, per
tenir una experiència pràctica sobre el tema i conèixer el món de la investigació.
Les vaig aconseguir arran de la meva visita a les portes obertes del PRRB dins de
la celebració de les 48h Open House Barcelona. Vaig contactar amb la
responsable de comunicació del Parc de Recerca i ella em va posar en contacte
amb el CMRB, els quals em van oferir la possibilitat de realitzar uns dies de
pràctiques i d’observació al centre.
El CMRB és un centre de recerca dedicat a la investigació amb cèl·lules mare
humanes i models animals capaços de regenerar òrgans, tal i com el peix zebra.
Es va fundar al 2004 per tal d’aprofundir en el coneixement del desenvolupament
embrionari i les aplicacions de les cèl·lules mare a la medicina regenerativa. El
CMRB es troba dins del PRBB (Parc de Recerca Biomèdica de Barcelona), al
costat de l’Hospital del Mar, i es divideix en Centre d’Investigació, Banc de Línies
Cel·lulars i Plataforma Tècnica (Core Facility).
Durant la meva estada al CMRB vaig conèixer el centre i vaig poder veure de
primera mà la feina dels investigadors. Concretament, vaig efectuar l’estada al
Core Facility, una plataforma del CMRB que dóna serveis a la resta
d’investigadors del centre. Està formada per les unitats de ratolins, peixos, cultius
cel·lulars, histologia, microscòpia òptica, microscòpia electrònica, citometria i
biologia molecular.
En el transcurs de la setmana, em van atendre la directora del Core Facility, Sra.
Mercè Martí, i els responsables i tècnics especialitzats de cada unitat: Bernd
Kuebler i Laia Miquel, a cultius; Cristina Morera, Lola Mulero i Cristina Pardo, a
histologia i bioimatge.
Cèl·lules mare i Parkinson Autor: Julián Bobis Camacho
32
L’estada va consistir en fer diferents procediments i protocols específics
d’aquestes unitats, relacionats amb el manteniment, la diferenciació i la
caracterització de les cèl·lules mare.
En cada unitat, el responsable explicava el funcionament del departament i els
principals serveis que ofereixen al CMRB i al PRBB, a més d’una explicació de la
pràctica a realitzar en el departament en qüestió.
Ara a continuació recolliré tant l’aprenentatge teòric com les pràctiques
realitzades, les fotografies de les quals les vaig prendre jo mateix.
3.1.1 Conceptes teòrics adquirits
Durant la meva estada al PRBB vaig adquirir una sèrie de nocions relacionades
amb les pràctiques que anava realitzant que ajuden a poder entendre aquests
procediments i a realitzar-los correctament.
És un recull de coneixements que serveixen com a introducció a les pràctiques i
possibiliten el seu correcte anàlisi posterior.
3.1.1.1. Unitat de cultius. El cultiu in vitro de cèl·lules mare
En aquest apartat s’exposen els conceptes relacionats amb el cultiu ex vivo de
cèl·lules mare, és a dir, fora del seu medi natural en un organisme.
Introducció al concepte de cultiu cel·lular
Un cultiu cel·lular és un medi on es produeix el creixement d’unes cèl·lules sota
unes condicions determinades però fora del seu ambient natural, normalment en
un laboratori.
L’objectiu d’un cultiu cel·lular és imitar les condicions normals de temperatura,
pressió, pH... del medi habitual de la cèl·lula en qüestió i substituir els sistemes
del medi natural per processos i substàncies artificials.
Cultiu de cèl·lules mare
El cultiu de cèl·lules mare no difereix molt d’un cultiu de cèl·lules ja diferenciades
o d’altres organismes. Però hi ha una sèrie de diferències com les tècniques de
suport i les seves condicions que cal esmentar.
Cèl·lules mare i Parkinson Autor: Julián Bobis Camacho
33
En el cultiu d’una colònia de cèl·lules mare, cal tenir en compte la temperatura,
l’alimentació, el suport i el material del contenidor en que es troben, entre d’altres
variables.
En les sales de cultiu del CMRB, les cèl·lules mare es troben en unes condicions
molt controlades ja que aquestes cèl·lules són molt delicades i es poden fer malbé
(contaminar, trencar o morir) o diferenciar-se espontàniament.
Tal i com vaig veure, cada cabina on treballa el personal de cultius està formada
per: una placa de metacrilat vertical, que impedeix que la persona respiri dins
l’espai de treball, una superfície horitzontal de metall, que s’ha de netejar cada
cop que s’utilitza, i una llum ultraviolada que destrueix els possibles
microorganismes que encara queden a la taula o als aparells. A més tota persona
que entri a la sala de cultius ha de dur bata i guants, i rentar-se amb alcohol els
guants i tot allò que vagi a tocar, ja que el risc de contaminar el cultiu és elevat (jo
mateix vaig haver de fer-ho cada vegada que entrava).
Les cèl·lules mare es mantenen en cultiu sobre pous o plaques de Petri, en
incubadors tancats amb una temperatura constant de 37º C i un percentatge de
CO2 del 5%. La pressió dels laboratoris de cultius és especial: l’aire surt de dins
cap a fora per evitar que partícules de l’exterior o microorganismes entrin a la sala
i contaminin els cultius.
Un cultiu de cèl·lules de qualssevol tipus sempre s’ha de tractar amb les màximes
condicions d’esterilitat per evitar qualssevol contaminació biològica.
Suport i manteniment d’un cultiu de cèl·lules mare
Per multiplicar una colònia de cèl·lules es necessita un medi de cultiu, un líquid o
gel que doni el suport i les substàncies necessàries per a que la mostra creixi. En
el cas de les cèl·lules mare, aquest suport pot ser altres cèl·lules (cèl·lules feeder)
o un líquid anomenat matrigel. El suport s’escolleix depenent de les necessitats de
la mostra i dels resultats que es volen obtenir.
Les cèl·lules feeder són fibroblasts (cèl·lules epitelials) que proporcionen suport a
les cèl·lules mare. Les feeder es troben sobre la superfície de la placa de Petri o
d’un pou, i aconsegueixen que la colònia de cèl·lules mare creixi ja que la fixen i
l’alimenten a través de les substàncies que desprenen (proteïnes, glúcids,
lípids,etc).
Cèl·lules mare i Parkinson Autor: Julián Bobis Camacho
34
Al medi s’afegeix un factor anomenat FGF (Fibroblast Growth Factor): una
substància que manté anul·lada la capacitat d’especialitzar-se en les cèl·lules
mare i manté el seu creixement, proliferació, supervivència, migració i
diferenciació controlada. Gràcies a aquest factor les cèl·lules mare es poden
nodrir de les substàncies que produeixen els fibroblasts sense que, pel contacte,
es diferenciïn.
Les feeder poden ser humanes, HEF (human embryonic fibroblats), o de ratolins,
MEF (mouse embryonic fibroblats).
El matrigel és una matriu proteica formada per proteïnes i altres biomolècules,
pròpies de la matriu extracel·lular, que serveix com suport a les cèl·lules mare. En
aquest cas, es necessita incorporar un medi amb els nutrients i factors provinents
de les cèl·lules feeder per fer créixer les cèl·lules mare. Al CMRB fabriquen el seu
propi medi, no el compren de fora. Aquest s’anomena conditioned medium i es
fabrica a partir de les substàncies que desprenen les feeder. Així cada dia es
recull el medi de les feeder i s’afegeix al cultiu en matrigel.
Per a què les cèl·lules mare puguin créixer i dividir-se cal que el medi on es
troben, és a dir, el líquid que les envolta, contingui sals minerals, glúcids com a
font d’energia, lípids, aminoàcids, vitamines i proteïnes.
Tant el matrigel com les cèl·lules feeder s’han de renovar periòdicament. En el
cas del matrigel, perquè les substàncies del medi s’esgoten o perquè el matrigel
es degrada. En les cèl·lules feeder, perquè aquestes es degraden contaminant,
així, la colònia de cèl·lules mare. Cada dos dies, aproximadament, vaig veure com
es canviava el medi de cultiu.
En el cas de les feeder, es realitza de manera mecànica, és a dir, agafar petites
quantitats de la colònia amb una microagulla i posar-les en altre cultiu amb nou
medi. Aquest procediment per cèl·lules feeder el vaig realitzar jo mateix com a
pràctica en el transcurs del primer dia.
A més, les colònies s’han de canviar de medi per l’augment en la quantitat de
cèl·lules mare a la mostra, ja que un nombre massa elevat pot induir per contacte
a la diferenciació.
Cèl·lules mare i Parkinson Autor: Julián Bobis Camacho
35
En aquest cas cal dividir la colònia en dos o més parts (mai deixar cèl·lules
individuals perquè és més complicat que es reprodueixi) i traspassar-les a un nou
contenidor amb un suport nou. Aquest canvi de pou s’anomena passaging i es
produeix cada setmana, més o menys.
En aquest procés de passar les colònies a una nova placa s’utilitzen dos
metodologies: mecànica o enzimàtica. Amb el mètode enzimàtic s’utilitzen
enzims per tallar les connexions entre cèl·lules mare i poder dividir així la colònia.
Aquest mètode és més agressiu que la manera mecànica. La forma mecànica té
el mateix procediment que el mètode mecànic en les feeder.
Cultiu de iPSC
El cultiu de les iPSC no té moltes diferències amb el cultiu general d’una cèl·lula
mare, però té un seguit de característiques pròpies.
Les iPSC es poden mantindre en cultiu sobre feeders o sobre matrigel amb
conditioned medium.
Tot medi de cultiu, ja sigui de iPSC, ESC o altres cèl·lules ha de contenir els
nutrients per a que la colònia creixi o es mantingui viva. Normalment, aquest medi
de cultiu conté sals minerals, lípids com a font d’energia, aminoàcids, vitamines i
proteïnes.
En el cas d’un cultiu amb feeder, les substàncies indispensables per a les cèl·lules
mare les aporten aquestes, les feeders, tot i que és necessari afegir altres
substàncies com penicil·lina, per evitar agents biològics, aminoàcids no
essencials, glúcids i, molt sovint, Dulbecco’s Modified Medium, que conté una
barreja de nutrients.
També, amb freqüència, el medi de cultiu es complementa amb un sèrum
compost per albúmines i factors de creixement o inhibidors de creixement, FGF
depenen del nostre interès. Abans s’utilitzava l’anomenat sèrum fetal boví, FBS,
però des del 2004 s’utilitza més el knock out serum replacement (KSR), perquè
presenta menys complicacions i problemes com contaminacions o diferenciacions
espontànies que el FBS.
Cèl·lules mare i Parkinson Autor: Julián Bobis Camacho
36
És molt important la presència del FGF perquè les iPSC tenen una gran tendència
a diferenciar-se espontàniament. Per això és important posar inhibidors de
creixement, no només per controlar la seva divisió sinó també la seva
especialització a cèl·lules adultes.
Aquest medi de cultiu es canvia cada dos dies a través de traspassar les colònies
a un altre pou, sempre amb compte de no contaminar la mostra o danyar-la.
Els cultius de iPSC, com la resta de cultius de cèl·lules mare es mantenen en
incubadors a temperatura constant i condicions controlades.
També es controla el percentatge de confluència de les cèl·lules: quan arriben a
una confluència del 80%, s’ha de dividir la colònia en dos o més grups de cèl·lules
i es traspassen a pous o plaques de Petri diferents.
3.1.1.2. Unitat de histologia. Caracterització de cèl·lules mare
Les cèl·lules mare tenen un seguit de característiques que les fan úniques entre la
resta de cèl·lules. Per a assegurar que una cèl·lula és mare i, per tant, que té
aquestes característiques (capacitat de diferenciació, autorrenovació...) cal fer un
seguit de proves que les defineixin i en confirmin el manteniment al llarg del
temps. Aquest seguit de proves s’anomena caracterització
La caracterització d’una cèl·lula mare consta de diversos procediments:
Proves de pluripotència: procediments que, a través de substàncies
presents únicament a les cèl·lules mare, confirmen la seva naturalesa. Hi
ha dos tipus:
- Fosfatasa alcalina: enzima que es troba de manera molt abundant a la
membrana cel·lular de les cèl·lules mare. Per tant, a través de la detecció
d’aquest enzim es pot assegurar la presència de cèl·lules mare.
- Immunocitoquímica de colònies pluripotents: es confirma la presència
d’unes proteïnes específiques gràcies a l’acció d’uns anticossos que les
indiquen, a través de fluorescència.
Proves de diferenciació: mesuren la capacitat de les cèl·lules per
diferenciar-se en altres tipus cel·lular. Es classifiquen segons el lloc on es
produeixen:
Cèl·lules mare i Parkinson Autor: Julián Bobis Camacho
37
- Ex vivo o EBs: consisteix en deixar que les cèl·lules proliferin i es
divideixin en una placa o pous fins a formar els anomenats EBs (embryonic
bodies), caracteritzats per contenir les tres capes germinals en ells
mateixos. Així es demostra que les cèl·lules de les quals provenen eren
mare i que podien diferenciar-se correctament en tots els tipus cel·lulars.
- In vivo o teratoma: és molt semblant a l’anterior però en comptes de
realitzar-se en plaques de vidre, es produeix en un organisme al qual se li
han introduït les cèl·lules a estudiar. Si aquestes són pluripotents
desenvoluparan un teratoma amb les tres capes germinals.
Tant ex vivo com in vivo s’ha de fer després una immunodetecció per comprovar
que s’han obtingut les tres capes germinals.
Immunodetecció de pluripotència
L’objectiu d’aquesta prova és determinar si les cèl·lules són pluripotents.
Per fer aquesta prova, s’utilitzen anticossos que s’adhereixen a proteïnes
específiques i, amb fluorescència, permeten visualitzar la seva presència.
Per indicar la presència de les proteïnes s’utilitzen dos tipus d’anticossos: primaris
i secundaris, els quals van conjugats amb fluorocrom per, quan s’uneixin als
anticossos primaris, marquin la seva presència en el microscopi gràcies a la
fluorescència i, per tant, determinar que s’hi troba la proteïna en qüestió.
Els anticossos provenen d’espècies animals a les quals s’han injectat les
proteïnes humanes que volem trobar. El sistema immunitari de l’animal produeix
anticossos contra aquesta proteïna. Així, es recullen aquests anticossos
específics i s’empren en la immunodetecció. Els anticossos primaris estan diluïts
en un sèrum de l’espècie animal de la qual són els anticossos secundaris, per tal
de bloquejar els llocs inespecífics on es podrien adherir els secundaris.
Els anticossos primaris provenen d’espècies animals, a les quals s’han injectat les
proteïnes humanes que volem trobar. El sistema immunitari de l’animal crea
anticossos contra aquesta proteïna, que es recullen i s’utilitzen per a la
immunodetecció.
Aquesta prova es realitza en cèl·lules aïllades, ESC o iPSC.
Cèl·lules mare i Parkinson Autor: Julián Bobis Camacho
38
Caracterització de diferenciació d’un teratoma
Aquesta prova de caracterització consisteix en injectar cèl·lules que es vol
estudiar en un ratolí. Es deixen proliferar i formen un teratoma.
Un teratoma és un tipus de tumor que conté diversos teixits i tipus cel·lulars propis
de les tres capes germinals. Desenvolupa tipus cel·lulars diferents d’aquell en que
es troba envoltat.
Per això, s’utilitza un teratoma per demostrar la capacitat de diferenciació d’una
cèl·lula: permet observar els tipus cel·lulars que es desenvolupen, el procés i
assegurar que les cèl·lules embrionàries o iPSC tenen una correcta capacitat de
diferenciació.
El ratolí al qual se li injecten les cèl·lules està immunodeprimit, és a dir, que té
carències en el sistema immunitari. Gràcies a aquest fet, les defenses del ratolí no
atacaran el teratoma ni el destruiran.
Passades de 6 a 12 setmanes, s’extirpa el teratoma de l’individu i s’analitza per
veure-hi els resultats. Normalment, es fa una immunodetecció. En el cas dels
teratomes, com les mostres són grans, més que en mostres de iPSC, cal posar la
mostra en parafina i després es talla al micròtom, un aparell que produeix làmines
molt fines d’una mostra amb volum. A partir d’aquí es realitza la immunodetecció.
3.1.1.3. Unitat de bioimatge. Microscòpia i tincions
El microscopi confocal és un microscopi que
permet obtenir construccions tridimensionals
de les mostres. Això és molt útil per a
mostres amb volum, com EBs.
Està compost de dues parts: microscopi
òptic, actua com un microscopi òptic normal i
s’utilitza per enfocar el punt de la mostra que es vol estudiar i prendre la
fotografia, i de microscopi de fluorescència, capta les diferents fluorescències que
pot tenir una mostra i observar els anticossos d’una immunodetecció.
El microscopi de fluorescència es serveix d’una llum de fluorescència, que ens
ajuda a orientar-nos en el portaobjectes, i un làser.
Microscopi confocal
Cèl·lules mare i Parkinson Autor: Julián Bobis Camacho
39
Aquest últim escombra línia a línia la mostra per tenir una imatge a l’ordinador, a
més que obté fotografies tridimensionals a partir de la superposició de imatges
bidimensionals.
A més, com aquest tipus de microscopi només enfoca un pla de la mostra o una
zona d’aquesta, s’obté una resolució major que si s’enfoqués la mostra sencera.
S’eliminen així els fons negres o desenfocats. Però per contra, a vegades, es
requereixen temps allargats d’exposició, el que pot provocar que la mostra es
cremi o es malmeti pel làser.
El làser passa per una sèrie de filtres fins arribar a la mostra. En aquesta, excita el
fluorocrom i fa que emeti una ona de longitud d’ona més petita que la que ha
rebut, i que es pot observar a l’ordinador.
L’ordinador utilitza el programa informàtic LAS AF per visualitzar i manipular la
mostra a la pantalla. Aquest consta de fins a quatre canals per veure els diferents
fluorocroms que hi ha a la mostra.
També vaig aprendre a utilitzar un microscopi electrònic de transmissió (TEM),
però les imatges que vaig prendre i el seu ús no aporten informació addicional per
confirmar o negar les hipòtesis.
3.1.2 Pràctiques realitzades en la Unitat de Cultius
La unitat de cultius consisteix en un conjunt de laboratoris on es produeixen els
cultius cel·lulars, és a dir, on es fan créixer les cèl·lules mare, on es fabrica el seu
medi de cultiu, on es congelen...
Seguidament explicaré dos processos que vaig observar a la unitat de cultius:
cultiu in vitro de iPSC i la diferenciació de cèl·lules mare en NPs. El primer el vaig
realitzar jo mateix, mentre que del segon només vaig realitzar les fotografies i les
conclusions, ja que el procediment l’havia realitzat el responsable de la unitat de
cultius, Bernd Kuebler.
Cèl·lules mare i Parkinson Autor: Julián Bobis Camacho
40
3.1.2.1. Canvi de medi de cultiu en colònies de iPSC
El canvi de medi d’un cultiu és un procediment molt comú en la unitat de cultius.
En el meu cas es tractava d’un cultiu de iPSC sobre feeders, el qual, al cap de
quatre dies, vaig observar en un microscopi òptic per confirmar si la colònia
s’havia adherit a les feeders.
Aquest procediment consisteix en traspassar cèl·lules mare d’un pou de cultiu a
un altre per canviar-les de medi.
Procediment
Per a realitzar el canvi de medi d’un cultiu de iPSC es necessita el pou que conté
la colònia i un altre amb nou medi i feeders però que no tingui cap cultiu, és a dir,
que no hagi estat utilitzat. A més vaig emprar una lupa per observar la colònia i
seguir el procediment, guants, alcohol desinfectant i un stripper amb una
microagulla.
Vaig seguir la forma mecànica per realitzar el canvi de pou, ja que aquesta
manera és la més adient per a colònies en feeders.
Abans de començar, es neteja el lloc de treball amb desinfectant per evitar
qualssevol contaminació de la mostra. Es neteja la superfície horitzontal de metall
però també els nostres guants. És important intentar no treure les mans de la
zona de treball perquè, sinó ens hauríem de tornar a rentar els guants, per evitar,
així, possibles contaminacions. També cal treballar el més cap al fons possible
però sense arribar al final ja que com més a prop del corrent d’aire que impedeix
la entrada de microorganismes o partícules, més risc de contaminació hi ha.
Després, es posa el pou amb la colònia a la lupa i es troba un grup de iPSC.
S’agafa l’stripper i, amb molt de compte i sense tocar el fons ni els costats del pou
amb la microagulla, es rasca suaument la superfície de la colònia però sense
arribar a treure les feeders, i es continua rascant fins que es trenca casi totalment
la colònia.
Un cop desintegrada, es treu la microagulla del pou i es pressiona l’stripper per tal
de començar a agafar les iPSC. S’introdueix la microagulla al pou i, poc a poc, es
xuclen les iPSC.
Cèl·lules mare i Parkinson Autor: Julián Bobis Camacho
41
Un cop tinguem les iPSC dins la microagulla, es traspassen lentament al nou pou.
Es fica la microagulla al medi del pou i s’alliberen les iPSC deixant d’apretar
l’stripper. Es buida varies vegades per assegurar-nos que no quedi res a la
microagulla.
Aquest procés es repeteix fins que més o menys totes les iPSC de la colònia
trencada i del pou s’hagin traspassat al nou medi.
Quan es repeteixi el procediment però amb un pou de iPSC diferent, hem de
canviar la microagulla de l’stripper per no barrejar pous diferents per precaució, ja
que podrien haver-hi contaminacions o canvis en les cèl·lules.
Després de traspassar un pou, s’observen les iPSC en el nou medi per confirmar
que estiguin allà i que no s’hagin danyat en el traspàs.
Ja acabat el procediment amb tots els pous, s’agafen els pous que contenen ara
les iPSC i s’introdueixen a l’incubador de nou per a un possible ús futur o per
repetir el procés al cap d’uns dies.
Resultats
Passats quatre dies en els quals les iPSC es van fixar a les feeders i van
proliferar, vaig observar en un microscopi òptic els resultats (figures 1 i 2) i els
vaig fotografiar.
Figura 1
La figura 1 va ser presa amb 5x. Mostra una colònia de iPSC (és la part més fosca
i amb forma de mitja lluna).
La colònia de iPSC es diferencia de les feeders perquè aquestes últimes són més
grans que una iPSC, tenen una forma més allargada i no formen conglomerats
iPSC
Cèl·lules feeders
Cèl·lules mare i Parkinson Autor: Julián Bobis Camacho
42
definits. A més a més, les colònies de iPSC tenen la característica pròpia que
tendeixen a formar formes puntegudes o amb sortides.
Figura 2
La figura 2 és una fotografia de dues colònies de iPSC a 10x.
En la figura 2 es veuen iPSC, en aquest cas dues colònies, en un cultiu de
feeders. Aquesta fotografia presenta les mateixes característiques abans
esmentades de la figura 1.
Conclusions
A través dels resultats es pot assegurar que les iPSC s’han fixat correctament a
les feeders perquè al sacsejar el pou de cultiu aquestes no es movien de la seva
posició. També cal destacar que formaren colònies ben definides i sense
incorreccions aparents.
Es confirma així que el procediment seguit ha sigut el correcte i que aquest s’ha
fet seguint els passos fidelment i amb exactitud.
Aquest procediment demostra la cura que s’ha de tenir en el moment de tractar
amb cèl·lules mare en general i totes les precaucions a prendre per evitar
qualssevol situació no desitjable, contaminació o desbaratament del pou.
També ha servit com a pràctica per treballar el cultiu de cèl·lules mare i veure les
condicions en què es troben a un laboratori i el seu funcionament natural
(creixement, proliferació, fixació...).
iPSC
Feeders
Cèl·lules mare i Parkinson Autor: Julián Bobis Camacho
43
3.1.2.2. Diferenciació de iPSC a NPs
Actualment, al CMRB s’està treballant en l’elaboració d’un protocol per obtenir
NPs (Neural Progenitors) a partir de cèl·lules mare embrionàries i iPSC.
Els NPs són cèl·lules mare multipotents amb capacitat per originar els diferents
tipus cel·lulars del teixit neuronal. La producció d’aquest tipus de cèl·lula mare
dóna molta informació sobre la generació de neurones i el desenvolupament de
la neurogènesi.
L’avantatge de la producció de NPs és que aquestes no necessiten passar per
altres fases de la diferenciació neuronal sinó que a través de factors es poden
especialitzar directament en el tipus de neurona o cèl·lula del sistema nerviós que
volem. A més tampoc cal que es formin a partir d’uns conglomerats de cèl·lules
mare, anomenats neural rosetes per la forma, sinó que s’originen directament des
de les iPSC seguint un procediment específic. Igualment, mantenen la seva
capacitat d’autorenovació i diferenciació.
El procés per generar-les i els resultats del procediment són extrets del document
Efficient and Rapid Derivation of Primitive Neural Stem Cells and Generation of
Brain Subtype Neurons From Human Pluripotent Stem Cells.
Les fotografies (figures 3 i 4) van ser obtingudes per mi mateix a partir dels
resultats obtinguts per Bernd Kuebler de la unitat de cultius del CMRB en el seu
protocol.
Procediment
Abans de començar la diferenciació a NPs, les colònies de iPSC es divideixen en
grups i es situen en nous pous cada tres o cinc dies quan arriben a un
percentatge de cèl·lules en la mostra superior al 70% de confluència.
Tant les colònies cultivades amb feeders i aquelles sense es divideixen en sis
parts de 20000 o 25000 cèl·lules per cm², que es posen en sis pous amb el mateix
tipus de cultiu en el qual es trobaven.
Unes 24 hores després d’aquest pas, es substitueix el medi de cultiu per Gibco
PSC Neural Induction Medium, un medi que indueix, pel seus components, a la
especialització en cèl·lules mare neuronals. Aquest medi permet obtenir més
cèl·lules mare neurals de les que s’obtenien abans amb altres mètodes, a més de
que s’originen més ràpidament.
Cèl·lules mare i Parkinson Autor: Julián Bobis Camacho
44
Durant quatre dies, aquest medi es canvia una vegada al dia. Després del quart
dia, el medi es canvia quan les cèl·lules arriben a una confluència elevada.
Al setè dia ja s’obtenen cèl·lules mare neurals primitives. Aquestes se separen en
grups de 0,5-100000 cèl·lules per cm² de manera enzimàtica i es traspassen a
plaques que contenen un medi específic per expandir i induir a la diferenciació en
cèl·lules mare neurals. El medi es canvia cada dia fins arribar a cinc dies. En
aquest moment, s’obté una quantitat considerable de NPs, que tenen la capacitat
d’autorenovar-se i especialitzar-se en neurones i cèl·lules del sistema nerviós.
En les fotografies anteriors, realitzades en un microscopi òptic amb un augment de 10x i 20x respectivament,
les NPs correspondrien a les zones amb més volum o més pronunciades. En la segona imatge es poden
veure línies als conglomerats que serien les dendrites i els axons dels NPs que ja estan adquirint una forma
semblant a la d’una neurona.
Les cèl·lules mare neurals primitives que no s’han diferenciat en NPs es
criocongelen amb el medi en el qual es trobaven.
Per confirmar les característiques de les NPs, van induir a la diferenciació
d’aquestes en neurones dopaminèrgiques. Les cèl·lules mare neurals primitives
que es van criocongelar, es posen en plaques de 400000 cèl·lules per cm² en
Neural Induction Medium. Al dia següent, el medi de cultiu es canvia amb
Neurobasal medium, que indueix a la diferenciació en neurones dopaminèrgiques,
aminoàcids i FGF. Aquesta situació es manté durant deu dies reemplaçant el
medi de les cèl·lules que s’estan diferenciant cada dos dies.
Al desè dia es divideix la colònia de cèl·lules amb enzims i es traspassen a un pou
amb medi similar al anterior amb àcid ascòrbic i factors cerebrals, per assegurar
la maduració a neurones dopaminèrgiques.
Cèl·lules mare i Parkinson Autor: Julián Bobis Camacho
45
Resultats
Després d’acabar el procediment, sempre és necessari fer una inmunodetecció
per anticossos.
En la mostra que vaig observar, les cèl·lules expressaven el marcador PAX6, una
proteïna situada al nucli de les NPC (figura3). Aquest fet indica que les cèl·lules
de la mostra expressen els factors de les NPs i, en conseqüència, que són
cèl·lules mare neurals (es correspondrien als nuclis més brillants de color verd en
la figura 3).
En la figura 3 (veure annex) també podem observar els nuclis de totes les
cèl·lules de la mostra amb el marcador DAPI, un factor que s’expressa en tots els
nuclis de les cèl·lules i mostra la seva ubicació. Aquest s’uneix a regions de l’ADN
riques en adenina i timina. Per tant, revela la ubicació dels nuclis de les cèl·lules
(lloc on es troba l’ADN cel·lular).
En l’última imatge de la figura 3, es pot veure una superposició de les dues
primeres imatges.
A més a més de l’expressió de PAX6 també vaig estudiar la presència de l’anticòs
anti-SOX2 que marca la presència de SOX2, una proteïna pròpia de les NPs.
Tal i com es pot veure en la figura 4, a més del DAPI es manifesta el marcador
neural SOX2; per la qual cosa ens assegura encara més que a la mostra hi ha
cèl·lules mare neurals.
També es va realitzar una inmunodetecció per la proteïna SOX1), però en aquest
cas, no es va mostrar perquè el marcador no es va expressar i la imatge en el
microscopi confocal era totalment negra.
Conclusions
A partir dels resultats, es poden treure varies conclusions:
Les cèl·lules de la mostra estudiada, després d’haver fet la
inmunodetecció, són cèl·lules mare neurals, perquè expressen els
marcadors neuronals PAX6 i SOX2 (encara que no es manifesti SOX1).
Són cèl·lules mare perquè es mostra la presència de les proteïnes ja
esmentades. Per confirmar del tot aquesta afirmació caldria diferenciar-les
en neurones i altres cèl·lules del sistema nerviós per provar la seva
capacitat de renovar-se i especialitzar-se.
Cèl·lules mare i Parkinson Autor: Julián Bobis Camacho
46
Aquestes cèl·lules estan encaminades a produir tots els tipus cel·lulars del
sistema nerviós ja que són cèl·lules multipotents de la línea neuronal.
Aquesta pràctica confirma que es poden originar NPs in vitro a partir de iPSC i
ESC en poc temps però mantenint la seves característiques d’autorenovació i
diferenciació.
3.1.3. Pràctiques de la Unitat de Histologia i Bioimatge
Les unitats d’histologia i bioimatge són un conjunt de instal·lacions dintre del Core
Facility. Conformen unitats diferents però estan molt relacionades entre si per la
mena de serveis que donen als investigadors.
La unitat de histologia s’encarrega de realitzar proves moleculars o de teixits i les
preparacions de mostres per a la posterior observació en els microscopis o per a
investigacions.
La unitat de bioimatge ofereix serveis de microscòpia als investigadors. Aquesta
unitat té microscopis òptics, electrònics, confocals i lupes, a través dels quals,
poden donar resultats de les proves realitzades a histologia o respondre a
peticions dels investigadors relacionades amb estudis morfològics i qüestions a
petita escala o in vivo.
A la unitat de histologia vaig realitzar una inmunodetecció per anticossos d’unes
cèl·lules mare, guiat per la responsable de la unitat Lola Mulero. A bioimatge, vaig
ser atès per Cristina Pardo, Cristina Morera i Mercè Martí, responsable de tota la
plataforma. Aquí vaig fer observacions en microscopis òptics, confocals i en un
microscopi electrònic de transmissió.
Cèl·lules mare i Parkinson Autor: Julián Bobis Camacho
47
3.1.3.1. Immunodetecció de diferenciació d’un teratoma
Procediment
Abans de començar la immunodetecció, com es tractava d’un teratoma, va caldre
fixar i parafinar la mostra per poder-la convertir en làmines.
Primer de tot es realitza la fixació del teratoma en una solució al 4% de PFA
(paraformaldehid). La mostra es manté en aquesta solució a 4ºC durant la nit.
Seguidament es fan una sèrie de quatre rentats de 15 minuts cadascun en PBS
(tampó fosfat alcalí, amb les seves sigles en anglès, és una solució isotònica), i
s’identifica la mostra per posar-la en una mena de cassettes que s’introdueixen en
un processador automàtic de parafina.
Així al processador automàtic de parafina la mostra es sotmet a concentracions
creixents d’etanol i, finalment, a parafina.
El procés consistiria en:
Una hora en una solució d’etanol al 30%.
Una hora en etanol al 50%.
A una solució d’etanol al 70% durant una hora.
Una hora en etanol al 90%.
Dues hores en etanol al 96%.
Dues hores més en una solució d’etanol al 100% de concentració.
Dues hores en xilol.
I, finalment, cinc hores en parafina.
Tot aquest procés és la inclusió en parafina.
Després de la inclusió, es formen els blocs
refredant la mostra que ara està envoltada
de parafina. Es fan utilitzant un motlle
metàl·lic i la part del cassette que té el
nombre identificador. Aquests es refreden
durant, mínim, una hora.
Un cop refredat i sòlids, es tallen els blocs al micròtom de rotació i es realitzen
talls de cinc µm. Aquests talls transversals es deixen a l’estufa durant tota la nit a
37ºC.
Cèl·lules mare i Parkinson Autor: Julián Bobis Camacho
48
Els portaobjectes amb els talls dels blocs es fiquen a l’autostainer, una màquina
que s’encarrega de desparafinar i rehidratar la mostra. El procés és a la inversa
que el que té lloc al processador automàtic de parafina: xilol durant 5 minuts tres
vegades seguides, dues vegades cinc minuts en una solució d’etanol al 100% de
concentració, cinc minuts dues vegades en una solució al 96%, cinc minuts al
70% de concentració, cinc minuts al 50%, altres cinc minuts a una solució al 30%
d’etanol, i cinc minuts en aigua destil·lada.
Un cop acabada la rehidratació, s’agafen les mostres i s’introdueixen en una olla a
pressió, olla Pascal, que conté una solució de citrat amb un pH 9. Aquest pas
serveix com a desemmascarament antigènic, és a dir, recuperar els antígens que
s’uniran amb els anticossos i facilitar aquesta unió.
Finalment, es deixen temperar els talls entre deu i vint minuts a temperatura
ambient. A partir d’aquest moment es produeix la immunodetecció pròpiament
dita.
S’agafen els portaobjectes i es renten amb TBS1, un rentador, tres vegades
deixant cinc minuts de marge entre cada rentat. Després del rentats, es deixen els
portaobjectes en una solució tampó formada per TBS1 més un 0,5% de
concentració de sèrum de tritó i un 3% de sèrum d’ase. Restaran en aquesta
solució durant mitja hora.
A continuació es disposen els portaobjectes amb les mostres al bloqueig TBS++,
és a dir, en la solució que aporta els anticossos primaris per bloquejar els llocs
inespecífics. Aquesta solució conté TBS1, un 01% de sèrum de tritó i un 3% de
sèrum d’ase. També conté els anticossos primaris, la quantitat dels quals es
calcula segons la concentració que ha de tenir en la solució.
0,5 µl d’anticòs anti-ASMA provinent de ratolí.
4 µl d’anticòs anti-FOXA2 de cabra.
1 µl d’anticòs anti-AFP de conill.
0,4 µl de anti-TUJ1 provinent de ratolí.
0,2 µl de anti-GFAP de conill.
8 µl d’anticòs anti-MAP2 provinent de ratolí.
Els tres primers anticossos correspondrien al primer portaobjectes, mentre que els
tres últims s’afegiran a la mostra del segon portaobjectes.
Cèl·lules mare i Parkinson Autor: Julián Bobis Camacho
49
Cadascuna de les quantitats esmentades d’anticossos primaris s’afegeixen a
microtubs de plàstic que contenen el TBS++.
Després d’afegir-los, es disposen a la centrifugadora i es fan vibrar perquè la
solució es barregi correctament.
Sense deixar passar molt de temps, s’aboquen les solucions TBS++ amb els
anticossos als portaobjectes amb l’ajut de pipetes de la manera abans indicada i
es deixen durant 24 hores a una temperatura de 4ºC, per a què els anticossos
s’uneixin correctament.
Passades les vint-i-quatre hores, es tornen a rentar els portaobjectes amb TBS++
tres vegades deixant cinc minuts entre cada rentat.
Seguidament s’afegeix TBS++, però en aquest cas conté els anticossos
secundaris en compte dels anticossos primaris. Aquests anticossos secundaris
s’uniran específicament als anticossos primaris, que actuaran com a antígens.
D’aquesta manera en 200 µl de TBS++, s’afegeix:
1 µl d’anticòs Antimouse Cy2.
1 µl d’Antigoat Cy3.
1 µl d’Antirabbit Cy5.
2 µl d’anticòs Antimouse Cy2.
1 µl d’anticòs Antirabbit Cy3.
2 µl d’Antimouse Cy5.
Un cop els anticossos són a la solució TBS++, es centrifuguen els microtubs a la
centrifugadora i s’aboquen els seus continguts a través d’una pipeta als
portaobjectes (els tres primers anticossos corresponen a la primera mostra i els
tres últims, a la segona).
Els portaobjectes es deixen reposar durant dues hores a 37ºC per a què els
anticossos secundaris es conjuguin correctament als primaris.
Es neteja amb TBS1 tres vegades la mostra per treure els anticossos que no
s’han adherit. Hem d’esperar cinc minuts entre rentat i rentat, així fins a tres
vegades. Quan s’acaba de fer l’últim rentat, es seca una mica el portaobjectes per
sota i els costats.
Cèl·lules mare i Parkinson Autor: Julián Bobis Camacho
50
Després, amb l’ajut d’una pipeta, s’afegeix l’indicador cel·lular DAPI en
concentració 1:10000. Els portaobjectes reposaran ara durant deu minuts abans
de continuar.
L’últim pas és muntar el cobreobjectes i preparar la mostra per la seva
visualització al microscopi. Primer, es col·loca el cobreobjectes sobre la mostra
amb molt de compte de no trencar-lo i de danyar la pròpia mostra.
Després, es treu de les vores la solució en la qual es troba la mostra i es segella
el portaobjectes i el cobreobjectes amb un fixador, en el meu cas esmalt d’ungles.
Amb aquest pas s’assegura que cap de les peces del contenidor de la mostra es
mogui i danyi la mostra, ni que cap microorganisme o contaminació hi entri.
Ara, ja la mostra està preparada per ser observada al microscopi i treure’n
resultats d’ella.
Resultats
La meva mostra, un teratoma, va ser observada en un microscopi confocal per
visualitzar la fluorescència dels fluorocroms continguts en els anticossos
secundaris.
Totes les fotografies fetes del teratoma van ser preses amb un augment 20x.
Al portaobjectes número 1, la mostra contenia l’anticòs anti-ASMA per detectar
mesoderm a través de proteïnes al teixit muscular llis. També contenia els
anticossos anti-FOXA2 i anti-AFP que evidencien la presència d’endoderm.
L’anticòs anti-FOXA2 marca la presència de la proteïna FOXA2 que regula la
diferenciació de les cèl·lules cap a pàncrees i fetge; mentre que l’anticòs anti-AFP
és un marcador de teratomes i del desenvolupament embrionari del fetge i el sac
vitel·lí.
El portaobjectes 2 té els anticossos anti-TUJ1, anti-GFAP i anti-MAP2. Aquest
anticossos són específics per a ectoderm, capa germinal que es diferenciarà en la
pell i en el sistema nerviós, tant central com perifèric. El primer anticòs marca la
presència de neurones, concretament el seu citoplasma. L’anticòs anti-GFAP
mostra les cèl·lules de la glia, especialment els astròcits. La proteïna MAP2
només s’expressa en les neurones i destaca les dendrites i el soma o cos
cel·lular.
Cèl·lules mare i Parkinson Autor: Julián Bobis Camacho
51
A més a més, totes dues mostres tenien el marcador DAPI per evidenciar els
nuclis de les cèl·lules presents.
Aquesta fotografia realitzada amb un
microscopi confocal mostra el marcador
fluorescent DAPI. Es poden veure els nuclis
de totes les cèl·lules que hi ha a la mostra.
Serveix com a control per a les següents
fluorescències que mostren cèl·lules
específiques de cada capa germinal. Així,
podem veure on es troben les cèl·lules en la
mostra per comparar amb les altres
fotografies. El marcador DAPI es concentra
principalment al centre de la imatge però
també als voltants encara que menys.
La següent fotografia exposa les àrees on
està present la proteïna ASMA. Així podem
observar, en color verd, zones que
contenen cèl·lules del mesoderm,
concretament teixit muscular llis, que es pot
veure en la forma allargada de les zones i
una major intensitat de verd (correspondria
a la part central de la fotografia i la meitat
superior esquerra). Així, es pot afirmar que
en la mostra del portaobjectes 1 s’ha format
mesoderm.
Figura 5
Figura 6
Cèl·lules mare i Parkinson Autor: Julián Bobis Camacho
52
Tal i com es pot veure en la figura 7, les
àrees vermelles corresponen a les zones
amb anticòs anti-FOXA2. Les zones més
vermelles són la part superior, sobretot
l’esquerra, on es congreguen en tres o quatre
formes glandulars. Es pot extreure que el
teratoma s’ha diferenciat cap a endoderm,
perquè s’ha expressat el fluorocrom indicant
la presència de la proteïna. També es pot
saber que hi ha endoderm per la forma similar
a glàndula que desenvolupen les àrees
vermelles, una elevada concentració de cèl·lules concentrades en forma d’anell.
També vaig realitzar la immunodetecció per a la proteïna AFP, però en el moment
d’observar els resultats no es va veure l’anticòs d’aquesta proteïna expressat.
Aquesta situació podria indicar o bé que els anticossos primaris i secundaris no
s’han unit correctament o que no hi ha proteïnes AFP.
Respecte al portaobjectes 2 que també contenia una mostra del mateix teratoma
que el portaobjectes 1, els resultats van ser:
La figura 8 correspon a l’expressió
del marcador DAPI. Mostra
l’existència de cèl·lules en la
colònia i la seva ubicació per a una
posterior comparació. Així, es pot
veure com en les zones més
blaves indica una concentració
major de cèl·lules, principalment al
centre de la fotografia i al costat
dret en una franja que va des de
dalt de tot fins el cantó inferior dret.
Figura 7
Figura 8
Cèl·lules mare i Parkinson Autor: Julián Bobis Camacho
53
La següent imatge (Figura 9) és
l’expressió del fluorocrom de
l’anticòs que indica la presència
de l’anticòs anti-TUJ1 i, per tant,
de la proteïna TUJ1. Partint de la
base que la proteïna TUJ1
s’expressa al citoplasma de les
neurones i que en la imatge hi ha
fluorescència verda, es pot
concloure que la proteïna TUJ1
està present. També es conclou
que a la mostra hi ha ectoderm.
L’àrea amb ectoderm
correspondria sobretot a la part més verda de la fotografia, però hi ha neurones
per casi tota la imatge, menys a la cantonada superior dreta.
La figura 10 mostra l’anticòs
anti-GFAP. Com la proteïna
GFAP només s’expressa en
cèl·lules de la glia, en especial
a astròcits, podem afirmar que
hi ha cèl·lules de la glia i que
també hi ha ectoderm (ja que
aquestes cèl·lules també
deriven del ectoderm, a l’igual
que les neurones). Podem
assegurar-nos de la presència
d’astròcits, per la forma
allargada i filamentosa, i més
concentrada en algunes zones
que en altre, que adopta el fluorocrom. A més, la concentració de fluorocrom és
major en zones on l’anti-TUJ1 ha evidenciat una proporció major de neurones.
Figura 9
Figura 10
Figura 9
Cèl·lules mare i Parkinson Autor: Julián Bobis Camacho
54
Així es pot lligar la presència de més astròcits amb més neurones, ja que
aquestes primeres són cèl·lules de suport de les neurones.
La següent fotografia (Figura
11) és una imatge de la
ubicació de la proteïna MAP2.
Aquesta proteïna, present en
les dendrites i el cos cel·lular
de les neurones, es detecta a
través de l’anticòs primari anti-
MAP2. La situació de les
neurones en aquesta fotografia
coincideix amb l’emplaçament
de les neurones en la figura 9.
En aquest cas, les parts més
intenses de color són al centre
de la part inferior i la meitat
superior, tot i que té menys color.
Conclusió
Després d’obtenir els resultats i interpretar-los, s’obtenen varies conclusions:
El teratoma s’ha diferenciat en les tres capes germinals, perquè
s’expressen els marcadors de les proteïnes específiques de cada capa
germinal. Així, a través de l’observació de la fluorescència que emeten els
fluorocroms podem assegurar que hi ha presents en la mostra cèl·lules de
les tres capes germinals (endoderm, ectoderm i mesoderm).
La diferenciació del teratoma confirma que les cèl·lules que van formar el
teratoma tenen la capacitat de diferenciar-se en els diferents tipus cel·lulars
i, per tant, són cèl·lules mare. La seva pluripotència es manifesta en les
imatges, les quals mostren tots els tipus cel·lulars desenvolupats i la
confirmació d’aquesta característica pròpia de les cèl·lules mare.
Figura 11
Cèl·lules mare i Parkinson Autor: Julián Bobis Camacho
55
L’objectiu d’aquesta prova es veure si les cèl·lules que tenim són mare o no. Per
tant, després de realitzar la immunodetecció, podem dir que les cèl·lules en
qüestió són cèl·lules mare pluripotents (per la capacitat de desenvolupar les tres
capes germinals ).
Al ser aquestes cèl·lules pluripotents poden ser utilitzades com a modelatge de
malalties infeccioses, genètiques, neurodegeneratives... Aquesta opció obre
moltes possibilitats de investigació, per exemple en Parkinson o en diabetis.
També podrien servir com a base per a investigacions sobre el desenvolupament
embrionari, l’envelliment o el funcionament de la regeneració de teixits com la pell
o el fetge.
3.1.3.2. Observació d’ iPSC en un microscopi confocal
Vaig realitzar aquesta pràctica al
departament de bioimatge del Core
Facility. Va consistir en la visualització d’
iPSC mitjançant un microscopi confocal
després de que aquestes haguessin estat
sotmeses a una immunodetecció de
pluripotència.
Així, l’objectiu d’aquesta pràctica era
obtenir els resultats de la immunodetecció
a partir de fotografies de les mostres amb fluorescència i confirmar el caràcter
pluripotent de les cèl·lules.
Aquesta pràctica em va permetre aprendre el funcionament d’un microscopi
confocal (molt utilitzat en biologia) i obtenir resultats a partir de la interpretació de
fotografies, el que pot ser molt útil en la meva vida acadèmica, però també en el
meu futur professional.
Tant aquesta pràctica com les dues següents, vaig realitzar l’obtenció de les
imatges però no els procediments que han donat lloc a les mostres a analitzar.
Jo mateix utilitzant un microscopi confocal
Cèl·lules mare i Parkinson Autor: Julián Bobis Camacho
56
Procediment
En aquest cas, no seria necessària la utilització del microscopi confocal perquè
les iPSC no tenen molt de volum i no caldria fer reconstruccions amb diferents
plans.
Primer de tot, és imprescindible encendre el microscopi, però també l’ordinador.
Un cop que estan tots dos encesos, s’enfoca al microscopi confocal, que funciona
en aquest moment com a microscopi òptic, la part de la mostra que ens interessa
més.
Aquí es canvia la funció del microscopi, que passa a ser de fluorescència. En
aquest moment no es pot mirar directament al microscopi (es fa a través de
l’ordinador), perquè el làser podria danyar els ulls. Per això el microscopi
incorpora la opció de tallar la transmissió de les imatges de la mostra als
binoculars del microscopi.
Seguidament s’escolleix el nombre de canals, que corresponen al nombre de
fotografies de diferents fluorescències que s’obtindran. En el meu cas vaig
escollir-ne fins quatre canals: el primer canal correspon al anticòs DAPI, en color
blau, el segon és de color verd, ja que rep una longitud d’ona blava, el tercer és
vermell perquè s’excita amb verd, i el quart canal emet rajos infrarojos perquè rep
una ona vermella.
És important apuntar en el programa informàtic el format de la imatge, és a dir, la
seva resolució, i també el factor del zoom, l’objectiu utilitzat, perquè aquests dos
factors poden modificar la imatge i millorar-la o empitjorar-la.
Després, es defineix la freqüència de l’ona que s’emet pel làser (en el meu cas
400Hz, standard) i el pinhole o obertura del diafragma, és l’amplada del pla
enfocat on 1 és la confocalitat màxima. Quan més s’obre el pinhole més àrea
s’observa però es perd resolució.
Es pot escollir l’opció de frame average, es fa una mitja d’entre varies imatges per
eliminar el soroll de fons i potenciar la zona de la mostra que ens interessa.
Finalment, es seqüència, per veure tots el canals en conjunt i guardar tota la
configuració feta fins aquest moment. Els passos següents aniran destinats a la
millora de la qualitat de les imatges per a un correcte anàlisi posterior.
S’acciona l’opció live del programa, que permet veure en directe la mostra però
només la fluorescència. Així, per aconseguir una bona fotografia es mou la zona
Cèl·lules mare i Parkinson Autor: Julián Bobis Camacho
57
d’observació en l’eix de les x i l’eix y. També es pot modificar la potència del làser
per augmentar o disminuir la intensitat dels colors i obrir o tancar el pinhole, o
augmentar la sensibilitat dels detectors amb el fotomultiplicador.
Per veure quins punts es troben massa potenciats, el que pot indicar una
cremació d’aquests, s’acciona el captable. Així, a través d’aquest es pot veure si
el fotomultiplicador està massa intensificat. També existeix l’opció de l’offset, que
ajuda a treure soroll de fons i netejar la imatge.
Aquest pas s’ha de repetir amb els quatre canals per tenir la quantitat d’imatges
de la mostra desitjades per a poder realitzar posteriorment un correcte anàlisi. Un
cop fet amb tots el canals, es prem el botó start, que mostra a la pantalla els
quatre canals a la vegada per veure’ls en conjunt.
Finalment, es prem l’opció d’overlay. Aquest botó sobreposa els quatre canals i
crea una imatge composta amb quatre colors, cosa que fa més fàcil la futura
interpretació; i es guarden les fotografies de cada color i la superposició indicant el
objectius utilitzats i l’anticòs la presència del qual evidencien.
Resultats
Les quatre primeres fotografies mostren la mateixa zona de la mostra però
evidencien la presència de proteïnes diferents segons el color i van ser preses
amb 20x i amb una escala de micròmetres.
A continuació es recullen els resultats de manera resumida. L’explicació de cada
fotografia es dóna més detallada a l’annex.
La primera fotografia (figura 12 de l’annex) és l’expressió del marcador DAPI. És
un control de l’experiment per assegurar-nos de la presència de cèl·lules a la
mostra.
La figura 13 representa la manifestació de l’anticòs anti-Nanog. Aquesta proteïna
es codifica a través del gen Nanog i es situa al nucli. Com que és un factor propi
de cèl·lules pluripotents i s’expressa en aquesta mostra, indica que les cèl·lules
tenen característiques pluripotents.
La imatge 14 de l’annex és la manifestació de la proteïna TRA-1-80 a la cèl·lula.
Aquesta proteïna es situa a la membrana cel·lular de les ESC. Aquest fet afirma
que en la colònia hi ha cèl·lules que contenen molècules pròpies de ESC.
Cèl·lules mare i Parkinson Autor: Julián Bobis Camacho
58
La figura 15 correspon a la superposició de les expressions dels tres anticossos
anteriors. Amb la imatge es pot fer una distinció en la colònia de les cèl·lules no
pluripotents i aquelles que sí ho són.
La segona sèrie de fotografies comprèn quatre fotografies d’una mateixa colònia
de cèl·lules preses a 20x. Malgrat que es va realitzar una cinquena fotografia per
un anticòs, aquest no es va manifestar, la fotografia era negra, sense cap
expressió de l’anticòs, i no aporta informació per caracteritzar les cèl·lules.
L’indicador DAPI, tal i com es mostra en la imatge 16 de l’annex, es concentra al
ben mig de la il·lustració. Hi ha altres cèl·lules al voltant però ens interessen
sobretot les centrals.
La següent fotografia, figura 17, correspon a la expressió de l’anticòs anti-Oct4.
Aquest anticòs s’uneix amb la proteïna Oct4, molt lligada amb l’autorenovació
cel·lular i les ESC. Per tant, podem dir que aquestes cèl·lules es troben en un
estat no diferenciat.
Aquesta imatge, figura 18 és la manifestació de l’anticòs anti-SSEA3. Detecta la
molècula SSEA3, present en la superfície de les ESC. Aquesta mostra conté una
molècula pròpia de les ESC, indicant que les cèl·lules de la colònia són semblants
a les embrionàries.
L’última imatge de la sèrie (figura 19 de l’annex) és la superposició de les tres
fotografies anteriors. Així la majoria de cèl·lules de la colònia expressen els tres
marcadors abans explicats.
La tercera sèrie està formada per quatre imatges, en les quals es poden veure les
expressions dels mateixos anticossos que en les quatres imatges anteriors però la
colònia de cèl·lules és diferent i es van prendre a 63x. També, igual que en
l’anterior sèrie, es va realitzar la inmunodetecció per a una tercera molècula però
tampoc va sortir correctament: la fotografia resultant era negra, sense cap
manifestació de l’anticòs amb el fluorocrom.
La primera fotografia, figura 20, correspon a la expressió del DAPI en la colònia.
Com a anècdota hi ha cèl·lules que estan en procés de mitosi, cosa que es pot
assegurar perquè els cromosomes que apareixen estan marcats en blau intens ja
Cèl·lules mare i Parkinson Autor: Julián Bobis Camacho
59
que són rics en adenina i timina. Entre les
cèl·lules en mitosi podem trobar cèl·lules en
anafase (al ben mig de la fotografia hi
ha dues i al cantó inferior esquerre, tot i que
aquesta ja estaria produint la citocinesi.) i en
metafase, com a la part inferior dreta, al mig cap
a la esquerra i la part superior de la imatge
(metafase tardana).
La figura 21 mostra la manifestació de l’anticòs
anti-Oct4. S’expressa en la majoria de cèl·lules
excepte en aquelles en mitosi, ja que aquestes
momentàniament no tenen nucli definit, per tant,
aquesta molècula, que es situa en el nucli, no
està present al no haver-hi nucli definit (es mostra
verd igualment perquè la molècula es troba
escampat per tot el citoplasma). Les cèl·lules de
la colònia són riques en una proteïna pròpia de
les ESC, del que es desprèn que tenen un estat
semblant a aquestes.
L’esfingolípid SSEA3 (fotografia 22) es mostra en la colònia repartidament. Això
exposa que les cèl·lules de la mostra contenen el lípid propi de les ESC, cosa que
ens va confirmant cada cop amb més força la seva naturalesa
L’última figura, fotografia 23 de l’annex, és la exposició de les tres fluorescències
anteriors. Els nuclis, ben definits, tenen un color entre blau i verd que confirma la
doble pertinença de DNA i Oct4.
La següent sèrie de fotografies està formada per quatre imatges, figura 24 de
l’annex, preses a 63x més un zoom del 01 i una escala de 2cm:7,5µm. Mostren la
cantonada inferior dreta de la mostra anterior. Al ser un zoom de fotografies
anteriors, la immunodetecció té els mateixos anticossos i l’expressió d’aquests és
la mateixa.
Figura 20
Figura 21
Cèl·lules mare i Parkinson Autor: Julián Bobis Camacho
60
A les quatre imatges es visualitza cèl·lules que manifesten amb intensitat l’anticòs
anti-Oct4 i una cèl·lula al centre que es troba en la metafase de la mitosi. Els
punts vermells es situen al voltant del nucli amb una forma més o menys circular,
seguint la forma de la membrana.
L’última sèrie comprèn cinc imatges de la mateixa colònia a 20x i 2:75µm
d’escala. A més, en aquesta sèrie sí que va sortir la immunodetecció per a la
cinquena molècula.
El marcador DAPI, figura 25, s’expressa amb normalitat i es defineixen els nuclis
cel·lulars, encara que una mica difuminats.
En aquesta imatge (imatge 26, annex) s’observa l’expressió de l’anticòs anti-Sox2,
que s’uneix a una proteïna de les ESC. La manifestació d’aquesta proteïna
evidencia el caràcter semblant a ESC de les cèl·lules de la colònia.
La següent fotografia, figura 27, és la exposició de l’anticòs anti-SSEA4. El
SSEA4 és una glicoproteïna de les ESC. Per tant, la seva expressió en aquesta
colònia mostra que les cèl·lules de la imatge són semblants a les ESC.
La figura 28 correspon a l’anticòs anti-TRA-1-60. Es situa a la superfície de les
ESC. La ubicació d’ella en la colònia indica unes característiques que
s’assemblen a les d’una ESC.
La superposició de les quatre fotografies anteriors es plasma en l’última fotografia
de la sèrie (imatge 29 de l’annex).
Conclusió
Després d’obtenir els resultats de la immunodetecció es pot afirmar que aquestes
cèl·lules són pluripotents i així ho demostra el seguit de molècules que es troben
en les cèl·lules de la mostra.
Es pot assegurar perquè aquestes molècules estan presents només en cèl·lules
pluripotents, concretament ESC, per tant, si es troben en les cèl·lules de la mostra
és que ho són.
Es realitzen tantes proves per a molècules diferents per assegurar amb la màxima
seguretat la potencialitat i no caure en l’error que podria afectar a futures
investigacions amb cèl·lules provinents d’aquesta colònia.
Cèl·lules mare i Parkinson Autor: Julián Bobis Camacho
61
A partir d’aquesta conclusió principal es pot treure d’altres:
- Les cèl·lules de la mostra es troben en un estat semblant al de ESC
perquè tenen les mateixes biomolècules que aquestes però no ho
són estrictament perquè no s’han obtingut del blastocist durant el
desenvolupament embrionari, així que són iPSC, perquè s’han
produït a partir de cèl·lules adultes diferenciades.
- El procés de retrocés a un estat no diferenciat (reprogramació) s’ha
realitzat correctament ja que les cèl·lules obtingudes expressen les
característiques pròpies d’una cèl·lula pluripotent i contenen les
molècules que les defineixen.
Com a crítica es podria dir que hi ha dues immunodeteccions que no tenen
resultats. Aquest fet pot haver estat causat per un error en la realització de la
reprogramació, en la unió dels anticossos a la molècula o en la obtenció de les
fotografies. Encara que no hagin sortir aquestes dues, es pot confirmar igualment
que les cèl·lules de la mostra tenen un caràcter pluripotent ja que contenen molts
dels principis immediats presents en les ESC, cèl·lula pluripotent per excel·lència.
Aquest tipus de cèl·lula i concretament aquesta colònia podria ser utilitzada en
investigacions sobre el Parkinson perquè permet esbrinar reprogramant cèl·lules
adultes d’un malalt de Parkinson quins gens intervenen en l’enfermetat i com es el
desenvolupament d’una neurona afectada de la malaltia comparant-la amb una de
normal. També es podrien utilitzar, gràcies al seu caràcter pluripotent, en
medicina regenerativa dirigida al Parkinson reprogramant neurones afectades i
modificant-les per tal d’obtenir cèl·lules sanes, tot i que es necessitaria saber els
gens i els motius pels quals les neurones degeneren en aquesta enfermetat. Així
les iPSC obren moltes possibilitats de investigació en la malaltia del Parkinson,
però encara cal saber més coses de la malaltia i aplicar-les amb finalitat de
curació.
Cèl·lules mare i Parkinson Autor: Julián Bobis Camacho
62
3.1.3.3. Observació d’EBS en un microscopi confocal
Aquesta pràctica té com a objectiu confirmar la potencialitat de les cèl·lules de les
qual es parteix. Es deixa que aquestes cèl·lules es diferenciïn i proliferin les tres
capes germinals per veure si són capaces de donar origen a tots els tipus
cel·lulars de l’organisme adult.
Es realitza una immunodetecció sobre les masses cel·lulars que s’obtenen, EBs,
per a diferents principis immediats característics de cada capa germinal. Després
es visualitzen les mostres a un microscopi confocal ja que les masses cel·lulars
tenen un cert volum i el microscopi confocal permet produir fotografies de cossos
amb volum.
Jo vaig realitzar l’obtenció de les imatges de les mostres però no la
immunodetecció o el procés per originar EBs. El procés per captar les imatges és
el mateix que en la pràctica anterior, per la qual cosa no es fa necessari repetir la
explicació del procés.
La única cosa que canvia és l’amplitud del camp de visió en la vertical (eix z) que
s’ha d’augmentar i es fa una mitjà de les diverses capes que es capten.
Resultats
Prèviament es va realitzar una immunodetecció per a molècules característiques
de cada capa germinal, gràcies a la qual es poden diferenciar entre si i confirmar
la seva pluripotència.
Les quatre primeres fotografies corresponen a la immunodetecció per a molècules
pròpies de l’endoderm, a més del ja conegut marcador DAPI. Van ser preses amb
20x augments i una escala 2:75.
Els tres marcadors propis d’endoderm (anti-AFP i anti-FOX 2) van confirmar la
presència d’endoderm en la mostra. Els EBs han pogut diferenciar-se en cèl·lules
d’aquesta capa germinal, el que evidencia que aquestes cèl·lules tenen
característiques pluripotents. Per a una major descripció de les fotografies i dels
resultats per a l’endoderm, aneu a l’annex a l’apartat d’observació d’EBs en un
microscopi confocal.
Cèl·lules mare i Parkinson Autor: Julián Bobis Camacho
63
Seguidament vaig realitzar fotografies per detectar mesoderm en la mostra. El
resultat són tres imatges, que tenen la mateixa escala que les imatges anteriors i
van ser preses amb els mateixos augments.
També es va realitzar la immunodetecció per a la molècula ASA però no va sortir
per causes no conegudes, possiblement errors.
Van mostrar que les cèl·lules de la mostra també s’havien diferenciat cap a
mesoderm. L’explicació detallada de cada fotografia i les imatges es troba en
l’annex.
Les últimes quatre fotografies corresponen a una colònia, la qual es va sotmetre a
anticossos que indicaven molècules de l’ectoderma. Es va realitzar una
immunodetecció amb tres anticossos
més el DAPI, però un d’aquests no va
sortir.
El marcador DAPI (figura 37) com en els
altres casos, permet situar els nuclis
cel·lulars i les cèl·lules de la colònia. En
aquesta mostra, els nuclis són més petits
i més nombrosos que en l’anterior colònia
malgrat va ser presa amb els mateixos
augments (20x). Aquest fet pot voler dir
que el tipus cel·lular és diferent que
l’anterior i que les cèl·lules es troben en
estats no diferenciats del tot.
Aquesta fotografia, imatge 38, és
l’expressió de l’anticòs anti-TUJ-1 unit a
la proteïna TUJ-1. Aquesta és una
constituent primordial del citoesquelet,
dels microtúbuls del citoplasma de les
neurones. Concretament es situa en els
axons i intervé en el seu manteniment i
control.
Figura 37
Figura 38
Cèl·lules mare i Parkinson Autor: Julián Bobis Camacho
64
La manifestació del TUJ-1 en la colònia de la fotografia evidencia que les cèl·lules
pertanyen a l’ectoderma. A la imatge s’aprecien els axons de les neurones i les
xarxes que començaven a establir-ne. A més, les construccions allargades i
filamentoses que adquireixen confirmen la naturalesa neuronal de les cèl·lules.
En la figura 39 és visible un color vermell intens amb formes filamentoses i
allargades. Es tracta de l’expressió de la
proteïna GFAP. Aquesta proteïna es
troba en el citoplasma de les neurones i,
durant el desenvolupament embrionari,
distingeix astròcits d’altres cèl·lules de
la glia. Per tant, a la imatge hi ha
astròcits i, conseqüentment, hi ha
ectoderma ja que aquestes són un tipus
de cèl·lules del sistema nerviós.
L’última imatge és la superposició de les
tres anteriors fotografies preses.
L’àmplia gamma de colors indica que
l’expressió dels tres marcadors previs
s’estén per tota la fotografia. Aquesta
fotografia permet observar les xarxes
neuronals que formen les neurones més
els astròcits. També es observable que
en aquelles zones on hi ha molta
concentració de nuclis i axons, es troben
molt a prop astròcits, cèl·lules de
suport.
Figura 39
Figura 40
Cèl·lules mare i Parkinson Autor: Julián Bobis Camacho
65
Conclusió
Aquesta pràctica respon rotundament i amb suficients proves a la hipòtesi inicial:
la mostra davant la qual ens trobàvem sí que n’era, de capaç de generar cèl·lules
de les tres capes germinals del desenvolupament embrionari. És a dir, són
pluripotents i es poden caracteritzar com a pluripotents i cèl·lules mare, per tant,
poden ser utilitzades en estudis de desenvolupament o regeneració.
També es confirma la característica generadora dels EBs com a forma cel·lular
que conté les tres capes germinals. Aquest tipus de cèl·lula ens permet no haver
d’utilitzar embrions naturals, que comporta inconvenients ètics, alhora que són
molt similars a aquests.
Tot i que alguns dels marcadors de cada capa germinal no s’han expressat, la
majoria ho ha fet i permeten confirmar el caràcter de les cèl·lules de les quals es
partia.
Aquesta pràctica ha sigut molt útil perquè m’ha permès veure les tres capes
germinals de primera mà i poder distingir les diferències entre elles. Ja en
pràctiques anteriors havia observat diferents tipus cel·lulars però la claredat
d’aquesta és major i els resultats són més clarificadors.
A més, la pràctica també permetia visualitzar els processos de diferenciació en les
tres capes germinals en el desenvolupament embrionari. Aquest fet és destacable
en el meu cas perquè en el Parkinson es vol conèixer els motius de l’incorrecte
funcionament de les neurones en el cervell d’un malalt i una de les causes podria
estar relacionada amb l’origen de tot el teixit neuronal, és a dir, a les primeres
etapes de la vida, l’embrió.
Malgrat els avenços que es fan dia a dia en aquest camp encara s’està
relativament lluny de trobar una causa del Parkinson i una possible solució a
aquest, per tant, qualssevol investigació destinada a portar llum en aquest terreny
és important.
Cèl·lules mare i Parkinson Autor: Julián Bobis Camacho
66
3.2. Entrevistes
3.2.2. El Parkinson des de la recerca i la situació econòmica de la
investigació: doctora Cristina Malagelada
El desembre de 2014 vaig realitzar una entrevista a la doctora Cristina
Malagelada, del departament de farmacologia de la facultat de medicina de la UB.
L’entrevista va girar entorn del Parkinson, els tractaments i l’estat actual de la
recerca a Espanya. Tenia com a objectiu conèixer les teràpies que actualment
s’investiguen com a tractament per al Parkinson i per donar resposta a tres
hipòtesis: si Catalunya és un focus important d’investigació, si és necessari
continuar la recerca sobre malalties degeneratives i si la teràpia cel·lular es pot
aplicar com a tractament per al Parkinson.
- Què tracta el seu departament?
És un departament de farmacologia. Tot i que fem coses relacionades amb la
farmacologia, fem moltes més coses relacionades amb la neurociència (biologia
cel·lular, bioquímica i biologia molecular). Farmacologia ens va molt bé a nivell
terapèutic, per provar una molècula o compost. És una mica multidisciplinari,
encara que pertanyi a farmacologia.
- A què es dedica exactament, és a dir, vostè investiga o coordina les
diferents investigacions que es realitzen en el seu departament?
Estem organitzats com a grup de recerca: una estudiant de fi de grau, tres
estudiants de doctorat i jo. Cadascú té el seu projecte. Jo ideo projectes (ells
també tenen idees, però), que, si hi ha diners i medis, es porten a terme; a més
coordino i controlo els projectes.
- També dóna classes?
Sí, a gent de medicina, ciències biomèdiques, ciències mèdiques bàsiques i altres
graus de biologia. No gaires classes perquè per contracte no puc donar masses.
Intento fer coses interessants com pràctiques.
Cèl·lules mare i Parkinson Autor: Julián Bobis Camacho
67
- Quines investigacions estan desenvolupant en aquests moments?
Gairebé tots estem centrats en una proteïna, que serveix d’excusa per a
investigar: la RTP801. Hem vist que és necessària per induir mort neuronal. Com
és una peça important per a què les neurones es morin, qualsevol maniobra que
fem per modular-la i mantenir-la baixa ens dóna la idea que seria una aproximació
terapèutica per a malalties amb mort neuronal com el Parkinson. Si mantens els
seus nivells baixos i estresses la neurona, les protegeixes. A partir d’aquí hem
desenvolupat diversos projectes: la seva relació amb la parkina, una proteïna que
degrada la RTP801, amb la Nedd-4, en la malaltia de Huntington, on hi ha una
expressió d’una proteïna mutada, la huntingtina, que provoca un augment de la
RTP801 i la mort neuronal, per tant es bloqueja l’expressió de la RT801 per
protegir les neurones.
El problema és que si mantens baix la RTP801 en una situació de càncer, les
cèl·lules canceroses no es moren i s’agreuja més. També modifica la proliferació
neuronal modificant el camí que segueixen les cèl·lules mare fins a arribar a
especialitzar-se en neurones, i les connexions entre neurones, la quantitat de
neurotransmissors.
- Quants anys porta el departament funcionant?
Molts anys. Jo només en fa cinc, però el departament porta entre trenta i quaranta
anys, o més fins i tot.
- Quants investigadors o professionals treballen en el departament i en
el seu grup?
Al departament, som quatre grups de més o menys 17 persones entre tots. En el
meu grup som cinc persones.
Cèl·lules mare i Parkinson Autor: Julián Bobis Camacho
68
- Creu que els fàrmacs personalitzats, no només per al Parkinson per
exemple, sinó també per altres malalties, són el futur?
Home sí, però és molt car personalitzar. Si hi ha una manera de decidir quin
fàrmac és adient per a una persona, la seva dosi i amb un patró concret de
preses, estaria bé. És molt utòpic perquè és molt car; és molt més fàcil
homogeneïtzar una dosi per tothom.
- Com d’avançada es troba la recerca sobre el Parkinson? I
concretament sobre el seu tractament?
És complicat dir-ho. S’ha avançat molt a nivell de mecanismes, d’entendre perquè
passa, però no s’ha avançat prou en el tractament. Tot sembla que funciona molt
bé en cèl·lules i models d’animals però quan proven aquestes estratègies en
persones, no els hi acaben de sortir. Normalment les persones que participen en
assajos clínics són persones fartes de la malaltia, així que s’ha d’escollir molt bé
el tipus de pacient de Parkinson on es prova el fàrmac. Com que hi ha molts tipus
de Parkinson i alguns acaben també en Alzheimer, és una barreja que costa
abordar. És complicat, però alguna cosa sortirà aviat.
- Pensa que hi haurà en pocs anys un tractament especialitzat per a
aquesta malaltia? I una cura?
Jo crec que costarà. Tant de bo perquè hi ha molta gent que hi treballa. Penso
que el que té més potencial són fàrmacs que ja es donen en altres malalties però
que provades en una altra patologia curen el problema, per exemple la
metformina dels malalts de diabetis tipus 2. Pot ser és el que té més probabilitats
de que s’utilitzin fàrmacs que ja estan al mercat, que ja han passat tots els estudis
de seguretat i els assajos clínics, i s’adaptin a la nova malaltia.
Cura total, això ja s’hauria de fer amb cèl·lules mare perquè la gent ha perdut
tantes neurones quan comencen els símptomes del Parkinson (els queden entre
el 30 i el 40%). Les neurones que queden haurien de funcionar molt bé i repoblar-
les d’alguna manera. Seria més amb estratègies amb cèl·lules mare.
Cèl·lules mare i Parkinson Autor: Julián Bobis Camacho
69
Però en un assaig clínic on van introduir cèl·lules mare en pacients de Parkinson,
tot i que els símptomes motors milloraven, van veure en el teixit post mortem que
les neurones noves també presentaven cossos de Lewy. O sigui que la causa és
del pacient: per molt que posis noves neurones, l’entorn neuronal les fa tornar
malaltes, per la comunicació.
- Quines són les seves línies d’investigació sobre el Parkinson?
Hi ha moltes: hi ha gent que mira les causes, què fa que les neurones es morin, i
altres estan més centrats en tractaments, en millorar a nivell farmacològic, a nivell
de pacient, i teràpies cel·lulars o gèniques.
- Treballa en col·laboració amb altres centres de recerca? Us passeu
informació
Sí, amb Boston per exemple. Vam estar col·laborant amb ells. També amb gent
de Nova York, de la Universitat de Columbia, amb Alemanya... Ens anem movent,
també amb gent de la universitat.
Sempre i quan no ens ho trepitgin. Hi ha molta competència, sobretot entre els
grups més grossos.
- S’investiga a Espanya el Parkinson? I a Catalunya?
Home, déu ni do! Crec que hi ha grups potents que fan coses interessants. Penso
que en neurologia i càncer, Espanya és un dels llocs on s’hi posen més. Tot
depèn de les inversions: hi hagut molts grups que han tancat.
Sí, les inversions a Catalunya en ciència han estat molt ben cuidades per la
Generalitat. La política en investigació de la Generalitat ha estat una de les més
aplaudides, i han provocat que els grups consolidats hagin continuat investigant.
Es pot competir a nivell europeu i americà, o al menys es podia, ara ja no ho sé.
Cèl·lules mare i Parkinson Autor: Julián Bobis Camacho
70
- Reben ajuts de la Generalitat, l’Estat o una altra institució pública?
Ara de l’estat espanyol sí, del ministeri d’economia i competitivitat. De la
Generalitat, diners específics per fer investigació no, només beques o bé ajuts per
a grups de recerca consolidats, però és molt poc. Estem pendents de la resolució
d’una demanda d’ajut al ministeri que ja ens van concedir aquest any. També
tenim finançament americà: un projecte de la fundació del Michael J. Fox, l’actor
de les pel·lícules de Retorn al futur, que té Parkinson; i d’un projecte europeu.
- Tenen financiació privada?
També, però no una persona física que et pagui tota la recerca perquè és molt
difícil de tramitar a nivell fiscal. Hi ha casos: una persona ens està donant diners -
no milions- perquè volia fer-ho directament sense passar pel crowdfunding que
vam organitzar.
- Té un cos elevat desenvolupar un projecte de recerca?
Sí. Són molt cars els reactius, que fins i tot és vergonyós. Són coses molt
específiques. Per exemple, en el primer projecte que vam fer teníem 90000€ per
tres anys i ens els vam gastar molt ràpid. Parlem de molts diners, i el que rebem
nosaltres és poc en comparació amb grups més grans.
- Hi ha hagut retallades en el seu departament? Les ha notades?
Sí, perquè com hi hagut retallades a la universitat, de retruc al departament també
han retallat. Ens van treure bombetes i abans la facultat obria per vacances; ara
tot l’agost i el Nadal tanca per estalvia. Nosaltres podem entrar per acabar
experiments però no hi ha consergeria i has d’entrar amb targeta.
Cèl·lules mare i Parkinson Autor: Julián Bobis Camacho
71
- S’investiga més o menys que abans de la crisi?
Crec que abans de la crisi s’investigava més, però tampoc ho sé molt perquè
quan no hi havia crisi jo estava als Estats Units. Nosaltres aquest primer trimestre
no teníem diners per a res, no podíem comprar ni les puntes, ni les pipetes, ni els
reactius...
- Com qualificaria l’estat de la investigació en aquest país?
Molt pèssim. És una pena perquè es fa molt bona ciència i hi ha gent molt bona,
però degut a això és molt trist que no es pugui fer en les condicions que toca.
Suposo que en algun moment s’arreglarà. A nivell d’intencions, hi ha molt bones
intencions i idees amb molta qualitat, però l’ambient econòmic no acompanya.
- Sap si altres països han tingut retallades?
Jo crec que s’ha notat a tot arreu. Als Estats Units va haver-hi retallades
importants i ha afectat a tot el món. A Europa, els projectes europeus van de capa
caiguda, als EEUU amb la guerra de l’Irak es van gastar-hi tots els diners.
- Veu sortida a l’estancament de la recerca per l’economia?
Penso que sí, perquè si no penséssim que hi ha sortida, tancaríem tot i ens
marxaríem a casa. Hem superat aquesta etapa tant bèstia i poc a poc anirem
remuntant.
- Veu preparades les noves generacions d’investigadors?
Hi tant! Són generacions que heu estat exposades a informació molt més ràpida i
el grau d’accés a la informació és molt gran. Jo crec que estan molt ben preparats
i que tenen una agilitat per captar i aprendre les coses i per aplicar i pensar noves
idees que és gràcies aquest ambient tant positiu que et dóna la xarxa o la
interacció.
Cèl·lules mare i Parkinson Autor: Julián Bobis Camacho
72
3.2.2. El Parkinson segons els afectats: president de l’associació de malalts
de Parkinson de L’Hospitalet
El 19 de maig de 2014 vaig realitzar una entrevista a en José María, president de
l’Associació de malalts de Parkinson de L’Hospitalet i el Baix Llobregat, per tal
d’informar-me sobre la pròpia associació i les teràpies que efectuen, però també
sobre la pròpia vida d’un malalt de Parkinson.
L’objectiu d’aquesta entrevista era respondre a dues hipòtesis del Treball de
Recerca: cal continuar la recerca sobre malalties neurodegeneratives i cèl·lules
mare, i si la teràpia cel·lular es pot aplicar per millorar la qualitat de vida de
pacients de Parkinson o com a tractament.
- En quin any va néixer?
Vaig néixer al1938 en un poble petit. En el Parkinson el lloc de naixement no
influeix, és a dir, afecta per igual a persones de diferents pobles o ciutats.
- Quan li van detectar la malaltia?
Fa onze anys. Ara mateix tinc 76.Normalment el Parkinson es detecta entre els 55
i els 60 i pico,però cada vegada tendeix a presentar-se en persones més joves.
- Quin era el seu treball quan li diagnosticaren l’enfermetat?
Quan em van detectar Parkinson ja portava quinze anys jubilat. Abans treballava
a la fàbrica SEAT, en el sector de construccions metal·lúrgiques. No hi ha una
relació directa entre el tipus de treball que has tingut i la presencia de Parkinson.
- Com va saber que tenia l’enfermetat? Com se la van detectar?
Per la tremolor de la mà. La majoria dels parkinsonians comencen amb aquesta
tremolor característica.
Cèl·lules mare i Parkinson Autor: Julián Bobis Camacho
73
- Té antecedents previs a la família?
Que jo sàpiga no. Ningú dels meus familiars propers la pateix. En la majoria de
casos de Parkinson, l’aparició d’aquesta no és un motiu hereditari.
- Quins símptomes se li han manifestat?
Sobretot, la tremolor en les mans i la rigidesa. També em costa més
moure’m,camino i faig les coses més lentament i, a vegades, em costa dormir. En
cada malalt, els símptomes que es manifesten són diferents, és a dir,pot aparèixer
la rigidesa però no la tremolor a les mans; però sempre afecta la mateixa part del
cervell.
- Ha hagut d’adaptar la seva vida i vivenda a la seva situació?
La meva casa no perquè el malalt de Parkinson no necessita més que la
medicació i una mica d’ajuda d’una altra persona quan ja està molt
desenvolupada l’enfermetat. La meva vida segueix sent més o menys la mateixa,
encara que puc fer menys coses o les faig amb més lentitud.
- Necessita ajuda d’una altra persona?
Jo, personalment, no. Algunes persones en l’associació ja han de vindre
acompanyades perquè no poden arribar fins aquí soles. Quan ja portes molts
anys amb l’enfermetat costa donar-te la volta al llit,llavors també hi ha gent que
necessita una persona per donar-se la volta i llevar-se.
- Quins tractaments utilitza? Quins fàrmacs?
Tots prenem L-dopa o levodopa, però a partir dels cinc/sis anys l’efecte es
deteriora i és més dèbil. El que passa amb el Parkinson és que les neurones van
morint amb molta facilitat. La L-dopa fa que no es deteriori tant. Normalment,
s’administra amb pegatines i, sovint, es dóna amb pastilles o una bomba d’infusió.
Cèl·lules mare i Parkinson Autor: Julián Bobis Camacho
74
- Quines teràpies no farmacològiques segueix?
Doncs aquí faig rehabilitació i logoteràpia. Fins fa poc es donava més importància
a la fisioteràpia, però últimament es treballa més la logoteràpia perquè la malaltia
també afecta a la parla: la part de la gola que controla la deglució i la respiració es
posa rígida i pot passar que l’aliment vagi a la part respiratòria, provocant
infeccions.
- L’enfermetat també afecta a la psicologia del malalt? Necessita ajuda
psicològica?
Pot haver-hi depressió però, entre els afectats que conec, no veig problemes
psicològics. Sobre tot la família i la parella, que reaccionen d’una forma negativa,
poden agafar depressió perquè el Parkinson té conseqüències en l’entorn ja que
el malalt deixa de ser la mateixa persona que abans (tendeix a ser més passiu).
- Aquesta passivitat del malalt, és una passivitat física (no pot fer una
cosa) o psicològica?
En el meu cas i en la majoria, és psicològica: em dic a mi mateix, he de fer això
però sóc incapaç d’arrencar, fins que arriba un moment semblant a un flash i
arrenco. És com un resort que falta. La voluntat en el Parkinson s’ha de buscar
molt, fa falta automotivar-se.
- Si li diguessin de participar en un assaig clínic, acceptaria a
participar?
Segurament sí, però m’ho pensaria. Si fos per provar un fàrmac de
manteniment,no ho faria perquè com estem amb la L-dopa ja estem bé. Hauria de
ser un fàrmac per a la curació ja que val la pena per tu i pels demés. Necessitaria
valorar els pros i els contres.
Cèl·lules mare i Parkinson Autor: Julián Bobis Camacho
75
- Segueix alguna investigació sobre el Parkinson?
Respecte a la investigació pura, aquella que va dirigida a curar el Parkinson
(cèl·lules mare...) no ha sortit res i no se sap res que hagi realment. El que sí que
ha millorat és la dosificació de la L-dopa: s’han buscat maneres de subministrar-la
a través del pàncrees periòdicament. També hi ha un tractament quirúrgic
anomenat estimulació cranial profunda. És una intervenció cranial en la qual es fa
un forat al crani i es posa un elèctrode que es passa pel cap i activa la substància
negra del cervell per a que aquesta reculli millor la L-dopa. Però només s’aplica a
persones menors de setanta anys i amb uns requisits específics, sobretot físics.
- El tractament de cada malalt és personalitzat?
D’alguna manera sí, però sempre s’aplica el mateix tractament, la mateixa
medicació amb dosis diferents; excepte en l’estimulació cranial profunda que
només alguns se’ls pot aplicar. Hi ha tractaments que milloren la malaltia però no
hi ha ara mateix res que la curi totalment i tampoc tinc expectatives de que es
curi.
- Quants anys porta com a president de l’Associació de malalts de
Parkinson de l’Hospitalet i el Baix Llobregat?
Set anys. Abans ja havia sigut tresorer: redactava els llibres de comptes i d’actes
des del 2003. L’associació porta onze anys en funcionament.
- Quantes persones formen l’associació? Ve gent de fora de
L’Hospitalet?
Ara mateix som una mica més de vint persones però hem arribat a ser quaranta-
cinc. La majoria som de L’Hospitalet i de Cornellà, tot i que tenim persones de
Sant Boi i Barcelona.
- Coneix algun cas d’una persona jove amb Parkinson?
La veritat és que no. Perquè,normalment, el jove que té la malaltia i treballa, no ho
diu ja que sinó el podrien acomiadar.
Cèl·lules mare i Parkinson Autor: Julián Bobis Camacho
76
- Quina és la mitjana d’edat en l’associació?
La mitjana d’edat és més o menys de setanta, una mica més. Hi ha persones que
tenen l’enfermetat des de fa 22 anys. A l’associació hi ha més homes que dones
perquè el Parkinson afecta una mica més a homes que a dones.
- Quin tipus d’ajut proporcionen a l’associació? Quines teràpies fan?
Els dilluns fem fisioteràpia i logoteràpia, el dimecres, musicoteràpia, i el dijous
tornem a fer fisioteràpia. L’associació, sobretot, dóna suport al malalt, informa de
que és el Parkinson,com evoluciona i com viure amb aquest.
- Reben ajuts de l’Administració?
No. Abans teníem una subvenció per a un fisioterapeuta però, per les retallades,
ens van treure l’ajuda i ara fem nosaltres mateixos la fisioteràpia. Al contrari que a
un malalt d’Alzheimer,a un malalt de Parkinson se li pot millorar la qualitat de vida,
però l’Administració no ens ajuda ni compta amb nosaltres.
- Estan emparats per la llei de dependència?
No, perquè no tenim un grau de dependència o minusvalidesa elevat. El que
pateix Parkinson es pot valdre per si mateix fins que l’enfermetat està molt
avançada. Ara mateix a l’associació estem en un percentatge del cinquanta per
cent de persones que venen acompanyades i cinquanta per cent que venen soles.
- Entre les associacions de malalts de Parkinson, fan alguna reunió per
a coordinar-se?
No, som independents entre nosaltres. De tant en tant, la Federació Espanyola
ens convoca per a un Congrés Nacional, però no ens marca cap directriu. Decidim
per nosaltres mateixos.
Cèl·lules mare i Parkinson Autor: Julián Bobis Camacho
77
- En quins hospitals els atenen si tenen algun problema?
A mi m’atenen a l’Hospital de Bellvitge. Has d’anar amb una periodicitat perquè
els medicaments que et recepten s’han d’adaptar, per exemple la L-dopa. Un dels
problemes que té aquest medicament és que els efectes es passen de seguida,
per això després se li va afegir la carbidopa que feia que s’allargués la duració,
però igualment s’ha d’adaptar la medicació (augmentar la dosi). En el meu cas,
les pegatines de L-dopa, en un inici eren de 4mg i només portava una; ara porto
una de quatre i una altra de vuit.
- Els malalts de Parkinson, per informar-se de l’enfermetat, pregunten a
l’associació o al propi metge?
Com la diagnosi i el seguiment, els fa el metge, ell ja respon als dubtes, però com
tenen poc temps i utilitzen un llenguatge tècnic i poc usual, venen a l’associació ja
que podem respondre a les preguntes d’una forma més entenedora perquè som
més propers al ser també afectats pel Parkinson.
Cèl·lules mare i Parkinson Autor: Julián Bobis Camacho
78
4. Conclusions
Després de realitzar tot el recull documental, explicar la part teòrica del Treball i
obtenir els resultats de les pràctiques, és el moment de confirmar o desmentir les
hipòtesis plantejades al principi del treball.
Respecte a la primera hipòtesi (la teràpia cel·lular és segura), tal i com explico a
l’apartat de medicina regenerativa i al de iPSC, actualment s’utilitza teràpia
cel·lular per a algunes malalties. Per tant, si tingués efectes secundaris o
provoqués reaccions a l’organisme, no s’empraria contra aquestes afeccions ja
que per a què un tractament es pugui aplicar a una malaltia, cal que aquest passi
una sèrie de controls: primer s’aplica en models in vitro al laboratori i després en
animals (és la fase preclínica), després d’uns quants anys on els resultats en
animals són bons, es passa a la fase clínica, en humans, i si el tractament resulta
ser eficaç en persones i sense efectes secundaris, es realitza el registre. La
teràpia cel·lular que ja ha passat tots aquests controls es converteix en tractament
i, conseqüentment, és segura.
També cal tenir en compte que les iPSC tenen l’avantatge que no suposen un risc
immunològic per al pacient, així que no produeixen rebuig immunològic o altres
reaccions al pacient, però, tot i això, tenen riscos, com una divisió incontrolada i la
producció de teratomes.
Malgrat tots aquests avenços i aplicacions que ja té la teràpia cel·lular, no hem
d’oblidar que les cèl·lules mare encara es troben sota investigació i que tenen els
seus riscos. Per tant, la teràpia cel·lular és segura, per a algunes malalties, però
utilitzar-la en altres malalties on no s’aplicava fins ara com a nou tractament
comporta riscos encara no solucionats.
La següent hipòtesi (és difícil tractar amb cèl·lules mare i les seves tècniques) es
respon en tota la part pràctica del Treball. Com es pot llegir en aquests apartats,
les tècniques que envolten les cèl·lules mare i amb les quals es tracten tenen
molts passos a seguir, el que augmenta la probabilitat d’error, i han de ser
realitzades amb molta cura, el que fa que sigui dificultós treballar-hi, com per
exemple diferenciar-les en el tipus cel·lular desitjat (apartat 3.1.2.2.).
Cèl·lules mare i Parkinson Autor: Julián Bobis Camacho
79
A més, les possibilitats d’error són elevades perquè, com les cèl·lules no deixen
de ser organismes vius, no se sap amb certesa com reaccionaran a les diferents
substàncies ni si donaran els resultats esperats.
Per aquest motiu la hipòtesi inicial és certa: tractar amb cèl·lules mare és difícil,
no només per tots els minuciosos procediments que s’han de seguir sinó també
per la complexitat com a organisme viu.
Catalunya és un focus important d’investigació en el món sobre cèl·lules mare.
Aquesta hipòtesi es confirma gràcies a l’entrevista amb la doctora Malagelada i
pel fet que moltes investigacions que vaig consultar tenien participació catalana
(veure bibliografia).
A més, Catalunya consta d’una quantitat considerable de centres de recerca (com
el PRBB, l’Institut de Recerca Biomèdica de Barcelona i els diferents centres
hospitalaris) gràcies a les inversions públiques i la qualitat del sistema de salut i
dels investigadors (malgrat la crisi, que les està reduint i empitjorant-ne la
qualitat).
El nombre de publicacions no és comparable amb el de grans països que donen
molt de suport a la recerca, com els Estats Units, el Regne Unit o el Japó, però és
considerable i fan de Catalunya un focus a tenir en compte.
L’última hipòtesi (és necessari continuar la investigació sobre cèl·lules mare i
malalties neurodegeneratives) es confirma al llarg d’aquest treball. Hi ha moltes
qüestions desconegudes sobre les cèl·lules mare, la seva diferenciació, la
progressió del Parkinson i els seus inicis, etc, que fan que el desenvolupament
d’aquests dos camps de la medicina es vegin ralentins. Així, es fa molt necessari
continuar la recerca de les respostes, tant a nivell teòric com pràctic, les quals es
puguin aplicar a la vida de les persones per sanar-les i avançar en la cura del
Parkinson i d’altres, com la malaltia del Huntington, l’Alzheimer o l’ELA, totes elles
en espera d’una solució. Per aquest motiu, també cal invertir en investigació. Per
tant, la investigació sobre cèl·lules mare i malalties degeneratives és necessària i,
fins i tot, una obligació per a l’avenç de la medicina, al societat i les persones.
Cèl·lules mare i Parkinson Autor: Julián Bobis Camacho
80
En definitiva, la teràpia cel·lular podria ser una solució per al Parkinson, com es
pot veure a l’apartat de medicina regenerativa, teràpia cel·lular i Parkinson i en
l’entrevista a la doctora Cristina Malagelada, del departament de farmacologia de
la UB, i en l’estada al CMRB.
Per començar, hi ha precedents en ratolins i primats on es trasplantaven cèl·lules
dopaminèrgiques als seus cervells i milloraven els símptomes sense efectes
secundaris. Són una bona base per a continuar en la recerca d’un tractament.
A més, la teràpia cel·lular ja és un fet, com per exemple es fan sovint
trasplantaments de cèl·lules del moll de l’os, còrnia i pell.
En aquesta línia, s’estan desenvolupant aquelles investigacions sobre iPSC ja que
no causen rebuig en el pacient i s’obtenen fàcilment a partir de fibroblasts.
Constitueixen el següent pas en la investigació (actualment hi ha assajos clínics
per aplicar-les en humans, encara que estan en fase preclínica).
Per arribar a ser la solució, caldria corregir les mutacions o reaccions que causen
el Parkinson i evitar la transmissió de substàncies tòxiques entre neurones, que
en comprometria l’aplicació.
Ara bé, les cèl·lules mare com a tractament per restaurar les neurones mortes -ja
que generen noves cèl·lules- alberga esperances per al tractament de la malaltia i
la millora de la vida dels pacients, perquè en pocs anys s’ha avançat molt en la
investigació sobre cèl·lules mare i Parkinson i la perspectiva és bona, malgrat que
queda temps per l’aplicació i hi poden haver errors en aplicar-les.
Per tant, podem dir que la teràpia cel·lular és un possible tractament del
Parkinson en un futur, quan es coneguin les causes de la malaltia i aquestes es
puguin corregir per millorar els símptomes.
Conseqüentment, l’objectiu del meu Treball s’ha assolit i la resta de hipòtesis
plantejades s’han confirmat i matisat.
Ara bé, aquest treball tindria continuació, perquè és possible aprofundir més en
aspectes del Parkinson i les cèl·lules mare, per tal de solucionar els problemes
que encara plantegen, abans explicats.
Cèl·lules mare i Parkinson Autor: Julián Bobis Camacho
81
Respecte el Parkinson, es podrien descriure més detalladament el seguit de
processos que donen origen a la malaltia i com funciona la neurona malalta de
Parkinson, la seva progressió, és a dir, la mort neuronal i tot el que desencadena,
a més de l’efecte dels fàrmacs a nivell cel·lular i de la persona.
Es podria aprofundir en les cèl·lules mare: explicant les reaccions que originen la
diferenciació i el desenvolupament embrionari. Però, en la meva opinió, no es
podria continuar aquest treball de recerca que uneix cèl·lules mare i Parkinson,
perquè no hi ha més investigacions i informació que desenvolupin aquesta idea i,
per tant, fins que no avenci la recerca en aquest àmbit, seria fer suposicions.
Aquest Treball de Recerca ha estat una molt bona experiència. L’estada al CMRB
va ser molt profitosa, tant personalment com per al treball ja que ha enriquit molt
el meu treball i he après molt amb els professionals. Ha suposat la meva primera
experiència en un laboratori realitzant investigació i el primer contacte amb el món
de la recerca. M’ha refermat en el meu interès per la investigació i per dedicar-
m’hi com a professió en el futur.
He après a buscar informació per tots els mitjans, contrastar-la, a decidir quina
d’aquesta informació era important per al meu treball i redactar, una tasca
imprescindible per transmetre els coneixements i arribar a les conclusions.
Malgrat la gran quantitat de feina que suposa un treball de recerca i la quantitat
d’hores que cal dedicar, crec que és una bona preparació per al futur. Ha suposat
una inversió de temps i treball profitosa, a més que ha respòs satisfactòriament a
les meves inquietuds per conèixer coses sobre les cèl·lules mare i el Parkinson.
El meu treball Cèl·lules mare i Parkinson constitueix una experiència enriquidora i
enormement positiva, que m’acompanyarà al llarg de la meva vida.
Cèl·lules mare i Parkinson Autor: Julián Bobis Camacho
82
5. Fonts
Referències
- ABAD, María, et al. “ Reprogramming in vivo produces teratomas and iPS
cells with totipotency features”. Nature (EEUU). 502, 2013, p.340-345.
- ARDUINI, Brigitte. Teratoma Assay. Estats Units: Rensselear Plytechnic
Institute, 2013.
- ATHAUDA, Dilan; FOLTYNIE, Thomas. The ongoing pursuit of
neuroprotective therapies in Parkinson disease. Regne Unit: Nature
Reviews, Macmillan Publishers Limited, 2014.
- BI, Kun, et al. Generation of transgene-free iPSCs from Parkinson’s
disease patients. Estats Units: Life technologies, 2013.
- Cèl·lules mare i medicina regenerativa, programa professors i ciència de
CatalunyaCaixa. Espanya: CMRB, 2014.
- CHO, Myung-Soo, et al. Efficient derivation of functional dopaminergic
neurons from human embryonic stem cells on a large scale. Corea del Sud:
Nature Publishing Group, 2008.
- DE LA CASA FAGES, Beatriz. Guía informativa de la enfermedad del
Parkinson. Espanya: Federación Española del Parkinson, 2013.
- GARCÍA, Pedro. “Prehistoria de la enfermedad del Parkinson”. Neuciencias
(Espanya), 2004.
- GOLBE, Lawrence, et al. Parkinson’s disease handbook. Estats Units: The
American Parkinson Disease Association, Inc, 2010.
- GRAZIA, Maria, et al. “α-Synuclein in filamentous inclusions of Lewy bodies
from Parkinson’s disease and dementia with Lewy bodies”. Neurobiology
(Estats Units). 95, 1998, p.6469-6473.
- LANSKA, Douglas. History of Neurology. Estats Units: Elsevier B.V. , 2009
(Handbook of Clinical Neurology; 95).
- LIU, Guang-Hui, et al. “Progressive degeneration of human neural stem
cells caused by pathogenic LRRK2”. Nature Letters (Estats Units). 491,
2012, p.603-607.
Cèl·lules mare i Parkinson Autor: Julián Bobis Camacho
83
- Logoteràpia y Parkinson: alteracions de la parla en la malaltia del
Parkinson. Espanya: Associació de malalts de Parkinson de L’Hospitalet i
del Baix Llobregat.
- MARTÍ, Mercè, et al. Zebrafish heart regeneration occurs by cardiomyocyte
dedifferentiation and proliferation. Estats Units: Nature Letters, 2010.
- MARTIN, Gail. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos
cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Estats Units:
Procl. National Academy of Science, 1981.
- MCCULLOCH, Ernest; FILL, James. The radiation sensivity of normal
mouse bone marrow cells, determined by quantitative marrow
transplantation into irradiated mice. Estats Units: Academic Press Inc,
1960.
- MCCULLOCH, Ernest, et al. A stochastic model of stem cell proliferation,
based on the growth of spleen colony-forming cells. Canadà: Departament
de biofísica mèdica de la Universitat de Toronto i Institut del càncer
d’Ontàrio, 1963.
- MEJÍA, Eva. Sessió informativa. Espanya: CMRB, 2014.
- Musicoteràpia i Parkinson: un projecte de rehabilitació mitjançant la música.
Espanya: Associació de malalts de Parkinson de L’Hospitalet i del Baix
Llobregat.
- ORENSTEIN, Samantha, et al. “Interplay of LRRK2 with chaperone-
mediated autophagy”. Nature Neurosciences (EEUU). 16, 2013, p.394-406.
- PARKINSON, James. An essay on the shacking palsy. Regne Unit, 1817.
- RAYA, Angel, et al. Efficient and rapid generation of induced pluripotent
stem cells from human keratinocytes. USA: Nature biotechnology, 2008.
- REYNOLDS, Brent; WEISS, Samuel. “Generation of neurons and
astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous
system”. Science (USA). 255, 1992, p.27.
- SHULTS, Clifford. “Lewy bodies”. Proceedings National Academy os
Sciences (EEUU). 103, 2006, p. 1661-1668.
- SONG, Peipei, et al. “Perspectives on human clinical trials of therapies
using iPS cells in Japan: Reaching the forefront of stem-cell therapies”.
BioScience Trends: Japó. 7, 2014, p.157-158.
Cèl·lules mare i Parkinson Autor: Julián Bobis Camacho
84
- Stem cell facts. Estats Units: International Society for Stem Cell Research,
2011.
- THOMPSON, James, et al. “Embryonic stem cell lines derived from human
blastocysts”. Science (USA). 282, 1998, p. 1145.
- Tipus de cèl·lules mare. Espanya: CMRB, 2014.
- WOLTJEN, Knut, et al. “piggyBac transposition reprograms fibroblasts to
induced pluripotent stem cells”. Nature (Estats Units). 458, 2009, p.766-
770.
- YAMANAKA, Shinya; KAZUTOSHI, Takahashi. “Induction of pluripotent
stem cells from mouse embryonic and adult fibroblasts cultures by defined
factors”. Cell (Japó). 126, 2006, p.663-676.
- YAMANAKA, Shinya, et al. “Induction of pluripotent stem cells from adult
human fibroblasts by defined factors”. Cell (Japó). 131, 2007, p.861-872.
Webgrafia
- EuroStem Cell. www.eurostemcell.org (25 de novembre i 2 de desembre
del 2014).
- Centre de Medicina Regenerativa de Barcelona. CMRB. www.cmrb.eu (21
d’octubre i 1 de desembre del 2014).
- California’s Stem Cell Agency. Definiciones de célula madre.
http://www.cirm.ca.gov/our-progress/definiciones-de-c%C3%A9lulas-madre
(25 de novembre del 2014).
- Viquipèdia. Teràpia amb cèl·lules mare.
ca.wikipedia.org/wiki/Ter%C3%A0pia_amb_c%C3%A8l%C2%B7lules_mar
e (2 de desembre del 2014).
- Viquipèdia. Controvèrsia amb les cèl·lules mare.
http://ca.wikipedia.org/wiki/Controv%C3%A8rsia_amb_les_c%C3%A8l%C2
%B7lules_mare (2 de desembre del 2014).
- StemGen. International Database on the legal and socio-ethical aspects on
stem cells. www.stemgen.org (2 de desembre del 2014).
- National Institutes of Health. Stem cells Information. stemcells.nih.gov (25 i
29 de novembre i 2 de desembre del 2014).
Cèl·lules mare i Parkinson Autor: Julián Bobis Camacho
85
- National Institutes of Health. National Center for biotechnology information.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ (30 d’octubre del 2014).
- International Society for Stem Cell Research. www.isscr.org (2 de
desembre del 2014).
- Centre for Regenerative Medicine. Stem cells and Regenerative Medicine.
http://www.crm.ed.ac.uk/stem-cells-and-regenerativemedicine/regenerative-
medicine (2 de desembre del 2014).
- Generalitat de Catalunya. Diari Oficial de la Generalitat.
http://dogc.gencat.cat/ca (2 de novembre del 2014).
- Gobierno de España. Boletín Oficial del Estado. www.boe.es (2 de
novembre del 2014).
- BBC. First trial of embryonic stem cells in humans.
http://www.bbc.co.uk/news/health-11517680 (1 de desembre del 2014).
- Wikipedia. Stem cell. http://en.wikipedia.org/wiki/Stem_cell (27 i 29 de
novembre i 2 de desembre del 2014).
- El Periódico. “Científicos suecos descubren nuevas vias para curación del
Parkinson”. http://www.elperiodico.com/es/noticias/sociedad/cientificos-
suecos-descubren-nuevas-vias-para-curacion-del-parkinson-3668945 (1 de
novembre del 2014).
- Nature. Pluripotent Stem Cells, iP Cells.
www.nature.com/scitable/topicpage/turning-somatic-cells-into-pluripotent-
stem-cells-14431451 (27 de novembre del 2014).
- Abcam. Antibodies and reagents. www.abcam.com (28 i 30 d’octubre i 1, 2 i
4 de novembre del 2014).
- Wikipedia. Malattia di Parkinson. it.wikipedia.org/wiki/Malattia_di_Parkinson
(3, 4, 5, 9, 24 i 30 de desembre del 2014).
- Associació Catalana per al Parkinson. www.acaparkinson.org ( 3 de
desembre del 2014).
Treball de recerca
Rosa Díaz
Cèl·lules mare i Parkinson: Annex
Julián Bobis Camacho
2n Batxillerat B,
Departament de Ciències
INS Santa Eulàlia
L’Hospitalet, gener 2015
Cèl·lules mare i Parkinson Julián Bobis Camacho
2
Fotografies
Figura 3
DAPI PAX6 Superposició
Figura 4
DAPI SOX2 Superposició
Cèl·lules mare i Parkinson Julián Bobis Camacho
3
3.1.3.2. Observació d’ iPSC en un microscopi confocal
La primera fotografia és
l’expressió del marcador DAPI.
En la imatge es pot veure la zona
més acolorida, que correspondria
quasi amb la totalitat de la imatge,
excepte aquelles parts en negre
de les cantonades superiors. És
un control de l’experiment per
assegurar-nos de la presència de
cèl·lules a la mostra.
La figura 13 representa la
manifestació de l’anticòs anti-
Nanog, que s’uneix a un factor de
transcripció molt relacionat amb
l’autorenovació i el manteniment
de l’estat pluripotent de les ESC.
Aquesta proteïna es codifica a
través del gen Nanog i es situa al
nucli. Com que és un factor propi
de cèl·lules pluripotents i
s’expressa en aquesta mostra,
indica que les cèl·lules d’aquesta
es troben en un estat no diferenciat i mantenen la propietat de multiplicar-se.
Figura 12
Figura 13
Cèl·lules mare i Parkinson Julián Bobis Camacho
4
La imatge 14 és la manifestació
de la proteïna TRA-1-80 a la
cèl·lula. Aquesta proteïna es
situa a la membrana cel·lular de
les cèl·lules embrionàries.
Comparant aquesta il·lustració
amb l’anterior, es pot observar
que les parts més il·luminades
amb vermell aquí corresponen a
les parts amb un verd menys
intens a la figura 13. Aquest fet
afirma que en la colònia hi ha
cèl·lules que contenen
molècules pròpies de ESC, el
que es podria derivar en la confirmació de la seva potencialitat.
La figura 15 correspon a la
superposició de les expressions
dels tres anticossos anteriors. A
la imatge es visualitzen els
espais en vermell (citoplasma); el
color blau ens permet veure tots
els nuclis cel·lulars, mentre que
el verd, aquells que contenen
molècules pròpies de ESC
(extrem superior sobretot). Així
es pot fer una distinció en la
colònia de les cèl·lules no
pluripotents i aquelles que ho són.
Figura 14
Figura 15
Cèl·lules mare i Parkinson Julián Bobis Camacho
5
L’indicador DAPI, tal i com es
mostra en la imatge 16 de
l’annex, es concentra al ben
mig de la il·lustració. Hi ha
altres cèl·lules al voltant però
ens interessen sobretot les
centrals. Gràcies a aquest,
podem conèixer la ubicació de
les cèl·lules a través del seus
nuclis, definir l’àrea que ocupa i
la seva grandària com a
control de concentració.
La següent fotografia, figura 17,
correspon a la expressió de
l’anticòs anti-Oct4. Aquest
anticòs s’uneix amb la proteïna
Oct4, molt lligada amb
l’autorenovació cel·lular i les
ESC (normalment s’utilitza com
a marcador de cèl·lules
indiferenciades). Per tant, si és
un marcador de cèl·lules no
diferenciades, i en aquesta
colònia es manifesta, podem dir
que aquestes cèl·lules es
troben en un estat no diferenciat, semblant al de les cèl·lules pluripotents.
Figura 16
Figura 17
Cèl·lules mare i Parkinson Julián Bobis Camacho
6
Aquesta imatge, figura 18 és la
manifestació de l’anticòs anti-
SSEA3. La proteïna que
detecta és la SSEA3, un
glicoesfingolípid present en la
superfície de les ESC. Es
desprèn que aquesta mostra
conté el lípid i, per tant, conté
una molècula pròpia de les
ESC, indicant que les cèl·lules
de la colònia es troben en un
estat semblant a les cèl·lules
embrionàries i que podrien
tenir les mateixes
característiques que aquestes.
L’última imatge de la sèrie
(figura 19) és la superposició
de les tres fotografies
anteriors. En aquesta es pot
veure que al voltant dels
cossos cel·lulars d’un color
entre blau i verd hi ha punts
vermells que corresponen a la
proteïna de la membrana
cel·lular. Així la majoria de
cèl·lules de la colònia hi
expressen els tres marcadors.
Figura 18
Figura 19
Cèl·lules mare i Parkinson Julián Bobis Camacho
7
L’esfingolípid SSEA3, tal i
com es pot observar en la
fotografia 22, es mostra en la
colònia repartidament.
S’acumula sobretot a la
cantonada inferior dreta i en
petits cúmuls a la resta de la
superfície. Això exposa que
les cèl·lules de la mostra
contenen el lípid propi de les
ESC en el seu cos cel·lular,
cosa que ens va confirmant
cada cop amb més força seva
naturalesa.
L’última figura, fotografia 23
de l’annex, és la exposició de
les tres fluorescències
anteriors. Els nuclis, ben
definits, tenen un color entre
blau i verd que confirma la
doble pertinença de DNA i
Oct4. Aquesta imatge permet
veure com al voltant dels
nuclis turqueses hi ha punts
vermells que delimiten el seu
citosol ja que els esfingolípids
es situen a les membranes
cel·lulars. Les cèl·lules en
divisió tenen diferenciat el color verd del blau per la concentració en els
cromosomes de l’ADN, i moltes no tenen al seu voltant punts vermells
(expressió del anti-SSEA3), fet que significaria que estan en procés de
diferenciació i han perdut característiques pròpies de cèl·lules pluripotents.
Fotografia 22
Figura 23
Cèl·lules mare i Parkinson Julián Bobis Camacho
8
Figura 24
Cèl·lules mare i Parkinson Julián Bobis Camacho
9
El marcador DAPI, figura 25,
s’expressa amb normalitat i es
defineixen els nuclis cel·lulars,
encara que una mica
difuminats perquè es tractava
d’una colònia amb volum, per
la qual els nuclis es
superposaven.
En aquesta imatge s’observa
l’expressió de l’anticòs anti-
Sox2, que s’uneix a una
proteïna essencial per a
detectar cèl·lules
embrionàries i pluripotents.
També està present en
cèl·lules mare neuronals. La
manifestació d’aquesta
proteïna (tant en la colònia
circular com a l’esquerra de la
fotografia) evidencia el
caràcter semblant a ESC de
les cèl·lules de la colònia, a
més de tenir molècules pròpies de NSC, el que indica que es troben en un estat
anterior a cèl·lules mare neuronals.
Figura 25
Figura 26
Cèl·lules mare i Parkinson Julián Bobis Camacho
10
La següent fotografia, figura 27,
és la exposició de l’anticòs anti-
SSEA4 amb un fluorocrom
vermell. El SSEA4 és una
glicoproteïna situada a la
superfície de les ESC. Per tant,
la seva expressió en aquesta
colònia mostra que les cèl·lules
de la imatge són semblants a
les ESC, ja que sinó no tindrien
aquesta molècula en la seva
superfície i l’anticòs no s’hi
uniria.
La figura 28 correspon a
l’anticòs anti-TRA-1-60. Com la
molècula anterior, es situa a la
superfície de les ESC, per això
forma figures arrodonides amb
un buit interior on s’ubica el
nucli i el citoplasma. La seva
expressió és major que la de la
molècula anterior, tot i que es
manifesta de manera puntual
com a conglomerats no de
forma llisa com el Sox2 o el
DAPI. La ubicació d’ella en la
colònia indica unes característiques que s’assemblen a les d’una ESC.
Figura 27
Figura 28
Cèl·lules mare i Parkinson Julián Bobis Camacho
11
La superposició de les quatre
fotografies anteriors es plasma en
l’última fotografia de la sèrie. En
aquesta s’observen figures arrodonides
de color verd blavós (nuclis) sobre un
fons groc amb punts vermells
(membrana plasmàtica). Aquesta
fotografia ens permet visualitzar quines
cèl·lules de la colònia tenen les quatre
molècules abans detectades per
caracteritzar-les
Observació d’EBS en un microscopi confocal
La primera fotografia, figura 30,
es tracta de l’expressió del
marcador DAPI en una colònia
de EBs. Tal i com es pot
observar a la imatge, la major
concentració de cèl·lules,
definides pel nucli, es situen al
centre, disminuint la
concentració cap als extrems.
Encara que la intensitat del
color és baixa als voltants del
centre, hi ha cèl·lules en ella i
Figura 30
Figura 29
Cèl·lules mare i Parkinson Julián Bobis Camacho
12
cal tenir -les en compte.
La segona fotografia, figura
31, posa de manifest la
presència de la proteïna AFP
Aquesta proteïna es secreta
des del citoplasma cap a
l’exterior (per això els nuclis
cel·lulars estan enfosquits) en
la formació del fetge i l’intestí
durant el desenvolupament
embrionari indicant, així, que
és una molècula pròpia de
l’endoderm. Per tant, la seva
expressió en aquesta colònia
evidencia que hi ha teixit
endoderm en la colònia, sobretot al centre de la imatge on hi ha més intensitat
de color però també en una franja en diagonal. A més les cèl·lules ja estan
començant a adquirir una certa ordenació, símptoma que les cèl·lules s’estan
diferenciant i adquirint funcions característiques.
La següent fotografia, figura 32,
és la manifestació de l’anticòs
anti-FOX-2 unit a la proteïna
FOX-2, que indica divisió
cel·lular, ja que regula una part
de la transcripció i diferenciació.
La seva manifestació en
aquesta colònia fa palès que les
cèl·lules tenen capacitat per
dividir-se, reproduir-se i
diferenciar-se en tipus cel·lulars
més especialitzats.
Figura 31
Figura 32
Cèl·lules mare i Parkinson Julián Bobis Camacho
13
L’última imatge d’aquesta tirada és la
superposició de les tres anteriors
(figura 33). Es pot observar com hi
predominen els verds i els tons
roses. Aquest fet s’explica perquè la
majoria de cèl·lules de la colònia
tenen la proteïna FOX-2 que les
diferencia cap a teixits diferenciats
d’un organisme adult, i la proteïna
AFP, característica de l’endoderm.
Així, es desprèn que les cèl·lules de
la fotografia es diferencien cap a teixit
endodèrmic.
En aquesta figura 34 que
mostra el marcador DAPI en
la colònia es veu que els
nuclis de les cèl·lules es
troben més separats i són
més grans que en imatges
anteriors. Aquest fet podria
presagiar una major
diferenciació que en mostres
anteriors ja que les cèl·lules
adultes són més grans que les
cèl·lules mare. Per la resta, la
seva manifestació és normal i
l’esperada.
Figura 33
Figura 34
Cèl·lules mare i Parkinson Julián Bobis Camacho
14
La figura 35 ens aporta una
informació molt valuosa.
Primer, evidencia la presència
d’actina, una proteïna globular
que és un dels components
principals dels microfilaments
que formen la part contràctil
dels músculs. D’aquí es
desprèn el segon fet: intervé
en la mobilitat de molts tipus
cel·lulars, però en el nostre
cas, lligat al fet que es troba
en els músculs, fa d’aquesta
una proteïna molt típica del
mesoderm. L’àmplia manifestació de la actina en la colònia, el gran nombre de
filaments que es poden veure, l’alta definició i estructuració d’aquests
comporten que les cèl·lules de la imatge són pròpies del mesoderm i tenen
característiques d’aquesta capa germinal.
La superposició de les anteriors
imatges, figura 36, permet
visualitzar la ubicació dels
microfilaments segons el nuclis
cel·lulars. L’amplitud dels nuclis
també es veu reflectida a la extensió
dels citoesquelets d’aquestes i, per
tant, dels seus citoplasmes, més
allargats que amples (típic de les
cèl·lules musculars del teixit
muscular estriat).
Figura 35
Figura 36