DOCTORADO EN CIENCIAS Y BIOTECNOLOG(A DE PLANTAS

Aislamiento e identificación de metabolitos bioactivos de Colubrina greggii y Pentalinon

andrieuxii, dos plantas nativas de la Península de Yucatán

Tesis para obtener el grado de Doctor en Ciencias presenta:

QFB. Dafne Berenice Dominguez Carmona

Centro de Investigación Científica de Yucatán, A.C.

Mérida, Yucatán, México

2010

CENTRO DE INVESTIGACTON CIENTlFICA DE YUCATA A.C. POSGRADO EN CIENCIAS BIOLÓGICAS

RECONOCIMIENTO

Por medio de la presente, hago constar que el trabajo de tesis titulado "Aislam1ento e identificación de metabolitos bloactivos de Co/ubrina greggii y Pentalinon andrieuxii, dos plantas nativas de la Peninsula de Vucatán" fue realí~do en los laboratorios de la Unidad de Biotecnologla del Centro de Investigación Científica de Yucatán, A.C. bajo la dirección del Dr. Luis Manuel Pena Rodrlguez. dentro de la Opción de Biotecnologla perteneciente al Programa de Posgrado en Ciencias Blológicás de este Centro.

Para los efectos que sean necesaños,

Dr. Osear Alberto Moreno Va lanzuela Director Académico

Centro de Investigación Cienliñca de Yucatán AC.

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•

CENTRO DE INVESTIGACIÓN CIENTÍFICA DE YUCATÁN, A. C.

DECLARACIÓN DE PROPIEDAD

Declaro que la información contenida en la sección de Materiales y Métodos Experimentales, los Resultados y Discusión de este documento provienen de las actividades de experimentación realizadas durante el periodo que se me asignó para desarrollar mi trabajo de tesis, en las Unidades y Laboratorios del Centro de Investigación Científica de Yucatán y que dicha información le pertenece en términos de la ley de propiedad industrial, por lo que no me reservo ningún derecho sobre ello.

Dafne Berenice Domfnguez Carmona

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1 •

RECONOCIMIENTOS

Este trabajo se realizó en la Unidad de Biotecnologla del Centro de Investigación Científica de Yucatén A.C., bajo la dirección del Dr. Luis Manuel Pella Rodrfguez.

Las evaluaciones de actividad antiprotozoarla se realizaron en el laboratorio de del Dr. Alberto Gíménez Turba de la Universidad Mayor de San Andrés en La Paz, Bolivia, y en el laboratorio del M. C. Manuel Jesüs Chan Bacab de la Universidad Autónoma de Campeche.

Los experimentos sobre el receptor CXCR4 se realizaron en l!l laboratorio de Biomoléculas e Innovaciones Terapéu!lcas del Dr. Jean-luc Galzl, de la Facultad de Farmacia y Escuela Superior de Biotecnologla de Estrasburgo (ESBS), Franela.

La colecta del material vegetal se realizó con el apoyo del técnico Paullno Simá Polanco de la Unidad de Recursos Naturales, CICY.

Este trabajo de invesbgaclón fue frnanciado por el proyecto FOMIX­Yucatán (66262). los programas de colaboración del CYTEO (Proyectos X-5 y RIBIOFAR). el proyecto Alfa ·A chemtcal and computalional approach to explore relevan! blological processes by smaU-molecular probes obtalned rrom natural sources (EULAOIV)", Beca de Movirldad del CICY para estancias de investigación y por el Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologla (CONACYT) a través de dos Becas Mixtas para Estancias en el Extranjero [Bolivia (204971) y Francla(1 n004)] y una Beca para esll¡dios de Doctorado (CONACYT-204975) a Dafne Berenice Domlnguez Carmona

11

AGRADECIMIENTOS

A mi asesor el Dr. Luis Ma~el Peña Rodriguez, por haber tomado el riesgo de aceptarme en su grupo de trabajo, gracias por las Infinitas oportunidades de crecimiento académico y personal.

A los Integrantes de mi comité Moral y revisores de tesis: Dr. Luis Ma~el Peña Rodriguez. Dr. Rogelio PE!feda Miranda, Dr. Sergio Peraza Sánchez, Dr. Roberto Cadillo, Dr. Vlctor Loyola Vargas, Dr. Felipe Vázquez Flota, Dr. Gumerslndo Mirón López y Or. Jean-Luc Galzi.

AJ Dr. Alberto G iménez Turba y al Dr. Jean-Luc Galzl por aceptarme como parte de sus grupos de trabajo y ayudar en la realización de este proyecto.

AJ M C. Manuel Chan Bacab, a las Oras. Rosa Moo Puc, Muriel Hachet­Haas. Guilla Getti y Shlñey Fairhu.rst y a los Drs. Nlgel C. VeHch, Patrlcl< Gizzi, 8emard Bucher y Uonel HiD, por su ayuda en las evaluacíones y/o en la Interpretación de los resultados, asl como a la Q.B.B. Karllna Garcla Sosa, la 0 .8 .8. Fabiola Escafante Erosa, la Lic. Grace Ruiz Pinell, et M .C. David Gutlérrez Yapu y el Biol Paulino Simá por su dedicación y el apoyo técnico prestado. A la Al. Valerte Utard, quien me brindó su Infinita ayuda y amistad.

A mis compañeros de laboratorio en MéxiCO, Bolivia y Franela que estuvieron noche y d la acompañándome durante la reállzación de este trabajo.

A mis amigos Vlcky, Jericó, Daniela, Carlos L., Carlos C .. Rosalia, Cinlhya, Gerardo, Jeany, Glendy, Ellana, Eliel y Zhetmy por estar conmlgo durante estos afias; asf como .a Carolina, Erlka, Ana, Abraham, Francisco, Roberto, Marina y Gustavo por ensellarme qua la distancia acerca a las personas.

Un agr.¡decimiento especlal a Patnck por la confianza que depositó en mi.

A mi famma. Yolanda y catalina quienes me ensellan dla a dfa éon el ejemplo lo que es persevet"ancia, a Gregario por darme las herramientas para superar fas adversidades, a mis hermanos Ayax y Axel quienes a

lll

pesar de la dlslatlela slempce estén para apoyarme y a Emigdio, que me brinda fuerzas para seguir.

lv

DEDICATORIA

No podemos resolver problemas pensando de la misma manera que cuando los creamos.

Albert Einstein

A mi fami La •..

V

Reconocimientos Agradecimientos Dedicatoria lista de figuras lista de cuadros Lista de abreviaturas Resumen Abstract INTRODUCCIÓN REFERENCIAS

INDICE

CAPITULO 1. Antecedentes 1.1 Las enfermedades persistentes y parasitarias

1.1.1 El caocer 1 1.2 El VIH y SIDA

lil V

xlil xvll xlx xxi

xxili

1 3

5 6 5 6

1 1.3 las enfermedades parasitarias causadas por protozoarios 7 1.1.3.1 la leishmaniosis 7 1.1.3.2 la tnpanosomiasls americana 8 t .1.3.3 la malaria 9

1.2 La medlclna tradicional y los productos rialurales 9 10 1.2.1 Los produelos naturales como fuente de fármacos

1.2.2 las plantas como fuente de proouctos naturales de Importancia biOlógica 10

1.2.2. 1 Biogénesls de los productos naturales en las planias 1 O 1 .2.3 los productos naturales de plantas como agentes

terapéutlcos 1.3 Importancia del estudio 1.4 Objetivos

1.4.1 Objetlvo general 1.4.2 Objetivos partlculaJes

1.5 Estrategia eKpellffientaJ 1 .6 Referencias

vil

13 17 18 18 18 19 20

CAPÍTULO 2. Descripción taxonómica y conocimiento fltoqulmlco de Pentallnon andrieuxii (Müell. Arg.) B.F.Hansen & Wunderlln y Colubrlna greggll var.

yucatanensls M.C. Johnst 27 2.1 lnlroducción 27 2.2 Pentallnon andrieuxii (MOell. Arg.) B.F.Hansen & Wunderlín 27

2.2.1 DesaipciOn taxónomica de P. andrieux/1 (Müell. Arg.) S.F. Hansen & Wunderfin 28

2.2.2 Distribución geográfica 29 2.2.3 Usos etnobolénlcos 30

2.2.4 Conocimiento fltoqulmico y actiVIdad biológica de la famhla Apocynaceae 31

2.2.5 Conocimiento filbqulmlco y actividad biológica de género Pentalmon 32

2.3 Cclubrina greggfl S. Watson var. yucataflflfiSis M.C. Johnsl 33 2.3.1 Desaipción botánica de C. greggfl S. Watson var

yucatanensls 33 2.3.2 Distribución geográfiCa 34 2.3.3 Usos etnoboténlcos 35 2.3.4 Conocimiento litoqulmico y actividad biológica de la familia

Rhamnaceae 35 2.3.5 Conocimiento rrtoqulmico y actividad biológica del género

Colubrlna 36 2.4 Referencias 39

CAPÍTULO 3. Actividad leíshmaníclda de los extractos crudos y fracciones de partición de Penta/lnon andrieuxii Müell. Arg. y Colubrlna greggli S. Watson 43 3.1 Descripción del capitulo 43 3.2 Leishmanicldal acllvity of yucatecan med'teinal plantas on Lt~lshmania species responsible for cutaneous lelshmanlasis 44

yj¡¡

3.2. 1 Abstrae! 44

3.2.2 lnlroduction 45

3 .2.3 Materials and melhods 46

3.2.3.1 Plant material 46

3 .. 2.3.2 Preparation of extracts and lnitia.l fraotionation 4 7 3 .2 .3.3 Leishmanlcldal activlty assay 48

3 .2.3.3.1 MTS assay 46

3.2.3.3.2 OpHmizalion of MTS assay 46

3.2.3.4 Lelshmanie spp. para.siles and cellllnes 49

3.2.3.5 Stallstical analysls 50 3.2.4 Resulls 50 3.2.5 Olscussion 55

3.2.6 Acknowledgments 55

3.2. 7 Uterature cited 56 3.3 Información adicional 59 3 3 .1 Materiales y métodos 59 3.3.1.1 Procedimientos generales 59 3.3 .1 .2 Obtención del extracto organico crudo y fraccionamiento

Inicial del extracto orgánico crudo 60

CAPÍTULO 4. Actividad antiprotozoarla del ácido betullnlco

y sus derivados 61 4.1 Oescrlpclón del capitulo 4.2 Anliprotozoal activlty of betulinic acld derlvalives

42.1 Abstract

4.2.2 lntroductlon

4.2.3 Materlals and Melhods

4.2.3.1 Planl material

4.2.3 .21solalJOn of betulinic acid (1)

4.2.3.3 Preparatlon of betullnic acid derivallves

4.2.3.3.1 Betullnlc acid aoatate {2)

4 .2.3.3.2 Belulonic acid (3)

4 .2 .3.3.3 Betulinic acid melh)'l es!er (4)

lx

61 62

62 63 64

64

64

64 64

65

65

4.2.3.4 Lelshmanlcidal assay 65

4.2-3.5 Trypanocldal assay 65

4.2.3.6 Antlp!asmodlal assay 66

4.2.4 Results and Discusslon 66 4 2.5 Acknowledgements 69 4.2.6 References 70

4.3 Datos espectroscópicos del ácido betulinico y sus derivados semlsintéticos 75 4.3.1 ÁcidO betullnico (1) 76 4.4.2 Acetato del écldo betulfnico (2) 75 4.4.3 ÁcidO betulónlco (3) 75 4.4.4 Ester metllioo del ácido betulfnico (4) 76

CAPÍTULO 5. Metabolitos de Colubrlna greggll var. yucatanensis y evaluación de su actividad antiprotozoaria

y cltotóxica 79 5.1 Descripción del capitulo 79

5.2 Meta bolitas from rools of Colubrlna greggif var yucalanensls and

evauation of thelr antiprotozoal'l and cytotoxic actlvity 76

5.2. 1 Abstract 80 5.2.2 lntrodudlon 80 5.2.3 Resulls and dlscussion 82

5.2_4 Experimental 87

5.2.4.1 General ExperimeolaJ Procedures 87

5.2.4.2 Plant material 87

5.2.4.3 Extractlon ot plant material and purification of crude

extract

5.2.4.4 3-0-acetyk:eanothfc acld (1)

5.2.4.5 Ceanothic acld (2) 5.2.4.6 3-0-acetykilmethykeanothate (3)

5,2.4.7 Dlmethyt-ceanothale (4) 5.2.4.8. Ceanothenlc acid (5)

5.2.4.9 Betullntc acia (6)

88

88

88

89 89 89 89

5.2.4.10 Discañne 8 (7) 5.2.4.1 1 Chrysophanem (8) 5.2.4.12 Clvysophaneln peracetate (9) 5.2.4.13 Bloassays

5.2.4.13.1 leishmanlcidal assay

5.2.4.13.2 Trypanocldal assay

5.2.4,13.3 AnUplasmodlal assay

5.2.4.18.4 CytotoxlcJty assay

5.2.4.13.5 AntiproHferauve assay

5.2.4.13.6 Statisticel ana!ysis 5.2.5 Acknowledgements 5.2.6 Support ioformatJon

5.2. 7 References

90 90 90 90 90 91 91 91 92 92 92 93

101

5.3 Principales características en los espectros de resonancia magnélica nuclear del ácido 3-0-acetllceanóUoo 106

CAPiTULO 6. Penta/lnon andrleuxii como fuente de

metabolltos antagonistas a la asociación CXCL 12/CXCR4

111 6.1 Introducción 6.2 Materiales y métodos

111 113

6.2.1 Procedimientos generales 113

6.2 .. 2 Purificación del extracto crudo de P. andrieux/1. 114

6.2.3 Ensayos sobre receptores 114

6.2.3.1 Unión de CXCL 12-TRIEGFP.CXCR4 en Uernpo real114 6.2.3.2 Ensayo de •nlemallzación del re<;eptor EGFP.CXCR4

115 6.2-3.2.1 Visualización de la intemalizaaón del receptor

EGFP-CXCR4 pormicroscopla 115

6.2.3.2.2 Cuantificación de la intemalizaclón del receptor

EGPF-CXCR4 empleando anticuerpos 116

6.2.3.3. Mediciones de segundos mensajeros 117

6.2.3.3.1. Movilización del calcio intracelular 117

xl

6.2.3.3-2 Inhibición de la producclón del adenosin

monofosfato c!cllco (AMPc) 117 6.3 Resultados y discusión 118 6.4 Referencias 134

CAPÍTULO 7. Conclusión general y perspectivas 139

xii

USTA DE FIGURAS

Figura 1.1. Principales rutas del metabolismo secundario. 12

Figura 1.2. Productos naturales y derivados utlllzados

como fármacos. 14 Figura 1.3. Agentes qulmlopreventlvos y sus derivados

aislados de plantas. 15 Figura 1.4. Principales productos naturales, derivados naturales y

semísintéticosy productos sintétiCos modelados de

productos naturales. con actividad anllmatárlca 16 Figura 2.1. Pemalinon andrewdl (MOetl. Arg.). 29 Figura 2.2. Distribución de P. andreuxl7 (M\ieD. Arg.) B.F. Hansen

& Wunderiin 30 Figura 2.3. Esfructuras de algunos metabolilos bioactivos do la

famRía Apocynaceae . 32 Figura 2.4. Tri-nor-sesquiterpenos obtenidos de la rafz de

P. andrieuxil. 33 Figura 2..5. Colubrina greggíl S. WaiSon var.yucatanensis

M.C.Johnsl 34 Figura 2.6. Distribución de las variedades de C. gr:eggli S. Watson.35

Figura 2.7. Ejemplos de metabolltos obtenidos del género

Colubrina. 37

Figura 2.7. (conL) Ejemplos de metabomos obtenidos del género

Colubrirta. 38 Figure 3.1. The effecl of DCG-3A and TPZ-2A (5 ¡.tg/ml) on

terminally dlfferentiated THP-1 cells infected with L selhioplca is reponed. 54

Figure •4.1 . Structures of Betulinic actd (1), Belulinlc acld

derivalives (2-4) and betulln (5). 67 Figura 4.2. Espectros de ' H-RMN de ácido betullnlco y acetato

del ácido betullnlco 77 Figura 4.3. Espectros de ' H-RMN de ácido betulónlco y

ester metnlco del ácido betulinlco 78 Figure 5.1. Structures of the natural and semisynthetfc

xiii

Figure 5 .. 2.

Figure S.~.

Figura 5.4, Figura 5.5.

Figura 5.6.

Figura 5.7.

Figura 5.8. Figura 8.1.

Figura 6.2.

Figura 6.3.

Figura 6.4.

Figura 6.5.

Figura 8.8.

derivallves compounds from C. greggH 84 Principal H-H COSY couplings and HMBC correlations 3-0-acetyi-ceanothlc acld (1) 93

TLC analyses of 3-0-acetyt éeanothic acld In the

cruda extract of root from C. greggfl. 100

Espectro de ' H-RMN del ácido 3-0-aceblceanótico. 106

AmpRación del experimento H-li COSY del ácido 3-0-acetllceanótlco. 107

Ampliación del experimento HMBC del écldo

3-0-acetiiGeanótico. 108 Ampllaclóo del experimento HMBC del écldo 3-0-acetlloeanótico. 109 Espectro de 'H;RMN de la discarfna 8 110

Porcentajes de Inhibición de la unión de CXCL 12-TR

con el receptOf EGFP-CXCR4 por efecto del

exlracto cnJ<Io y las fracclones semipurif1Cadas de P. andrieuxJ7. 119

Porcentaje de fnhfbiciOn de la unión de la qulmloclna CXCL 12· TR con el receptOf EGFP-CXCR4

por efecto de las fracciones PA-'IA-4M. 120

Porc;entaJes de lnl1ibld6n a diferentes mneoolraQanes de 18 lnlcclón PA-4K en la unl6n ds la qulmloclne CXCL 12-TR cort 111 receptPr EGFP-CXCR4. 121 Vla de transducclón de señales Inducida por la unión de CXCL 12 al receptOf CXCR4, reladooadas principalmente a la mlgra.ción y la qulmlotrutis;

otros efectos incluyen la supervivencia, proliferación y transcripción celular. 122

Obs81Vaci6n por mlcfoscopia de fluorescencia del efecto del extracto crudo de P. andrieuxii(PA-1) y sus fracciones

de purillcacl6n (PA-3A-3C, PA-4K) en la lntemafizaclón del receptor EGFP-CXCR4 expresado en células HEK-293. 124

Cuantlf•cac!ón porcentual de receptores EGFP-CXCR4

xiv

presentes en la membrana plasmática en ¡xesenda de las fracciones semipurñiCadas de P. andriellldl

(PA-3C, PA-4K y PA-4G). 126 Figura 6.7. EValuación de la fracdón PA-4K sobre la movilización

de calcio lnlracelular en células HEl<-293 EGPF-CXCR4. 127

Figura 6.8. Inhibición dosis dependiente en la producclón de

AMPc en células HEK-293 EGPF-CXCR4. 128 Figura 8.9. MovUizacíón de calcio lnlrace!ular por activación de

qulmlocínas en células HEK-293 EGPF-CXCR4 ó HEl<-293 CCR5, en presencia de la fracclón PA-4K. 129

Figura 6.1 O. Inhibición de la movilización del calcio intracelular en

células HEl<-293 EGPF·CXCR4. 130 Figura 6.11. Perfiles cromatogréflcos por HPLC en fase reversa

de lasfracolones PA·5C. PA-50 yPA-5F. 131 Figura 6.12. Perfiles cromatogréflcos y co-cromatografla por HPLC en

fase reversa de las fracclones PA-4K y PA-50. 132

XV

xvl

LISTA DE CUADROS

Table 3.1. Ust of plan! exttacts, fracllons, and pure melaboUtes

from Yucatecan ptants. 51 Table 3.2. Effect of 24-hr treatmenl wlth the plan! extracts ata

cooeentraUon of 100 IJg/ml on L aelhfoplca, L. mejor and L tropica metacycllc prcmastigotes. 52

Table 3.3. L050 and RMP values extrapolaled from probit anatysis

wilh loglt transformalion of dose-response data. 53 Cuadro 3.4. Rendimientos de los extractos orgánicos crudos y las

fnaccíones de partición llquklo-llquldo de las especies

en estudio. 60 Table 4. 1. IC:¡o (¡JM) values of antiprctozoal actfvity of betullnlc acld

and derlvates. 68 Table 5.1. leishmanlcldal, ttypanocídal, antiplasmodíal and cytotoxlc

activity [IC,., (1J9· mL''ll of aude extrsct. fnacltons and

pure compounds from C. greggii. 86

Table 5 .. 2. ''e and 1H NMR data forihe ceanolhane compounds 3-0-

acetyt ceanolhlc 8CKI (1). acetyH!imethyt ceanolhate (3). dimethyl ceanothate (4) and ceanothenlc acld (5) (ppm). 94

Tablo 5.2. (Con!.) 13C and 1H NMR dala for !he ceanothane

compounds 3-0-acetyl ceanothlc acid (1 ), acetyt-dlmethyt

ceanothate (3), dlmethy1 ceanothale (4) and ceanothenlc

acld (5) (ppm). 95 Table 5.3. ' 3e and 'H NMR data for oompounds a· and 9. 97 Tabla 5.4. 1H and ''e NMR spectroscoplc data for 7 in CO,OD

at 30 •e (400 MHz). 98 Table 5.5. Cytotoxic activlty ¡ee50 (¡¡g·mL1)) in Hela, KB, HeP-2

and VERO cells of pure metabolítes from C. greggü and

sem•synlhelic derivativas. 99

Table 5.6. lnhíbffion of the growth (IGt.a (119·ml'1}]ln Hela, KB,

HeP-2 and VERO cefls of pore compounds lsolated

from C. gregg/1. 100

xvll

xvlll

USTA DE ABREVIATURAS

TLC Thin !ayer ~hromatography

Cromatografía en capa delgada

NMR

COSY

HSQC

DEPT

HMBC

THP-1

VERO

HEP-2

KB

NUClear magnetlc resonance

Resontmeia magn611ca nuclear

Correlation speclroscopy

t=spectrosccpfa de COITIJIIICJórJ

Heteronuclear single quantum coherenóe

CoutJiaclón t1eteronucJeer a Simple cuanto

Distortionless enhancement of polii!riU!tlon transfer

Incremento sin ClislorsJórJ por transferencia de po/srfzsdón

Heteronudear multiple bond correlation

C<Nrelación heteronuc/ear a varios enlaces

Human acute monocytlc leukemia cells

Células de leucemia monocltlca aguda humana

Green monkey kldney cells

Células de ññón de mono verde

Human latyngeal ~rclnoma cel!s

Células de carcinoma /arlngeo humano

Human nasopharyngaal carcinoma cells

Células da carcinoma nasofaríngeo humano

xlx

HELA Human cervical adenocarclnoma cells

Qllulas de sdenocarcinoma da C{¡rvfx humano

HEK-293 Human embryo lódney ttansrorms cells

Qllu/as úasfotmadas de riñón de embrión humatiQ

GPCRs G Pl'otein Coupled Receptors

Racaptores acoplados a prota/nas G

FRET Auorescent Resonanca Energy Transfer

Transferencia da anargfa de nuorescancla por resonancia

EGFP Enhanced Green Fluorescent Protetn

Proteína verde ffaorescante mejorada

CXCL 12-TR Chemoklne CXCL 12 tagged lO Texas red

Qulmíocin.a CXCL12 unidas rojo TeXBS

AMPc Adenosin Monopl1osphate cy~:llc

Adenosin monofosfalo clcllco

PBS Phosfate.buffered safine

Amortiguedarfosfato salino

BFS Bovina Fetal Serum

Susro fetal bovino

BSA Bolline Serum Albumin

Albúmina séric:a bovina

SRB Sulforhodamine B

Sultorodamina B

RESUMEN

las plantas son una fuente Importante de moléculas de interés farmacofógioo. Recientemente, como resultado de un estudio de bíoprospección de fa flora endémica y nativa de la Peolnsula de Yucatán. se repolió que el ex1racto de las hojas de Pentalinon andrleuKii posee actividad lelshmank:ida y que el extracto de la ralz de Co/ubrina grt~ggli posee actividad citotóxka y antlprotozoarla, Como una continuación de diCho estudio. los objetlllos principales de este trabajo fueron el Uevar a cabo la purificación blodfrlgida y la identificación de metaboli!os bfoactlvos presentes en los extractos orgánicos crudos de C.greggii y P.andr/6uxll.

La purificación de las fracciones bloaclivas de P. andrioux/1 condujo al aislamiento e identificación del ácido betulfnieo y el taraxasterol; en fanto que de C. greggi/ se obtuvo un nuevo producto natural idenllflcado como ácido 3-0-aceUJceanóUco. junto con el ácido ceanótlco, el ácido ceanoténico, la discarlna B y fa crisofaneina. La actividad antlprotozoaria del ácido betulink:o muestra que esto metaboflto conlnbuyo a la actlvidad antimalárica y lripanocida de les fracciones biOactlvas de P. andrleuxl/ y C. greggü, pero no a la actividad leishmanlckla. Sin embargo, los metabolltos aislados de C. greggil los ácidos 3-D-acetílcean6ti y ceanoténlco posean una moderada actlvldad lelshmanickla; estos últimos, al Igual que la discarina B y la crlsofanelna, poseen una baja actividad tripanocida.

Los estudios de estructura-actividad realizados con los écidos betulfnico y céanótico, los dos tritefl)enos más abundantes, que permitieron eslablecer la importancia del grupo oxhidrflo en la poslclón C-3 y del carbonllo en la posición C-28, para la actividad antlprolozoarla. Los resuilados obtenidos mostraron que lll$ modificaciones en la posición C-3 de la estructura del ácido betullnlco aumentan la acUvldad leishmanlclda (e.g. acatato de écldo betulfnlco y écido betufónico), mientras que las modifiCaciones en las posiciones C-3 o C-28 de todos los derivados probados, disminuyen la actividad lripanocida. Por otra parte, las modíficaciones en C-3 y C-28 del ácido ceanótico desmotraron que estos grupos no son esenciales para la expresión de actividad lelshmaniclda y tripanoclda. Rnalmente, las evaluaciones realizadas con la fracción de polaridad alta de los extractos de P. andrieUXJi, así como en las lra<x:lones semipurifiCadas, detectaron la presencia de metabo!itos de naturaleza polar con actividad antagonista a la asociación CXCL12/CXCR4, y CCL5/CCR5. Estos resultados refte)an la Importancia de P. andrlewáJ como fuente de molécutas con actividad biológica sobre blancos terapéuticos novedosos y principalmente como lnhlbldores de la entrada del VIH.

xxf

'"'"

ABSTRACT

Planls are an importan! soorce of mo!ecules of pharmacologlcal lnterest. Recen11y, as a result of a bioprospection study on !he endemlc and natJVe llora from the Yuca tan Península as source of bloactive metabolltes, it was reportad thal the leaf crude extract from Pentalfnon andrieuxH posses leíshmanicídal actlvlty and lhat !he root crude exlract lrom Colubrina greggii has cytoloxic and antlprotowal actlvlty. To conUnue wlth this study, the maln objecUve of this work was lo carry out the bioassay-gulded purificaUon and ldentíflcaUon of bloactive metabollles In !he cruda organic extracts of C.gregg/1 y P.andrieux/1.

PurmcaUon of the bloactive lraclions led to the isolatlon and ldentlficaUon of betullnic acld and taraxasterol lrom crude extrae! ol P. endr/euxíl: wllíle the cruda extract ol C. graggO yielded a new natural product ldentifled as 3-0-acet)iceanothic acld, together wllh ceanothic acld. ceanothenlc acid, dlscarlne 6 and ctvysopllanein. The anttprotozoan ac1rv1ty of beluOnic acld showed that this metabohte con1rlbutes to !he antipfasmodíal and l!ypanocidal actMtles of !he bioactive fraclioos from P. andriew111 and C. graggr1, but no! to their lelshmanicldal actlvity. However, the metabolltes lsolated from C. gregg/1, 3-0-acetyfceanothlc acld and cenothenlc acid, pos ses a moderate lelshmanlcidal aclivlly and, together wlth discarine B and chtysOI)hanein, have a wealc irypanocidal activíty

Structure-activlty relalionshlp studies carried oot oo betulimc acid and ceanothic acid. !he two rnost abundan! lriterpenes, allowed to estabilsh the lmportance of the hydroxyl group at C-3 and of the carbonyf group al C-28, In lhe expresslon of leíshmanlcidal acUvlly. Results showed thel modlflcatlons in the C-3 posiUon lncreased leishmanlcldal ilctivity (e.g, betullnic ac<d acelate and betu!onlc acid), wtlUe modlflcations or C-3 or C-28 In en derivalies testad. decreased the l!ypanocldal activíty. Alternallvely, modifiCStions in C-3 or C-28 of ceanothlc acid showed lhal these posilions are not essentlal for the expresslon of lelshmanlcldlal or trypanocldal activllies. Flnally, evaluallons of the hlgh po!arity fractlon from crude extracts of P. andrieuxü, together with the semlpurified fractlons, a!lowed detectad the jl(esence of polar melabolites wíth antagonis! aCI!vity to tite associatlon of CXCL 12/CXCR4 and CCLSICCR5. These results reftect the ímportance of P. andrieuxii as a source of molecUles with biological actlvity towards novel therapeutio largets and, in padlcular, as lnhibitors of the HIV entry.

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INTRODUCCIÓN

En la actualidad los tratamientos para enfermedades de tipo emergentes. persistentes e Infecciosas son deficientes. Asimismo, las enfermedades emec-gentes como el VIHISIOA. han Incrementado la persistencia de otras enfermedades como lo son las de tipo parasitario (WHO, 2002: Desjeux. 2000). Las enfermedades huérlanas como la leishmaniosls. trlpanosomiasls y la malaria conjuntamente con la aparición de microorganismos patógenos resistentes a los medicamentos de primera lfnea, reflejan la Importancia de desarrollar nuevos y más eficientes fármacos (Kayser el al., 2002; WHO, 2004; Croft el al., 2006).

Los productos naturales son la fuente más consistente y exitosa de moléculas lldec-es de uso farmacol6gtco, ya que tlan provisto una mayor cf.versldad estnJctural que las moléculas obtenidas por ta quimK:a combinatoria clásica (Harvey, 2000). Teniern:!o en cuenta que se han reportado 135,330 moléculas ten sólo de origen vegetal y que cuentan con 5,750 esqueletos diferentes (Cordel! el al., 2000),1as plantas son una fuente potencial de moléctJlas bloacUvas.

En la bllsqueda de productos natutales novedosos de origen vegetal y con potencial para el desarrollo de nuevos fármacos, se ha utilizado como estrategia. estudiar a especies vegetales ubicadas en las reglones ricas en b!odiversidad y que adk:ionalmente tengan informaáón elnobotánica (Marceno el al., 2002).

En México, con su extensa riqueza natural y cultural, existe un número Importante de especies vegetales comunmenta utilizadas en la práctica de la medicina tradicional; sin embargo, hasta ahora. menos del 2% de las especies vegetales han sido estudiadas en relación con la produoclón de metabolitos bioactivos (Medles 81 al., 1993),

Como parte de un proyecto dirigido a la evaluación de la blodlversidad de la peninsula de Yucatan como fuente de metabolitos bloactlvos, se evaluaron en una sec-ie de bloensayos.los extractos crudos de ralees, tallos y hojas de un grupo de plantas nativas de la península de Yucatan; los resultados de esta evaluación indicaron la presencia de acUvidad cltot6xica y antiprotozoarla (lelshmanlclda, tripanocida y antiplasm6dica) en el extracto de ralz de Cclvbrina greggO (Veca-Ku, 2003)

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y actividad leishmanlcida en el extracto de hojas de Pentalinon andri&uxil (Chan-Sacab el al., 2003).

El oonoclmiento fitoquímico de estas dos especies solamente Incluye la presencia de la antraqulnona entfmlcroblana crisofanol en la especie Colubrlna gragg•1 (Rhamn_aceae) (Garcfa.Sosa el al., 2006) y de dos nor-sesqulterpenos con esqueleto novedoso de PentalfnQn andrieuxn (Apocynaceae) pero sfn actividad biológica (Yam-Puc el el., 2009).

Debldo al escaso conodmiento fitoqufmlco de C. greggii y P. andrieuxii, asl como a la presenCia de una interesante actividad biológica, se planteó como objebvo general en este trabajo, el aislamiento e ldentílicacl6n de los metabolilos bioactivos producidos por estas dos especies nativas de la penlnsula de Yuca~n

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REFERENCIAS

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CAPITULO 1

Antecedentes

1.1 LAS ENFERMEDADES PERSISTENTES Y PARASITARIAS

8 cancer es una de las enfermedades persistentes más conocidas, afecta al 13% de la población mundial y es considerada por la Organización Mundial de la Salud (OMS) como la tercera causa de muerte a nilrel mundial (WHO, 2008). El síndrome de inmunodeficlencJa adquirida (SIDA), junto con las enfermedades infecciosas y parasltadas (e.g. leishmaniosis, lripanosomiasls, malaria, eto.), ·se encuentran entre las d iez principales causas que conducen a ta pérd.ida de años de vida y muerte prematura (Hotez et al., 2007). En México, los casos de cancer causan el 12% de la mortalidad y aunque las enfermedades Infecciosas y el SIDA muestran una bajq tal><! dt> mortalidad (0.6 y 0.8%, respectivamente; SSA, 2008}, la persistencia de esta.s enfermedades las convierten en un problema seno para el sector salud, y para su solución se requiere ~e un trabajo integral entre las Instituciones de salud, las unlversKiades y los centros de lnvesUgación.

1.1.1 El cáncér

El cáncer es un conjunto de enfermedades ocasionado por la proliferación continua de células anormales que ·afecta a· 7.9 millones de per.¡onas en el mundo (Aiberts el al,, 1'999¡ WHO, 2008). En la lucha contra el cáncer, los tratamientos se han basado primordialmente en el uso de agentes cl!otóxlcos; estos productos son poco· selectivos y afectan tanto a las células cancer!genas como a las normales .. ocasionando severos efectos adversos, 8 cáncer, junto con otros padecimienlos relacionados con un proceso Inflamatorio crón!co como la artritis reumatoíde, los procesos degenei¡¡tivos a:;oclados con el envejecimiento y las enfermedades neurodegenerattvas, se les ha relacionado con un estrés oxidativo pen;i!;lente. entendido como la continua pérdida del balance entre !as especies reactivas de oxigeno (ERO's; e.g. radi<;ales superóxído, oxhldrilo y peroxilo) y las defensas antíolddahtes celulares (Ames el al .. 1993; Males el al., 2000). En la actualidad la quimioprevención, que consiste en la administración de agentes antioxidantes y anliinflam;;~torias que eviten estas condiciones, se ha adoptado como una estrategia para disminuir la

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incidencia del cáncer y otras -enfermedades· relacionadas con el proceso inflamatorio crónico (Eskens & VS~Weij., 2000; Kinghom el al., 2004; Keil, 2Q09).

Recientemente se ha reconocido al -receptor qulmloclna CXCR4, como uno de los más importantes en la respuesta inflamatoria, ya que esta implicado en el iráfico y r~clutamiento de leucocitos en el sitio donde se libera su ligando endógeno, la quimioc[na SDF-1 (factor derivado de células del -eslfoma) ó CXCL 12 (Murdooh, 2000), Asimismo, se ha reportado que las células malignas por lo menos 23 tipos de cáncer ·expresan el receptor CXCR4 y responden .a CXCL12. Este receptor esta Involucrado en la migración directa de las· células cancer1genas a tos sit!os de meiástasls, inc;rementando 1¡¡ supervivencia de las célúías·y su establecimiento (Balkwlll, 2004; Slagsyold al af, 2006), por lo que se ha sugerido que el receptor CXCR4 y la qulmloclna ·cxcL 12 p,uedef? s~ posibíes blaflCOs terapéuttcos para el ttatamlento del proceso_ metasláslco (Zeelenberg et al:, 2003; Kucfa el al., 2004).

1.1.2 El VIH y SIDA

El SIDA. ocasionado por el virus de la lnmunodefrclenQla humaha (VIH), que infecta las células del sistema Inmune, representa· uno de los padecimientos má.s.lmportantes de este siglo. En la actualidad existen ·32 millones de personas viviendo con VIH/SIDA en el mundo. Se. calcula que ocurren aproximadamente 13,700 nuevos casos por dla y que eada al'lo 2.2 míilooes de personas mueren por causas relacionadas a. este padeclmlento (WHO, 2008). IOn América LaUna la cifra estimada de infectados de SIDA es de 1.5 millones (WHO, 2002). Hasla ahoca, las templas farmaeológica.s para el control del S!DA tienen como objetivo diferentes blancos en el ciclo de repltcacl6n del virus: 1) inhibidores,de la entrnda (e.Q. T-io y maravlroo): 2) antirretrovtra!es. que pueden ser análogos de . los .nucleósJdos (e.g. zldovudine), análogos nucleotidlccs (e.g. tenefovir) y aná.logos no nucleosidlcos (e.g. nevlraplne); 3) inhibidores de la jntegrasa (e.g. raltegrnvir); 5) lnhibidores-de la proteasa (e.g, lndinavir); y 6) inlíibidores de la maduración (e.g. hldroxlurea). Cabe mencionar que una d.e las lineas de VIH-1 resistente a las drogas anUvirales llene tropismo X4, que está asociado con una répida -progresión de la enferm.edad debido a la disminución en la cantidad de Gélulas T CD4+ y que utiliza como co­receptot, a l receptor de quimloclna CXCR4 en linfocitos T y Gélulas permisivas. (Markowltz et al., 2005; VieO!ard el al., 2008}. La Importancia del receptor CXCR4 en el desarrollo del VJJ-1, igual que como se mencionó

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anteriormente para el cáncer, to sitúan como un lmport$inte· blanco para la búsqueda de nuevos y más l!flcientes tratamientos pqrq estos padecimientol; (Tsutsumlat al., 2006),

1.1.3 Las enfermedades parasitarias causadas por protoz.oarios

las enfermedades pamsitarias cons1ltuyen el .grupo de enfermedades lnfecaiosas más imJ)Grtantes de la humanidad, no sólo por su Incidencia, sino también por w prevalencia (WHO, 2004). Dentro de este grupo ·de enfermedades podemos ubicar a las causadas por parásitos protozoarios como lo.son la leishmaniosis, la tripanosom!asls y la malaria.

1.1.3.1 la lelshmanlosls

la leishmaniosis es Una de lás enfermedad¡;& infecCiosas más Importantes en las zonas tropicales del mundo; el'te conjunto de enfermedades actualmente afecta a 12 mUiones <le personas, en 80 palses del mundo-y en México-se reportaron 710 casos durante el año 2008 (WHO, 201 O; SSA. 2008). Recientemente la lelshmanloSil? ha cobrado. particular Importancia, dada su asociación con el VIH; la cofnfecclón Leishmánia-VIH se ha reportado en 33 paises. y se estima que de 1.5· a .9% de los pacientes con SIDA pueden desarrollar lelshmanlosís (Rosenthal et ª'" 1 995; Desjeux, 2000). Esta enfermedad es cau$ada por un parás_ito protozoario flagelado del Qéne¡o LB/shmanw (familia Trypanosomalidae); los diferentes complejos de especies que producen telshmanioSis se han asociad_o a treS diferentes formas clfnicas: viscerel (complejo Leishmanfa donovanl), mu.co¡:utánea, cutánea difusa o diseminada (compleio Leíshmania mex/cane) y cutáneá (complejos Leishmania troplca y Leishmania mexica(IB en el VIejo Mundo y en América Latina, respectivamente). la enfermedad, de manera geAeral, produce úlceras en la plel que pueden tardaren sanar (cutánea), o lesiones deformantes en las mocosas (mucoctitánea), asl como provocar-lesiones en bazo, hfgado, medula ósea y ganglios linfaticos {visceral). El parásito es transmitido por los vectOfes del g~nero Phlebotomus (en el Viejo Mundo) y Lutzomia (en el Nuevo Mundo), tos cuales se Infectan al p!car al hospedtll'o vertebrado, ingiriendo sangre y la linfa que -contlene a.mastigotes; el parásito pasa por el Intestino del vector. transformándose hasta promast!gotes me!aclclicos ln{ectlvos que son transmitidos por la picadura a otro hospedero vertebrado sano. En el interior del hospede<o, los promastigotes son fugocflados por las eéluJa.s mono-nucleares y pierden :;u flagelo. traRSiormándose e¡¡ amasUgo(es 10!> cuales .se multiplican hasta provocar lisis celular y la coos~ente.sallda del microorganismo a células vecinas en donde se repite el proceso (Klllick-Kendrick, 1990) . Hasta ahora, y dado que

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las vacunas. contra . la leishmania aün-estan en desarrollo (Brandonisio & Splnelll, 2002), el control de la enfermedad radica en la farmaooterapia. La primera linea de terapJa para este padecimiento se ha basado en el uso de compuestos antJmonlales pentavalentes como el estibogluconato sódico (Pentostam®} y el -antimon.rato de meglumina (G!ucantime®). Sin embargo, en los (!!timos años se ha incrementado el numero de cepas de Le/shmania spp. resistentes a estos fármacos {Sundar el al., 2001 ). ta ·segunda ltnea de medlcllmentos Incluye a la pentarnidlna (Pentacarinat®) y a la enfotericlna B (Ambisome®), dos ¡>roductos que' causan efectos secUJidarios severos por ·su cardiotoxíc!dad y la alteración de la función renal y hepática Recientemente, la miltefoslná (Mlltex®) ha sido aprobada como el primer fármaco de administración oral para la lelshmanlosis. Sin embargo, el rango de recalda a la enfermedad es grande (Sundar & Mutray, 2005) y en tlS!Udlos In vítro se ha establecido que una mutación puntual en el parásito puede conducir a l;¡rresi$1eneia a este fármaco (Perez-Vlctoria el al., 2003).

1.1.3.2 La tripanosomiasis amer-icana

La tripaflosomlasis de América del Sur, conocida eomo la enfermedad de Chagas. es causada ¡:¡or el protozoario flagelado Trypanosoma crui1 y mundialmente-afecta a 18 mlllones de personas; en México, durante el año 2008, se reportaron 679 casos (SSA. 2008). Esta enfermedad· presenta itas· esi<Jdíos·: a) fase aguda. en la que aparecen los primeros síntomas, la lnfeceíón se expande y en la que ocurren cerca del 30% de las muertes; b) fase indeterminada, aslntomáúca que puéde durar varios años y e) fase .aónlca, cuando los parásitos fnvadefl ras células nerviosas y del corazón, causando la reacllvación ·dé la en!errnedad y la muerte (Rodrlguez-Mora!es, 2005), 8 T. cruzi es lransmi!Rio por hemipteros de la familia Reduviidae y en los últlmos años las transfusiones se han convertido en una de las- principales vlas de transmisión de esta enfermedad (Pioto-Dias, 199i). 8 protozoario penetra en forma de tripomastigotes metaeiclicos que invaden a las células del hospedero, parUculanrtente macrófagos, donde se multfpllcan y proliferan como amastigotes, los- cuales se diferencian a 1ripomastlgotes cuando-enlran a l torrente sangufneo. l>stos colonizan otras células (mUs.culo y tejido neuronal) o son Ingeridos por un Insecto vector para-comenzar de nuevo el ciclo (Srener, 1973). Los fármacos más comúnmente empleados paLa el tratamiento de la enfermedad da Chagas son los compuestos heteroclclos nitrogenados como el benzntdazol (Rochagan®) y el n1furtimox (Lampit®), ambos de llmitada disponlbflldad en algunas zonas consideradas como endémicas de la enfermedad y de llmitadá eficiencia· {50%) para la cura de

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pacientes en rase aguda (Rodrigues-Coura el al., 2002). Hasta ahora no existen fármacos efectivos para el IIatamiento de estados crónícos de la enfermedad y la única 5us1ancia trlpanocida US!!da para IIatar la sangre en los bancos de sangre es el violeta de genciana cuyo uso es limitado por los efectos no deseados en los pacientes (Mafezoll el aL, 2000).

1.1.3.3 La malaria

La malaria es una enfermedad importante en las zonas tropicales de África, Asia y América del Sur. Aun cuando esta enfermedad es. causada por cuatro especies de Plasmodium (P. falciparum, P. vtvax, P. ovale y P. malariae), la mayoria de los casos son causados por P. falciparum; sin embargo, de los 2,357 casos reportados en México, todos se de.bieron a P. vlvax (SSA. 2008), Estos parásitos son transmitidos por la picadura de mosquitos del género· Anopheles infectados. Una vez infectado el hospedero, los parásitos salen r.ápldamente de la circulación y se localizan en los hepatocitos en donde se transforman, multiplican y desarrollan hasta la forma de esquizontes tisulares (fase exoerltrocitlca), los.cuales se rompen para liberar mnes de. merozollos que penetran en la circulación e invaden los eritrocitos (fase erltrocltica), donde se pueden encontrar las formas anulares, lrofozoitos y ll5qui:zontes maduros. l a reemecgencia de la malaria como un problema de salud pública está ligada a la aparición de cepas de P. falcíparum resistentes a la quinina y otras fármacos de uso común cóíno la cloroqulna y la plrlmetamina (Tracy el al., 2000).

En s fntesis, los tralamientos existentes· para las enfermedades parasltarias ·mencionadas presentan serias d~entajás al tener poca eficacia en estadios avan:zados de la enfermedad, severos efe.ctos adversos; la necesidad de supervisión médlca para ·su adminisiiación, periodos largos de lí'alamiento, que suelen ser costosos y la reciente aparición de cepas· resistentes a los tratamientos romunes (Murray, 2001}. Por todo lo anterior es imperaUva la búsqueda de nuevos y mejores tarmacos para aliViar estas enfermedades.

1.2 LA MEDICINA TRADICIONAL Y LOS PRODUCTOS NATURALES

la medicina tradicional ·consiste en el conJunto de conocimientos, habilidades y prácticas.. basados en t~rlas, experiencias o creencias de (as diversas ciJJturas, que han sido usadll's en el mantenímiento de la Salud, así como la prevención, diagnóstica o trat<Uniento· de enfermedad~ flsia¡s y mentales. La OMS estima que el 80% de la poblaciá!J de paises en

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desarrollo basa el cuidado de su salud en la medicina tradicional en tanto que el 20% restante usa, en más del 25% de les casos, fármacos que han sido del'ivad~s de productos naturales (Famsworth et al., 1985).

1.2. 1 Los productos naturales como fuente de fármacos

los produc!os naturales, definidos como moléculas sintetizadas por una fuente biológica, representan una fuente eomerc!al viable de fármacos y una alternativa importante para eJ desarrollo de nuevos y más efldentes tralamleotos para enfermedades como e! ·cáncer o las enfermedades Infecciosas. Los productos naturales ofrecen una gran diversidad es1ruetural y, por lo general, ocurren como molécUlas de baja· masa molecular (Mi.lller el al •• 2000). La lmportanda deJos productos naturale.s·como nuevos farrnacos o modelos para los mismos; es- evidente si se tiene en cuenta que de los 1,184 productos que se incorporaron a l mercado durante el perioda de 1981 a 2006, el ·5% correspondió a productos naturales con estructuras novedosas, el 23% se obtuvo como derivados de éstos, el 1 O% .corr.aspondló a nuevas moléculas modeladas a partir de productos naturales y e! 4% a moléculas. de productos naturales obtenidos por sfntesls-quimlca (Newman & Cragg, 2007).

1.2.2 Las plantas como fuente de productos. naturales de Importancia biológica

De las 300,000 especles de planlas superiOfes que se estima existen, Onlcamente el 10% han sido investigad9s desde un punto de vista litoqufmlco y/o farrnacológrco. Esto refleja el potericiiil de t¡¡¡s plantas como productoras de metabolllos con estructuras novedosas y con propi~ades farrnacológícas ImportantE~$. Se considera que existen aproximadamente un millón de diferentes metabo!itos p.endientes de JdenUfiC8l'Se (Hostettmann, 2P06), En México, ·que posee una ilora me¡licinal ~ensa que lneluye 7,000 especies de plantas e.') uso clasificadas botánfcamente, el pOfcentaje de las es¡¡E¡cies estu·diadas desde el punto de·vlsta fitoqulmico y/o farmacológico es menor al 2% (Mecke;; el a/, 1993),

1.2.2.1 Biogénesls de-1~ productO$ nat!lfales en la5 plantas

Las plantas producen una vasta y dívetsa variedad de moléculas, que no .parecen participar diredamente en su creclmier.tto y desarrollo. Estas moléculas, conocidas eómo me!abelilos seCIIndarios,. frecoentemente se encuentran dlslribuidas en llll limitado grupo taxonómico. las·funciones de muchos de eslfls productos naturales continúan siendo desconocidas;

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sin embarga, la producción de metabolítos secundarlos es modificada por las interaeciones de la planta con· su entorno, como parte de sus mecanismos de protección y competencia, además de lo~ procesos de pofinlzación, simbiosis y destoxlfícación, entre otros (Cro!eau el el., 2000}. En la figura 1.1 se resumen las· rutas b1o$in(éticas que conducen a la producción de los diferentes grupos de meta bolitas secundarios.

LoS compuestos alifátlcos prese(ltan, en su mayorla, estructuras aclcllcas poco ramtficadas, las cuales se fanman por oonde!lSaciones sucesivas de unidape$ de acetato-malon¡¡to, Dentro de éstos se agrupan los ácidos grasos y sus derivados que incluyen pofiacetileno~. prosta.glandinas y sus análogo:;, acetogeninas alifáticas entre otros. Los productos aromáticos Incluyen derivados simples de benceno, anillos bencénicos candensados, monómeros, dlmeros o polfmeros de masa molecular elevada (e.g. llgninas y taninos) y generalmente presentan grupos oxigenados (e.g. navonoldes y sus derivados). EStos metabolitos se bio~ntetizan prlncipaJmente por dos vías: acetata-m·slonalo (e.g. acetogenlnas o poHcélldos) y ácido shlkfmloo (e.9. fennpropanos). Por otro ·(ado, tos terpenos·san metaboiUos con Uf1a amplia diversidad estructural dada la gran variedad de grupos funcionales que presentan y los díferentes números de carbonas que conforman sus esqueletos (e.g. monoterpenos, diterpenos, trlterpenos, carotenoldes, etc.); su origen blosinlétlco es a partir de dos vlas del metabolismo primario, la ruta del MVA (acetalo/mevalonato) que se lleva a cabo en a! citoplasma (Marcano el el., 2002) 6 de Ja nueva ruta MEPIDOXP (2C-ma1ii-D·eritrol+ fosf3to11-<leoxi.O·xlluJosa-5-fosfato) en los pJástidos, que Inicia. con la condensación del gliceraldehido-3-fósfato y el plruvato para formar la 1-<leoxi-D-xllulosa-5-foslato (Lichtenth&ler el al., 1997; Li<:htenthaler, 1999). Finalmente, los alcaloides son moléculas que contienen nitrógeno en su estructura y su O(Ígen biosintélico es variado (Figura 1.1 ), siendo sus' p;ecursores algunos aminoácidos (e.g, ornitína, llsina, triptófano, fenllalanina, lirosina), policétidos, unidades de prenDo, azücaJ:es y bases purlnlcas y pirlmfdrcas (Marcano el al.. 2002).

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n~vOñoidtt. :antoct:anff)a:S-,

nnln••-

SJKIMATOS

Mono..,. oD-go-. poflósléo~

Gi.UCÓSI!)OS

ftnofu. q_ufn.cna~ pofi1cl111ono•. m1e:r01ldo$. ~é.ldos gr.n:G-s:, ljpJd:Gl-

POUCEnoOS

Figura 1.1. Principales· rulas del melabollsmo secundarló. Traducido de lkan el al., (2008).

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1.2.3 Los productos naturales de las plantas como agentes terapéuticos

8 uso de las plantas como fuente de agentes terapéuUcos Incluye el aislamiento de metabolitos bioactivos de uso directo como fármacos, e.g. mqrfina, laXo!, etc. ; la generación de productos semlsinté1lcos de alta actividad y/o baja toxicidad, e.g. melformlna, nabllona, etc.; el uso de agentes como coadyuvántes en tratamientos farmaoológicós, e.g. antioxidantes como el ácido ascórblco y los tocoferole$: y el uso de la planta completa o partes de la misma como remedio herbal, e.g. Glnkgo bUoba (Fabrican! & Famsworth, 2001}.

Los primeros tarmacos de origen vegetal incluyen a la aspirina, un derivado de la satlcina (Sal/x alba, Salicaceae) empleado como antíínflamatorio, analgésico, antipirético y más tecientemente como antlcoagulante; la digoxina (D/gitalis purpurea, Scrophulariaceae), usado como antiarritmlco; la morfina (Papaver somníferom, Papaveraceae), principalmente usada como analgésico: y la pHocarpina (P!1ocarpus jabarondl, Rutaceae), empleada en casos de glaucoma y xerostomia. En la actualidad, los ejemplos mas importantes de fármacos de origen vegetal Incluyen al taxol y a los alcaloides bisindólicos vincristina y vinblastina (Agora 1.2), empleados en el tratamiento dal canear (Evans. 2002).

Por otra parte, una de las éstratf!gias para la prevención del canear ha consistl.do en el consumo de. compu~tos que disminuyan el estrés· oxldaUvo (e.g. los tocoferoles, el ácido ascórbico y otros productos fenóllcos), éebido· a que generalmente estos compuestos poseen actividad antioxidante y antiinflama!oria (e.g. las lsoflavonas). [);entro de estos compuestos qulmlopreventivos de orjgen vegetill se encuentran metabolitos como la deguellna, el resveratrol, la bruceantina, fa brassinina y la 4'­bromoflavoria (Figura 1.3), entré otros, y que han demostrado actividad en modelos de inhibición de carcinogénesis In vivo y aon moléculas prometedoras para el tratamiento de este padec1miento (KI119horn el al., 2004).

.13

Vlnbluttna Vlncrtsitns Jl'ilou tplna R.·· Cf", Q • CR)

Figura 1.2. Prod~ctos naturales y denvados ub1izad0s como mrmaeoS.

14

Otpllna Bl\l e •anttna

4'..&romonavona

...

Figura 1.3 • .Agenlll$ qulmiOpreYent!IIOs y sus Cloi1vados 8'slados de plantas.

los metabolitos de origen vegetal con actividad contra parásitos protoloarios Incluyen a qulllOilaS, naftoqulnonas, llgnanos, neolignanos, alcaloides, chalconas y terpenos (Chan-Bacab & Pel\a-Rodrlgue-z. 2001; Kayser el el., 2003). Entre los agentes anUmalátlcos (Agura 1.4), se encuentra la qull'rina (Cinchona pubescens), que ha sido un Importante producto narural usado en esta patologla (Evans. 2002), y la artemislnlna (Artamlsia annua), que íunto con sus derivados semlslntéiJcos y naturales como la dilúdroartemlslnina, el artemeler y el artesunato han demostrado una buena efectividad en el control de P fakíperum (Meshnidl et al., 1996). Recientemente, empleando bibliotecas de productos naturales en ta

lS

büsqueda de nuevos antimaláricos, se encontró que las espirolndolonas fnhíben la síntesis de protelnas en P. falc/parum y la optimización de estas moléculas resultó en fa esplrolndolona sintética NIT0609, el cual es un probable candidato para pruebas cUnlcas (Rottmann el al., 2010).

Qulntn• Espirolndolona WTDUt

Aramlolnlna Dlbldroortemlolnln•

Arte.rnthr An•t.una:lo s ódico

Figura 1.4. Principales productos t'aturatea, donvados nattuale& y semlsintétlcos y productos sintéticos modelados de productos naturales. c;on actividad. aotlmaladca.

16

1.3 IMPORTANCIA DEL ESTUDIO

MéxJco es uno de los doce paises en las que se distribuye aprollimadamente el 70% de las especies vegetales en el mundo (Myers el al., 2000). La península de Yucalán cuenta con una gran diversidad de ecosistemas como los bosques perennes tropicales, selva baja caduclfolla, pantanos tropfcales y vegetación de sabana (Zarate-Hoyos, 1998). eo los que las es.pecies vegetales libran una batalla conslante por su supervivencia, tomando en cuenla que las plantas. como organismos sésnes. se ven obligados a desarrollar una serie de defensas qulmicas para protegerse de las bactenas, insectos, hongos y, en algunos casos, de mamlferos (Fellows & Scolield. 1995).

Como parte de la extensa nora de la penlnsula de Yucatán, eldslen 168 especies consideradas corno nativas o endémicas y cuasi-endémicas, cuyos esrudios flloqulmicos y farmacológicos son limitados {Ourán el el., 2000; Sánchez e l al., 2001 ). Este grupo de plantas es de particular importancia si se tiene .en cuenta que en la actualidad, las especies de distnbución restringida o perteneciente a famíllas poco exploradas. son de partJcular interés para la büsqueda de nuevos metabolltos bloactlvos.

En los ultlmos años, la acelerada tasa de la pérdida de los recursos blótlcos se ha traducido Indirectamente en la pénlida del acervo qulmico que le ha brindado al hombre un beneficio lnvaluable (McChesney el a/., 2007) Es por ello que aehJalmente se busca un beneficio dual entre la conservación de la blodJVersidad y la bUsqueda de próductos naturales que puedan ofrecer un benefiCio a posterior/ (Moran el e/., '2001 ).

Como parte de un estudio de bloprospecclón rea.llzado con la flora nativa de la península de Yucatán para la búsqueda de metabolitos bioaclivos, se realtzó la evaluación ere diferentes 6pos de actividad biológica en extractos de plantas considerarlas corno naUvas de la penlnsula de Yucalán, enconlrándose que los exlractos de Colubrina greggíl (Rhamnaceae) y Pentallnon andrieuxil (Apocynaceae), dos especies comunmente utlllzadas en la medicina tradicional yucateca, representan dos fuentes importantes de metabofitos bioactlvos Mientras que el extracto de ralz de C. greggíi mostró actividad antlcancerosa y citoslállca, además de actividad antrmalérica, actlvidad anllmicrobiana y actMdad tripanocida (Vera-Ku, 2003), el extracto ()f98nlco de las hojas y ralz de P. 8/ldrléux/i mostró actividad contra parásitos de l.llishmania spp. (Chan..Sacab &1 el., 2003).

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Dada la Importancia de ambas especies como fuentes potendales de metabolitos bioactlvos de Interés farmacológico, en este lrabajo se ptantea uUIIzar diferente$ técnicas de bloensayo (e.g. detección de actividad antlprotozoaria, citot6xica, etc.) para nevar a cabo la purificación biodlrigida de los metabofltos responsables de las actlVldades detectadas en 1os ex11aetos efe C. greggD y P. andrleuxJ1.

1.4 OBJETIVOS

1.4.1 OBJETIVO GENERAL

Uevar e cabo la puríflcaci6n biodiriglda y la ldentlfrcación de metabofltos bloactivos presentes en los exltaclOs orgánicos crudos de dos especies nativas de la penlnsula de Yucatán, Colubrina grt~ggi/ y PentiJIInon andrfauxll.

1.4.2 OBJETIVOS PARTICULARES

• Establecer y estandarizar una estrategia de fraccionamiento para cada uno de los exltactos Olgánlcos crudos.

• Llevar a cabo la purifrcación blodlriglda de las fracclones bloadivas utilizando diferentes estrategias de fraccionamiento y técnicas cromatográficas de separacíón.

• ldentifrcar las estructuras qufmlcas de los productos obtenidos en forma pura, mediante la lnterpretru;ión de sus dalOs espectroscópicos y de los resultados de reacolones qulmlcas de corretaclón.

• Evaluar el probable mecanismo o sitio de acción de los metabolítos bloactlvos aislados.

• Reafl2llr estudios de estructura·actMdad.

18

1.5 ESTRATEGIA EXPERIMENTAL

Para cumplir con los objetivos planteados, se llevo a cabo la s¡gulente estrategia expenmental

~ ---En este trabajo se presenta, en el capíhllo 2, la informac1011

taxonómica necesaria para la Identificación de las especies C. greggti var. yucatJJnensis y P andrieuXil asl como su conocimiento fitoqulm•co. En et capítulo 3 se descn'be la obtención de los e>dtaclos orgániCOS crudos de ambas especies, asl como de las correspon\lientes fracciOnes de partición y de cuauo metabolitos puros, cuya acbvlilad teishmanicida fue evaluada empleando diferentes cepas de Leisllmania del Viejo mundo. En et cap¡tulo 4 se relata ta preparación de d1ferentes deriVados del ácido betuHnico y la evaluación de su acbvldad antiprotozoaria (leishmanielda. tnpanodda y anttplasmócf1C8), en tanto que en el capitulo 5 se describe la puriflcaci6n biodtriglda de los componentes del extracto organ100 cfUdo de C greggll, la identifiCación de los metabolítos obtenidos en forma pura y la evaluación de la adlvidad anbprotozoana c.totóxica y citoestálica de los diferentes productos. Rnalmente, en el capitulo 6, se presentan los resuHados de la evaluación del extmcto crudo y de las fracciones de purifteación de P. ancili6uxlt en los ensayos de unión y adlvacKin del eje celular CXCL12JCCR4 Las conclusiones generales y las perspecliv3s del trabap se incluyen en el capitulo 7

19

1.6 REFERENCIAS

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CAPÍTULO 2

Descripción taxonómica y conocimiento fitoquimlco de Pentallnon andrieuxl/ (Müell. Arg.) B.F.Hansen & Wunderlln

y Colubrina greggílvar. yucatanensls M.C. Johnst

2.1 INTRODUCCIÓN

Uno de los puntos Importantes que requiefe particular atención en la qulmica de l)(odUctos naturales, es la correcla ldentif~eación taxonómica del material vegelal en estudio. La escasa lnformaolón sobre las pjanlas en cuanto a su uso tradicional, suele llm11ar la comparación lnten:ulhMal de la utilizacl6o de las plantas en el tratamiento de diferentes enfefmedades (Ankn el o/., 1999}.

A continuación se presenta la descripción taxonómica y una revisión sobre el conocimiento litoquimlco de las especies Pent~inon andrieux/1 (Müell. Arg.) B.F.Hansen & Wunderlln y Colutxína QT&ggíi var. yucatanensis M.C. JohnsL

2.2 Pentallnon andrleuxll (Müell. Arg.) B.F.Hansen & Wunderfln

P. andrleux/1 pertenece a la famHia Apocynaceae, a la cual recientemente se le ha Incluido la familia Asclepladaceae y comprende ai)(Oxlmadamente 355 géneros y más de 3,700 especies (Endress & Bruyns. 2000}.

La famllla Apocynac:eae se distribuye en zonas tropicales y subtroplcales e Incluye plantas arbóreas, arb\Jstives y herbáceas, a menudo trepadoras y algunas especies existen como lianas tropicales (Evans. 2002). Se clasifica en cinco subfamRias, una de las cuaJes, la subfamUia ApocynoldeBB, consla de cinco tribus, donde la Echiteae, que comprende apraxlmadamente 23 géneros, Incluye el género Pentelinon (GRIN, 2007).

El género Penlallnon se encuentra conformado únicamente por dos especies. P. andrieuxil ( Urechites andrleuxD, Echitas cvpu!ilarus) y P. lvteum (VUICa tutaum). Las especies de Pantalinon son llanas con laUos clllndrlcos

27

en edad adufla, con secreol9n lechosa, glabros o pubescentes; sus hojas se encuentran opuestas, sin coléteres en el nervio central, las Inflorescencias son clmosas, axaares, cáliZ con cinco sépalos, cerota amarilla o crema. límbo con cinco. lóbulos, los frutos apocárplcos, foliculares, fusifonnes, llsos. continuos, y sus semmas son numerosas, desnudas y oornosas en el épice miaopilar (Morales, 2009).

2.2.1 Descripción taxonómica de P. andrleuxii {Müell. Arg.) B.F.Hansen & Wundertln

P. sndr/eux/1 (Figura 2.1) es una llana con tellós glabros o puberolentos, sus hojas son etlpticas (4.7-10.8 x 2.3-6.9 cm de ancho) con el épice acuminado, la base obtusa, glabras o g!abrescentes en el haz, glabrcls o esparcldamente pubenllenla$ :por el env.és y un peciolo da 0.9-2 cm de largo (Figura 2.1 a), Las Inflorescencias son glabras o glabrescentes, pedic;elos de 1 ;a-3.9 cm de !argo, brécteas diminutas (ca. 1.5 mm de largo); sépalos ovados {4-8 mm de largo), corola verde-amarilla o amarilla, glabra, con la parte Inferior del tubo 9-18 mm de laf90 y la parte superior tubular de 2.2- 4 .4 cm de largo con 0.6-1.1 cm de diámetro en la fauca, la cual presenta lóbulos obovados(1 .3-2.3 • 0.9-1.1 cm) y sus anteras son de 8-7 mm de largo (F¡gura 2.1 b). Adicionalmente, la flOración ocurre entre los meses de agosto y noviembre. Los frutos son fofiWlares (14-'30 cm x 5-8 mm) {FI!)ura 2.1 e) con semillas de 1.5-1 .9 cm de largo con presencia de comas de 1.2-2.7 cm da largo (Figura 2.1 d y e), P. sndrlevKii se reconoce por sus brácteas florales diminutas, corolas con la parte Inferior mas larga (~16 mm vs. 6-8 mm) y semillas más grandes en comparación con P. lutevm (Woodson, 1936; MOfa!es, 2009).

28

Figura 2.1. Pentsllnon andreuxn (MOell. Atg.), a, laminas !ollares opuestas; b. lnlb'MGencla con corola alargada; c. frutos foliculares; d, somilta con coma y e, longitud de semilla.

2 .2.2 Distribución geográfica

La distribución geográfica de P. Btldrleuxil en el continente americano abarca desde Rorida en los Esllldos Unidos hasta México y de las AniDias hasta el norte de Colombia. En México se encuentra distribuida por la vertiente del Pacffico áesde el eslaáo de Mlchoacán, hasta el estado de Chiapas y en la vertiente del Golfo de México abarca los eslados de Veracruz, Quintana Roo y Yucatán (Figura 2.2). Esta especie es parte de la vegetación de la selva mediana y alta subperenlfoUa por lo que se encuentra en bosques secos y bordes de manglares, en etevaciooes de 0-500 m. Adiclonalmen!e, se le conoce con los nombres comunes de canUbteac, vlperol bejuco, bejuco guaco o contrahierba (Woodson, 1936, MOO!Ies, 2009)

29

Figura 2.2. Oislribución de P andriewcii {Mílell. Alg.) B.F. Haos&n & Wundetlin Los CU8dms negros Indican la dislllbucilln da la especie. Tomado de mapas de dlsltlbución dol Mis90W1 Bolanical Ga¡don para P. andrleuxil (hllp:/fmobol1.mol)ot.oq¡/websltafprint_map.asp ?u~=htlp://mobot 1.mobotorg/outpull oarth2_MOBOT1225612081850.]pg&name=Pentallnon andrlouxll)

2.2.3 Usos otnobotánicos

P. andr/euxli es una planta usada en la penlnsula de Yucalán para el tratamiento de la lelshmaniosis cutánea localizada. La medicina tradiclooal maya recomienda lavar las lesiones con una infusión de ralz. y después aplicar la raíz. pulverizada sobre el área afectada o la apllcacl6n directa de las hojas secas y molidas en las lesiones (Chan-Bacab el af,, 2003). Otros usos incluyen el lratamiento de mordeduras de serpientes, para lo que se recomienda masticar fa ralz o las hojas frescas y apltc;artas a manera de cataplasma en la mordedura. 8 látex también se utUIZa para aliviar el dolor de cabeza y los disb.Jrblos nervlosos (Argileta et fll., 1994; Pulido & Serralta, 1993).

30

2.2.4 Conocimiento fltoqufmlco y actlvfdad biológica de la familia Apocynaceae

Los estudios frtoqulmtcos de especies medicinales pertenecientes a la famHia Apocynaceae reportan la presencia de alcaloides y glucósidos de lmportanola rarmaco!Oglc:<l: siendo los alcaloides blslnd61icos vinccisUna y vlnblasüna, tos metabolltos nuis Importantes rle Cathsranlus roseus, usados en el tratamiento del cáncer. Asimismo, la reserplna de Rauvolfia serpenlína ha sido usada como antihípertensivo aunque con COflS!derab!es efectos adversos (nsurotoxleidad, cltotoxk:idad y depreslón) (Rgura 2.3a, Evans, 2002). Adicionalmenta, se han reportado otros alcaloides como la ramiflorlna A y B (Agura 2.3b) de Aspldosperma romiflorum, los cuales poseen actividad contra promasUgotes da Le/shmanla amazonensis y L brazHiensls (Piloto et al., 2004) asl como el alcaloide corooaridina (Agurs 2.3c) de Peschí&ra austra/is con actlvk!ad teishmanlclda (Delorenzl el al., 2001) Por otro lado, los alcaloides isoschizogalina y 6.7-<lehidro-191}­hldroXJischizozlna de Schlzozyga coffaeides y tos lridoides plumerlcina e lsoplumeñc:lna {Figura 2.3d) obtenidos cm Allamanda catbarlJca L . pasoen actividad antífúnglca (Kariba el el .• 2002; Abdef-Kader el el., 199n. Algunos productos entlfunglcos e inhibldores de la bioslntesls de esteroles han mostrado ser una fuente promísorla de fármacos contra T. cruz/ en modelos experimenfales (Urbina. 1998). SI bien el conocimiento fitoqulmico de la tribu Echiteceae es limitado, para el género Echlles se ha descrito la presencia de cardenólidos y alcaloides pirrollzidlnk:os con actividad an1ltomoral y hepatotñxíca (TDiequln et al., 1993), asf como actividad antñnllamatoria y sedante (Chan el al .• 2003).

31

b

~:

Rorollloilna A R: H,.

Rominorb•• B lhiH

e

d

coronllll~n.a

••

l'iuln9rklna R1 :I;:.R>•IIt

lsoptumlltclna R1.; MP.R 2 • H

Figura 2.3. Estructuras de algunos metabolilo:S bioaGtfvos de la familia Apocynaceae.

2.2.5 Conocimiento fitoquimleo y actividad biológica del género Pental/non

8 conocimiento fitoquimíco del género Pentallnon únicamente Incluye la presencia de urechltoles A y B obtenidos del e.>tlraoto de la ralz de P. andrieux/1, los cuales presentan estructuras Q!Jimícas novedóSas (Figura 2.4; Yam-Puc, 2009).

32

Ur&e:hltol A Urechltol S

Figura 2.4, Trklor-$éS<¡ult~lp!!nOs-()blenldos de 1<1 rafz de P. and!íeUldl.

2.3 Colubrfna greggli S. W;3tsorrvar. yucBtanensls M.C. Joh~t

Colubrina greggli pertenece a la farnllfa Rhamnaceae que consta de 59 gé!'éros y c~cá de 900. espeples. Son ptantas cosmopolitas y usualmente son árboles o arbusto~. El ¡¡énero Co/ubrina comprende cerca de 31 especies Incluyendo C. gregglf que presenta tres variedades: C. gregglf var. greggil, C. greggil var. angustior y C. greggil var. yucatanensis (Johnston el al., 1971). · ·

2.3.1 Descripción botánica de C. gregJJií S. Watson var. yucaúmensls

C. greg_gfl S. Watson var. yucatanensis (Figura 2.5) es un arbusto· qué oscila entre 1 y 5 m de altura, con rarnás delgadas, glabras o tomentosas; hojas. alternas, láminas ovadas a lanceoladas, con ápice agudo o acuminado, base truncad_a, margen aserrado-glandúlar, haz hirsu!ado a pub_~cente (Figura 2.5 a). Las lnflorescencil!s-se preS.enl<!n en U~os con 15 a 40 llor~s de 15-30 mm de longitud, sépalos verdosos deltac;k>s, pubescentes dorsalmente y florece en los meses de marzo a Junio (Figura 2,5 b). Su frutp es ligeramente t~ de 8-10 mm de largo, casi esférico, con semillas negras, oblongas, comprimidas, lustrosas y el endospermo tan grueso cqmo las cotiledqnes (Femández. 1986) . Esla variedad se d iferencia de las alfas por tener una mayor -amplltud en el centro de las lámrnas follares con un ángulo aguda apical de 3S a so•, asl como de la presencia de dii!Jl{es. marginales en las hojas (Figura 2.5 e) (Johnston el al., 1971).

33

Figura 2.5. Colubtina gteggil S. Wa!son var yucat1111et1sl6 M.C. Johnsl a. laminas foliares; b, inftoresce11Clas en 1irsos. c. dientes malglnales en tes hojas.

2.3.2 Distribución geogr.ifica

C. greggil var. yucatanensís se distribuye desde el estado de Texas, EUA hasta Guatemala (Figura 2.6) y oreoe a una altitud de 300 a ·1,600 m. Su óiStñbuclón es de matorral xerófilo, de bosque tropical caducifolio y de endnares contiguos. Se conoce oon los siguientes nombres comunes: Pujuche', china may, guayal. guayo!, guayut, manzanita, pimiento ché, tatu:m, trampHio, trompillo y vara prieta (Femández. 1986). C. greggil var. yucataoonsls se encuentra en Guatemala y México; en esle último es abuni:lante en algunas partes de Yucatán y se encuentra también cerca de la Laguna de Chtchankaneb (Johnston et al., 1971 ).

34

FlgiiTII 2.8. Dlstribuclón de las variedades de c . grm" S. Watson. C. gregr¡ii var. yucataii8Mis (clrculos llanos), C. greggJl vat, greggil (cltallos vaclos) y C. g¡ogg// var. angustlor(citcUios medio Uooos). Tomaeo de Johnston et al. , (1971 ).

2.3.3 Usos etnobotánlcos

C. greggJi se usa como remedio contra abscesos y en enfermedades como el asma. la cfiSenterla, enfermedades del hlgado, en granulaciones de párpados, en la tuberculosis, uiCE!faciones de la pfcj, como emonente y antítusivo (FernándlU, 1986).

2.3.4 Conocimiento fltoqulmlco y actividad biológica de la familia Rhamnaceae

Los constituyentes de la famína Rhamnaoeae incluyen qulnonas (antraquinonas, antrano4es y sus glucósidos), alcaloides de Upo benzlllsoqulnolina y de Upo ciclo pépUdos (en varios géneros), saponinas y triterpenoldes (Evans, 2002; Heinrlch el al., 2004 ),

35

2.3.5 Conocimiento fltoquimico y actividad biológica del genero Co/ubrlna

En diferentes estudios del género Collibrlna se ha reportado la presencia de actividad citotóxlca significativa en extractos de C. macrocarpa y C. lexenensis. IdentifiCándose de esta última al acetato de colubrínol (Agura 2.7a) como el metabotito responsable de la actividad (Popoca ata/., 1998: Waní el al., 1973). De extractos de C. el/iplica se ha reportado el aislamiento e ldentlflcacl6n de saponlnas (Fig\Jra 2.7b) (Ouiand-Ali et al .. 1994), en tanto qua en C. faraJaotra se han entonltado alcaloides aporlfnlcos, ácidos fenólicos y varios tlavonoi<les cuyas agliconas fueron identificadas como mlrcetlna, kaempferol y quercetlna (Figura 2.7c; Gulnaudeau el a/., 1981). Dll C. granulosa se han aislado cinco ácidos lriterpenoldes (Figura 2.7d) (Roitman & Jurd, 1978), mientras que en C. re/usa se repona la preseocia de tres juJubogenloas con actividad antimlcroblana contra Candida albfcans, Cryptococcus neoformans, Asperg/1/us fumígatw; y Mycobacterlum lntracellulare (Figura 2.7e; Xlng­Cong el al., 1999: E!sohly el al., 1999). Recientemente se ldentfficó al crisofanol (FigUra 2.71) como uno de los metabolitos responsables de la actividad anUmicroblana contra Beclllus sublt71s, Candk!a alblcans y Streptococcus aureus. deteciada en el extrccto de raíces de C. greggU (Garcia-Sosa et al., 2006). El crisofanol es utlf!Z8do como pyrgante y posee actividad bacteriostáUca contra S. epldermlclls y Sh/gehe sonnel {Kamblzl el al, 2004), además de actMdad anüioflamatoria, anUtumoral (Zhang el al., 2004) y anUfúngica (Kuhnert & Mokld, 2005).

36

a

Colubrtnot

b

M:&biOaldo 8 Mobl6oldo e

R ·~t,-.)-(ilc

Mal>l6aldo o Mabl6sldoe

Agura 2.7. Ejemplos de metabolltos obtenidos del gánnro Co/ubrina,

37

e

..

•

~~~ , .,-¡¡J•b0sl4o R•" Faratróstcto P•oH

Ul\,-3-ttf.tl •t1 2)R, •P<o•••DIIII R1=H J)R,•t4.R7•~

d J '

,.,

R.s • li a-.. t.4t R, • OH PAc R,• .... CHpl q , •Me.01JOH ~ ·H. ...

C:eanotanos

,

Figura 2.7. (conl) Ejemplos ele metaboll1oe ot>tenldos del género ColuMna.

38

2.4 REFERENCIAS

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42

CAPITULO 3

Actividad leishmaniclda de Jos extractos crudos y fracciones de partición de Pentalinon andrleuxli Müeli. Arg.

y Cofubrlna greggli S . Watson 1

3.1 DESCRIPCIÓN DEL CAPITULO

Los estudios biodtrigldos o semiblodirlgidos emplean técnicas de bioensayo para detectar un cierto tipo de actividad bíol6gica en un extracto crudo o en una fraccl6n semlputilidlda. asl eomo para guiar el proceso de purifJCaclón de los metabolltos responsables de la activldad biológica. En este capitulo se describe la obtención de los extractos orgánicoS CtUdos de P. ondriewii y C. gr&gg/1 var yucstonensls. su fraccionamiento Inicial. la oblendón de cuatro melabolltos puros, asl eomo la evaluación de su acUvldad lelshmanlcida (sección 3.2). Los resultados de la evaluación Inicial de los extractos y fracciones semlpurlflcadas de las dos especies eontra promastlgoles de L major, L troplca y L. aethlopice, mostraron que las lracdones de baJa po!andad de P. endrieuxll y de C. greggll poseen actividad leishmamcida. Dada la actlvidad de la fracción de polaridad baJa OCG-3A y de dlscarlna B ¡NcG-5C) contra promastlgotes de L eethlop/ca (LOso de 7 .2 y 62.4 ~g·mL· respectivamente), se proced'r6 a su evaluación sobre amastigotes axénicos encontráDdose que poseen una menor acUvidad (L050 de 27.1 y 94.2 ~·ml'1, respectivamente). ASimismo se observó que la fracción OCG-3A, a una concenlr'..ción de511Q·ml'1, reduce significativamente (ca. 50%) la infección en macrofagos derivados de m000<:1tos (THP-1) sin mostrar toxicidad en células humanas. Estos resultados •confirmen la presencia de metabolltos con actividad teishmaniclda en la fracción de baja polaridad de C (!Teggll. Finalmente, se incluye una extensión de los materiales y métodos que detanan los rendimientos de los procesos de eldraccfón, asi como otros procedimientos generales no Incluidos en la publicación (sección 3.3).

1 1.os roSJJtados d& la evaluaclón de la ac:IMdad leisllmanidda de los eJdraCtos ctUdos, fracdooos semipuriflcadas y metabolilos putOs de P. IJJ'Idrieuldi y C. greggfl sa onc:luyen en el trabajo "Lolshmanlcldal ¡;cdvity of Yucatecsn modic:inal plants on LeiShJm)nís speoles rasponSible ror CU!ai160US lelshmalllasis" publicado en J. Parasllol. (2009), 95 (2). 456-460.

43

3.2 lfiSHMANICIDAL ACTMTY OF YUCATECAN MEDICINAL PLANTS ON LEISHMANfA SPECIES RESPONSIBLE FOR CUTANEOUS lf1SHMANIASIS1

Giulla Getti'. Prlyanka Durgadoss•, Dame Domlnguez-Carmonat, Zhelmy Martii1-0ulntalt, Sergio Peraza.Sánchezt, Luis Manuel Pel\a-Rodriguezt. and David Humbe!:i

3.2.1 AJlstract

The lel$hrnanicldal activíly of 15 ex.tracts and 4 pure metabol1tes obtained from Urecliltes andríeW(ii, Colubrina gregg/1, Dorstenia contrajeMJ, and Tridax procumbens was eva!Uated uslng the newly developed MTS ((3-(4 ,5-dlmelhytthlazol- +2-yt)-&13-carboxymethoxyphenyt)-2-( 4-sulfophenyf)-2H..Jetrazo!ium, lnner salt) assay, optlmized for promastlgotes of Lelshmania majar, Leishmania tropica, and Lfllshman/a Bfllhiopica, as well as for L aethíopica axenlc amas{ig(ltes. The assay was lhen usad for calculating lhe percentage of viable statlonary phase parasltes after a 24-hr treatment wilh each plant extract or puce metabollte. The 3 most active samptes, 2 from C. grsgr¡H (NCG.SC and DCG·3A) and 1 from T. procvmbflns (TPZ·2A), showed LO,¡, values of 62.4, 7.2, and 18.5 IJg/inl, rospectfvely, onstationary promastlgotes, and of .94.2, 27.1, and 95.2 ¡Jgfml, on amasllgotes ol L aflthloplca. Moreover, TPZ·2A and DCG-3A slgnlfJCalllly reduced the percentage of Infectad monocytederived macrophages (THP-1 ). The p«centage of lnfected cells decreased from 69.9% ± 2.5% to 20.8% ~ 2% when the cells were treated wilh lhe DCG·3A fractlon and to 14.9% ± 0.5% when treated with TPZ·2A. withol.tt s!gnificantly decreaslng lhe number of human cells. These llndlngs lndlcate the presence of potentially bloactive metabolítes In the roots of C. greggll aod In T. procvmbens and reflect ·lhe importance of pursulng the bloassay-gulded puriflcatlon of lhese me!abolltes

i Esta sección ha sido publicada en Joumal of Parasl!ology, (2009) 95, 456-460.

·school of Heallh and Blosclence, Unlversity of East London, London, E15 4LZ, U.K. e-mefl: q.qetti@uel.ac.uk

3.2.2 lntroductlon

Leishmaniasis ls a group of \roplcal dlaeases causad by protozoan parasltes. These parasltes enter immune system cells foltowtng the blte of an Infectad sand fty and spread eíther lo !he skin. causlng dlsfiQuríng leslons, oc to interna! organs, causing lelhal lnfections (Pearson el al., 1983). Thls disease affects C11fer 20 mllllon people arovnd the world and is now endemic to 88 countríes on 5 contlnents. About 350 mlllion people are al rísk of being infeclad, wilh 1.5-2 mUiion children and adulls developlng !he dlsease each year (Oesjeu.t, 2004). The global prevalence of lelshmaniasls has risen In receot times because of an lncrease In tntematJonal travel, human alt01"8Uon of bo!h vector and host habítats. and concomftanl faclors thal increase susceptiblrlty. such as human immunodeflclency virus lnfecUon and malnutritlon. Recent lntematlonal confllets have elso contríbutad to an increase In and spread of leishmaniasis In previously unaffectad counlries (Rosypal el oJ .. 2003). In Mexico, d lnical and epldemiological studle,s have demonstratad thal the woodland reglons of the Yucatan peninsula coostitule an cndemic area for this disease (Arguello, 1995; Vargas-González et .el., 1999; Andrade-Narváez el e/., 2005).

Although !he causativa agenls of teiShmania.sis have been known and studled slnce 1903 (Donovan, 1903; Lelshman. 1903), to date, an effectlve cure foc the dlseasa does not exlsl. The cbemotherapeutlc agenls most commonly used for tre.atlng lalshmanlasls, l.e .• sodlum sUbogluconata (Penlostam®), N-meth)'lglucamlne antimonla!e (Giucantime®). pentamldine (~tacarinat), and amphoterlcin B (Funglzone®, Ambisome®), are not effecllve when admlnistered orally. Moreover, they often requlre long perlods of treatment and cause serious sida effects, lncluding cardlac and renal toxk:ily (Murray, 2001 ; Akendengue el al., 2002). This has promptad the World Heal!h Organization (WHO) lo ·emphasize the need foc development of new drugs in the treatrnent of lelshmanlasls (WHO, 2005). AIH>ther drug that recently became avai!able for lhe lreatrnent of lelshmanlasls ls mlltefosine. The use of this drug was approved In India In 2002 and In Colombia In 2005; l t is slíll Undef invesllgation for pos$11lle use In the rest of thewortd

RecenUy, lnfocmation regarding the use of plants In trad11ional medicine has been of considerable interest for the acquisltion of new and better pharmaceutleals, 1t ls estimatad thal close to 90% of all plapl spedes have yet to be studied for lheic potentlal as anU-lelshmen/a spp. agenls (Hamburger & Hoste.ttrnann, 1991; Klnghom, 1992).

4S

------------------

Mexico ís recognrzed as having a parlicularly rlch and unexp!oíted blodlverslty, whlch lncludes more lhan 20,000 plant specles. Of lhese, 7,000 ate oomrnonly used In !he practice of !rad'tional medicine, wilh 800 or lhem recognized as medicinal planls in !he Yucatan península. However. desprte !he richness and vanety of lhe peninsula's medicinal flora, le$s lhan 2% of !he ptant spec!eS dassífled. as meóunal have been exarnlned from a phytochemical or pharmacological perspectiva (Meckes el al., 1993).

RecenUy, as part of a projecl <fncted lo'lt'afd evaluatíng !he Yuca!eC8n nora as a poten1ial soun:e of nem antl-protozoan agenta. a number of plants commonly used In Yucalecan tradilional medicine for !he lteatment or parasillc d!seases were examinad fOr thelr felshmanlcldal. lrypanoddal, and anu-malarial e!fecliveness. Cruda methanol extracts of C. greggU and U. andriewui showed actlllity agaJnsl lXO(IIastlgotes of L danov;wl, L brazllietlsis, anc! L amazonensís (Chan-Bacab el si., 2003), and !hOse of T. procumbens and D. ~ showed similar aciMly when testéd aga1nst promastlgoles of L mexicana (Peraza-Sanc::hez et al., 2007).

Here, we report on !he evalualion ot lhe-leishmanlcidal actJvrty of a numhef d extraets. purified hactious, and sE!CQfld31)' lll613boiites oblained from U. andneu}(fl, C. gregg11, D. contrajerva, and T. procumbens when tested against promastigotes ot L aethiopica. L ltoplca, and L majar. and axenic amastlgotes ot L eethlop¡ca.

3..2.3 Mateñals and methods

3.2.3.1 Plant material

Whole plants ot T. procumbens were collecled in Ménda, Yucatan, México, between FebnJ31)' and July 2004; a IIOUCher speclmen was aulhenticated by F. May·Pat and depositad al the herbarium d "Unidad de Recursos Naturales..CICY" under the code number FMay-1955.

Leaves of U. andrieuxU MueR,·Arg. were col1eded nonheasl of Campeche, México, al the 3 5-lcm marlt on the road to ChinA, Campeche, México, in Apn1 2006; a VOildler spec¡men was deposlted at the herbariiJm of "Unidad de Recursos Naturales..CICY" under collection I'A.Imber P. Simá 2245.

Roots of C grtlggi S . Watsoo were collected In Abalá, Yucallln, México, in November 2000; a voud'ler specimen was depos11ed al the

46

heroanum d "Unidad de Rearsos Naturale$-CICY" under collection number P. Slmá 2503.

3.2.3.2 Preparatlon of extracts and lnitlal fractlonatlon

Tridax procumbens: Dry-ground w1101e plal)ts were macera:ed 4 times wrth melhanol al room lemperature. EvaporaUon of the solvent under reduced pressure ylekled the cruda me!hanofsc extract TPZ-1. A portion or !he extract was suspended in 75% aqueous methanol, and the resulting suspension was successively parfrtionsd betweeo hexane and dichloromethane lo produce the correspoodirlg low (TPZ-2A) and medium­fow (TPZ-28) polanly fractions.

Urechltes andrieux1t D!y-ground leaves were ex1racted through maceration (4 times, 72 hr each} wllh ethanol al room temperatura. Evaporallon of !he sofvent under reduoed pressure )ielded the cnxle ethanolic extract OUA-1 , a portlon ol which was suspended In a 3:2 (v/v) mbcture ol water-melhanol. The resulbng Sil$pe/lSlOI1 was successMlly partltioned between hexane, elhy1 acetato, and water-salurated butano! to produce the corresponding low (OUA-2.A). m~ (OUA-28), and l'llgh (DUA-2C) polarity fractions. A precipllate rich 1n betullnlc acid, ldentífled by comparing its spectroscopic data With those repotted in the lltera!ure (Mahato & Kuodu. 1994), obtalned while concenlrnting fractlon DUA-28, was labelled DUA-281. Slmtar1y, a water-sauaiBd butancl extradJon oran aqueous layar, also obtalned whUe concentrallng fracllon OUA-28., ylekled fraction OUA-282b. Successlve, prellrmnary, dvomatogG!ph.c punticalion of !he low and medlum polarily fractions ylelded the pure metabolites. laraxasterol (DUA-51) and OUA- 5F, respecllvely. Taraxasterol was iden!ifled by both lhin~yer and gas co-cllromatography wlth an authent1c saJllple and by comparing íts MS fragmentallon pattern with !ha! reportad in !he lltetalure (can-Aké et a/., 2004).

Cclubrina greggii: Dry-ground roots were mi!Ce(8led 4 fimes (72 hr each) wllh ethanol at room temperalure. Evaporatlon ol !he salven! under reduced pressure yielded the cruda ethanollo extracl OCG-1. A portlon el !he cruda extract was suspended In a 3:2 (YIV) mixture of water-methanol. and tt-.e resultlng suspenslon was suooessively partíttoned belweeo hexaae, elhylacetate. and waier-saDJI'a!Bd butt-.anol, lO produce the corresponding low (DCG·3A). medlum (OCG-38), and hlgh (OCG-3C) polarity fracllons. SUccesslve prelimlnaly chromatographic puriftcatlon or !he medlum potanty fraction YJSfded the pure metabollles NCG-2F1 and NCG-5C.

3.2.3.3 Leishmaniddal activity as.say

Samples ( ex1racts, fradlons, and P'Jre metabolites} were dissolved in dimethyl wlfoxide (DMSO, Sigma-Aldrlch, Gillingham, U.K.) and dlluted IYtth tiquid medium lo final concentralions ranging from 100 lo 1.5 ¡Jgiml, malnta1nlng !he final DMSO concentration at a maximum ot 0.05% w/V. Patasltes were dls!rlbuted In 96-well pla'.es (Nunc. Loughborough, UK) (1 >< 10~ parasi!eslml) ín trlplicate, and each experimenl was repeated 3 ~es. Plates were lncuba!ed (Q( 24 hr at 22 e or 26 C, ~ on the specíes beiog tested. lnhlbitlon of promastlgote growth was determined by !he MTS assay (Ganguly el ~~~~ 2006). after optmlling i l for L 1111thiopica, L tropica, and L major. The percenlage of growth lnhlblllon was determinad by comparlng the treated !lfOUP$ v.'i!h untreated controls after 48 hr. Amp/lolericin B was used as a positJve control.

3.2.3.3.1 MTS assay

A soMlon ot MTS (Promega, Southampton, U.K.} was preparad (2 mglml in phosphale-buffered sa!lne; 0.02 M PBS, ptt 7.2) and stored al -20 C. Phename methosUlfale {PMS, Sfgma-Aldrioh) was slmUarly preparad (0.92 mgfml in O 02 M PSS, pH 7 .2) and stored at -20 C. Bolh solutions were $1ored In the dark and combfnecl just prlo; to use. For the evaluatlon, 20 ¡JI of an MTSIPMS (5:1) mixtJJre was added lo each well con1aining 200 ¡JI ~~ trealed andlor untreated Leisllmania spp. cultures and seeded al an lnitial concentralion of 10• cellslml; the entite pla'.e was lncubated at 37 e for 3 hr. The absoroance was measured al 490 nm and !he pereentage ot v1ability was calculatectas descrihed by Ganguly el al~ (2006).

3.2.3.3.2 Optlmlzation of MTS assay

Selection of m/ld/um and oplímum WtJWt/ength: All 3 speaes of L.eishmania spp. were culturad lo both DMEM-F12 medlum and M199 (Sigma· Aldrich), supplemented wllh 10% FCS (Slgma-Aldllch}. Followlng ldentificatiort of DMEM-f12 as the best candldate lO support !he growth of Leishmania spp., 107 parasiteslml were plated and tncubated With 20 111 of MTSIPMS at 37 •c. The absorbance spectrum of soluble formazan in DMEM·f12 medlum bet\•.-een 375 and 690 nm was acqulred ¡n a Multiskan spectrum {Thf!rmo Sectron Corporatlon, Vantaa, FJnfand) ,

Selection ot optimum JncubtJtíon tempe¡:atureltime and MTSIPMS ratio: Since the assay ls perlormed at 37 •e and the temperature for optimum gowth of L aelhlopica ls 22 ·c. ít was necessary to determlne1he

ol8

optimum fncubation temperatura, In this case, it was found to be 37 ·c. Various MTS/PMS ratlos (40:1 , 20:1, 10:1, 5:1) and incubation limes (1 , 2, 3 hr) were evaluated; !he 5:1 ratio and Jlv lncubatlon lime were selected

Establishment of llna8fily: Promastígotes of L aethioplca, L tropk;a, and L mejor, and amastlgotes of L aath/opica were seedod al concenlrallons ranglng from 4.6 ><106 lo 1.8 x 104 cells/200 ¡¡1 in a 96-weU plate. and absorbance was read al 495 nm foUowing 3-hr lncubation with a 5:1 MTS/PMS ratio.

3.2.3.4 Le/shmanla spp. parasites and cetlllnes

Promestigotes: Promastigote inhibttlon studles were performed on L aa/h/opJca (MHOM/ET/721l100) and L tropica (MHOM/SU/58fOD) growo el 22 -e and L mejor (MHOMISU/73/SASKH) grown at 26 'C In DMEM-F12 medlum, supplemenled with 10% fetal calf serum and gfutamine (Sigma· Aldrlch).

Axanic amsstigoles: These slages were oblalned from promastigote cultures of L ae/hfopica (MHOM/ET/72/l 100). CUltures o( pronrnUgotes In the log phase were washed in PBS and aéjusled toa concentrallon of 106

organlsmsfml In 7 mi of fresh modified JH30 medium al pH 5 and lncubatod at 32 •c. Complete transformallon lnto amastlgotes was achleved wfthín 10 days of lncubation. The parasi'.es were then maintained In JH30 medlum at an adjusted pH of 5 for 5 mo. Amastigote inhlbltlon studies were performod on parasites that had been axenically reverted back lo !he promastigote stage 6 times.

Human monocyfes: THP-1 cells were maintained In the same medlum used for the parasites, at 37 'C and 5% C01 In a· humidified incubalor. Cells were subcultured avery second day at a starllng concantralion of 5 x 10S celfslml. Cells in late log phase were lncubaled al a starting concentraUon of 1 o• cellslml In 96-wall plates. Samples were ¡ncopo¡ated lnto tnpUca!e cui1Uras a! a final DMSO concentration o( 0.05%. Alter 24 hr of lncubation at 37 •c. grnwth was estimated by countlng viable cel!~ wlth a hemalocytometer, alter stalnlng with trypan blue.

Infectad human monocytas: lnfectlon was establishod alter THP-1 cells were transformad lnto nonadherenl macrophages by 3 days treatment wfth 1 !JM relinolc acld (Sigma) Transtorrned THP-1 (from the European CotlecUon of Cell Cultures (ECACC), Portan Down, U.K.) cells were Infectad wifh stationary phase promastigolas of L aathlopiCa al a ratio of 10:1 and malntained for 48 hr at 37 •e and 5% C02 1n a humiórfled incubator. TPZ·2A

49

and DCG-3A were then added al a concentration of 5 1Jg/ml, and the trealed cells were incubated fa a further 24 hr befae 1111alysls. The activity was determ!ned fmm lhe percentage of 1nfected cells In treated and untrealed cultures In methanol-fixed and Glemsa-stained pre¡¡aratlons. The total oombef of ceUs was estímaled by countlng the number of THP-1 cells per field of vlew. Ea eh data sel came from lhe average of 3 experiments, each of which was done ln tríp!icate. A mlnlmum of 100 macrophages was counted for each sllde.

3.2.3.5 Statlstical analysis

The elfectS af lhe sample$ on cel1 vlabUity were expressed as LDlJO, which ls lhe concentratlon re<¡ulred to kiJJ 50% of the gÍIIen population. LDeo values wera cak:ulated fran graphlc extrapolaOon of dose-response curves and confirmad by problt analysis wlth loglt transformatfon ol dose response curve. The relallve median potency was aJso estlmated v~a lhis analysis, assumlng a parallel relation between lhe samples' response curves. Sltlce a goodness-<lf-fit chi-square test was s!gníficanl a heterogeneity factor was used In the calcutatlons.

3.2.4 Results

The various plant extracts, semí-purified fr..ctlons, and purffied metabolites are nsted and.described in Table 3.2.

so

Table 3.1. llst ol ptanl oxtracts, fractions. and pura molabolltaa from Yuca'~ planW.

Codo Solublllt:z: Descrletton DUA-1 EIOH.M&OH CNó8 eXIt8Ct from leaYe$ of U. tllldrlewdl DUA-2A CH2CJ2JMeOH low polarily fraction., from pas1ition ol OUA-1 wí1h

Mxene DUA-28 CH2ct2/Me0H Medlum polarlty fractlon. from partitlon of OUA·1

OUA-281 MeOH/CH2CI2 wtth ethytacetate Pt8Cipi!a1e rich in betutinlc ac:id

DUA-282 MeOHICH2C12 Hlgh pclanty fnldion, from paniliOn of aq. OUA· 28 wíth butano!

DUA·2C MeOHICH2Cl2 Hlgh po!atity fraction, from partltlon of OUA-1 wllh bulanol

DUA·5F CHCIJ¡'MeOH Pura unlenown metabolae from U. &ndrieultll DUA-51 CHCl3/MeOH Taraxasterol from U. andrleuJa7 DCG-1 EtOH. MeOH Crude exttad from roots of c. (llfi99R DC~3A CH2CI2/Me0H Low polaiity l'raclio.'l. from partitlon of OCG-1 wí1h

hela:lne DCG-38 CH2Ct2/Me0H Medlum polerity fractlon. from par1ition of OCG-1

wllh elhylacutale oc~c MeOHICH2Cl2 Hlgh po!arity fraclion, from part.tion of OCG-1

wllh bulanol NCG·2f1 Me OH Pure metabo111e from C. Grqggil NCG·5C CHCI3 Pura me!abollte from C. Gregg¡1 TPZ·1 MeOH CtudG eXItiiCI from T. procumbens, whole plan! TPZ..2A Hexane low polarily fnwlion, from partítlon ol TPZ·1 wlth

hoxane TPZ..2B CH2CI2 Low po!ality lractlon, from partíllon of TPZ·1 wlth

dlc:Noromelhane DCRZ-1 Me OH Ctudo extract from roota ol D. oontrajefva DCHZ·1 Me OH Ctude oxtract from lesves of D. oontro¡eNa

The leishmanlcldal actlvlty of all samples was evalualed usong !he MTS assay (Ganguly el al., 2006); .slnce lhls ·assay had never before been used for L eelhiopica, lt was optimlzed for lhis sj¡edes followlng lhe procedure described above. All samples were lniliaDy tested for lheir lesihmanlcldal activity at 100 IJg/ml, uslng Le/shmanls spp. promastlgotes (Table 3.3). Of !he specles tested. L aelhioplcs proved lo be !he most sensitiva to !he various samples. showlng percentage values or viable cells as low as 1. 75 after 24 hr or trealment. whije L mafrx appeared lo be !he most resistan! lo !he actlon of !he planl extracts, except for DUA-1.

51

Tabla 3.2. Effea ot 24-M lleatmenll'.ilh lhe ptant el<llaeta al a concentrationot 100 ¡J9Iml on L a&thloplca, L major, and L I1'0pks metacydlc promasdgotes. The extracta shown In bold wem aelected for furthoranalyslt.

01;1A.1 OUA.2• OUA-28 OUA-281 OUA.282 OUA-2C OUA-SF DUA-51 OCG-1 DCG-31\ OCG·38 OCG-3C NCG·2F1 NCG-5C TPZ-1 TPZ-2• TPZ-28 OCRZ· 1 OCHZ·1

L trop/C6 % VIable Cell :!: SO

24.57:1:0.65 18.80:1: 1.30 53.06:1:1.96 44.76:1:5.71 49.n:s.95 44.93;1;0.25 23.19 ±0.98 57.62:1:0.57

46.83 :1: 11.26 14.03:1: 1.0!1 29.86:1:8.49 55.37:1:4.08 21.40 :t 1 22 11.59 :1: 1.39 43.02:1:1 .30 14.!>4 t 0.49 31.55:1: 1,55 28.95 :t 1.80 35.30 :t 12.57

Lma}or % VIable Cetl t SO

27.13 :1:2.28 51.82±.2.29 73.69:1:6.30 81.99:1:0.86 56.88± 11,74 92.71 ± 2.29 63.56:1:3.44

104.88 ±30.91 126.92:1:11.74 44.13± 1.72 85.02 :!:.3.44 63.80 :!: 16.80 90.08 i 11.47 85.02 :!: 23.48 78.14:!: 0.00

25.30:1: 11.74 70.04:!: 2.29 74.70:!: 4.29 74.70+4.88

L aethtopfca % VIable Cell :!:SO

41.37:t 5.40 16.78:1: 1.58 44.08:1:3.91 42.95:1:9.01

49.50:1:19.74 "4.81 t 13.97 14.00 :t 1.99 71.12.:1:7.27 40.40:1:6.89 7.36:1:2.13 28.09:1:3.61 30.51 t 10.11 20.99:1: 1.48 1.75 :1: 1.14

21.06 :t 3.29 7.87±3.19 21.30:1:1 .91 33.49 t 7.32 33.90 :t8.47

The 3 most actiVe samp!es were turther lnvestigated for thelr effect on both promastlgotes and axenlc amasllgofes ot L aeÚI/op/ca In thls case, the most active sample, as indlcated by thé lowesl LO~ value (7.2 ¡Jg/mlln promasUgotes and 27 vg/ml In amasllgotes) and confirmad by the hlghest relaUve median potency (RMP) (29.24 ~ 10-4 in proma.stlgotes and 7.78 • 10· • In amastigotes), was the fow.po!.arity frac1ion from C. greggü OCG·3A (Tabla 3.4). The second most active sample, also a low polarlty rractJon, TPZ·2A from T. prowmbens, showed a very hlgh LOso against L. aelbloplc8 promasdgotes, but not against lts amastigotes.

52

Tabla 3.3. LOso and RMP values extrapolated from prob!t analysis v.ith IOg!t ltanafoonalion of do5e'f6Sp0nse data . The RMl' was es!lmeted by uslng amphoterlán B as a reference compound. Plal1t exlrads v.-ere tested et concenlratrons ranglng trom 100 to 1.5 l'{llml

Plan! extract TPZ.2A OCG-3A NCG-5C TPZ·2A In amaaUgotes DCG-3A In amaatlgoíes NCG-5C in amastlgotes Amphoterieln B

LD .. 18.5 7.2

62.4 95.2 27.1 94.2 0.02

Rf,!P 11.43 X10 29.24. 10 .. 3.38 . 117" 2.22. 10~ 7.78 . 117" 2.24. 10~

1

Both fractlons were lastad for thelr abiflly lo de<:rease lnfection In cells lreated with S ¡¡g/ml of each seml-puriflad fractlon; the resulls showed that both fractions slgnificantly raduced (P < 0.05) the percentage of iníected cells wíth respect to the percentage of untreated Infectad ceHs. going from 69.9% ± 2.5% In the latter to 20.8% :1: 2% In lnfected cells trealed wlth the OCG..JA fraction and to 14.9% i: 0.5% In TPZ-2A-treated cells (F¡gure 3.1a). Nether lreatrnent slgniflcanUy affected the number of total cells counted In each slide {F"ogure 3.1b), suggestirlg thal both fracllons represent an Importan! source of candidatas fof lelshmaniasl$ therapy. Presently, the bloassay-gulded purfficaUon of the extracts of both plants is in progress.

53

..

.. .. .. • ...

1: , "

.. .. u

1 ... ~

r-J

a

b

lllfl• .........

Flgure 3.1. The effect of OCG-3A and TPZ-2A (SIJ!lfml) on tenninally ditlerentiale!l THP· 1 cell~ lnfaded wlth L aiJlhlop/ca l s reported, (a) The percenlage of lnfected THP-1 cells lollowtng 24 tlr ttealment wtth the plant extJacts ls compared with tne percentag& of inlectod untrea!ad THP-1 cells (b) The elfect of lhe same tteatroont on 1he number of total c:els present ln lhe slde. L aethiaplca and THP-1 ce!ls are present 111 al !Sal1lples.

54

3.2.5 Dlscusslon

The present study showed that both the root .extract or C. greggii and the whole plant extracl from T. procumbens wero lhe most active against promastlgotes of L aefhiopfca. L tropica, and L major. Ackfrtionally, the results showed that for both plants. the metaboliles responslble for the leishmal'licldal actlVily are of low polan1y, slnce fraclionaUng of the correspondmg aude extracts concen1rated the activtty agaJnst promastlgotes of the 3 Lelshmanía spp. and on axenic amastigotes of L aathiopfca in the hexane fractlons.

Both low-polarfly fracUons were also able to signlficantly reduce the peícenlage of lnfectlon In a population of pre-infected THP-1 cells, withoul slgnif.canUy affecllng the number of mammalian cells.

On the basis of the resulls obtalned, and although ll is not posslble to eslabllsh the mechanlsm ot action of eílher fractlon al this slage. when considering the actMty ot !he 2 seml-purifled irac11ons agalnsl both promastlgotes and amastlgotes o! L aethiop/ca, lt appears. that Ule low­polarity fraction from T. procumbens (TPZ-2A) acls dlrecUy on lhe parasltes by killing lntracellular emasbgotes.

Flnally, the results showed tbat both C. grégg/1 and T. procumbens can be COI'ISidered as Importan! natural sources of therapeutically active egents against leishmanlasis.

3.2.6 Acknowledgments

We are grateful lo Kevln Ctough, Ray Stocker, Manl Tripathl, Paulina Simá.Polanco, and Fablola Escelante-Etosafor technical supporL

SS

3.2.7 Uterature elted

Akendengue, B., Roblot. F., Lofseau. P.M .. Bortes. C., Ngou-M!Iama, E., laurens, A., and R. Hocquemmer (2002). Klaivanollde, an antiprotozoal Jactone from Uvada klaineana. Phytochem!slly, 69, 885-888.

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57

World Health Organlzalion (2005). Lalshm811iasis: Burrlan of disease. Retrleved December 29. 2005 from http:JNiww.who.lnutelshmanfasis

58

3.3 INFORMACIÓN ADICIONAl

3.3.1 MATERIAlES Y METODOS

3.3.1.1 Procedimientos generales

Para los difGtentes procesos de extracción y purifiCIIclón se U1Jiizaron disolventes grado técnico deslOados en el laboratorio y dlsolventes grado analltico (fermont). La evaporación de los cfisolventes se· llevó a cabo a presión reducida. en un evaporador rotatorio (Büchl RE111) equipado con un baño de agua a 35• C. El análisis de !os extractos, las fracciones y los metabolltos aislados se Uev6 a cabo por cromatografía en capa delgada (ccd), empleando cromatofotios de aluminio impregnados con gel de slllce (25 DC-Aiufollen Kleselgel 60 F250 MOtel<) e Indicador nuorescenté, Los· cromatogramas sé obsetvaron primero bajo luz ultravioleta de onda corta (254 nm) y larga (365 nm) y posteriormente se sumergieron en una dlsoluci6n de acldo foslomotlbdico al 5%, se secaron y se calentaron con una pistola de aire calienle durante 1 6 2 minutos hasta visualizar los componentes. En las purificaciones por cromatografia en columna de gravedad y para adsaber las muestras purificadas por cromatografia liquida al vacío, se ut11izó gel de snice de 70-230 mallas (E.M. Men:ll). Las ooumnas para las purificaciones por oromatografla liquida al vacfo se empacaron con gel de ~fllce 60Gf~ grado ccd {E.M. Merck) y para las purlftcaclones por cromatografla en columna rápida tipo flash se usó gel de slllce de 200 a 400 mallas (Aidrich).

Los análisis por cromatogafia de gases y especlromelria de masas se realizaron en un cromatógrafo de gases (Agilent Technologles modelo 6890 N), acoplado a un detectOC' másico (AgUen! Technologies modelo 59758). Las muestras se Inyectaron al 1% en CHC~ grado analfUco (Aidñch) y las separaciones se reallzaron en una columna no polar HP-5MS (30 m x Q.25 mm l.d. x 301Jm). Se empleó He como gas acarreador y un programa de temperatura T0 150 •e (2 min), T, 280 ·e (35 mln) con un gradiente 10• C/mln. La temperatura del lnyectOC' y del detector másico se mantuvo a 280• C . Para los análisis de espectrometrla de masas se utilizaron los equlpOli JEOL-JMS-SX102 y ESl-HRMS (electro-spray ionlsation mass con el microststema Waters O-TOF).

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3.3.1.2 Obtención del extracto erudo orgánico y fraccionamiento Inicial del extracto org6nic:o crudo

Los rendimientos de fas extracciones y partldones se resumen en el ruadro 3.4; la purffieeción e iden!lficaclón de los metabollkls ácido belulfnico (OUA-5F), díscarlna 8 (NCG-5C) y ctisofaneína (NCG·2F1) se describen en los capltulos 4 y 5.

Cuadro 3.4. Rendimientos de los~ or¡¡ánlcos crudos y las fracciones de partición Uqukfo.llquldo de las especies on estud!o.

Descñpcl6n P. andrfeux/1 c. fl.T89.fl.fl Clava Rendimiento Clave Rendimiento

(%! (%) Exltacto OUA-11 54.53g OCG-16 219.5g orgánico crudo (14.9%) (11 .6%) Fracción de OUA·2A• 2.15g OCG-3A0 OAg polalldad baja

DUA-28• (21.5%)

OCG-38' (4.5%)

Fracción de 0.73g 7.5g llOI&ridad media

OUA-282be (7.3%) (73.9%)

Pfedpilado 0.6g (5.8%)

OCG-3C' Fracci6nde OUA-2C' 2.8g O.Sg polaridad alta (28.0%) ¡s.3%}

• Rendimiento (w!W) otílenldo con base a 365.1 g de mateMl vegetal seco: ~ Rendimiento (Wfw) obtaÑdO con base a 1,890.5 g de matenaJ vegetal seco: • RencfiiTliento (wlw} obtenido con base a 10 g de exttacto orgánico crudo.

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CAPÍTUL04

Actividad antiprotozoarla del ácido betulinlco y sus derivados. 2

4.1 DESCRIPCIÓN DEL CAPÍTULO

La actJvklad blológíca y los mecanismos de acaón son caractetísticas que se eocuentran lntimamante Ugadas a la estructura químíca. los derivados de produc1os naturales de uso farmócológico, generados p« modiflcadones semlslllléticas sin la alteración del grupo farmacóforo, tienen como objetivo la obtención de productos mas efectivos contra los organismos blanco, oon menores efectos secundanos o con mejores propiedades de absorcoóo y dtslribuci6n en el organiSmo.

En e>te c;apitulo no describe la actividad le\shmaniclda, tripanocida y anllplasmódlca del ácido betulinico y varios de SllS dema<los sembn!~ asi como un apartado que muestra los datos espectroscópicos más relevantes de estos productos (Sea:i6n 4 .3). la evaluadón de la actlvidad antlproiOWStia del écido betullnlco (1 ), moslró que este metabollto no posee acllvidad leillhmanicida, pero presenta una moderada actividad tripanoclda y una buena actividad anúplasmódica. Dada la potenQal adlvidad tripanocida y ardiplasmóátca del éeldo betulfnico (1), una seña de derivados simples fueron preparados y evaluados. La evaluaclón de los dBiivadoe aceülado (2). oxldaóo (3) y mellado (4) del ácido betulinlco, además de la berufina (5}, mostró que mientras las modiflcaclones en la posición C-3 de la estructura de 1 aumentan la actiVIdad leishm3111Cida (e.g 2 y 3), las modifi<;aciones en las posiciones C-3 o C-28 (e.g. 2, 3, 4 y 5). d1smlnuyen la actMdad tripanocida

~los restAiados de este lrabap se indllye<On en et mantl$CI11o • Anllprolo1,oal aciMty of betul'lfllc !ldd detivalles", P' Hicado en Phy!D<r.edicine, (2010), 17, 379-382.

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4.2 ANTTPROTOZOAL ACTMTY OF BETULINIC ACID DERIVATIVEs'

D. B. Domlnguez.Carmona. 1 F Escalanle-Erosa,• K. Gatcla-Sosa." G Rui:I:-Pineu,• O. GuUerrez-Yapu,• M. Chan-Sacab,< A. Glménez·Turba,• and L M. f>eña..Rodrlguez"'

"Unidad lle Blotecnologla, cenuo de lnvestigad6n e:.entlftca lle YUCillán. caroe 43, No 130. CoL CI'I.Jiuná, Ménda. Yuca!án. snoo MéJclco.

"lrlstilulo do bwestigaciones-F¿,~, Unlvetsida<l Ma}'Qf de San Andrés (lll'B-UMSI,), Minlllores, la Paz. BoiMa

~Oepartamenlo de ll.icroblclogía Arnbletllal y Blotecnologla, Unlvemd&d Autónoma de Campeche, Campeche, Campeche, MélÓcO.

4.2. 1 Abstract

Betulinlc aad (1), lsolated from lile crude extract of 1he leaves Qf Pentelinon 8fldñeuxll (APocynaceae), together wrth betufrnlc acid acetate (2), betufonic acld (3), betulinic acld methyt ester (4), and belulln (5) were evaluated for lhe•r antiprotozoal actMty. The results showed that modifying lt'.e C-3 position lncréases leishmanícldal actívity wMe modifrcatlon of the C-3 and C-28 posltions dec:reases trypanocídal actMty.

Key words: Pentalinon andriexii; betulinic acid. leishmaniCidal; trypanocidal: antiplasmodíal.

1 Esta sección ha sido publk:ada en Phytomedkine, (2010) 17, 379-382.

'rotresponding author. T~ +5~2&330 ~xt 159: Fax: +52·999·9813900; e­nuil: lmanuetPRCt.m•

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4.2.2 lntroduction

Protozoal dlseases conllrue 10 be consldered an important goup o# llnesses because d lhe!t slgnfficant number of cases and mortafrties every year (WHO 2004). The chemolherapy agalnst dlseases sucll as leishmaniosis and uypanosomlosls 1s 6mlted by lhe exmence o# od.y a f­dnlgs in lhe market. mosl of which are of low efflcacy, requíre a long and supervlsed treatment. show toxic side effec:s, and frequently lead lo lhEI appearance of resistant strains (Kayser el al.. 2002: Croft et al., 2006; Ashutosh el al., 2007), lhls refleds the need to continúe searching for ,_ and bet!er antlprotozoals. T ríterpenes are a group of natural products lha1 have shown a 'Nide ranga of biological actlvilies, lncludlng leishmanicldal, llypanoddlll and ant!plasmodial (Chan-Bacab et 81., 2001, Kaysec el 81. 2003; TOistikova et aL, 2006).

RecenUy, the cllernlcal transformalion cA natural trnerpenolds has been used lo prepare derivativas w.lh improved blologlcal actMty (T olstlkov ef al., 19Q7; Sallina el al., 2003). Bewr.nic: acid (1) ls a h1pane-type tmerpene found in many plant spec:ies, which has been reportod to exh!bft anll-HIV-1, antibacterial, antlfungal, antiplasmocf131, and anti-inllammatory actlvlties (Yogeeswari et sJ., 2005}.

Beiullnlc acid ( 1) has also been reported 10 lnhibft growlh d canoer cells, w.lhout affecling normal ceUs (Einznammer & Xu 2004), and íts lack of cytotoxic activity has beeo demonstrated In human astrócytes (Wick el al., 1999), human deonal fibroblasts, peripheral blood tymphoblasts (Bnzhammer & Xu 2004; Zuco el al., 2002), and animal studies (Zuco 61 al., 2002; Pisha el al., 1995). Addilionally, a number o# betulnlc acid derivativas llave been prepared to enhanee antl-HIV actMty (Kashlwada et al., 1996; Baglln el al., 2003), to reduce the organotoxic ef!eét of antlllJmor dtugs, and to be evaluated as n- anticancer agents (Rajendran et al., 2008). Howevet, and alfhough 1 has been shown to suppress the• activity of ONA topoisomerase 1 (Chowdhury el a/., 2002), and melabolites able lo 1nteract w.lh human ONA are reported lo be antiparasític (Nenortas el al., 1998; Rowe el al., 2001 ; Barakll eta/., 2004), little ls known aboutlhe antiprolozoal acllvi1y of lhls tríterpene. We wlsll to repon here on lhe lelshmar*:idal, trypanocidal and anuplasmodial activifies ol betullnic acld (1) anda number of its derivativas (2-5).

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4.2.3 Materlals and Methods

4.2.3.1 Plant material

Leaves ot Pentalinon andrfeuxR Muell. Atg. (Apocynaceae) were collected 3.5 km noñhwesl of campeche, México. on lhe road lo Chlná. A IIOOCher specimen (P. Simá 2503) has been depeslled In !he Herbarlum of Cenlro de Investigación Científica de Yucatán.

4.2.3.2 lsolation ot betuDnic acid (1)

Dry, ground teaves of P. sr.dlfeUxil (365g) were extracted three limes with e1hanol ( 4 L) at room lMlperature. Evaporallon of !he solvent yielded lhe coiresponding crude extrad (54.5g, 14.9%), wtlldl was fradionaled by successlve r¡quid-llquld pani!ion with hexane. eth~ acetate and butano!, to produce the corresponding low, medMn and high polanty f~actions. Purificatlon of !he 1ow polanty fractlon using sif~ea gel (70-230 mesh, E.M. Merck) column chromatography and a gradient elutJon {CHCb/MeOH (99:1 -90:10) mlxlures) prodUced 62.7 mg (0.11%) af pure betuflnic acid (1), klen~led by comparing Hs spectroscople data with those reported In the llterature (Mahalo & Kundu, 1994; Macias eral., 1994).

4.2.3.3 Preparation of-betullnlc acid derivaUves

The s1ruCIU!eS of all derivawes were estabrtshedlly comparlng thei­correspondlng speclroscoplc data wlth those re)lorled In !he litefature (Macias et 81., 1994). Betulin (5 ), amphoteric:ln B and chloroquíne were purchased from Sigma.

4.2.3.3.1 Setulinic acld acetate (2)

A rniXtu'e of be!ulinoc aád (10 mg), acetlc anhydride (1 ml) and pyridine (0.5 mL) was aJiowed lo stir al room tempecature for n h. The reactlon miXture was poured over dísüled water (20 mL) and !he resulting suspension was exlraded tw1ee With ethylaeetate (2:1 v/v). The organic !ayer was washed successively with equal volumes of HCI {5%). Na0H (3%), ~. and NaO satd., and then dried over anhydrous Mlh$0, Fitratlon and evaporatron of the solvent yielded 10.5 mg (96.2%) of crude acetytated product. ldenti!ied as beiiJUnic aád ecelale (2).

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4.2.3.3 .2 8etulonlc acid (3)

A solution ol 23.5 mg ol betulinlc acid ín diChlorometllane (2 ml) was treated yfflh an excess ol Corey's reagent (PCC) (Corey el al .• 1975). The reacllon mixture was allo'Ned to sbr at room temperature for 24 h and then idtered through a plug ol sillca gel (70-230 mesh). elutlng wlth 50 ml of a 99:1 mixture ol otchlorome1hane-methanall0 produce 16.1 mg (68 6%) of crude oxlcfrzed product ldentified as betvtonic acid {3).

4.2.3.3.3 Betullnlc acid methyl ester (4)

A mixture al betuUrnc acid (13.5 mg), K~ (200 mg), ~~ ( 1 mi) and acetone (1 ml) was stirred for 72 h al room temperatura. The reaction mixture was poured over distlllef water (13 mi) and the resultlllg suspension was extractad twice wíth EtOAc (4:1, viV); the organoc phase was dned wlth anhydrous ~o •. fillered and lhe solvent evaporated to produce 12 mg (86.2%) ol cruda esterified Pfoduct identifted as betulinlc acid methyl esther (4)

4.2.3.4 Leishmanicldal assay

Thls assay was carried out foiiO'Mng the procedure re¡x.rted by Muñoz. e/ al. (1994) and lnchausll el al. (1997), Briefiy, stralns of L atnamnemis (IFlAIBRI75/PH8), L brazilie(ISÍs (MHOMIBRI751M2903) and L donovani {MHOMI741PP75) were malntalned In Schnelder culture medlum v.1th 10% fetal bovine serum (FSS); pacasltes in the log phase al their growth cycle were transfen"ed 10 a microplale (96 wells; 1x106 paraslteslwell), Stock solutlons of DMSO (blank). amphct.!!l iáu e (posl!ive conlrd), belullnlc acid, and lhe varíous betulínic acid derivativas were díluted in Schneider mediUITI at <1001J9/ml, added to the plate. and incubated at 27 •e ror 72 h The IC.O (IJg!mL) values were ob!aíned using a GraphPad Software lnc. vet. 4 OO. Al the assays were carried out In tripllcate.

4.2.3.5 Trypanocldal assay

T rypanosorna cruzl slraln T ulahuen paras !tes were mallltalned In hver infuslon tryptose (LIT) medlum supplemented wlth 5% FBS. fotlowing the procedure. modified by Chataing el al ( 1998). Bnelly, parasites In the log phase of their growlh cycle wera transferred to a mlcroplata (96 wells; 1x101 parasíteslweU). Stock solubons al bellZrlida%Die, DMSO (positl\-e control and blank respectively), betulinic acfd, and lhe various batulinic acid denvatives were diuted in UT medasn and added to a p!ate (100 IJI.) at

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concentta!Ions <1 00 IJ9fmL. and lncubated at 27 ·e fat 72 h. The ICs! (¡¡glml) value was ~btained using a Graph?ad Software lnc ver. 4.00.

4.2.3.6 Antiplasmodlal assay

P.asmodium fa!clpatum st:·ain F32 was aJI!lvated at 37 -e in RPMI medium wnh 10% of human serum and 4% of hematoccite (0 , Rh+), under anaerobio ccndJtlons. accordJng to lhe melhod ol Trage; ~ Jensen (1976). Cultures wrth 1% parasilemlc and 2% hematocri!e (100 ¡.d.) were ttansferred toa 96 wells plate Stock solubons ol ctioroqulne (control), betulinlc acid, and lhe vanous betullnlc aci<! derivativas were diluted in RPMI medium to a concentratloo or <10JIS{ml and added to each well. The plate was lhen lncubaled at 37 •e fat 48 h. The IC:.o values were calculated uslng the programa GraphPad Software lnc. ver. <LOO.

4 .. 2.4 Results and Oiscussion

Betufinlc acld (1) was obtalned from the purífK:atlOn of the low polarily ftacoon of the leal extract of P. 8fldrleuxii, a plant whose eXlracts have been shown to pcssess lelshmanlcidal activíty (Chan-Bacab et al .• 2003). Allhough the low polarity iradion had shown moderate leishmanic!dal actMty, lhe lack of actlvtty of pure betulinlo acld ( 1) lndlcated that lhe tríterpene was not responsible for the weak lelshmani&ídal activlty onginaRy detected However. tes!ing. or the pura metabolile agalnst T. cruli and P ftllclpafum showed thal 1 has a modera!e trypanoádal activrty and a good an\iplasmodl31 actMty (Table 3.1). In arder to explore the possibi!ity of lmprovlng lhe anUprotozoal activlly of 1, a oomber ol slmple semlsynthatic deriva1Ne$ were prepared and/or evaluated; these derivaUv~ lncluded betullnlc acJd acetate (2). betulonlc acJd (3), betulin!c acld methyl esther (4) and betulln (5) (F¡gure 3.1 ),

66

~ •• .. .. ' •

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~ " a:oot, -· !JI o """' 1'1 • "" (1)00;,

IJl " "" """' Agure 4.1 . Strucrures of Belulinlcadd (1), Be:uünlc acld derivatives (2-4) and betufin (5).

The results showed lhat modilicallon of the C-3 hydroxyl group, either by esterifrcallon (lo produce 2) Ot oxidation (lo produce 3), resuited In a slgnfficant increase of leishmanlcidal aclivlly agalnsl L. amazonensis (Table 3.1). AJtemaUvely, the modlficaüons on the C-28 carbolcyl group dld nol show a clear effecl slnce while bell.llinlc acid (1) and betuUn (5) lack leishmanletdal actlvity, betullnlc acid methyl esler (4) showed an lmproved aclivity against L bl'azUiensis (Table 3.1 ). On the other hand, the eva!uation of the trypanocldal activity of lhe varloua lerpenoids showed lhal any modiflcaUon on lhe betulinlc acid ske!eton resulted In a Jower acUvlly (Table 3.1). Finally, and allhough our results showlng betulinlc acid (1) as an adequate antlplasmodlal agent are In ¡¡greement Wlth those reportad in !he literatura (Zlegfer el al., 2004; Ouker-Eshun el el., 2004). testlng of !he varloos dertvatlves showed thal only lhe esterification of lhe C-3 hydroxyl group (to produce 2) results in ao lmproved aclivlty (Table 3.1 }.

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Table 4.1. I~(IIM) vaki8S of an!iplotozoal actMty of beliAlnic ecid and der!vates

lelshmanlcidal Try- Anti-

Sample panocldal plasmodtal

LA M2.903 TULA F32

Betullnic add (1) >200 >200 so. o 22.5

Betullnlc acld acetate (2) 44.9 >200 154.4 11.8

Betulonlc acid (3) 51.2 >200 181.4 >20

BetuHnlc add melh}l >200 69.9 8l.3 >20 estber (4)

Betulln (5) >200 >200 173.0 >20

Amphowtcln 8 o.s 0.2 0.2

Benznldaz.ol 314. ..

Chloroqulne 0,2

lA Letshmanla ama:zonensls: M2903; L lraZ.rliensis: TULA: T I)JliJOO$tltDiJ aurJ tulahiJen: F32: Plasmodlum faJclparum

The lncrease in le•shmanlcldal activíty shown by 2. 3, and 4 sugges1s ihat preparation of other acyt derlvawes a1 the C-28 posluon. marnainlng a kelone or an ester group In C-3, can produce new derlvabves with lmproved lelshmanick!al and antlplasmodlal adivltles, since an ester al the C-3 p posiiJon and a free carooxylic acid, a high hydrophUic group, or a hydrogen donatlng QI'O'.IP at C-28 are requlred tor cytoloxic< and antí-HIV actlvilies (Bagf.n el al., 2003) lntereslingty enoogh, belulinaldehyde has been reported to be active against emasllgo!es of L amawnensis (Sauvain el al., 1996}. whUe the C-28 aldebyrle detiva!ive of belulonic acld has been shown 10 have a hgllef an!itumoral actlvity than that of the paren\ metabolíte (Klm el el., 1998; Jeong el al .. 1999; Hala el al , 2003; Dzubak eral~ 2006). Furthermore, betutonic 2cfd (3) has been reportad 10 be able to reduce the «ganotoxic effect ot anlllumor drugs {SOI'oklna el BL. 2004), while its C-28 amlne derlva!ives ere reportad as potent lnhlbi!ors of rumor cell growth (S hiruyaptna et aL. 200n.

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To date, lhere exist a number of reports 1n the literature desalbing lhe chemical modifications of betulinic acld to produce semisynlhetlc derlvatlves Wílh enhanced antl-HIV and cytolox!G acUvitles (Baglin et al., 2003); however, llttle ls known aboutlhe importance ofthe various functional groups In lhe betulinlc acld skelelon, for lhe expression of antiprotozoal aclivity. This ls the first report of the evaluation of the enliprotozoal actlvlty of betufinlc acid and a number of its derivatíves and lhe flrst report of the betulinic acld cfenvalive 2 Wílh lmproved anUplasmodlal aclivlty.

4.2.5 Acknowledgements

The authofs wlsh to lhank to Pautlno Sima lor the identlfiC8bon of the plan! matenal This wor1< was supported by Program CYTED (Projects X.S and RlBIOFAR) and Project FOMIX-Yucatán (66262).

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·-------------

4.2.6 References

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74

4.3 DATOS ESPECTROSCÓPICOS DEL ÁCIDO BETULiNICO Y SUS DERIVADOS SEMISINTÉTICOS.

las sei'laJes caracteristlc:as en el espectro de 1H-RMN del ácido betullnico, asl como de sus derivados semlslntéhcos, se muestran en las figuras 4.2 y 4.3.

4.3.1 Ácido belullnlco (1)

Agujas Incoloras; solubles en CH2CI:./MeOH; R, 0.5 (Hx/An 7:3¡; IR (CHCl~, film): 3462 cm·' {0-H), 3078 cm·' (C-H sp2

), 2945 y 2863 cm· (C-H sp') y 1690 cm 1 (Cq)); 1H-RMN (COCJ~~OD, 400 MHZ) ll 0.68 {1H, d, .F 9.3, H-5), 0.72 {3H. S, H-23), 0.77 {3H, S, H-28), 0.90 (3H, s, H-25) 0.91 (3H, s, H-24), 0.92 (3H, s, H-27), 1.15 (1H, m, H-21a), 1.25 (1H, m, H-9), 1.38 (6H, m, H-6a. H-7a, H-11a, H-12a, H-15a, H-16a), 1.58 (5H, m, H-6b, H-2ab, H-21b, H-13), 1.67 {3H, s, H-29), 1.91 (2H, m, H-15b, H-22b), 2.24 (3H, m, H-1~ H-7b, H-13), 3.01 (1H, ddd, .P 4.8, 10.8, 10.8 Hz, H-19), 3.1~.,~1H. ód, J- 5.3, 10.8 Hz. H-3), 4.58 (1H, sa, H-30a), 4.69 (1H, sa, H-30b), C-RMN {CDCI3, !00 MHz) 15.1 {C-27), 15.9 (C-23), 16.4 (C-25), 16.6 (C-26). 19.1 (C-6), !9.5 (C-29), 21.7 (C-11), 26.4 {C-12), 27.6 (C-2), 28.4 (C-24), 30-4 (C-21), 31.4 (C-15), 33.1 (C-18), 35.2 (C·T). 37.9 (C-22), 38.0 (C-10). 39.2 {C-13), 39.6 (C-1), 39.7 (C-4), 41.5 (C-8), 43.2 (C-14). 48.0 (C-19). 50.1 (C-18). 51.5 (C-9), 56.4 (C-5), 57.1 (C-17), 79.3 (C-3), 110.0 (C-30), 151.5 {C-20), 179.9 (C-28) ppm; ESI-HRMS miz 440.3690 (M' -~0 +2) (calculado para C30H.aOa: 440.3854).

4.4.2 Acetato del ácido betullnlco (2)

Agujas Incoloras; soluble en CH2CI2 y CHCb; R, 0.65 (CHCI:{MeOH 98:2); IR (CHC~ film): 2946, 2870 cm·' (C-H spi, 1722, 1693 cm·' (C:O) y 1374 cm·' (C-H); 1H-RMN (CDCIJMeOD, 400 MHz) ó 0.75 (3H, s, H-23), 0.78 (31-1, s, H-26), 0.91 (6H, s, H-25, H-24), 0.93 (3H, s, H-27), 1.69 (3H, s, H· 29), 2.04 {3H. s, H-32), 3.00 {1H, ddd, J: 4.8, 10.8, 10.8 Hz, H-19), 4.46 (1H, dd, J= 5.8, 10.6 Hz, H-3), 4.61 (1H, d, J: 2.0 Hz, H-30a) y 4.74 (1H, d, J: 2.0 Hz, H-30b); ESI-HRMS: miz 439.3556 (M' -CH,COOH + H) (Calculado para ~702: 439.3576).

4.4.3 Ácido betul6nlco (3)

Polvo blanc;o; soluble en CH,Cb/MeOH; R, 0.65 (Hx/An 7:3); IR (CHCJa, lílm): 3308 cm·' {O·H amplio). 3073 cm·' (C-H sp1, 2945, 2878 cm·' (C-H sp3) , 1700 cm·' (C=O), 1644 cm·' (C=C) y 1460 cm-• (C-OH). 1H-RMN

75

(CDCI,/C0300, 400 M Hz) & 0.92 (3H, s, H-23), 0.97 (3H, s. H-26), 0.98 (3H, s. H-25), 1.01 (3H, s, H·24), 1.06 (3H, s, H-27), 1.69 (3H, &, H-29), 3.00 (1 H, m, H-19), 4.61 (1 H, d, J= 1.2 Hz. H-30a) y4.74 (1H, d, J= 1.6 Hz, H·30b).

4.4.4 Ester metJ11co del ácido betulfnico (4)

Polvo amariDento; soluble en C~ y CHCb; Rt 0.65 (Hx/An 8:2); IR (CHCJ,, film): 3523 cm·' (0-H), 3078 cm·' (C.H sp'). 2924, 2868 cm·' (C·H sp3

), 1721 cm·' (RCOOR): 'H-RMN (COCb/CD,OO, 400 M Hz) S 0.66 (1 H, d, J= 9.1 Hz. H-5), 0.74 (3H, s, H-23), 0.79 (3H, s, H-26}, 0.90 (3H, s, H-25), 0.95 (6H, s. H-24, H-27), 1.67 (3H, s. H-29), 2.99 (1H, ddd, J= 4.5, 11 O, 11.0 Hz, H·19), 3.10 (1H, dd, J= 4.9, 11.24 Hz, H-3), 3.66 (3H, s, H-31), 4.53 (1H, d, J=1.2 Hz, H·30a) y 4.66 (1H, d, J= 1.6 Hz, H-30b),

76

••

.,. ,.~ .. 110-* ""* ~--.... .,. ...... \!_ ....

30 :L5 1 0 10 05

. -a• - 0411 o$ -

..il1-~~~$,~~5)!! ~

Figura 4.2 . E8pec:tros de 'H-RMN de ácido behJ!Inlco (a) y acetato del Acldo betullnlco (b ).

77

46 40 35 30

b .J. -r!ff:fr--.1~ .............. ~.7. /

............. ~ /, ....... ... , ........

o 4 .0 • o J6 30

• 2.5 2.0 10 0.5 ppm

--· r.. ~ ......... .. , ...... u.,

. ....... ,.,' ...... ./

20 1.0 o. e ••'" Figura 4.3 . Espectros de 'H-RMN de ácido betulónleo (a) y ester metllico del écido betullnico (b).

78

CAPÍTULO 5

Metabontos de Colubrina gregglf var. yucatanensis y evaluación de su actividad antlprotozoaria y cltot6xíca.1

5.1 DESCRIPCIÓN DEL CAPíTULO

En el capitulo 1 se reportó la presencia de adividad leishmanicida en las fracóones semipuriflCadas de polaridad baja y media del extracto de ralz de. C. greggñ; en este capítulo se describe el alslamient.o e ldenlitlcaci6n del ácido 3-0.acetiloeanótico como un nuevo producto natural con esqueleto ceanotano, ademas de cinoo melaboiitos previamente reportados, ldent!flcados como ácido oean6bco. áoldo C8all0ténico. áádo betulinico, d~Scama B y c:risofa-,eina, obtenidos de estas fracciones bioactlvas La evaluación de la acúvidad a!1llprotozoaria de los produclos na!utales y los ésteres semlsintáticos acetílcea.notato de cfnnelllo, oeanotato de dimelio y etisofaneina peraoeUlada, mostraron que el ácido 3-0-acetkean6tlco, el oeanolato de dimelilo, el ácido ceanoténico y la cnsofaneina peracelllaPa poseen una moderada ectiVidad le¡shmanicida, en lanto que la etisofaneina peracetilada mostró el mayor lndlce de selectividad de los productos evaluados. Por otra parte, los resultados también mostraron que el áddo 3-0-acetflceanótico. el áddo ceanol.énico, el ~cido berullnlco, y la dlscarina B, la cnsof9neina y la cnsofaneína peracetJiada poseen una baja activklad tnpanodda. Asimismo, los resulll!dos mostraron que la presenQia de los grupos oxhklrilo en C-3 y carbonilo en C-28 del esqueleto de los ceanotanos no es ésenclal para la expresión de aciMdad leishmaniclda y tripanocida. Por otra parte, la evaluación- de la actividad cltolóxlca y antiprorlferativa de los dlferentes productos revelO que ninguno de los metabolltos posee eslas actividades. Los resullados de la evaluación de la actividad antiplasmódica indicaron que el ácido behJIInlco contnbuye a la actMclacl antlplasm6dlc:a originalmente detectada en 1!1 extracto crudo de ralz de C. gret;¡g1f var yucatanensls. Adiaonalmen!e, se· ane.xan las principales caracleristicas en los .espoctros de RMN del ácido 3-0. acetllceanólico y cftScarina B (580Ci6o 5.3).

' Este capíllllo fanna parte del manuscrtfD "Metabolites frorn roots of Colubrlna greg¡jl 113f. yucat-nsl• ar1d éWluallon of lhelr anCipraloz.oan and c:!totoxic:al IIICIM:y" reden!eml!l\18 &Ome!ldo p8ta pUblcacíón al Joumal of ~ Olemlcal Soclety.

79

5.2 METABOUTES FROM ROOTS OF COLUBRINA GREGG/1 VAR. YUCATANENSIS ANO EVALlJAT10N OF THEfR ANTIPROTOZOAN AND CYTOTOXIC ACTMTY'

Dafne-Berenice Domfnguez-Catmona.• Fablola Escalante-Erosa," Karlina Garcia..SOsa,• Grace Ruiz-Pinell,' David Gutlerrez-Yapu,• Manuel-Jesús Chan-Bacab,• Rosa-Esther Moo-f>uc,4 ~ C. Veilcl!.• Alberto Giménez­Turba,• and Luis-Manuel Peoo•Rodrlguez.•

0 \Jnlclad~ Blotecnologfa. Cent:o de lmoestlgacióoo Cienbllca de Yueatén. Cale <43, No. 130, Col. Chubumá, Mé!lda, Yucafán, 97200 M6ldco. • lnslilutoo de lnvestigadones Fám\aco.Bioqulmicas. Un1Ya$1dad Mayor dé San Andr6s (IIFB­UMSA), AY SaiMICI<a 2224, la Paz. SoMa. • OepartamaniO de Mlcrobiologla Ambiental y Bloloonologla, Un!vetsldad lwt6noma de C8mpeche, Aguslln Melgar sin, Cal\)iliJoe, <:ampeche, México • lklidad de lnvesljgaori6ro Médica Yucatán, Unidad Médica de Alta Especle&dad, Cent:o Médico lgnao;io Ge!cla T élez IMSS, Calle 41 No 439, Col lnduslrlal, M4rlda. Yucafán, 971511 México. • Jodrell lalJoralory, Royal BOianc Gardeos Kew, Ridvnond, Surrey,TW9 3A8 U K.

5.2.. 1 Abstrac:t

PurifiCl!Uon of !he root extract of Co/ubrina greggil var. yucatanensi's resulted In the lsolalion and ldenllfication of 3-0-acetyt ceanothic acid as a new natural ceanolhane trlterpene, together wlth the fNe known metabolltes ceanottwc aád, c:enolhelliC aad. betuhnlc acid, discarine B, and chrysophanein. The natural ptOducts, and the semlsynthetic esters acetyl dimethyl eeanolhate, dimethyl ceanotha~ and chrysopllaneln peracetate, sho'....-ed moderate to low lelshmanlcidal and tsypanocidal acllvltles. None of tha metabolltes proved to be cytotoxic or to have antlproliferatrve activoty. The results a!so suggested that betuf'lllic acld conlributes lo the antiplasmodial activlty originafty detected In the crude root extract al C. greggi va.r yucal811ensis.

Key words: Colubrina gteggi var yucatanensis; Rharnnaceae; lelshmanocidal; T rypanoadal; Antiplasmoá.c: Cytotoxlc; Anbproliferauve; Ceanothane.

1 Es1e manuscnto ha sido sometido para :>u ¡xd>IICaCión al Joumal of lhe Brazlllan Chemical Soclety.

co~pondin¡ author Tel. ·52· 999.1342.8330 ext 159; Fu: +52-!199·9&13900; ~ mall: lmanuel@cEcy.m~

80

5.2.2 lntroductlon

Leishmanlosis, trypanosomlosls, and malaría are a group of PfOtozoan dlseases considerad of significan! importance due to thelt lncldenoe and rata ol mortallty In developing oountries (WHO, 2004 ), The low effectlveness, llmited availabHity and high toxicity al existln:g veetments for lhese Ulnesses empheslze the lmportance of conUnuing lhe search for new and better antiprotozoan pharmaceulicals (lose!, 2008).

The relevan! roje played by natural :products In the developmenl of new drugs, or models lor them, ls widely recogni2ed (Newman & Cragg, 2007; Baker et 81., 2007; Butler, 2008); al lhe sama lime, plants are considerad as an importan! source of blologlcally active natural products (Fabrican! & Famsworth. 2001 ), lncJudlng a number ol them wilh antlprotozoan activtty (Sepúlveda-Boza & Cassels 1996: Chan-Sacab & Pella-Rodrlguez. 2001; Saxena el al., 2003).

Phytochemlcal sludles of the genus Cotubrina (Rhamnaceaa), Whklh has 31 spedes (JohnSion, 1971), repon a wtde slruciUtal dlverslly of metabolltes. lncludlng ansa macrolldes. saponins, aporphinic alkalokls, phenollc acids, ftavones, and tri!erpenold acids (Wanl e/ el .. 1973a, 1 973b; Roltman & Jurd, 1978; Guinaudeau el al .. 1981; Baxter el al .. 1988; 0\Jiad­All e/ 81., 1994; 8sohly et al., 1999; Xing-Gong el a/. , 1999). To date, only chrysophanol, an anthraquinone wilh ¡mtimicrobial activíty. has been reportad es a meta bolita from C. greggU (Garcla·Sosa et al., 2006).

During tha screening al extracts from natlve yucateean medicinal plants as potential sources al bloactlve melaboliles, the root extram af Colubrlna greggii S.Watson var. yucatanensls M.C. JohnsL, a shrub used for !he treatrnent of llver diseases, ulcerations, abscesses, asthma and tuberculosis (Mendleta et al., 1981), showed trypanocidal, antlmafarial, lelshmanlcldal and cytostatic activíty (Vera·Kú, 2004; GetU el al., 2009).

Contlnulng our search for bloactlve matabolltes from the nallve nora of lhe Yucatan penfnsufa, we report hereln on the leishmanicldal, trypanocidal, antlplasmodlal. cylotoxic and antiproUferaUve actlvlty ol the crude extract. the semf.punfied fractlons and the lsola!ed melabolltes from the root extract Df C. gregg/1 var. yucatanensls.

81

5.2.3 Results and dlscusslon

lnílial fractionatlon of !he bioactive root extrad of C. greggii var. yucatanensls ytelded a low and a medlum·polarity fracUons, bolh wlth leishmanícldal activlty. Successlve purifkallon of 1he medlum-polarity fracllon resultad in the lsolatlon o! 3-0-acetyl-ceanolh-20(30}-en-1 ,28-dlolc ac!d (3-0-acetyl ceanolhlc acld, 1) as a new natural oeanothane trílerpene, togelher wlth~ the known metabolites oeaoothla acld (2), discarine B (7) and chrysophanein (B)~ Simaarty, purifiCation o( lhe low-polarity fractlon led to the lsolatlon and identiflcation of ceanolhenlc acld (5) and bewllnic acid (6) (Fig. 5.1).

The IR specltUm of 1 showed absorp!lon bands at 3073 (sp2-

hybridlzed e-H). 1731 (ester carbonyt) and 1681 cm·• (carboxyt carbonyl) and a sodrum adduct of the molecu~r Ion peak (M' + Na) al mtz 551 in lts HRMS, lndlcating a molecufar formula o( ~H,.01. The nature of the carbons In lhe structure, establisl'led through !he analysis of the HMQC and OEPT expenments, was establlshed iiS seven methyl grou~. nlne methylenes, seven methynes, and nlne quaternary oarbons. The 1H-NMR spectrum of 1 cootafned seven lhree-proton slnglets (0.88, 0.98, 0.99, 1.06. 1.16, 1.68 and 2.03 ppm) lndlcallng that all methyt groups wens attached 10 quatemary ca~bons; additionalty the tower fi~d methyt group singlets at 1.68 end 2.03 ppm were asslgned 1o lsopropenyt and acetyt groups, respectively. The presence of a diSUbstituted double bond In lhe structure of 1 was confirmed by the 1wo vlnytrc proton slgnals at 4.58 and 4. 70 ppm; whUe !he acetyl group was confirmad by an ester-cartxlnyt carbon {O 172.5) in its ')c­NMR. The double bond arid tlvee C<i!bonyt groups observed In lhe '3c-NMR of 1 {O 172.5, 1n.4 and 180.1 ppm) accounted for four of !he nlne unsaturallon sítes implled by !he molecular formula, and lndícated thal lhe llve rernainlng unsaturatlon 6ites corresponded lo a pentecyc!lc structure. The spedtoscoplc data of 1 (Table 5.2, F'¡gure 5.2) proved lo be very simdar to !hose reported for ceano!hlc acid (2), a ceanothane trllerpene orlginaUy lsolated from Ceanothus americanus (Julian e/ al., 1938) and later ldenlified from Colutxina granulosa (Roltman & Jurd, 1978). However, !he presenoa of a low-field carblnol proton in the 1H-NMR spectrum of 1. which showed strong HMBC correlatfons to both lhe ester carbonyl carborr (O 172.5) and lhe acetyt methyl slngfet al 2.03 ppm, strongly suggested !hat 1 was the 3-0-aoely1 derfvallve or 2. Thls was confirmed when acetytallon of 2 produced 1 as the only product. Furthennore, the prMence of 1 In !he origlnlll root extrae! from C. greggll, as delected by TlC (Figure 5.3), ruled out l ts belng

82

an artifact of the isolation procedure and confinned íl as a new natural product.

Oiscarlne B (7), chrysophaneln (8), and csanothenlc acld (5) were ldentilied by analyzing thelr spectroscopic dala (Table 4.2, 4.3) and comparing 1t with lhose reported In the literature (Goomel~ el al., 1998; Kubo el al., 1992; de Mayo et sl., 1962). Betullnlc acld (6) was 1denlifted by comparing its TLC behavloor wtth lhat ot an authentic sample, and by comparlng its '~e NMR data with lhose reported In !he llterature (Mahato & Kundun, 1994}. lt is lmportant to mention that metaboliles 1 and 2 were lnlllally characterlzed es thelr corresponding methy\-ester derívatlves 3 and 4, while 8 was ldeo!lflad as lts perace~ated derivativa 9 (Figure S. 1.; Table 5.2, 5.3).

All of the isolated melabollles, togelher wtth lhe semlsyntheUc esters acetyt-dlmethy1 ceanothate (3}, dimethyl oeanolhale (4), and chrysophaneln peracelate (9), wem evaluated for their In vitro antfprotozoan (leishmanlcldal, trypanocldal, and antiplasmodial), cytotolCic, and anUprollferative activllies. The results showed thal lhe natural ceanolhanes 1 and 5, and the semlsynthelic dert./Btlves 4 and 9, have moderate leishmanicldal acUvity (IC60 values ol 2Q-28 1JQ·ml'1); slmRarty, only !he natural produc1s 5-11, as well as lhe semisynthetlc esters 3 and 9, showed a low trypanocldal actlvity (IC110 of 30-70 IJQ·mL''). The evaluation of !he ant!plasmodtal activity of lhe various melabolites and derivatlves showed that belulinic acid 6 (IC,., 9 . 7 11Q·ml'1) appears to contrfbute lo lhe anliplasmodlal actlvity of the crude elClraot of C. greggii; thls ls In agreem¡¡nl with results previously reportad ln lhe literature (Duker-éshun el al .. 2004; Zlegle.r el a/., 2004).

83

1\j 11, .. """" """"' " ' COO!I • a

~ COC>(>o, ...,.,o c., • OOC>Oh " ""'

X 1

l

Figure 5.1. Stf\Jetures or lhe natural and .emisyntlletlc den'vatlvos compounds from e gregg;l.

84

Even though the crude root extract. together wlth the low and medlum polarity fTactions of C. greggfl. sllowe<l cytotoxlc ~tlvity agalnst HoP-2 cells, nona of the lsolated metabolites showed this type of activity (Tabla 5.4) These resu!ts are In agreement wlth !hose reportlng a llmlted biotogical activity for ceanothlc acld (2) {Lee al al., 1991: U al al., 1997; Lee al el., 1998: Suksamrarn al al., .2006). Furthermore, nona of the me!abolltes tested, wlth the exceplion of !he peracetylated clvysophanein (9) wlth a low activrty, showed antiprofrferative actMty agalnst KB cells. lt ls lnterestlng to polnt out that the cytotoxlc acUvlty ol C. macrocerpe and C. texensls has been attributed lo the presence of colubrinol and lts ace!ate (Wani el al., 1973a; Popoca et al., 1998), howeverthese me!abolites were not detectad In the root extract of C. greggil.

Although the activity ol the ceanolhic acid der!valNes 1 and 4 suggests that the presence of an acety1 and/or methyt group In the parent structute 2 fevors loishmanicidal acUvity (Tabla 5.1). the slmftar vatues of 2 and 3 tndlcate that nelther the carboxyt or hydroxyt goups are essentlal for the expresslon of anliprotozoan acUvlty. Altemallvely, perecetytatlon of clvysophaneln (8) produced the corresponding semisynthe!ic aster 9 wlth ~n lmproved leishmanlcldal actMty, and a considerable setec!Mly fndex (9,7, Tabla 5.1).

85

00

"'

Tobto 5. t Leishmon.,.dal, uyp&nooodat, Mllptasmodlal "'1d cy10toxlc: aeiMty (te;,. (fJO ml'1)1 of cruao &xtmC1. rreollons ond P"'" compOlunds rrom C. grof}flil.

EJ<IriiCII AJITIPAOT'OZOAII ACTMTY

Compooocts 1.. amnonen•.s T. cnnJ tulam- P. la/cWNm Vf!IO

IC.. SJ le.., st te., IC,.

CG·1 32.• - •100 - 8 NT

CG..2.A •2.5 - 73.S - 45 t.rr CG-28 •25 - •tOO - • 10 NT

1 2.8.2 t 2.7 3.& >lOO - •10 103.1 .. 18

2 45.As84 2.8 •100 - t/T 131.2 .. 3.2

3 40 2.: 9.8 - 5e 2:<5.2 - NT NT 4 20GsS-8 - >IDO - N'r NT

S ~h2.7 ~~ 84 O.:c4.3 15 14T N5.:12

• >100 - 34.2.:111 42 97 145.0 :<2.9

7 >100 - 5e~L•3.2 3.5 >lO tllll 1 12.7

8 >100 - ~7: 195 V1 >10 !5.2tO.:cU

V 12.7 t 1.1 t7 853• 9,0 18 ~to 123 ... 4.2

Pontamllllno 100s.0.8 - - - - NT

Senuidalole - - 740.5 - - NT Ctlkl(oqufne - - - - o 1ot0.02 I'IT

SI. SoltiCWotY '"""" ""'"' caloulo!ed., '-"• ro~o ¡e,. m" cytOtu!Cl~ ActMly'" VE~O collf'IIC, olonllproto>Obn ndtvlly

To date, ceanothane triterpenes halle only beeo reponed to OCC\.U' in specles of lhe Rhamnaceae famUy (Jullan el al., 1938; de Mayo el al., 1962; Eade ole/., 1973; Lee aJa/., 1996; Lee el al., 1!197. Ll al aL, 1997; Lee al al •. 2003; Suksamram el al., 2006; Gulacomefll el al., 2007), and particolarly In those belonglng to lhe ziZiphoids In the tribal classifícation reportad by Rlchardson el al. (2000). These results, together with our ñnding or ceanothanes ln lhe roo! ~el otc. greggn, support the possíbte use of lhis class of trilerpenes as chemotaxonomlc marl<ers tor classifH:allon in lhe phytogenelíc anatysis of lhe Rhamnaceae famlly.

5.2.4 Experimental

5.2 .. 4 .1 General experimen tal p rocedures

AnalyticaJ nc was carried out uslng alumlnum-bacl<ed slllca gel (60F~) platas (E.M. Mercl<, 0.2 mm lhlckness). The various oomponents in lhe chromatograms wentvísuallzed using a soMJon of phosphomollbdlc acid (20 g) and cene sulfate (2.5 g) In 500 ml of sulfuríc add (5%). Flash chromatogmphy purifH:ations were perlonned uslng sfllca gel (20()-400 mesh) from Aldrlch, whlle TLC-grade sUica gel 60GF~ (E.M. Merck) was used for vacuum llquid chromatography (VLC). Prep-TLC puriflcallons we¡-e carrled out usfng gless plales lmpregnated wilh sUica gel 60 Fw (E.M. Merck. 0 .25 mm lhlckness, 20 x 20 cm). Tha oplical rotalions were measured in CHCI,; using a Perkin Elmer 341 pofarlmeter. MeiUng potnts (uncorreeted) were determinad from ¡¡ Mel-Temp 11 epparatus (laboratory Devlces lnc.). IR spectsa were recorded In CHCI, or MeOH (film) uslng an FT-Nicotet Magna Protégé 460 speclrophotometer. 'H NMR (400 aod 600 MHz) and 13C NMR (100 and 150 MHz) spectra were acqulred on a Bruker Avance 400 spectrometer or a Bruker Avance 600 spectrometer with CHN cryoprobe, respectively, using the residual solvent resonances as Interna! references, callbrated to TMS (0.00 ppm). Electro-spray hlgh-resolutlon mass speetra (ESI·HRMS) wera determlned by dlrect injection on a Waters 0-TOF microsystem (using 0.1% phosphorlc add In a 1 :1 waterlacetonltrile mixture as rererenoe) or using an Orbftrap MS (Thermo) connected to a Surveyor HPLC (Thermo) lo lnject 11\&samples.

5.2.4.2 Plant materia l

Rools ol Cclubrina gmggii S. Watson var. yucatanensis M.C.Johnst. were cotlected In Abalá, Yucatán, México anda voucher speclmen (P. Slmá­D. Domlnguez 2916) was depos¡ted in the Herbarium of Centro de lnvesllgadón Oientlf1C8 de Vucatán.

87

5.2.4.3 Extractíon of p lant material and purlflcatlon of cruda extrae!

Dry roots or C. grii{Jgl7 (365g) were extractad three times wilh ethanol (4 L) at room temperatura. Evaporabon of lhe solvent yieldad the COfTespondlng crude extract (CG-1, 54.5g, 14.9%), whi<:h was suspended in 1.8 L el a H,O/MeOH (3:2, v/V) mixture; the resu!llng suspenslon was fractlonatad by successJVe llquid<llqukl partition wilh hexane (3 ><, 2:1, 1:1, 1:1), elhylacelate (3><, 2:1, 1:1, 1;1) and butano! (1 :2) lo produce lhe correspondlng low (CG-2A). medium (CG-28) and hlgh (CG·2C) polarlty fraclions. Purffication of lhe medium polarlty frectlon (CG-28, 9.6 g) by VLC, uslng e gradlent elutlon wilh CH,CI:¡/Me,CO (99:1-94:6) foflowed by CHCla/hexsne/MeOH (70:25;5), ylelded frections CG-5A-N Frection CG-SE (550 mg) was purífled by nash chromatography usl ng an rsocretk: elutlon wllh hexaneiM~~tCO 8:2, lo produce pura 3-().acetyl~nothic acld (1, 172.1 mg) and fractlon CG-61 (50 mg), which was furlher purified by rolumn chromatography {e!herfhexane (1:1)) to produce ceanothic acid (2, 16:5 mg) in pure form. AddiUonal purlf~catlon or- fraction CG-5C (414 mg) by flaih chromatography, us1ng a gradlent elution with hexane/ MB2CO (8:2-7:3). resulted In the isQiaUon of dlscarine B (7. 108 mg). F'lll8lly. chrysophaneln {8. 168.5 mg) was conectad as a yellow preclpltate by filtration from fcaction CG· 5G Purif1C8tlon el the low polarityiraction (CG·2A, 1.5g) by VLC, uslng a gradient eluUon w\th mixtures of hexaneiMe,CO/MeOH (95:3:2 to 60:38:2, produced eleven fractioos (CG-3A-K). Framlons CG-3E·F were comblned (500 mg) and purified by ftash chromatography (hexane/ether 7:3) to yleld ceanothenfc acld (5, 20.8 mg) and betullnlc acid (6, 2o.4 mg).

5.2.4.4 3·0-aeetyl-caanothlc acl d (1)

Whlte amorphous Solid; mp: 271.5-273.1 ·e; (a )o 3 -. 33.12 • (e O.o1 ,

MlltCO); IR (film) v,.. cm-•: 3073 (CH=Cl3

2929, 2873 {CH.C), 1731, 1685 (>C=O); ' H-NMR(CDa()D, 400 MHz) and C-NMR (CD3QD, 100 MHz) data: see table 6.2; ESI·HRMS m/z 651.3524 (M+Na)' (cate. for ~.oaNa08: 551.3584).

5.2.4.5 Ceanothlc acld (2)

Whíle smorphous solld; (o)020 + 30.82 · (e 0.003, MeOH); IR (fdm)

v_ cm· '· 3411 (OH~ 2942, 2873 (CH.C), 1697 (>C=O); 1H-NMR (CD30o, 400 MHz): O 0.88 (3H, s, H-24), 0.90 (3H, s, H-26), 0..97 (3H, s, H-27), 1.01 (3H, s , H-25), 1.35 (JH, s, H·23), 1.67 (3H, s, H-29), 2.45 (1H, s, H-1), 3.06 {1H, m, H-19), 4.06 (1H, s, H-3), 4.57 (1H, bf. s, Ho30a), 4.69 (1H, br. s, H30b); ESI·HRMS miz 487.3418 (M +Hf (cale. for C~.~S: 487.3418).

88

5.2.4.6 3·0-acetyf-dlmethyt-ceanothate (3)

A miJ~ture of 1 (5. 1 mg), KzC~ (80 mg). CH31 (300 IJL) and acetone (1 ml) WBS stirred ror 72 h at room temperatura. The reacUon mixture was paured over distOler water (14 ml) and lhe resulting suspension was extractad twice wlth EtOAc (4:1, v/v); the organic layer was dried over anhydrous Na~o. and evaporated lo produce 4.6 mg (87.7%) or !he crude estenfied product, which was puriflfld by column chromalography (hex¡¡ne/Me,CO 9:1) to glve 3 (4.2 mg, 91.3% yield) as a white powder. 'H· NMR (CDCI3, 600 MHz) and 13C-NMR (~. 150 MHz) dala; see table 5.2; LR-MS nVz 557 [WH]"

5.2.4. 7 Dlmethyl-ceanothate (4)

A fraction contalning ceanothlc acid as the maln product (6.5 mg), was mlxed wllh K2C~(2.20 mg), CH31 (800 fll) and acetona (1 ml) and lhen stirred for 72 h al room temperatura. The reaction mixture was poured over dislUied water (13 ml) and the resultlng suspenslon was extractad twice with EtOAc (4:1, v/v); the organlc: phase WBS dried over anhyórous Na.S04 and evaporated lo produce 9.6 mg o! the cruda esterffied product which was purffied by mulüple-eluUon (Sx) ~p-TLC (hexanelether 7:3) to giVe 5.4 mg o! 4 (56.2%) as a whlle solki H-NMR (CD30D, 400 MHz) and ' 3C-NMR (CDCia. 100 MHz) date: see teble 5.2; ESI-HRMS nVz 515.3731 (M+HJ' (cale. !or Ca,H~,~ 515.3731 ).

5.2.4.8 Ceanothenlc acld (S)

While powder. IR (film) v_ cm·': 3067 (CH~C), 2959, 2868. 2730 (CH-C), 1721, 1685 (>C=O); 'H NMR (CDCI,/CD30D 9:1,400 MHz) and 13C NMR {CDCI,ICO,OD 9 '1, 100 MHz) sea tabla 5.2; ESI·HRMS nVz 455.3156 (M•HJ (cale. ror c,.H.,o •• 455.3156).

5.2.4.9 Botullnlc acld (6)

Color1ess needles; IR (film) v,.. 3462 (OH), 3078 (CH=C), 2945, 2853 (CH·C), 1690 (>C=O). UC.RMN (CDCb. 100 MHz) 15.1 (C-27). 15.9 (C-23), 16.4 (C-25). 16.6 (C-26), 19.1 (C-6), 19.5 (C-30), 21.7 (C-11), 26.4 (C·12), 27.6 (C-2), 28.4 (C-24), 30,4 (C-21), 31.4 {C-15), 33.1 (C-16), 35,2 (C-7), 37.9 {C-22). 38.0 (C-10), 39.2 (C-13), 39:6 (C-1), 39.7 (C-4), 41 .5 (C· 8), 43.2 (C-14), 48.0 (C-19), 50.1 (C-18), 51.5 (C-9), 56,4 (C-5). 57.1 (C-17), 79.3 (C-3), 110.0 (C-29), 151.5 (C-20), 179.9 (C-28) ppm; ESI·HRMS miz 440.3690 (M' -H.O +2) (cald for C:,oH-4102: 440.3654).

89

5.2.4.10 Olscarlne B (7)

Wh.ite amorphous solld; v_ cm'1: 3267, 3027 (CH=C), 2960, 2934, 2873 (CH-C), 1634 (>C=O); 1H-NMR (CDsOD, 30 'C, 400 MHz) and 1~C­NMR (00300, 30 'C. 100 MHz) dala: see tab!e 5.4; ESI-HRMS m'z 574.3393 (M+H]. (cale. for CuH..,N.O •• 574.3393).

5.2.4.11 Chrysophaneln (8)

Yellow powder; IR (r~m) v_ cm'1: 3344 (OH), 2914, 2842 (CH-C), 1634 (>C=O); 1H-NMR (OMSO-d1, 400 MHz) and "C-NMR (OMS0-<1., 100 MHz) data· see ~e 5.3; ESI-HRMS mtz 255.2302 (M-C,H100~+H]' (cale. for C,sH,.o., 255.2324).

5.2.4.12 Chrysophaneln peracetate (9)

A mixture ~ 8 (10 mg), acetlc anhydrlde (1 mL) and pyrldine (0.5 ml) was allowed lo stlr al room temperatura lor 72 h. The reec!íon mixture was poured over disll!fed water (2Q mL) and lhe resulling suspenslon was extracted tw1ce wllh ethylacetate (2:1 vtv). The organlc layer was washed successlvely with equaJ volumes or HCI (5%), NaOH (3%), HP. and NaCI satd., and lhen dried aver anhydrous MgzSO, Flltratlon and evaporatlon or lhe solvent ylelded 13.9 mg (92.4%) of crude acetylated produc1 obtained as a yellow powder; IR (film) v,... em''; 3021 (CH=C~. 2919, 2847 {CH·C), 1757, 1680 (>C=O); 1H-NMR (COCI,, 400 MHz) and' C·NMR (COC~ 100 MHz): see table 5.3; ESI-HRMS m'z 849.1499 [M+Na)' (cale. for C,Ha,Na010,

849.1635).

5.2.4.13 Bioassays

5.2.4.13. 1 Lelshmanlcidal assay

The growth lnhibltlon of promastigotes was carñed out following the prooedure previously reportad by Mulloz eJ al., 1994 and lnchaustl el al .. 1997. Brlefty, a strain of L amazonensís (IFLAIBRI751PH8) was grown In Schneider culture medium with 10% fetal bovine serum (FBS), penlcillin (100 IU·mL'') and streptomycln (100 mg·ml'1) at25 •e; parasites in the log phase ot thelr growth cycle were then transfeired lo a microplate (96 wells; 1x1 O! parasítes/well), Stock soluUons of OMSO (blank), pentamidlne (posltlve control), crude extract, semlpurified fractlons and pure metabolltes were dRuted In Schnelder medium al s; 100 JJ9 ml'1, added to the plate, and incubated for 72 h. The percentages of lnhlbítlon were obtained by dlrected

90

observaban of each well with an lnverted phase microscope. All Ule assays were carried out in lrlplica!e.

5.2.4.13,2 Trypanocidal assay

Eplmast!gotes of Trypanosoma cruz/ straln Tulahuen parasites were malntalnad in llver lnfuslon ltyptose (LIT) madlum supplemented Ylllh 5% FBS, following the procedure modlfiad by Chataing el el, (1998). Brieffy, paraslles In the ~ phase ol growth cycle \\'efe transferred to a mlcroplate (96 we!Is; 1x10 paresltes/well) together with stock solulions of benznidazole, OMSO (poslbve control and blank respectlvely). extract. semipurified fractions 01 pure metabolltes preparad at different concentrallons ( ~oo IJQ·ml''). The mloroplates were lncuba!ed at 26 •e for nh.

5.2.4.13.3 An11plasmodlal assay

Plasmocfium falciparum strain F32 was grown at 3'7 •e In RPMI medium with 10% of human serum and 4% of hem3tocrlte (O, Rh+). under anaeroblc condilions, accorcling lo lhe reportad mE)thod (Tragar & Jensen, 1976). Cultures with 1% paraslternic and 2% hematocrite (100 lll) were transferred to a 96 well plata. Stock solutlons of chloroqulne (posibve control), DMSO (blank), extract, semipurilied frac:tíons or pura metabolites were diluted in RPMI medium to a concentralion of <10 1Jg·ml'1 and added to each well. The plate was then incubated at 37 •e for 48 h.

5.2.4.13.4 Cytotoxlclty assay

Human laryng~al carcinoma (HEP-2), human cetVical adenocarcinoma (Hela), human nasopharyngeaJ carcinoma (KB) and green monkey Vero kidney oells (VERO) were grown in DMEM (Git¡co) media supplemented wt1h 10% \V/\1) FBS (G1bco), with penidllin (100 U·ml-1) straptomydn (100 mg-ml- ). All the cellllnes were maíntalned at 37"C In a 5% C<>t atmosphere Yllth 95% humldlty. The eytotollicity assay was performed acc:ordlng to the method reportad by Rahman et al., (2001 ). Brielly, celllines were transferred toa mlcroplate (1 .5 " 10' viable cells of each ce11 llne) and tncubated at 37 •e, Yllth 95% humldíty and 5% C01 In DMEM meáRJm supplement With 10% of FBS, penlclllln (10 000 Ul), streptomycln (10 mg·ml:1) and amphotericine 8 (5 mg·ml'1). Alter 24 h. !he medtum was replaced by fresh medlum With 0.05% DMSO (blank) or different concentraUons of dooetaxel (positiva control, Sigma), extract, semipunfiBd fractions or pure metabolites dlssolved ln DMSO ( 100, 50, 25,

9~

12.5, 6.25 JJg·mL''), and the ceUs were incubated for 72 b under the conditlons alteady descrlbed. The medium was removed and 200 JJL of a 0.5% MTT (Sigma) solutlon In PBS (pH 7.2) W«e<Jdded to each well and left lo stand for 4 h at 37• c. Then 100 JJL of addifled lsopropanol (0.4 N HCI) Wflfe added to each well and the optical denslty (00) was measured al 540 nm uslng e Blo-assay reader (Bio-Rad). The experiment was carrled out In tripllcate and each concentration was tested in dúpllcate.

5.2.4.13.5. Antlprollferative assay

The sulforhodamlne B (SRB) assay was carried out accordlng to the method reportad by Rahman et a/, (2001), uslng OMEM medh.Jm with 10% FBS to Induce cell prollferetlon. Alter 48 h of lncubatron, the medlum was discarded and 100 ¡.tL of lce-<:old 40% triehloroacetic acid (TCA, Aldrlch Chemical) were added to f1x the cells, lncubatlng tor 1 h at 4 "C. The cens were washed flve times with water end left to dry; 50 !JL of SRB staln (1 O mg 1% acellc acid, Sigma) were added lo each we11 and teft to stand for 30 m in. Flnafly the cells were washed with 50 mL 1% acetfc acid, and rlnsed four timeswilh water, The OD ~ measured al 540 nm us!ng an ELISA reader (Bio-Rad modeJ 450). The expeñment was carrled out in triplicate.

5.2.4.13.6 Statlstlcal an<~lysis

Data were anatyzed with a oommercial software (GraphPad 4.0, Soflwate lnc., San Diego, CA). The dos&-resP9flse curvos (variable slope) lo obtaln !he lnhibitory concentraUon (In ¡.tg·mL'1) of 50% of parasi\es (1<11). !he growth !nhibílion of 50% of celts (IG~). end the cytotoxlc concentrallón ot 50% of cells (CC!JO), were fitted with lhe algoñthm; Y = D Emin + [(Emax-_Emln) 1 (1 +10(Log ED50 • Log O) HlD slope)].

5.2.5 Acknowledgements

The authors wlsh to lhank to Paul1no Slmá for the ldenliflcallon of lhe plan! material. This work was supported by Program CYTED (Projects X.S and RlBIOFAR) and Projecl FOMIX· Yu..atén (66262).

92

5.2.6 Support fnformation

OH

Flgure 5.2. Principal H-H COSY coupllnga and HMBC COITBlaliOne 3-Q.a~ ceanotllic aci<l ( 1)

93

Tablo 5.2. 11C and 1H NMR do la ror tho coonolhono compound$ S-O.acelyl oenothlc ncid (1 ), acolyi,-dlmeU,yl c:eanolhalo (3), dim81hyl CE!110111ate (4) and cenolhenlc acid (5) (ppm).

Ct ' 3 • S ... ~ltnull.) o.....-, 6c:c,muu 0., """"'

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2 '1?"1. (.) 17-c..a (e) 1 70..9(.8)

S fl7 o (O') 5-07 o t0., 0.-2_ c-31 &S. "1 ( O) aoee ....... 0) • 07• ta,2(Ci"} 5010(&0)

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!J !f7 e Cd) 17'tM c-•o 66..2:(0 ) ' ...... He (ct) 1.53 rn • ., e (o) o e• m o 10 ti Ctl t~m 11J2U.t t..;)) m 186fU , %7"' 1 &. O (t) 1 fi'Tnl

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~m "1.30 m :thm '19•m T7 57. <•> H..• C.) .56 T 01-' 568 ( -.) 18 50..6 rot 1~21'rl 0.1S.c.-,• 4..0~ (CU 1 8.C I' .. o o (a) , , .. 5-$ 50 0 (O) "1.36m

0.'17. (1 ... , ( '1'\ .. , c. 11l. 0.20

ID V>

Table 5.2.. (cont.) 13C snd 'H NMR elata for the ceanolhane compounds 3-0-acolyt oonolnlc acld (1), aootyk:l1molhy1 ooanothate (3), c;llmothyf cenolhote (4) and conolhenlc acid (5) (ppm).

(10..8 . • . &) t10A4.7) (10$J1 ... tt) C7 e_ .. OJ :ro t $20 ,,, 150,3<--) 1&o.S(s) 1401 (a) ,, :11 , ro

' Olt"' ~ 32.1 tf) 2.23 ,, ~7(1) 1.2"'r m n -•Ol 1.00m 180m 1..$7M

22 38.3 (1) 1 ,._,m uoru 130M 370(1) 1-27 '" 30.~ (1J 1 OOn'l

' 110"' 117m 178m 1.611 m V l'O. (Q) , , .. C4.0o4. C> >02{.Q)

•• C.2A 1 tD •

-· ( Q) 110e 28.4(q} o. 611 •

:t4 20 1 ( q ) o .... C..S- Co-A C. , . S ( qJ 11. C<!a

Ol5a a.~st(U) 1 .,.. a<I5(Q) 0 53 e

25 18. (q) 1.0 •• C.1 C.S.C. 1I. OtqJ 1 02• 14..8 ( Q ) o.aaa , ..., (Q) OliO e e. <>10

28 '17 2 (Q) o.Ns c-7 c.G 10 ... ( Q) on• 18..5(Q) ove 17-2 (q) o u. V IIU(q) 090• c..e. o-11.

c-t•.e.t.s , ... (Q) o 91. 1s.o ttn o 03• 1T8 a c•l

28 180 1 ~) 170,0 (a.) 170 o (a) on•co) 20 ut 1 (Q) 1.Us C.10 10. (Q) ..... Ut-3 t a ) OP• 17. (Q) 1:t2e ,., ,,o -3 ro 4$8 d(l 0.18'-. e-2. ,~ero

tu .. .... , •eo aa HHI ., (1) • S<t •• 109 1 (U 422d (2 2J

4 70 "t2.0) •n•• ... &3•• "'~6G(2t'

e-o •n.seeJ 170 5 \•) .... 2 ·1 O (<U .2,.03• C-.31 21.0 (q) 20..t. ...... • . ... (Q) 108• S1 .. (O) 3.60• MeO 0 1 , ( q ) 3ee • 51. (Q, 3~ ..

' ftfJ 11, R, ...

COOH Ot,CO H (1)011 rt " 3 COOCH t Ot,co Oh

e COOCH, H cw,

7

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6 a1 a, • Ole " ' Qc . k N.

96

X,

o

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~ E g • •o • ••• ......

Table 5.4. 1H and »e NMR spectrosoople data for 7 in CO,OD e\30 •e (400 M Hz).

CIH 6o(mull.) jf. ~.1/H::i) H .. IIC

1 151.7 ($)

3 82D(d) 4.80dd (8.4, 1.7) C.1, CA. C. O. C.17. c. te. c-10

4 C5l!IJI (d) 4 .4d (8.4) C3. C-6, C· 17. C.21

IS 172.4(s)

7 ~5(d) 4.20d4 (Q.1,6.o) c.e. C.27, C•30 8 172.1 (J)

10 127 .o (d) tSm "'" 11 -G10 (d) 8.871>~

12 132.4(s)

tSfW 131.4(d) 8.110 m C.1 ~A(d) 8_go"' C.1

14'1~ -P-2.2 (d) IU18m C12 110.2 (d) 8.117 "' C.12

17 30D(d) 2 .10m C.18,C· 10

18110. 20.8 (q) 110 d (0.0) c.a. C.17, C18110 11SA(q) 1.01d (liJJ) c-3. C.17. C·18JIO

21 173-2 (J)

22 74,<1 (d) 2.04d (8.'1) C.21 , C·23, C·24. C.:2!1. N ....

23 3!10(d) 1.81 m C.21. C·22. C·24. C·<l/l

24 271(0 1.60m C-22, C.23, C·21S, C.:2!1 1DOm C·22. C·23. C·21S. C-:211

2IS 11A(q) om1 (7.'1) C-23, C:-24

28 150 (q) 0 .74d (0.7) C.22. 0 ·23. C-24

N .. o, 42.6 (q) 2-24& C.21.C·22

27 20-8(0 2.00 bt dd (14.0) 2.74 "' dd (14.0)

20 124.7 (d) OJXIo C.7. C.2T. C30, C·35. c.30

30 110.4(s)

31 1103 (d) 7 ,44bld (7,11) C.30. 0·33. C-35, C.3:1

32 1108 (d) 8.00444 (8..0. 7A \.1) c-31, C-34, C-38

33 1224(d) 7.00 4dd (8.2. 7 A 1-2) c-31, C-34. 0·35

34 1123(4) 7.20 di (8.1, G.8) C.32.C·38

3!1 138.1 (J)

30 133.8(s) kiiif•nMII:S ¡:¡tid..,..,.ibii

98

Toble 5.5. Cytoto>dc &ctivhy [CC00 (¡.og·mL·')I In Hel.n. KB, HeP·2 ond YERO cells of pure metobofltes from C. groggllsnd semlsynlhotlc durlvatlvoo.

E.trltkll CYTOTOXJC ACTMTY

compountl Hell KB HeP-2 VERO ---

ce~ SI cc10 SI ce,. SI ~ CG-1 2d8 - 533-l - 89 - liT

CG-2A 208 - 196 - u - NT

CG..29 136.8 - 1404 - 13,1 - NT

1 36.2J:5 1 2.8 45_9:t!l.2 2 1 3390:109 0.2 103.1 : 1.8

2 NA> - 56.0%2..1 2l 68.7%14 1.9 1312:3.2

"' l NT NT ~~ NT "' 4 rrr NT ~~ NT

S &77:102 1.4 35.2:12 ~8 54 ~-3.6 1 8 88.6~1.2

e 15.~4 7 8.3 43.3.:4.2 33 1748%.2.1 0.8 145.0 .t 2.8

7 439~.9 <1.5 Gti 1:r7.2 l 17!1.6:2 1 l.' 199.1 :t 2.7

8 6!1.3~4 2 7.5 85.8:t11.3 e 102.7:4 , 5 521.0:63 1 120.510.1 , 46,0:2.1 26 65.7:34 1-8 1238:4-2

Oocela.Xel 020r001 5.5 0.23.t0.03 H 008:001 13.7 1 l.tO.OS

SI: Sol&c::Uvfty lnc:Mx wete catcut.ol(t., u ltle rntlo OC1111 of VERO oi')OsiCC., or oac;¡h cell lllto

Table 5.6. lnhlbitkln of the gmwth (IG$o (1'9 mi.'')) In Hela, KB, HeP-2 ané! VERO c:e8s of pure compounds isolated from C. greggi1

Elf!ra.CV AtmPaOLIFERATIVE AClMTY

ComllOUnd HeL• K8 HeP-2 VEllO

1 192.:h2.4 ~s~.t.5 7G2:45 1468~.7

2 14Uot1 a 55-L-56 5l.tn56 189.7ü2

5 48..8:3.1 3:U~1 89.8:.49 8~21

6 1077:1.2 45.~4 5 152.4::32 221 ~.6

1 125...1:2.3 56.9%3..4 1400:2.5 -201 4t3.8

8 7U:2g 666t78 9&.4~ 351.0:8.9

9 55 11.:2..5 1922:2..3 4ol7.t56 143~6.2

Docelllxel 003.:0 01 0.05%004 008:002 o 11.!:0 02

1

•• • 1 •

Figuro 5.3. n.c analyses of J.O.acetyt ci!allothtc-acid In lhe c:rude exlr8d of .­trom C. greggl 1) en.de exlr8d of mot from C greggl1, 2) Co-dlromaiOgraphy of crude extrect and J.<Nicetyl ceai\Otlloc acid 3) J.O.acelyl c:eanotbo<: 90<1, A) HPaneiMt!100 8:2; B) EtheriHeJCane 1·1

lOO

5.2.7 Roferences

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5.3. PRINCIPALES CARÁCTERISTICAS EN LOS ESPECTROS OE RESONANCIA MAGNETICA NUCLEAR DEL ÁCIDO 3·D-ACETILCEANÓTICO.

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Flguna 5.4. Espoctro do ' H·RMN del ácido 3-D-aceUiceanóUco

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·- .:. ,,J; .. ~ ... - l t 1· t 1 ,... . .. -::. . -· . -... ·- .~ • - _.. _J._ ...... ... .t.---.... " .... -Flgura 5.6. Ampllacfl)n del expe(lmento HMBC del acetato del 1\cldo 3·0.aooUlooonO\Ico. El ospoctro muestro las prfnclpolos oorrclacionos do H·3 que pormiUO el establoclmlento de un anillo A con cinco miembros. caractertstico do los ceano~anos.

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Agura 5.7. Ampllacl6n del experimento HMBC del écldo 3-0-acetilceanótico. El espoctro muostra las pnnclpales conelaaonos de tos carbonos a campo bajo.

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CAPITULO 6

Penta/lnon andrieuxil como fuente de metabolitos antagonistas en la asociación CXCL 12/CXCR4

6.1 INTRODUCCIÓN

Los receptores a qulmiocinas, pertenecen a la familia de proteínas transmembranales de siete dominios, acopladas 8 proteinas G (GPCRs) (Frednll.sson el al .. 2005). Estos receptoras son regulados por pequeñas protelnas qulmfoatrayentes, Upo cltocina, denominadas qulmloclnas. Actualmente se conooen 40 qulmloclnas (Ribelro el aL , 2007) y 19 receptores 8 qulmiodna en humanos (Proudfoot el el., 2010).

La unión {fe las quimiocinas a sus receptores inicia una casca{fa de eventos Intracelulares que culminan con la expresión de efectos biológicos aomo la activación de lo mlgraclón y la proliferación celular (Murdoc, 2000)

la mii)'Oria de los receptoras de qutmioclna presentan una redundancia en sU actlvación, e .g. el receptor CCRS al que se le pueden unir nueve qulmioclnas agonistas y una antagonista (Cocchf el al., 1995, Arenzana-Selsdedos el al.. 2006); sln embargo. existen otros receptores cuya actlvacl6n es especifica para una quimioclna en particular, e.g. el receptor CXCR4 que Clnlcamente as activado por la quimloclna CXCL 12 (Oberlin el e/., 1996; Latalllade el si., 2004).

La expresíón de CXCR4 es constitullva en la mayoria de los tefrdos y órganos; este receptor, junto con le qulmlocina CXOL 12. desempel'\a un papel esenclal y no redundante en la organogénesls (corazón, sistema vascular, gónadas, cerebro) y en la maduración del sistema Qnfolde durante el desarrollo embrionario (Lataitlade el si., 2004),

El receptor CXCR4 participa en varios procesos patológicos, e.g. es el unico receptor a qulmloclna que so conoce en el que una anomalla en el gen que lo codifica produce la patología humana conocida como el slndrome de WHIM (Balabanian el si., 2005). Asimismo, CXCR4 actúa comó un co-receptor para la entrada de tos virus VIH·1 T-trópicos (X4) a las célul¡¡s CD4' (Berger el el., 1999). El receplDf CXCR4 también juega un papel Importante en la respuesta Inflamatoria (Murdoch, 2000) y en el proceso de metástasis de cáncet (Baii<WUI, 2004; Slagsvold el al., 2006).

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Con base a lo anterior, la Interacción CXCL 1 2/CXCR4 se considera como Ull Importante blanco en la búsqueda de nuevos y más efk:ieo!es tratamientos para estos padecimientos (Uies el al., 2003; Tsutsuml el al., 2006; Tamamura el al., 2006; Abraham 111 al., ~007; H1¡chel-Haas el al., 2008).

Aun cuando los GPCRs son considerados como uno de los principales blancos terapéuticos por la Industria farmaoéutica, hasta ahora solo existe. un producto comercializado en el campo de los fármacos contra qulmlocinas; este p.wucto, conocido como maravlroc, es un bloqueador del CCHeceptor CCRS. Por otra parte, recientemente se aprobó Plerix~fEif (Mozobn, AM03100). un fármaco que actüa sobre el receptor CXCR4. y produce la movllízación de células hematopoyétlcas; finalmente, a la fer...ba hay 32 moléculas de baja masa molecular que actúan contra los receptores de quimiocina en fase cllnlca. De estaS 611lmas moléculasJ tres actíian contra el receptor CXCR4 y diez contra el receptor CCRS (Proudfoot el al., 2010)

Hasta ahora, los métodos para la detección de las lnlerac:ciones de los receptores con sus ligandos han !"llQuerldo del empleo de llgandos marcados con radlolsotópos (e.g. ~H. 1261, 32P); sin embargo, esta técnica presenta varias desventajas, incluyendo ríesgos a la salud, la necesidad de eliminar los residuos radiactivos, y el requerimiento de licencias especiales para el manejo de los radíolsótopos. Por lo anteríor, durante los u1Umos aflos se han desarrollado nuevos sisiemas de detecc16n basados en colorimetría, luminiscencia o fluorescencia (de Jong 111 al., 2005) En el laboratorio del Dr. Jeao-luc Galzi, en el Instituto de la Escuela de B10teonolog!a de Estrasburgo, se desarrollaron receptores y llgandos fluorescentes que permiten medir en tiempo real la unión de un ligando a un receptor empleando la transferencia de energía de ftuorescencla por resonancia (FRET) {Vollmer et al., 1 999), una técnlca empleada en varíes GPCRs Incluyendo los receptores a qulmloclna (Ff.lnchet ut al., 2006; Galzl el al., 2006).

8 principio del FRET, aplicado al receptor a qulmiocina CXCR4. demostró que la quimioclna CXCL12, rnarcada con ellluoróforo Te¡<as red (TR), se une al reeeptor CXCR4 marcado con la protefna verde fluorescente mejorada (EGFP.CXCR4), produciendo las correspondientes cinéticas de asociacl6n en tiempo real y que, adicionalmente, CXCL 1 2· TR es capaz ~e inducir la lntemalizadon, tanto del receptor marcado (EGFP·CXCR4) como del no marcado (CXCR4) (Veleozuela-Femándaz el el., 2001 ),

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Recientemente y con base en lo anteriQ(, la asocíación CXCl12-TR/EGFf'­CXCR4 ha sido utilizada en ta búsqueda de moléculas con potencial apllcacl6n fannacológica que lnlenlccionan con el eje CXCL 12/CXCR4 (Hachet-Haas eta/., 2008).

Dado que, hasta ah0f8, el único estudio de plantas como fuentes de moléculas antagonistas al eje de activación celular CXCL 12/CXCR4 reporta el empleo de radia)lgandos (Chen el al .. 2003), en este capitulo se muestt<>n los retultados de la evaluac!ón del extracto crudo y fracciones ~e purfflcaclón de Pentalinon andriauxíl, empleando el ensayo de la inhibición de la unión de CXCL12-TRIEGF?-CXCR4 y los ensayos de la lntemallzación del receptor EGFP.CXCR4 inducido por CXCL 12, inhibición de la producción del adenosln monofosfato élclico (AMPo) y del efecto sobre la movllz.ación de calcio lnlt8oelulat por activaci6n de los receptores a qulmloclna CXCR4, CCR5 y receptores muscarlnicos M, .

6.2 MATERIALES Y MÉTODOS

6.2.1 Procedimien tos generales

La digitooina, el AMD3100, el carbacol, e! ácido tnfluoroacético (Sigma-Aidrich). la penicilina. la estreptomicina, la l.glutamlna, el me!lio mlnlmo esencial {MEM), el suero fetal bovino complementado (FBS) (111Vllrogen), el pé¡llído T134 (Genecost). asl como la qulmloclna CCL5 (DB Blosciences) y el anticuerpo anU-ratón lg.G (H+L)-PE (Beckman Coulter) obtenido de cabra. fueron adquiridos de diferentes distribuidores comerciales. Las qulmloolnas CXCL12 y CXCL12-Texas Red fueron sintetizadas de acuerdo a lo reportado por Amare el al. (1 009) y Valenzuela­Fernández el al. (2001).

6.2.2 Purtflcac:ión del extracto crudo de P. andrieux/1

La colecta de P. andri&uxil y la obtención del extracto orgánico crudo (PA-1) se realizó de acuerdo a lo reportado en las secciones 4.3.3.1 y 4.3.3.2. Una porción (10 g) del extracto orgánlco crudo (PA-1) se extrajo sucesivamente con hexano (350 ml) y ac:e1ato de etilo (350 ml) durante Iras hof'as en un sonlcador (Cole-Parmer modelo 8853). Después de evaporar los diferentes disolventes se obtuvieron las correspondientes fracciones de baja (PA-3A, 12.2 g, 24.5%), media (PA-36, 5.15 g, 10.3'Yo) y alla polaridad (residuo, PA-3C, 32.6 g, 65.~). La fracclón PA-3C (32 g) fue puríflcada por crornatografia en columna liquida al vaclo, utilizando una

113

columna de 6.5 cm de dlametro y 5 cm de altura y una elución con mezclas de CHCb/MeOHIH20 (14:7:1 y 10:10:1). Se colectaron fracciones de 200 ml y se realiZaron lavados 0011 400 mL de acetona y metano!. L~ fracciones se monitOC'earon por ccd y se comblnaron en 1 3 rra<:clones pnndpa!es (PA-4A-4M). la fracción PA-4K (190 mg) fue purifiCada por HPLC utilizando una columna seniípreparaliva Phenomenex C18 (luna 250 x 10mm x 51J) y una mezcJá isocrálica de agua (80%) y metano! (20%) acidificados con 0.1% de TFA como eluyente. El Rujo del eluyente se mantuvo a 3 ml•mln'' y la detección de los componentes se realizó a 240 y 280 nm. De esta purifiCación se obtuvieron 10 fracciones principales (PA· SA-SJ), de las cuales las fracciones PA-5C (3.2 mg, 1.7%)y PA-5.0 (1.4 mg. 0.7%) mostraron la mayOC' actMdad en el ensayo de movfrzación del calcio IntracelUlar lndu<:ldo por CXCL 12.. la fracci6n P A-50 mostró un solo componente por HPLC.

6.2.3 Ensayos sobre receptores

Estos ensayos se realizaron en los LabotatOC'Ios de B!omaléculas e Innovaciones Terapéuticos de la Facultad de Farmacia y Escuela Superior de Biotecnalogla de Estrasburgo (ESBS), Francia. Las mediciones se reallza:ron en tres ex:penmentos independientes y los análisis fueron realizados utlllzando el software Kalek:lagraph 4.03 (Synergy Software, Reéding, PA) y GraphPad 4.0, (Software lnc .• San Diego, CA),

6.2.3.1 Unión de CXCL 12-TexasRed/EGFP-CXCR4 en tiempo rea.l

El método se basa en el procedimiento reportado por Valenzuela· Fernández el el. (2001). Las- células HEK-293 (células de rii'lón de embriones humanos), translectadas· esla.blemenle con el receptor CXCR4 marcado con la protelna verde fluorescente mejorada (EGPF-CXCR4 ), se cultivaron a 37 •e y 5% CO. en medio MEM, suplementado con 10% de FBS, con una mezcla de peníclllna (100 U·ml'1), estreptomicina (100 ¡~g·mL' 1), L~lutamina (2 mM) e hlgromidna B como agente de selección. Los

cultives con un 80% de crecimiento fueron dlsGfegados con PB5-EOTA (amortiguad()( salino de fosfatos con 5mM de EDTA): las cé'.ulas fueron lavadas con medio de cultivo, centrifugadas y resuspendid'"..s en 8 ml de hepesiBSA (137.5 mM NaCI, 1.25 mM MgCI1- 1.25 mM Cae!,, 6 mM KCI, 5.6 mM glucosa, 10 mM hepes, 0.4 mM NaH~PO~ y 0.1% rnlv al.búmlna serlca bovina) con 1% (vlv) de lnhlbldores de proleasas. (beslatlna 1 bacitra'cina, 4 mg·ml' : fosforamidon, 2 mg·mL·': qulmostalina, 10 mg·ml : leupeptil!a. 1 mg·mL''). la medlcióh de la unión entre el receptor EGF?· CXCR4, expresado POC' las células HEK·293, y la quimiocíha CXCL12·TR

114

3!Tegada 8 la SUspen$fón celular se realizó en un experimento 'time based sean· utilizando un espectr6metro SPEX Fluorolllg-2 (Jobln-Yvon) y 1 mí. de una suspensión celular (1•106 células·mL'1) , que fueron mantenidas 8 21 •e en una celda de cuan;o con un agítador magnético. Para evaluar la Interacción receptor-ligando se excitó la suspensión celular a la longitud de onda de excitación de la EGPF (470 nm) y se midió la reducción de la emiSión (a 51 O mn) en un Uempo total de experimentación de 300 s. Para el monltoreo de actividad en el ensayo de Inhibición de la unión de eXCL 12-TRIEGFP-CXCR4, los extractos o frac:clones fueron evaluados a una conoentración final de 40 1Jg·mL'1 y las curvas dosis-respuesta se realizaron empleando concentraciones entre 0.1 y 100 1J9'mL'1• Como testigo positivo (bloqueo de la unión de la qulmloclna CXCL12-TR) se utilizó T134 (100 nM). Las mediCiones· se reallzaron en tres experimentos independientes y en las gréftees se muestra el error estándar. Los cálculos se realluron a partir de datos normalizados uúllzando la siguiente fórmula:

AF-oroe~~go~ Vatorestable 81 adldoner ta fraccl6n o DMSO - Valoreslable en el rrWimo do~ aladlclonar CXCl12-TR.

6.2.3.2 Ensayos de lntemallzacl6n del receptor EGFP-CXCR4

6.2.3.2.1 Visualizáci6n de la lnternalización del receptor EGFP-CXCR4 por microscopia

Las células HEK-293. transfecladas establemente con EGPF­CXCR4, se cuiUvaron en placas de 24 pozos que contenlan cubreobjetos redondos de 12 mm previamente tratados con colágeno de rata (Roche, 60 fJ9·mL'1) y se mantuvieron a 37'C en medio MEM suplementado como se describió en la sección 6.2.3.1. A las plaí::as con un 60% de crecimiento celular se tes cambió el medio por hepes-BSA y se preincubaron por 1-5 minutos a 37 ·c. Posteriormente los cuiUvos celulares fueron tratados con las muestras PA-1, PA-3A, PA-38, PA·3C, PA-4K, disueltas a una concentración final de 40 IJ9·mL"' en hepes-BSA, además de T134 1 ¡¡M (tasUgo positivo) y hepes·BSA (tasUgo negativo. en o;usencla y presencia de CXCL 12 (100 nM) y se Incubaron a 37' e dur.¡nte 15 minutos. Las placas fueron colocadas en hielo para detener el metabolismo celular y se les adicionó PBS para lavar las células; post~rmente las células fueron fijadas con J)araformaldehldo 4% (Euromedex) por 15 minutos a

115

temperatura ambiente. Los cubreobjetos fueron retiraclos, lavados y fijados en portaobjetos con mowtol (Calbiochem®) y las laminas fueron observadas en un microscopio Zeiss Axiop!an (Zeiss, Alemania), ceo un objetivo 40x con aceite de Inmersión y un juego de futtos que permiten obs81Var la EGFP. Rnalmente les Imágenes fueron capturadas con una cámara Olympus DPSO (Oiympus. Optlcal, Japan).

6.2.3.2.2 Cuantificación de la lnternallzaclón del receptor EGPF-CXCR4 empleando anticuerpos

Estos experimentos se llevaron a cabo de acuerdo a la metodologla reportada por Glcqulaux el 81. (200-2) y Hachet-Haas et al. (2008). Los cultivos con un 80% de creamiento fueron disgregados con PBS-5 mM EDTA, centrifugados, resuspendldos en hepes-BSA (3.2 x 105 células·200 ¡¡L'') y mantenidos a 37 •e por 15 mln. Las fracciones PA-3C y PA-4K se evaluaron a una concentración final de 40 ¡Jg·mL'' con CXCL12 (100 nM) y se adicionaron a la suspensión celular para iniciar la cinética a 37 ·c. Se tomaron allcuotas de 200 ¡¡L de-cada suspensión a O, 15 y 30 mln, que se adicionaron a una placa de 96 pozos de fondo cónico con azida de sodio (Sigma) fria a una concenlraclón final de 0.1% (v/v) para detener el metabolismo celular. Las células en placas se Incubaron por 15 mln con PBS-BSA 1% para evitar el man:aje no especifico de los anticuerpos a las células. 8 marcaje primario se realizó para los recept!Yes que se encuentran únlcamente en la supetfJCie celular. por lo que las célutas fueron Incubadas durante 60 mln con el anticuerpo monocloóal (anti-hCXCR4 1gGv. de ratón, en una proporción 1:100 en PBS.BSA 1 %). Posteriormente las células fueron lavadas y el segundo marcaje se realizó Incubando las placas durante 60·mtn con el anticuerpo secundarlo (antl-lgG de ratón marcado con llcoerltrina; 1:100 en PBS-BSA 1%). Finalmenle, las células fueron fijadas con paraformaldehldo 4% y se mantuvieron en PBS y refrigeración hasta su lectura. La lectura de la fluorescencia de la ficoeritrlna se realizó en un c11ómetro de flujo FACS Callbur (BO Blosclence). Se colectaron datos de 10,000 células con el programa CeiiOuest Pro (BD BiQScience). La ftuoresoeocia media de fiCOOritrina iue calculada para cada muestra, eliminando la fluorescencia producida por el marcaje no espeCifico del anticuerpo secundario en las células. Los resultados fueron expresados C!Yno poroentaje de receptor mantenido en la superficie celular al minuto 30, estableciendo et 100% como la fluorescencia de las células incubadas en ausencia de la qulmloclna agonisfa CXCL 12. Los análisis estadlsllcos para determinar la existencia de diferencias signiflcallvas entre las diferentes fracciones (PA-3C, PA-4G y PA-4K) y el testigo negallvo (células en

116

presencia de CXCL 12 únicamente) se realizó mediante un análisis de varianza de una vla (ANOVA) y la comparación de medias "!!e reaHzó mediante una prueba de comparación múltiple de-DunneH.

6.2.3.3 Mediciones de segundos mensajeros

6.2.3.3.1 Movilización del calcio int racelula.r

La relación del calcio intracelular se realizó de acuerdo a lo reportadci·l)or Hachet-Haas ef al. (2008), usando indo-1 AM (FiuoProbes ®) como marcador de calcio. Las células HEK-293 transféctadas corr EGFP· CXCR4 o CCR5 fueron Incubadas cen fndo-1 AM (5 11M) du.rarrté 45 minutos para permitir la entrada del marcador de calcio al citoplasma. Las respuestas de calcio fueron re¡¡llzadas a 37 •e en una celda de cuarzo con agitación conteniendo una suspeÍlslón de 1 ><106 células·ml:1• Las mediciones se re¡¡rJZaron en un espectrofluorómelro'E!n el modo "time based sean• ajustado a la excitación del lndo-1 (335 nm) y lo~ c¡¡mblos de fluoresoenaa del marcador lndo-1 fueron mooidos a 401 y 475· nm. La relación entre la Intensidad a 401 nm y la inténsidad a 4 75 nm fue calculada y nórmalizada de aeuerdo con la intensidad máxima de fiU<m!Scencla detec~da después la adición <IE!I d eteigente dlgltonlna. Los. resultados son presentados cómo clnét!cas o curvas dosis-reSpuesta, en las que se tomaron los valores de ta amplitud má>tfma de las diferentes tratamientos y se consideró como el 100% de la respuesta a la amplitud máxima· de la respuesta de calci(l cuando fue Inducida por CXCL 12.

6.2.3.3.2 Inhibición de la producción del adenosln monofosfato c íclico (AMPc)

L(IS experimentos -de la producción de AMPc Intracelular en células HEK-293 EGFP-CXCR4 fueron reanzados por el Dr. Bernard Bvcher de acuerdo con lo reportad() por Gicqviau.x el al. (2002). Las placas de 24 pozos, con células con un 1!0% de C(lnfluencia, ftJeron lavadas con PBS y posteriormente Incubadas a 37 •e por 10 mln con buffer de ensayo (150 mM de NaCI, 5mM de KCI, 2.5 mM de CaCI2, 1.2 mM de KH2PO,, 1.2 mM de MgS04, 25 mM ds NaHC~. 10 mM de hepes, 10 mg·mL-1 de SSA, pH 7.4). El buffer de ensayo fue remplazado por buffer con 0.5 mM de 3-lsobutil-metli-Xantrna (IBMX) durante 1 O m in y 1~ células fueron expu"BStas a 1 O 11M de forskollna par.i Incrementar la producción de AMPc, se en¡pleó un rango de concentraciones del ¡¡~nista CXCL12 de 1 ><1 O-a a 1 x1 o·• M y la fracción PA-4K (10 y 40 \Jg·ml- )6 T1341¡JM (tasUgo positivo) durante 20 m in a 37 •c. La reacción fue de1enlda por adición de 0.2 M de HCI trio y las

117

células fueron Usadas por sonicaci6n y centrifugadas durante 15 min; tos sobrenadantes fueron almacenados a 20 •e hasta la determinación de AMPc por un radlolnmunoensayo empleando anti-AMPc y AMPc marcado con·~.

6.3 RESUL TAOOS Y DISCUSIÓN

El extracto crudo de hojas de P. andrkltJKii (PA-1) se evaluó en el ensayo de unlón de la qulmloclna CXCL 12-TR al receptor EGPF..CXCR4, encontrándose una Inhibición de ca. 1 O% de la transferencia t;le energfa de nuorescencia por re$onancla (FRET). El extracto crudo PA-1 fue fraccionado para obtener las correspondientes fracciones de b~a {PA-lA), media (PA-38) y alta (PA-3C) polaridad, que fueron evaluadas a una concentración final de 40 1JQ·ml'1 en el ensayo de unión de CXCL 12-TR al receptor EGFP..CXCR4. 8 péptldo T134 (500 nM) se utilízó como testrgo positivo, debido a que es un antagonista especifiCO del receptor CXCR4 (Aral<alú tJI 81., 1999) e Inhibe casi totalment.e la unión de CXCL12-TR al receptor CXCR4. los resultados obtenidos mostraroo que la fracción PA-3C produce la mayer ínhiooón de la unión CXCL 12-TRIEGFP..CXCR4, con un 54.3% de Inhibición del FRET.

118

PA-1 PA-31< PA-38 ,A-3<:

M UESTRAS

Figura 6.1. Poreentajes de 111tublo6n de la ur>~ón .de CXCL12-TR con el receptor EGFP·CXCR-4 por efedo del exuaao (tUda y las fracciones aemipurificadas de P andneux.íi 6 exuac:to orgánico cnldO (PA· l ) y l&s l!aCdoneS &emipl.ri(!Cadas de baja (PA-3A). media (PA-38) y alla (PA-3C) polanda<l (40 JZ9 ml ') así como el pépbdo T134 (500 nM) usado como tesbgo positivo, fueron adldonados al minuto 1 y al minuto 3 se adicionó CXCL12·TR la determmaoóo de d•f•rendas significativas (P<O 05) entre el extracto y las fracciones semipurificadas se realizó medlame un analisls de varianza do una vía (ANOVA), la comparación de medias se reallz6 median1e Ul18 prueba de Tukey (letras diferentes signlfoea11 cllterenc:as 811 los uatamientos) Las banas en !os gráficos muesiT8n el e<TOf esumdar para tres expenmemos independiente.s.

La punficac16n por cromatografla en columna liquida a l vaclo de la fracción de polaridad alta PA-3C, condujo a la obtención de las fracciones PA-4A-4M que al ser evaluadas en el ensayo de la inhíbiC16n de la unión de CXCL12·TRIEGFP-CXCR4 mostraron que la ftacción PA-4K (40 ¡Jg·ml 1)

presenta la mayof acbvidad con un 83 S% de mhibiCIOn de la unión de la qulmloclna a su receptor (F¡gura 6.2) La evaluaci6n de la lraccl6n PA-4K a d1feren~ concentraciones mostr6 que la lnhlbidón de la unión de CXCL 12-TR a EGFP-CXCR4 causada por esla lraccl6n es dependiente de la concentración, con una IC60 de 3.86:1: 1 05 1Jg·ml '1 (Figura 6.3).

119

POLARIDAD

Figura 6.2. Porcentaíe ele lnhibk:ión de la uniOn de la qulmiocina CXCL 12·TR con el receptor EGFP..CXCR4 por efecto de 13$ fracxiooes PMA--4M Las barras muestran el porcentaJe de dismanución ~ FRET d~ datoa nonnallzados palll 1•1o' células HEl<-293 EGFP..CXCR~ en presenoa de CXCL12-TR (100 nM) y las diferentes lraa:ion88 a 40 IJ9 mL ' La detenrnnaaOn de diferencias signfficalivu (P<0.05) enlte lalraceíón de polaridad alta (PA·3C) y sus f¡aociones de purificación, sa reaJízó mediante un aoAr~Sis de 118rlanza de una via (ANOVA) y la compa!aC16n de medias se n!allzó mediante el método múltple de Ounnett ¡- , P<O.Ol) La$ bemls en los gráficos muestran le error estándar peta tres expeómenlos independientes

120

·1 o 1 2 L.og (PMKI ~·¡

Figura 6.3. Pon:enta¡es de tnhibldón a drfereMes COI1CI!núadones de la fraec:l()n PA-4K en la ooión de la quimlocna CXCU2·TR con el reoeptor EGFP..CXCR4 Los punlos ~ el pon:en~a¡e de disrrnnudón del FRET en presenc:@ de la fracaon PA-4K a diferentes concemraaaoes (enve tOO y O 1 1'9 mL''). tos datos fueron nonnahado$ pat11 t•tO' células HEI<-293 EGl"P..CXCR4 en~ de CXCL 12-TR (100 nM) y los ~ mues !tan el error esténdar para !re$ experimentos independ11111t.es

El efecto inhtbttoriO produCido por la fracción PA-4K, en la untOn CXCL12-TR/EGFP-CXCR4. sugiere que la fracción PA-4K contiene componentes capaces de Impedir de forma competitiva la unión del ligando natural CXCL 12.

La unión de un ligando con un TeCeplor puede modillear Otferentes procesos de la transducc::iOn celular y pro<fuQ( una respuesta bloiOglca los llgandos que presentan esta caracterlsfica son denominados agonistas y los llgandos que se unen al receptor pero no lo activan y que además bloquean la acción de los agonistas. se denominan antagonistas (Pazos el al .• 2004) Para detemlinar si un producto posee un efecto agonista o antagonista, es necesariO realizar estudtos sobre la respuesta celUlar (F~gura 6 4). sjeJldo una de las respuestas producidas por la activación del receptor CXCR4. la endoci10sis del propio receptor

121

Rgura e . .4, Vía de uansducción de ~ inducida po< la unión de CXCL12 al receptor CXCR~. retacíonadas prindpalmen;e a la ~ y la QtlirnlotaJa:s, otros efectos incluyen la supermenáa, prolilefacl6n y ~ celular Los ll\lllbdores de esta via Incluyen pépódo$, moléculas de bajo peso molecular y anticoetpos que Inhiben la unoón del ligando al receptor Tomado de Wong et al (2008)

La endocrtosís de los recep1Dres acoplados a protelnas G (GPCRs) es una eonsecuencla de la respt.r¡¡sta celular y una protección ante la estimutac!6n celular excesiva o prOlongada por acción de sus agonistas La activación de los GPCRs a su vez activa a las cinasas de receptores acoptados ¡¡_ protefnas G (GRKs), una familia de Clllasas que se encargan de la fasfonlaaón de la serma y treonína en los receptores cuando se encuentran aSOCiados a sus agonistaS Esta fosfOfllacJ6n acbva una cascada comple¡a de seflales que permrte a las arresbnas: unltSe a los receptores y actuar como un adaptador entre el receptor y la maqutnana endocilica dependtente de datnna (Shenoy el al. 2003). Lo antenor permite la formación de endosomas, en los que se tnternalizan los receptores CXCR4 y se disociar¡ rapldamente de las arrestlnas, ocurriendo una desfosfonlacíón para poder ser reciclados hacta la membrana ptasmátlce (desensibilizaciOn) o degradarse (regulación negativa) (Perry & Lefkow11z, 2002, Venkatesan el al., 2003).

112

Para los experimentos de vlsualizaclón de la lntemallzación del receptOr EGFP-CXCR4 en células HEK-29_3 realizados con el extracto orgánioo crudo PA·1 y las fracdooes semipurifx:adas PA·3A-3C y PA-4K se uUIIzaro11 dos condiciones; una que permíta establecer una respuesta de tipo agonista y otra que permite observar una respuesta antagonista. En la primera se debe observar la endocltosis del re(eploc' por acclón de las fracclones par se, en tanto que en la segunda el afecto antagonista se evidencia por la permanencia del receptor EGFP-CXCR4 en la superfiCie celular cuando las células se encuentran en presencia del agonista CXCL12 y de los difenmtes tratamientos.

los resultados de estos experimentos mostraron que, en al.!Sencia de quimiocina CXCL12 y tralamiento (Figura 6.5a), el receptor EGFP· CXCR4 se ubica en la membrana plasmática de las células, dado que la fluorescencia de la EGPF es observada en la periferia celular. Por otra parte, la Incubación de las células con CXCl12 (1 00 nM) (F'f9Uf3 6.5b) mostró sitiOs ttuorescentes c;orrespondíentes a los receptores en los endosomas. El tratamiento de los cultivos celulares con el pépUdo antagonista T134 (1 IJM) mostró que éste no modifiCa el patrón de localización de los receptores EGFP-CXCR4 (FigUnl 6.5<:). en tanto que el tratamiento de las células con el pépUdo T134 (1 IJM) y la quJmíoclna CXCl12 (100 nM) (Flgll13 6.5d) mostró claramente el efecto antagonista del péptido, debido a que Impide la ínternallzación producida por CXCL 1 2 y mantiene la fluorescencia en la periferia celular tal y como."S9 observó en las células sin tratamiento (Figura 6.5a}. las evaluaciones del extracto orgánlco crudo PA-1 y las iracciones semlpunf'tcadas PA-3A-3C y PA-4K, en ausencia de la qulmlocina CXCL12 (Figura 6.5e, g, 1, k y m), mostraron que ninguna de tas fracclónes lndlule per se una lntemallzación del receptor CXCR4. Sin embargo, al Incubar las células con el extracto orgánioo crudo y las fracciones sem1punf1Cadas ~n presencia del agoni&ta CXCL 12. se encontró que mientras las fracciones PA-3A y PA-3S no inhiben el efecto agonista de CXCL í2. observándose la presencia del receptor EGFP­CXCR4 en vesiculas.endociUcas (FlQIJra 6.5h y)), el extracto cruóo PA-1 y las fracciones PA-3C y PA-4K illhlben la lntemallzaclón del receptor en las células, observándose la ftuorescencaa de la EGFP en la periferia de la membrana plasmática (Figura 6.5f, 1 y n). Estos resultados sugieren que el extracto de hojas de P. endriewai oonllene metabolitos· que actúan como inhlbldores de la unión de CXCL121CXCR4, pero que no conUene agonistas del receptor CXCR4, y que tos metaboWos responsables de la actividad detectada en el extracto crudo PA-1, son de naturaleza potar.

123

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40~~~ .. • •

Figura 6.5. ObseMICIOn por mlcroGOOpla de nuorescencJa del efticto da! elllrecto crudo de P l)ftdneux/1 (PA- t) y sus fmcdooes de punficaciOn (PJI.-3A·3C PA-41<) en la tntornalízadón del reoeptor EGfP..CXCR~ exptesado en células HEK·293- Les l!l'é.g- muestran el efedo del antagonista Tll-4 y las fracciones, en ousencls (·CXCL12. o, e, e, g, i , k y m) 'y pro!lot1Cilo de 100 nM d~ CXCL 12 (.¡ CXGL 1~1 t¡, d, !1 h, ¡, 1 y n} a los 15 rnlnutos- do lncubacl6n l.a flechO indiCa la lntemalizacíOn del receptor EGFP·CXCR4 en el endo&Orl\<1 de recldomiento.

Dados los resultados obtenidos con las fracciones semipoJñfic:adas PA-3C y PA-4K en la evaluación por microscopia de la lntemalización del receptor EGFP-CXCR4, se realizó la cuantificación de la expresión del receptor en la superfiCie celular mediante un marcaje doble con anticuerpos. la expresión del receptor en la supeñlcle celular se determinó usando la intensidad de la nu()(esoencia de la flcoerllrina del anticuerpo secundarlo, considerando la Intensidad de la ftuoresoencla obtenida en células sin activación del receptor CXCR4 (sln tratamiento) como la máxima expresión del receptor EGFP-CXCR4. En presencia de la qulmloclna CXCL12 (100 nM), las células presentaron un 60% de expresión del receptor en la membrana plasmática después de 30 minutos. Por otra parte. el antagonista AMD3100 (10 ~o~M), que mostró una expresión del receptor en la membrana plasmática de alrededor del 90% en presencia de la qulmlocina CXCL12, fue utillzado como testigo positivo en sustitución del anlagonlsta T134. dado que este ültlmo ~;e une al mismo si\io que el ~ntialerpo monoclonal antl­CXCR4 (Arakakl el al., 1999). Finalmente. la evaluaclón de las fracciones PA·3C, PA-4G y PA-4K, en presencia de la quimioclna CXCL12, mostró que las frac:ciot'les PA-3C y PA-4K presentan un 80 y un 100%. respectivamente, de expresión del receptor EGFP-CXCR4 en la membrana plasmática celular (Agura 6.6). en tanto que la tracclón PA-4G, inactiva en el ensayo de Inhibición de la unión do CXC!.12-TRIEOFP-CXCR4 (Figura 6.2), no modiflcó el porcentaje de expresión del receptor. Esto resultados confirman que las fracciones PA-3C y PA-4K impiden la lnternalización del receptor EGFP-CXCR4 en la presencia de CXCL12.

125

lRATAMENTOS

Figura 6.6. Cuantilicaci6n pórcenb.illl de receptores EGFP-CXCR4 pcesentes en la membrana plasmática en presencia de ll!S lracciooe$ sernipurlfiC&das de P 11ndneuxn (PA.;K;, PA-'IK y PMG). Los porcentajes de recep10CeS en la superfic:íe de las c61u!as fueron tomadOs al rmnuto 30 de lnod!aQOn de la quinioana CXCL 12 (100 nM) en presencoa o ausenaa de los diferentes llatemJentos (PA-3C, PA-4K, PA-4G a ~O ¡¡g·mL '), y el anla¡¡onlsta AMD3100 (10 pM) c:omo testigo pos1tivo. La deteanlnacl6n de cltferencias significativas (P<0.05) entre el efeQ!O de CXCL 12 solo y con los diferentes tratamienlos, se realizó mediante un anéltsís de varianZa de una vla (ANOVA): la comp818ci6n de medias se tniJzl¡ mediante una prueba de c:omparaclOO mün¡ple de Oumet1 Los !!fálicos muestrao las medias con e! ermr eStándar para dos experimemos independientes.

Se ha reportado que ta uníón de la qulmiocina CXCl12 al receptor CXCR4 tnduce cambios conformacronales en el receptor que permiten el acoplamiento de una protelna G inhibltona (Gi) que posteriormente se disocia en una subunidad o unida a GTP y en el comple¡o ~Y- Los productos de esta disociación regu!Qn enzimas efectoras· la subunldad o es de fipo lnhibítono (a¡) y regula de manera negativa a la enz¡ma adenilato ciciasa (AC), encargada de la producoíón deAMPc a partu del ATP, reduciendo asi la formación del AMPc (Coleman et al , 1994, Busillo el al., 2007), y et complejo lly actüa sobre la fosfolipasa C (PLCp), que conduce a la produc:cíón de inosltol uifoslato (IP3) y, por aoci6n de éste. a la movthzación del calcio intracelular que culmma con ta mtgraeión celular {BusllJo et 'al .. 2007; Wong et el., 2008, Ftgura 6.4). Tomando en cuenta la Importante actividad inhlbíforla de la um6n de CXCL 12 al receptor CXCR4 mostrada por la fracción PA-4K, se evaluó la capacidad de esta fracción para inhibir la activaaón de protelnas Gl mldJendo Inicialmente la movílízación del calcio tnlracelular Inducida por CXCL 12 en las células HEK-293 EGFP-CXCR4 Los resultados obtenidos mostraron que la fracdOn PA-4K reduce la

U6

amplitud de la respuesta máxima de calcio cuando las células se encuentran en presencia del agonista CXCL12, y que la lnhlblción de la m011olización de calcio causada por esta fr.tcción es dependiente de la concentración, con una IC,., de 27.8 t 1.05 ¡.¡g·ml'1 (Figura 6.7). Estos resultados sugle(en que la fracción PA-4K causa un decremento en la activación de los receptores CXCR4.

120

100+----;::---- -

0.5 1,0 I.S 2.0

Log [PMK) (Jlg • .mL' ')

_._ CXCL12 (5 nM)

Flgura 6.7. Evalu8ci6n de la fracción PMK "sobre la moviliz8clón de calcio lnttac:eW!sr en células HEK·293 EGPF.CXCR4. Las cátulas fueron preinaJbadas a concentladones entro 3 y 80 IJII·mL'' de la tra<:d6n PMK y la libenlci6n de calcio fue Inducida por el agonista CXCL12 (5 nM). Los resultadoS fueron normalizados con base ol valor de aatoracl6n ool indicador (lndo-1 ) en pre_$E!nola de dlgltonlno, cooslderando el 100% de la moYilizadón de calcio a la respues18 obtanida on presencia de Onlcamente CXCL 12 (5 nM). El gr&!ico muewa el error eslán<!!lf para tres e.perimentos Independientes.

Para evaluar el efecto de la fracción PA-4K sobre la producción del AMPc se utUlzaron células HEK-293 EGFP-CXCR4 estimuladas con forskol•na (FSK), que actúa sobre la AC aumentando los niVelas de AMPc.. Estas células, al ser tratadas con concentraciones crecientes del agonista CXCL12, mostraron una disminución gradual de ia producción de_ AMPo (curva A. Figura 6.8). Por otra parte, las células tratadas con el antagonista T134 (1 tJM) mostraron que exoste una competencia entre el agonista CXCL 12 y el antagon19ta T134, debido a que cuando se encuentran en presencia del antagonista, son necesarias mayores concentraciones del agonista CXCL 12 para observar la Inhibición de la producción del AMPo, que cuando el antagonista astá ausente, ohservéndose el desplazamiento caracterlstico hacia la derecha de la curva dosls-respues1a de la quimiocina CXCL 12 en la produccl6n de AMPo (curva B, Figura 6.8). La evaluación de

127

la fracción PA-4K en este ensayo demos!rO que, a concenlr.ldones crecientes del agontsla CXCL12 la fracciÓil produce un desplazamiento a la derecha en la curva dosiS-respuesta de Ja producción del AMPc, que es mayor conforme aumenta la concentración de la rracclón (curvas e y O, F~gura 6.8) Estos resultados, Sllnilares a los observados para el casó del antagomsta T134, confirman la presenCia de un antagonista competitivo contra el eje de actlvaclón CXCL121CXCR4 en la fracción PA-4K (F~gura 6.8)

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ltt fCltCl 121M Figura 6.8. lnhibl06n dosis dependiente en la-prodUCCIÓn de AMPc i!n células·HEK-293 EGPF-CXCR4. Las evaluáelones se realizaron en ~nda de forskollna (FSK) a c:oncenlnicionesc creoen~ de CXCL1~ El gráfico muestra la CUfVll de 1nhlbio6n dosls-dependiente del AMPc pata el agontsla CXCL 12 (A) , en presencia del ant~a T134 como le~go po$fifvo (8); y en prasencla de la fraeción PMK a 10 ~Jg.ml· (C) y a 40 119 ml 1 (D).

Como ya se ha mencionado, los receptores a quimlocina pertenecen a la famíha de re<:eplores acoplados a prolelnas G (GPCRs) los GPCRs comprenden m~s de IDM receplo(es que se dasifJCall, con base en sus caracterísúCaS estructuralés, en seis tamílias la mayorla de los receptores .se ubican dentro de las familias A (receptores bpo rodopslna/¡l­adrenérgicos) B (receptores tipo glucagonNIP/calcitenma) y C (receptores metabotróp!COs) (Gether el al .. 2000) los receptores a qutmiocma como el receptor CXCR4 se Incluyen en la fam11fa A de los GPCRs Con el objel1VO de probar la especifiCidad de la adíllidad lnhíbltorla de fracción PA-4K en el re<:eptor a qutmiacina CXCR4. se estudió la <!ctlvklad de la fracctón PA-4K sobre el receptor muscarfnico de subttpo Ma y el receptor CCR5 en la

128

movlllzaclón de éalcio intracelular. Estos dos receptores se encuentran acoplados a protelna~G que también pertenecen a la familia A El receptor muse<~rínico .de subtipo M3 se en¡;uentra expre..«ado, de manera endógena, !!O la linea celular HEK-293 (Mundell el al .. 2000), en lanto que el receptor CCRS fue trensfectado éStablémenle en la linea HEK-293. Al evaluar el efecto de la fracción PA-4K sobre el receptor muscarlnlco ~ se obse!Vó que la amplitud de la re_spuesta induciila por el agonista muscerlnic.o cerbacol, es la misma en ausencia (cu!Va roía. Figura 6 .9a) que en presencia (curva azul, F¡gura 6.9a) de la f~cción PA-4K (50 ~Jg·mL'1 ) Lo anterior demostró que fa tracción PA-4K no inhibe la movlllzaclón del calcio intracelular cuando se Induce la respuesta medí!lflte la incrirporación de cerbacol y a 1¡¡ conCéntreción en la que se obse!Va la inhibición campleta de la moviflzación del calcio cuando se produce la Inducción por CXCL 1·2. La evaluación de la fracción PA-4K sobra los receptores a qulmiocina CCR5 mostró qué el agonista CCL5 (15 nM) induce la respueslá de calcio (curva roja, Figura 6.9b) y que la fracción PA-4K (40 ¡.¡g•ml'1) Inhibe la respuesta de calcio Inducida por el agonfs.~ CCLS (curva azul, Ffgura 6.9b) .

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., • .. • .. -- ,_ ... Flgura 6.9. Mov1iiz.ación d11 calcio intracelular por acñv~ción de qulmiocinas en células fiEK-293 EGPF-CXCR4 o HEK-293 CCR5, en presencia de 1a fraécion PA-4K: a}Actlvtdad de la t'mo::ión PA-4K (50 IJ!I•ml·'. aztJI} o DMSO-tes~go (rojo)_ al minuto 1; ruando se induce la movifizaaón de calcio por la aoaón de CXCL 12 (5nM) sobre e) re<:eptor CXCR4 (minuto 2); ruando 51! induce la movlfaaci6n deccalcio por la .acción de car~ (50 "M) ~bru al receptor muscarinico M.. (minuiii 3): y el cal<:io total que se detecta al adicionar digitonina {50 11M) (saturación del ma!Cador lndo-1, minuto 4). b)Actividad de la rracción PA-4K (40 IJ!I·mL-1, awij o DMSO­tesf19o (rojo) al minulo 1; cuando se índooe la moviflzación de calcio por la adléión del agonista CCL5 (15 nM) del (eQ!ptor CCR5 y el calcio total al adl<:ionar dfgltonlna 50 ¡JM (minuto 3),

12-9

Dados los resultados obtenidos con la fracción PA-4K como inhibtdor de la umon de CXCL12/CXCR4. se obtuvieron canbdades adicionales de esta fracción proveniente del extracto orgánico crudo obtenido de una segunda co!ecta de material vegetal La purfficaclón por HPLC en fase reversa de una ~ón con un perfil cromatográfico similar a la fracción PA-4K, dto lugar a la obtención de las fracciones PA-5A-SJ cuya evaluación sobre la movilización de calcío intracelvlar inducida por CXCL 12. permiti6 ldentfficar 11 las fracciones PA-SC, PA-50 y PA-SF como las de mayor actJvídad (94 5, 86 2 y 84.5% de lnhlb!Qón, respectivamente; Figura 6 .10).

Figura 6.10. lnhibloiOn de la moviliZación del caloo lntraoelular en células HEK-293 EGPF..CXCR+. El gfllfico muestra las medias del efecto de las fracciones PA-<~K, PA-5A-5J (40 ~g mL'') sobre la amplitud de la rupuesta lrlduclda por CXCL 12 (5 nM) con el error estándar para dos· experimentos independientes.

8 anáhsis de los perfiles cromatográficos por HPLC de las tracclonés actrvas PA-5C, PA..SO y PA-5F (Figura 6 11) mostró que la oomposX:ión de la fracción PA..SD es diferente y que conbene un componente mayontano

130

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• " .. .. " • .. .. 1.1 .. Minuto;

Figura 6.1 LPerfile;¡ cromalo!lfáfiCQ1' por HPLC" en fase reversa de las fráceiones PA-.SC, PA-<50 y PA-.SF. Se Inyectaron 20 ~L de-una. solución 500 ~g.ml"1 de cada una dt: tas fraccio<!el'l se ulílizó una columna luna C18 (2) 50><46 mm 5 ~M 110A, con un_.tema de NH.I CH:;COO' 50 mM pHz7,4 (disolvenre A) y MeOH (<ftSolvente B) an gfll(fij!nte (0-0.7 min 100% A, 3 .. 2-3.7 min 100% By 3.9-6.7 min 100% A), con uo Rulo' de 2 "ml ·mio·• y una deteeción a 260 nm a) Peifil croma1Qgfáfico de ·ta lraooón PA-5C; b) Perfil cromatográfico de la fracci6n PA-50 y e) Perfil cromatográiiCO de la froocsón PA-5F.

L-a comparaetón por oo-cromatograffa por HPLC en fase reversa de los perfiles eromatográficos de las fra.ooiones PA-50 '1 PA4K mostró que el componente mayorifano deJa fracczón PA-50 corresponde al componente a /¡, 4.2· en el peffil cromatográfico de la fracción PA-4J< (Figura 6 12) . La fracczón PA..SD presento un bajo rendimzento {0.7%, 1 4 mg), por lo que purfficaciones -a.dzCtonaies son neoesanas para la ídentificaciórl de los componentes presentes en esta fracaón.

131

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• .. .. .. M .. .. .. - .. -=~ J; J j\ J\.

-~· .. .. .. . • • w .. • .. -Minuto•

Figura 6.12. Perfiles cromatograf¡q¡s y co.c(Omatografia por HPLC en fase reversa de las fracciones PA-41< y PA-50 Se inyedaron 20 ~L de la$ fraa:[ones en solución: a) PA-'IK (1 mg.mL''). b) PA-50 (500 ¡¡g.ml 1) y e) Mema de PA-4K (500 119.mt;') y PA..SD (250 ¡Jg.ml''): se unlizó una columna Gemini NX C18 150••.6 mm 511. con un sistema isoel'lillco de 80% H,O aci<lificado con 0.1% TFA (solvente A) y 20% de MeOH (solvente B), con un flujo de2 ml·min·' y una dete<:ción a 280 (naranja) y 330 nm (azul),

La respuesta inhibitoria observada para la fracción PA-4K en la movilizacrón de calcio inducida por CXCL12 y CCLS podría deberse a la presencia de, al menos, dos componentes que .actlian de. manera selectiva sobre cada uno de los ejes de -activación CXCL 1'2JCXC::R4 y CCL5JCCR5, o da cómponentes que actúan de manera no selectlva sobre estos ejes de activación. Aun cuando, hasta ahora, los reportes _de metabolitos de-plantas con actlvldad lnhlbltorfa contra los receptores CXCR4 y CCR5 son escasos. algunos. polifenoles como los taninos frecuentemente obtemdos de plantas. presentan una alta afmldad por protelnas que. puede ser de manera selectiva o no selectiva (Haslam eL si., 1989) , se-conoce que el áctdo tanico. un componente del extracto acuoso de los frutos de Forsyth/a suspensa, posea actividad inhlbltoda selectiva al e¡e CXCL12/CXCR4 (Chen el al .. 2003), asimismo, el alcato1de animab1na, obtentdo de los ta.llos de Amba sp. (Jayasuriya el aL 2004); los productos fenohcos 2,J:.dihtdroxt-4-metoxl-6,6,9-trimetii-6H-dJbenzo(b.dJplrano, 8-metoxF2-meUI-2-(4-metll-3,pentemi)-2H·1-benzopiran-8-{)l y a&tdo. 4-meloxt-3-(3-metil;2·buteml)·benzoico, aislados de W¡gandia urans (Cao et -al., 2003). y el tnterpeno semismtético

132

de llpo lupano 30-oxo-<:alenduladiol (Barrosó-Gonzáles et al., 2009), han sido reportados como lnhlb!dores del receptor CCR5. Flnalmente, se ha reportado otro compuesto fen611co de origen sintético, la chalcona {E)-1-(4'­clorofenJJ)-3-(4-hTdrqxl-3-metoxlfenll)prop-2-en-1-ona, que es un inhibldor seleetlvo del eje de activación CXCL 12/CXCR4 eón un novedoso mecanismo de acción que neutraliza a la quimiocina CXCL12 (Hachet-Haas et al., 2008).

La actividad antagonista presentada por los metabolltos de naturaleza polar de P. andriauxli contra los receptores de qulmiocina CXCR4 y CCRS, refleja s\J potencial corno posibles fármacos, o modelos para los mismos, para el tratamiento de dlf:erentes patologfas, Incluyendo la infeccfón por VIH. Al mismo tiempo, estos resultados demuestran la utlfldad de ensayos específicos· como la uriJI)n de CXCL 12-TR/EGF?-CXCR4 para la búsqueda de metabolitos bioacllvos a partir de extractos crudos de plantas.

133

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CAPÍTUL07

Conclusi ones generales y perspectivas

En un estudio anterior sobre la bioprospeccl6n de plantas medicinales nativas de la peAinsula de Yucatán, se encontró que el extracto crudo de raíces de C . . greggii posee actividad antlmicrol)iana, citoestátlca, antiplasmódica y tripanoclda, mientras que el extracto orgánico crudo de P. andrieuxil posee actividad lelshmanicida. En el presente trabajo, estos extractos orgánicos crudos fueron purificados blodlrigidamente por la actMdad lelshmaníclda, antiplasmódica, tripanocida y por una nueva actMdad detectada contra el eje CXeL121CXC::R4, asl mismo los metabolltos obtenidos de. fonna pura y sus derivados semlsintéticos iueron evalua{!os para detectar actividad crtotóxi<:a y citoestatica.

El fraccionamiento del extracto crudo de hojas d.e P. anclriewt./1 permitió ubiCar a los metaboiHos con actividad leishmanicida, tripanoclda y antiplasmódica en la fracción de baja polaridad, y a los melabolllos que interaccionan con la asociación CXCL t2/CXCR4 en la fracción de alta polaridad. De Igual manera, el ftaecionam!ento del extracto crudo de rálces de C. gregg/1 mostró que los metabolitos responsables de la actMdad anliprotozoaria se encuentran repartidos .en las fracciones de·baja y media polaridad.

La purffioaclón de la fracclón d~¡~ baja polaridad de P. anclrieUidl resultó en el aislamiento e Identificación de ácido belullnJoo y taraxasterol. en tanlo que el áeido ceanoténlco, el ácido ceanótico, la dlscarfna B, la erisofanelña~ el ácido bE¡tulinico y un nuevo producto natural Identificado como ácido 3-0-acetllceanótíco fueron aislados de 1~ fracciones l:iioactivas de baja y media polaridad de C. grBg[Jif. Est.e es el primer reporte sobre la ocurrencia de lo~ mataóolllos antel; mencionados en estas dos especies vegetales.

La evaluación en la activi<lad antiproto.zoaria del ácido betullnico .demostró qUe este lriterpeno contribuye á ta áctividad an!imálarica y tripanQCida de P. andrleux/1 y C. greggii, pero rlQ a la· actividad ielshmanlélda Adicionalmente se eneonlró {¡ue el ácldo-3-0-acetlleeanólico y el ácido ceanolénlco, ambo,s metpboll~s aislados de C. greggíl, poseen una m~erada actividad lelshmanicida y que és1os, )unto éon la .dlscarína 8

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y la crlsofaneina poseen una baja aetlvidad tripanocida. Debido a los bajos o moderados niveles de actividad encontrados para los metabolltos aislados, es posible que la actividad originalmente detectada en el extracto crudo se deba a urr efecto de slnerglsmo entre los metabolitos presentes en las diferentes-fracciones. Adicionalmente, ninguno de los metabolitos aislados de C. gregg/1 presentaroo actividad cltoestatica, por lo que son necesarios estudios encaminados a obtenef estos metabolllos o comprobar un posible efecto slnérglco Efntre estos.

la evaluación da. los derivados aceUiado, oxidado, metílado del ácido .belulínlco asl como de betulina, mostró que mientras las modificaciones en la posición C.3 de la éStruclura del ácido betulinlco aumentan la actividad lelsbmanicida (e.g,.acetalo de ácldo betulinico y ácido betulónico¡, las modiflcadones en las posiciones C~3 o C-28. de todos los derivados probados, disminuyen la actividad trlpanoclda. Asl mismo, los derivados acetllado, dlmelllado y acetlldlmetllado ·del. ácido ceanótico, mostraron que la presencia de los grupos. oxhidrilo en C-3 y carbonita en C-28 del esqueleto de los ceanotanos oo es esencial para la expresión de actividad leishmanlclda y triparygclda. Adicionalmente, otras modificaciones en estas estructuras como las aminaGiones u otras esterificaciones, podrian enriquecer estos estudios.

Las evaluacro~ realizadas con I<Í frliccfón de polaridad alta de P. sndrievxii y sus fraccrones de. purificacl ón, permitió establecer la presencia de metabolitos con actividad antagonista al eje de activación CXCL121CXCR4 y al eie CCL5/CCR5, por lo que estos estudios. muestran la ímportaAcía de esta planta-como fuerte de moléculas con actividad biológica sabre-novedosos. blanllOS teFapéuttcos y posiblemente como inhibidores. de la entrada del VI H. Aslm_ismo, _estos resultados, muestra la 1l(Diqad de los ensayos de unión-de GXCL ~2/CXCRA, ínternanzación de EGFP-CXCR4, asi como los ensa_yos -sobre los segyndos mensajeros AMPc y calcio lrrtracelular para !;! detec.,ión y purificación de moléculas con actividad contra el eje CXCL 12/CXCRII. Sin embargo, es necesario llevar a cabo la pun11caclón final e Identificación de los componentes bloactivos, asi corno más estudios de selectividad err otros receptores a qulmloclnas.

Con todo le anterior, -se aiéanza ·el objetiva gene.ral tfe este trabajo lográndose el aislamiento e identifica.ción de"me1abolltos bioactlvos en la$ dos plantas en estudiO y C!:)O base en lOS résultadOs Obtenidos secdemU!lStra ~ Importancia de estas plantas .en la produCÓióri de metabolitos. con actividad antipiotoioaria y de P. andrieux1J contra el ~e de.-actlvación

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CXCL 12/CXCR4. La continuación de estudios sobre las áctMdades antiproloz!iarias para determinar si se trata de un efE!C!o sln¡§rglco enl!e tos metabolitos aislados, asi como la reallzaclón de otros bioensayos para determinar el probable sitio de acción de los metabolitos aislados y la búsqueda de metabolilos con actividad citoestalíca, son neeesarias.

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