CINÉTICA DE FERMENTACIÓN

Los microorganismos crecen en el espectro n variedad de entornos físicos y químicos, su crecimiento y otras actividades fisiológicas en el tacto de una respuesta he aquí su entorno físico-químico. Cinética de fermentación se describe el crecimiento y formación de producto por microorganismos - no sólo el crecimiento celular activo, sino también a las actividades de descanso y la muerte de las células, ya que muchos productos de la fermentación de arco interés comercial producido tras el crecimiento se ha detenido.

En este capítulo se limita cinética Lo en cultivo discontinuo. Cinética de crecimiento y formación de producto en un cultivo continuo se considera en el capítulo 7.

MICROBIANA

El crecimiento microbiano se caracteriza generalmente por el tiempo necesario para duplicar la masa celular o número de células. Tiempo de duplicación de masa pueden diferir de tiempo de duplicación celular debido a la masa de células puede aumentar sin un aumento en el número de células.

Sin embargo, si en un entorno determinado el intervalo entre la masa celular o duplicaciones de números es constante con el tiempo, el organismo está creciendo a un ritmo exponencial. Bajo tales condiciones, el crecimiento se describe por:

dXdt

=μX

O

dNdt

=un N

Donde:

X = concentración de células en g /L

N = concentración de células en células / L

t = tiempo

μ= tasa de crecimiento específico en hr- 1 (en masa)

un=¿tasa de crecimiento específico (número)

Así, la ecuación 1 describe el aumento en la masa de células con el tiempo y la Ecuación 2 describe el aumento en el número de células con el tiempo. Bajo la mayoría de circunstancias el crecimiento se mide por un aumento en la masa, por lo que se utilizará ft. El valor X μ es la tasa de crecimiento volumétrico (productividad volumétrica) en g / l-hr

Integración de la ecuación 1 nos da:

∫x1

x2dXX

=¿∫t1

t 2

μdt ¿

Si la tasa de crecimiento específico es constante, la ecuación 3 rendimientos

lnX 1X 2

=μ∆ t

Ecuación 4 se puede resolver para el caso en el que A - td, es decir, el tiempo de re ¬ requerido para X2 = 2X, y, a continuación;

ln 2 .693

De la ecuación 4, se observa que la tasa de crecimiento específico se obtiene de la pendiente de una gráfica de ln A versus tiempo.

Crecimiento Bacteriano

Hay cuatro patrones generales de crecimiento microbiano, ejemplificados por bacterias, levaduras, mohos y virus.

Las bacterias se dividen por fisión, como se ilustra en la Figura 6.1. Durante el ciclo de crecimiento de la célula duplica su masa y la cantidad de todos los constituyentes de la célula. Antes de la fisión, la pared celular y la membrana se sintetizan y la célula madre se divide en dos células hijas idénticas, cada una de las cuales crece exactamente como la célula original. Como consecuencia, generalmente no es posible asignar una edad a una bacteria, excepto en el contexto de una sola duplicación. Así, la referencia a un cultivo viejo o joven se refiere al tiempo de permanencia en un matraz o en un agitador y no a la edad de las células individuales.

Una excepción importante el concepto de edad se produce cuando un cambio ambiental excluye la necesidad de una enzima específica en la célula y la enzima ya no se sintetiza junto con el crecimiento. A medida que la célula continúa dividiéndose, la enzima existente puede llegar a ser exponencialmente diluido. Como una consecuencia, es posible especificar edad del cultivo con referencia al nivel de enzima en la célula.

Tiempo de duplicación para algunas bacterias se informó a ser tan rápido como 15-20 minutos en condiciones de crecimiento óptimas. Sin embargo, los 45-60 minutos es más típico.

Figura 6,1 Ilustración esquemática de las formas típicas de crecimiento de bacterias, levaduras y mohos.

Crecimiento de levaduras

Las levaduras pertenecen a los hongos y por lo general se dividen por gemación. Las excepciones a esto incluyen levaduras que crecen por fisión o mediante la formación de hifas. Budding, como se representa en la figura 6,1, implica la formación de un brote en la célula

madre. Este brote crece hasta que se aproxime al tamaño de la madre, en cuyo punto la célula hija separa. A diferencia de la división de las bacterias, es posible distinguir físicamente entre la madre y la hija de células porque la célula madre retiene una cicatriz brote para cada célula hija producido. Así, una población en crecimiento de células de levadura tiene una distribución de células edad en continuo cambio. Bajo ciertas condiciones de crecimiento de las yemas no se separan de la célula madre y cadenas largas, ramificadas de las células (pseudomicelios) formará. Bajo la levadura condiciones óptimas pueden dividir en tan poco como 45 minutos, sin embargo, 90 a 120 minutos es más típico.

Crecimiento de moho

Otro tipo de hongos son los moldes, que característicamente crecen por alargamiento de la cadena y la ramificación como se ilustra en la figura 6,1. Procede el crecimiento de la punta del micelio (crecimiento apical) mediante la formación de septos entre las células. Una vez que una célula se forma retiene su integridad y tiene una edad con respecto al resto de sus vecinos. Dependiendo del entorno físico, el micelio puede ser largo y difuso, corto y muy ramificada, o una mezcla de los de los dos. Cuando se cultiva en una superficie, el micelio puede entrelazarse y formar esteras gruesas. Si bien en cultivo sumergido los micelios pueden existir como micelios difusa o puede formar gránulos con diámetros que van desde 0,1 hasta 10 mm. Las esteras y pellets son extremadamente importantes para el crecimiento de mohos ya que llicy tendrá un efecto en el medio ambiente local fisicoquímica de la estera individual o sedimentar las células. Esto se ilustra en la Figura 6,2 por el perfil de la concentración de nutrientes en un pellet. Puesto que las reacciones metabólicas son dependientes de la concentración de nutrientes, algunas células de pellets a menudo puede haber reducido o modificado de otros estertores de metabolismo.

Es muy difícil para seguir el crecimiento con respecto al número de células en los moldes debido a que las células no se separan fácilmente. Por esta razón, el aumento de masa se utilizan para controlar el crecimiento. La distribución de la edad y la morfología de los moldes son ambos extremadamente importante para la cinética de los procesos de fermentación. En algunos procesos sólo las células viejas producir el producto, mientras que en otros procesos las células jóvenes se requieren. Típicamente, los moldes tienen óptimos limas duplicación en masa de 4-8 horas, aunque algunos son reportados al doble en tan poco como 60-90 minutos.

Actinomyces y Streptomyces son clases de organismos estrechamente relacionados con las bacterias que son extremadamente importantes industrialmente. Ambas clases también crecen como organismos micelos.

6.1.4 Virus Crecimiento

Figura 6.2 Nutrientes y perfiles de producto de concentración en una micelial pellet; si el producto se sintetiza en el centro de la pastilla del perfil se verá como (a), y si las células en el centro están muertos o nutriente hambre, el perfil del producto puede aparecer como (b).

Virus microbianos o fagos, no siguen los patrones normales de crecimiento. Requieren un organismo huésped, que puede ser una bacteria, levadura, moho, o forma superior de la celda. Los virus son estructuralmente simple que consta de material genético (ADN o ARN)

incorporan normalmente en una vaina de proteína. Ellos pueden existir como partículas de virus individuales o se incorpora en el genoma de la célula huésped. Para multiplicar, sin embargo, deben infectar una célula y utilizar las proteínas de la célula y la síntesis de ácido nucleico maquinaria para producir material viral nuevo. Como resultado de ello, un solo virus dentro de una célula puede ser replicado 50 a 300 veces antes de las ráfagas de la célula y libera los virus recién formados. Así, el crecimiento es exponencial / pero el exponente es mucho mayor que dos.

crecimiento microbiano: una descripción química

El crecimiento puede ser considerado como una serie de reacciones químicas que conducen a la síntesis de la masa celular. La fórmula estequiométrica generalizada de crecimiento puede ser escrito como;

XXXXX

donde A, B, D, P y Q son los moles de los compuestos respectivos, C0H6Oc es un generalizada de carbono-fuente de energía, y M es los moles de una unidad de células (Ca HpOy Nj). Por ejemplo una levadura típica puede estar representada por C6H,, N03, por lo tanto la fracción orgánica de la célula tiene un peso molecular de la unidad 145. Si la celda es 90% orgánico y 10% de ceniza, el peso de la fórmula general de una celda unitaria es 145/0.9 = 161.

De esta relación estequiométrica, se puede ver que la relación de la masa celular formada por masa de sustrato consumido (M / / 1), se hace referencia como el rendimiento celular, depende de la eficiencia de la utilización de fuente de carbono para la incorporación en la masa de células y para la combustión a dióxido de carbono y agua para obtener energía para el crecimiento. Además, a partir de este equilibrio es posible concebir una relación entre el rendimiento de las células sobre el sustrato de carbono y la necesidad de oxígeno. Mateles (1971) deriva la siguiente expresión útil para este propósito.

Figura 6.3 Oxígeno requisito versus rendimiento celular de los microorganismos cultivados en diferentes sustratos. Datos de la celda composición son: O, 0,19; C, 0,53; N. 0,12; H, 0,07 para las bacterias y C 0 -47 'N. 0,075; O. 0,31; H, 0,065 para la levadura.

Donde C, H y O son el número de átomos por molécula de sustrato y C, O ', N' y H 'son la fracción de C, O, N y H en la célula, Y es el coeficiente de rendimiento celular (célula g / g de sustrato) para la fuente de carbono, y Mw es el peso molecular de la fuente de carbono.

De esta expresión, es evidente que la demanda de oxígeno es inversamente proporcional a la producción celular, que es una medida de la eficiencia de con-versión de la fuente de carbono a la masa de células. Esta relación se muestra gráficamente en la Figura 6,3 para el crecimiento en varios sustratos.

6.3 Métodos para medir el crecimiento MICROBIANA

Una amplia variedad de métodos están disponibles para medir el crecimiento microbiano, pero ningún procedimiento único es aplicable en todas las situaciones. El método de elección

depende del objetivo de la medición y en la utilidad de las técnicas disponibles. En muchos casos, especialmente las de fermentación comercial, la media para el crecimiento y la formación de productos son tan compleja (Solomons, 1969) que los métodos directos para la estimación del número de células mus no pueden usarse y son un medio para la evaluación indirecta de mas celulares es NECESARIO (Calam, 1972). Sin embargo, no importa qué método se usa, se requiere mucho cuidado en la interpretación de los resultados.

Xxxxxx no se escaneo bien

Recuento viable. El número de células se mide frecuentemente por la concentración de gérmenes viables. Este método emplea placas de Petri con agar que contiene un medio de crecimiento apropiado. El agar se propaga con muestras diluidas de los microorganismos de mantenimiento de cada muestra separada de su vecina. Estos cultivos de superficie se incuban durante 24 o más horas hasta arco formado colonias discretas, cada uno derivado de una unidad formadora de colonias (CFU). Es importante distinguir entre un CFU de una sola célula. Si las células tienden a agregarse, forman cadenas, pseudomyeclia, o myeclia cierto, es difícil, o imposible, separar las unidades, y una UFC en realidad puede ser más de una celda. Esta técnica es muy útil para las bacterias y la levadura y menos útil para los moldes. Es necesario tener cuidado también con muchas levaduras, ya que pueden formar myeclia pseudomyeclia o verdadero cuando se cultivan bajo ciertas condiciones.

Al realizar el recuento de viables, es necesario recordar que la viabilidad se define operacionalmente como la capacidad de crecer en un medio ambiente específico. Por lo tanto, es necesario tener cuidado en la selección de un medio apropiado para el recuento de viables desde un mejor crecimiento de algunos medios de apoyo que otros. Esto es especialmente cierto cuando una población contiene muriendo o mutando células.

Slide Cultura. Una modificación de la placa de recuento viable es la técnica de deslizamiento de cultivo descrito en detalle por Postgate, et al. (1961). este procedimiento emplea un medio de agar gel colocado en un pequeño anillo montado sobre un micro ¬ diapositiva alcance. Células contado desde plaling sobre esta placa de cultivo en miniatura, la totalidad de la preparación colocó en una incubadora. Después de tres a cuatro veces de duplicación, el portaobjetos se examinaron con un microscopio y el número total o microcolonias se divide por el número total de colonias de células que no se dividen más para producir la fracción de células viables. Este procedimiento tiene las mismas limitaciones que el recuento total en placa, pero es más rápido que en sólo unas pocas veces celulares duplicación es necesario contar [vfore (3-4 horas en lugar de 24).

Coulter Counter. Un método sofisticado para la determinación de recuento total de células utiliza un contador Coulter (Gregg y más enfermo, 1965). Un esquema de este dispositivo se muestra en la figura 6,4. Una muestra de cultivo diluido se coloca en el depósito de líquido que contiene un electrolito, y se aplica un vacío al tubo interior para tirar de un volumen predeterminado de líquido a través del orificio pequeño. Un electricista ¬ cal potencial se aplica entre los electrodos, y como las células pasan a través del orificio, la corriente aumenta la resistencia eléctrica y legumbres en causas. Estos impulsos se cuentan entonces. Además, la

magnitud del cambio de resistencia es proporcional al tamaño de las células, por lo que mediante el uso de un analizador de altura de pulso, la distribución de tamaño de célula también puede ser medido. Una variedad de tamaños de orificio están disponibles para el contador Coulter, y el tamaño más pequeño (30 / t) debe ser utilizado para las bacterias que son típicamente 1-3 / t de diámetro. Este orificio se enchufa fácilmente por partículas de polvo o agregados de células. Las células más grandes, tales como levaduras, protozoos o células de tejido se puede contar con más éxito con orificios grandes. No es sorprendente que la técnica es difícil de usar con organismos en cadenas y es inútil con organismos miceliales. \

Nephohmetry. Total de células o el número de partículas se puede determinar por nepholomelry. Esta técnica emplea una fuente de luz en un ángulo recto a una célula fotoeléctrica. A medida que la luz pasa a través de la muestra líquida, la célula fotoeléctrica mide la luz dispersada. Este procedimiento es útil para la célula diluido y suspensiones de partículas.

6.3.2 Medición de la masa celular: Métodos directos

Peso seco de la célula. El método más común para medir la masa celular total es el de obtener el peso seco de células. Las muestras de caldo de cultivo entero se recoge, se centrifuga, se lava con tampón o agua, y luego se secó a 80 ° C durante 24 horas o a 110 º C durante 8 horas. Para las células cultivadas en un medio libre de sólidos, esta técnica es aplicable en general. Sin embargo, si los sólidos no celulares tales como carbonato de calcio, sólidos de melazas, licor de maceración de maíz celulosa, o harina de soja están presentes, no se eliminan en el lavado y en consecuencia contribuir al peso seco final. Cuando el carbonato de calcio es el único material insoluble, es posible usar un lavado ácido para disolver la sal y re ¬ moverlo de las células antes del secado. Incluso cuando los sólidos no celulares están presentes, si las células de peso es mucho mayor que las impurezas "peso, peso seco de células es todavía útil, aunque no es preciso.

La turbidez. La densidad óptica o la turbidez de un caldo de cultivo es proporcional a la masa celular, este método proporciona una forma sencilla, rápida y barata para estimar la masa de células en una base rutinaria. El cambio en la intensidad de la luz /, a través de una distancia L está dada por:

XXXXX

donde e es el coeficiente de absorción molar y C es la concentración. Integración de la ecuación 8 rendimientos

donde e 'es el coeficiente de extinción molar. Por lo tanto, un gráfico de ln (/, / / 0) frente a la concentración C dará lugar a una línea recta con una pendiente-rL L se elige generalmente como CM. (/, / / 0) x 100 se define como T porcentaje de transmitancia y absorbancia es igual a log10 (L / T). Reordenando la ecuación 8 para dar la absorbancia A.

XXX

Por lo tanto, una gráfica de absorbancia en coordenadas lineales frente a concentración da una línea recta.

La turbidez de una suspensión de células se mide generalmente con luz a una longitud de onda entre 600-700 nm utilizando un espectrofotómetro o con luz a través de un filtro rojo cuando se utiliza un colorímetro. Es importante que no se salen del rango lineal del ensayo. La mayoría de arco espectrofotómetros lineal hasta dos o más unidades de absorbancia, una unidad de absorbancia es aproximadamente la mitad de un gramo de peso seco de células. Klett-Summerson colorímetros son lineales hasta aproximadamente 125 unidades klelt y típicamente 250-300 unidades klelt es igual a un gramo de peso seco de células. Es importante cuando se utiliza como una medida de la turbidez de la masa de células para estar seguro de que los productos de fermentación o de los componentes del medio no absorben la luz en la longitud de onda utilizada. Esta técnica no es útil si cantidades sustanciales de sólidos no celulares están en el medio. Cuando la turbidez se utiliza para las estimaciones de organismos filamentosos, a veces es necesario para homogeneizar la muestra en un mezclador Waring antes del análisis.

6.3.3 Estimación de la Masa Celular: Métodos indirectos

Es evidente que la naturaleza del organismo y los componentes del medio afectan en gran medida la facilidad con que se puede medir la masa celular. En muchos casos, tales como el moho u otras fermentaciones micelio en el complejo de los medios de comunicación los métodos descritos son inaplicables y es necesario recurrir a métodos indirectos para evaluar el crecimiento. La interpretación de los métodos indirectos para medir la masa celular se facilita por teniendo en cuenta el total stoichiom-tría para el crecimiento y formación de producto, que puede estar escrita en una forma general:

XXXX

De esta ecuación, es evidente que los métodos para la medición del consumo de nutrientes o la formación de producto puede estar relacionada con el crecimiento microbiano.

Componentes celulares. Un método útil para evaluar la concentración de células es medir un componente macromolecular de células (por ejemplo, proteína, ARN, ADN). Sin embargo, debido a que la proporción de estos materiales en una célula puede cambiar con la cal, es necesario tener cuidado en la interpretación de los resultados. Durante gruñido exponencial con una tasa de crecimiento constante, la composición de células es constante, como se muestra en la figura 6,5. Durante la primera parte y tardía de los cambios del ciclo de crecimiento de la composición celular. El contenido de proteína es bastante constante, mientras que el ARN varía dramáticamente con la tasa de crecimiento. ADN, probablemente el más constante, no se encuentra normalmente en los materiales no celulares añadidos como nutrientes. Análisis de ADN es laboriosa (Burton, 1957), pero, en medios heterogéneos complejos, donde la especificidad es necesaria para la medición de la masa de células, es útil. \

El análisis del contenido de proteína celular se merece una mención. Los métodos más comunes son biuret (Stickland, 1951), Folin (Lowcry ct al., 1951), nitrógeno kjehdahl y análisis total de aminoácidos. Cada método da un valor diferente para la proteína celular ya que cada reacción es diferente. Sin embargo:

Figura 6,5 cinética de crecimiento celular y composición macromolecular durante el curso de la fermentación por lotes (Herbert, 1961).

La reacción de Biuret es muy útil ya que principalmente mide enlaces peptídicos y hay poca o ninguna interferencia de otros componentes que contiene nitrógeno ¬ libras. Además, es un procedimiento sencillo y rápido.

análisis elemental de las células también pueden ser empleados. La técnica más común es el análisis de nitrógeno total mediante el método kjehdahl. Análisis de carbono, hidrógeno, oxígeno, nitrógeno y también es posible con un analizador elemental. El último, sin embargo, requieren un equipo costoso y en todos los casos, es necesario separar las células de otros componentes del medio. Si la composición elemental se determina que puede estar relacionado con el crecimiento a través de la estequiometría presenta en la Ecuación 6.

La captación de nutrientes. Un enfoque alternativo para el análisis celular es medir la eliminación de un nutriente esencial del medio. Es deseable elegir un nutriente no susceptibles de ser utilizados para sintetizar un producto metabólico. Fosfato, sulfato, o magnesio pueden ser candidatos probables. Cuando la masa de células es el producto principal, la fuente de energía de carbono u oxígeno son particularmente útiles para este propósito.

Formación de subproductos. Con frecuencia, los productos del crecimiento de células son útiles para la estimación de crecimiento, además de ser el principal objetivo de la fermentación. Un producto común, dióxido de carbono, resultante de la oxidación de la fuente de energía de carbono, se mide fácilmente con un analizador de gases infrarrojo, y puede estar relacionada estequiométricamente para el crecimiento. Muchos arco fermentaciones anaeróbicas caracteriza por la oxidación incompleta de la fuente de energía de carbono y la acumulación de productos tales como ácido láctico o etanol. Es necesario tener cuidado, sin embargo, en estos productos en relación con el crecimiento en que su formación puede ser tanto el crecimiento y no crecimiento asociado.

Un producto que es bastante general es el ion hidrógeno. Si ión amonio se utiliza para la fuente de hidrógeno, a continuación, por cada mol de amonio consumido,; i de iones hidrógeno se produce. Esta debe ser neutralizada para mantener constante pi I, y como consecuencia la cantidad de álcali añadido es proporcional al crecimiento. Si se utiliza nitrato de nitrógeno, se debe controlar la adición de ácido para la neutralización.

Evolución del calor. Un producto universal del crecimiento microbiano es el calor. Los microorganismos no violan las leyes de la termodinámica y el crecimiento pro-excede, el calor desprendido se. El calor de combustión de los microorganismos es bastante constante con un valor típico de 5 kcal / g y la evolución de calor dependerá de la eficiencia con la que se utiliza la fuente de energía de carbono. Este punto se discute en detalle más adelante en este

capítulo. Baste decir aquí que el calor es estequiométricamente relacionados con el crecimiento y formación de producto.

Varios métodos de medición de calor existen, pero los más adecuados para su uso con fermcnlors dos son un balance de energía en el agua de refrigeración y la técnica de calorimetría dinámica (Cooncy et al .. 1968).

Cuando un balance de energía está escrito para una fermentación, la siguiente ecuación se obtiene:

Xxxxx

donde Q3 es la acumulación neta de calor

¥ Q es el calor de la fermentación

03f es el calor de la agitación

Ocvar es el calor de la evaporación

0 ^. N es la cura sensible en la corriente de aire y Q »Mr, es el sanar disipado al ambiente a través de las paredes del fermentador.

Qfen es generalmente mucho menos de £,. Y pueden despreciarse. Qcv3p pueden ser eliminados mediante el uso de aire saturado con agua a la temperatura de la fermentación, o puede ser calculada a partir de la parte húmeda y seca temperaturas de bulbo de la entrada y salida de gas. GGC + Qiu "puede ser medida antes de la inoculación del cultivo a diferentes valores de velocidad de agitación y flujo de aire. Con la información dada aquí, el calor de la fermentación puede ser medida continuamente.

Calorimetría dinámica emplea el fermentador todo como un calorímetro adiabático. Para medir el calor de la fermentación, el control de temperatura se apaga y la temperatura se dejó subir por 0.5-1.0 ° C. La acumulación de calor se calcula entonces a partir de la pendiente de la curva de temperatura-cal (TA / FA) y la capacidad térmica total del sistema Cp en kca / ° C como se muestra en la Ecuación 14:

Xx

Un enfoque alternativo es medir la velocidad de flujo (w), entrada (;? "), Y la salida (Toul) temperaturas del agua de refrigeración. Esto es difícil de hacer en fermentadores pequeños y es más útil cuando la relación de superficie a volumen del recipiente es pequeño. El balance de energía en el agua de refrigeración puede ser escrito:

Xxx

donde Cp es el calor específico del larguero.

Los valores típicos para cada uno de los términos de calor en un proceso de fermentación se presentan en la Tabla 6,1. Así temprano en el error fermentación sustancial puede ocurrir, pero como la tasa de evolución de calor aumenta el método se vuelve cada vez más útil.

Tabla 6,1 magnitudes relativas de los términos del balance de energía durante una fermentación de Bacillus subtilis en melaza (de Cooney et al. 1968)

Xx

Embalado - Volumen Cell. Un método frecuentemente utilizado para la estimación de la masa de células en las plantas industriales es el volumen del concentrado de células. Esto se determina mediante centrifugacion una muestra de caldo completo bajo condiciones estándar de rotación y de cal en un tubo cónico, graduado. El volumen ocupado por los sólidos es entonces indicativa de la masa de células. Afortunadamente, existe poca variación de la densidad de las células con el tiempo (típicos gravedades específicas son 1.5 a 1.1). Este procedimiento es útil cuando los sólidos extraños están presentes debido a que frecuentemente instalarse más rápidamente que las células y su volumen se puede detectar visualmente y se resta del total.

Viscosidad. Las mediciones de la viscosidad del caldo son útiles en muchas fermentaciones comerciales. Por ejemplo, con el crecimiento del micelio o polisacárido formación hay aumentos sustanciales en la viscosidad del caldo en el curso de la fermentación. Lamentablemente, estos caldos son por lo general no newtoniano en su comportamiento, y las determinaciones reales de viscosidad requieren la medición de la tensión cortante en varias velocidades de corte. Sin embargo, la viscosidad aparente medido como una velocidad de cizallamiento fijo se puede utilizar para estimar celular o la concentración de producto.

Cuando la fuente de energía de carbono es un polímero tal como almidón o celulosa, la viscosidad del caldo de fermentación bacteriana o por levaduras disminuye con el tiempo y es proporcional al crecimiento y la actividad de hidrólisis en el caldo de cultivo.

También se ha demostrado que la viscosidad se puede utilizar para los organismos unicelulares en la ausencia de formación de polímero o utilización. La figura 6.6 muestra el efecto de la concentración de levadura de la viscosidad del caldo completo. Viscosidad / tc está relacionada con la presión AP gota a través de un canal delgado por la relación la gravedad específica, GC es la constante gravitacional, L es la longitud del canal, y Q es el caudal volumétrico de líquido.

ATP Medición. Trifosfato de adenosina (ATP) es un común intermediario de energía química utilizada para el crecimiento y la biosíntesis de vida organismos. Su presencia es exclusivo de las células y su concentración por unidad de masa celular es aproximadamente constante para un organismo dado. Por lo tanto, el análisis de ATP puede ser útil para detectar las células vivas cualitativamente y cuantitativamente medir la cantidad presente de la masa de células. El método utilizado para detectar ATP se basa en la reacción catalizada por la luciferasa, luciferina en la que se oxida a expensas de oxígeno y ATP y un fotón de luz se evolucionado. Mediante la medición de la emisión de luz total, la cantidad total de ATP puede medirse en presencia de luciferina y el exceso de oxígeno. Métodos para la detección de la luz, por ejemplo, los fotómetros o contadores de centelleo, son muy sensibles y pueden detectar hasta 10 ~ 12 g de ATP por litro. El contenido de ATP de una célula bacteriana es de aproximadamente 1 mg de ATP / g de peso celular seco. Así números pequeños de células vivas se detectan fácilmente.

6.4 Cinética del crecimiento microbiano y formación de producto

Crecimiento, que se caracteriza por un aumento en la masa de células y / o número, sólo se produce cuando ciertas condiciones químicas y físicas son satisfechas, tal como temperatura y pH aceptables, así como la disponibilidad de los nutrientes requeridos. La cinética de crecimiento y formación de producto refleja la capacidad de la célula para responder al medio ambiente y aquí reside la lógica de un estudio de la cinética de crecimiento.

Cinética del crecimiento celular

Una curva de crecimiento lote típico para un microorganismo que crece en un medio definido químicamente se ilustra en la figura 6,7. Generalmente, el crecimiento se mide por la valoración de la masa de células, y a menos que se especifique lo contrario este se supone que es el caso. Esta curva de crecimiento se ve que tiene tres fases: una fase de latencia, una fase de crecimiento exponencial, y una fase estacionaria.

La fase de retardo sigue inoculación del medio nutriente y es un periodo de adaptación. Cuando un cultivo microbiano se desplaza de un medio a otro, es necesario reorganizar ambos constituyentes sus micro y macromolecular. Esto puede implicar la síntesis o la represión de las enzimas o componentes estructurales de la célula. Como consecuencia de ello, la fase de retardo puede ser muy corta o larga bastante. Durante esta fase la masa de células puede cambiar sin un cambio en el número de células. También puede haber una fase de retardo aparente o pseudo cuando el inoculo es pequeño o tiene baja viabilidad, ya que el crecimiento sólo puede ser registrada por encima del nivel de sensibilidad del método de análisis. Por ejemplo, si la población celular inicial es de 105 células / ml y la turbidez se utiliza para medir el crecimiento, el crecimiento no será perceptible hasta aproximadamente 107 células / ml están presentes. Este es el punto de turbidez visible. Una vez que las alteraciones necesarias se han completado, las células se mueven en la fase de crecimiento. Esto es por lo general el crecimiento exponencial o registro, aunque algunas excepciones se presentan más adelante.

Figura 6.7 cinética de fermentación por lotes que muestran las tres fases de crecimiento. La curva (a) representa la masa de células en ausencia de lisis, (b) la masa de células cuando se produce la lisis y es seguido por el crecimiento críptico, y (c) de células viables contar cuando se produce la lisis celular.

La fase de registro se caracteriza por una línea recta en una gráfica semilogarítmica de la ln X vs tiempo. Este es un periodo de crecimiento equilibrado viciado o estable durante el cual la tasa de crecimiento específico / t es constante. A lo largo de la fermentación la composición química del caldo está cambiando desde el arco nutricnls se consume y productos metabólicos se han fabricado. Como consecuencia, el medio ambiente no es constante en la pizarra. En un rango de concentración de nutrientes, la tasa de crecimiento es independiente de la concentración. Además, durante la fase de registro, la composición macromolecular de células permanece constante; esto se ve claramente en la Figura 6,5 mostrando composición de células, el tamaño y el crecimiento durante las tres fases de fermentación por lotes. En algún momento, la tasa de crecimiento empieza a disminuir, ya sea a causa del agotamiento de un nutriente esencial, o porque se acumula un producto inhibitorio. Sin embargo, las células pasan por una transición hasta que la tasa de crecimiento neto es cero.

Esta fase estacionaria se produce cuando las células han dejado de dividirse, o cuando las células viables se han alcanzado el equilibrio con las células muertas, es decir, con la tasa de muerte. Tras incubación varias cosas tienden a suceder. A pesar de que el crecimiento neto se ha detenido, puede haber todavía metabolismo y la acumulación de productos en la célula o en el caldo. La masa total de células pueden permanecer constante [fig. 6,7 (a)], pero el número de células viables es probable que caiga [fig. 6,7 (c)]. Alternativamente, a medida que disminuye la viabilidad, la lisis celular puede producirse [fig. 6,7 (b)] y la masa celular se caiga. Esto conduce a la creación de un medio complejo de productos de lisis, y un segundo periodo de crecimiento, llamado crecimiento críptico, puede seguir. Con frecuencia, no esenciales metabolitos secundarios están formados por sistemas de enzimas no presentes anteriormente o funcionamiento en la célula. También, como se muestra en la Figura 6,5, la composición macromolecular de la célula es probable que cambie desde las demandas metabólicas de la célula son diferentes que durante el crecimiento. Esas células capaces de esporulación (por ejemplo, especies de Bacillus o Clostridia) pueden formar esporas en respuesta al entorno restrictivo.

6.4.2 Tasa de crecimiento frente a la concentración de nutrientes

Durante más de una fermentación de lote típico de la tasa de crecimiento específico es con ¬ constante e independiente de la concentración variable de nutrientes. Sin embargo, la tasa de crecimiento, como una velocidad de reacción química, es una función de la concentración química con ¬. Los químicos en este caso son los nutrientes esenciales o sustratos para el crecimiento. La forma de la relación entre la tasa de crecimiento y sub ¬ concentración estrategias se observó por Monod (1949) es similar a la cinética de saturación exhibidos por adsorción monomolecular. Por lo tanto, un modelo (Fig. 6,8) similar a la de Langmuir monomolecular isoterma de adsorción se aplicó al crecimiento. Este modelo, el modelo de Monod, tiene la forma:

XXXX

donde U es la Umax tasa de crecimiento específico es la tasa máxima de crecimiento específico, S es la concentración de sustrato, y Ks es una constante igual a la concentración de sustrato cuando / t = 0.5/tniax.

Los valores típicos de Ks son bastante pequeñas como se ve por los valores de la Tabla 6,2. Esto significa que / i ~ xxx cuando S> \ 0Ka y no es hasta que S <10 / C, que la tasa de crecimiento específico se convierte en una función fuerte de la concentración de sustrato. Debido a que el valor de Ks es baja, la tasa de crecimiento específico durante la fase de registro es constante. La transición de registro a la fase estacionaria es por lo general bastante rápida o brusca, ya que en el momento en el sustrato S residual es bajo, la alta concentración de células rápidamente utiliza el sustrato restante. Por esta razón, es muy difícil de estimar valores de Ks en fermentaciones cultivo discontinuo. Es posible sin embargo, para emplear cinética de velocidad inicial donde los bajos niveles iniciales del sustrato y se emplean cuando la tasa de crecimiento inicial se mide

antes de la concentración de sustrato cambia de manera significativa. Esto se debe hacer con recuentos de placas viables o algún otro método muy sensible. El método habitual para medir los valores de Ks es emplear continuo, la cultura como se discutió en el Capítulo 7.

El modelo de Monod se basa en observaciones empíricas pero frecuentemente se racionalizó por analogía con Michaclis-Menton cinética enzimática (Lchningcr, 1975) con la hipótesis de que una sola rale enzima limitante catalizada paso controla la tasa de crecimiento. Además, algún significado físico y biológico se puede atribuir a las dos constantes Umax) es la tasa máxima de crecimiento específico en un medio químico determinado a la temperatura especificada y PLL, y Kx es inversamente proporcional a la afinidad del microorganismo por su sustrato. Muchos otros modelos han sido propuestos para la tasa de crecimiento se refieren a la concentración de sustrato (véase Powell, 1967), pero el modelo de Monod se utiliza más comúnmente.

6.4.3 Crecimiento Celular y rendimientos de productos

Crecimiento y formación de producto por microorganismos son procesos de bioconversión en el que los nutrientes químicos alimentados a la fermentación se convierten a la masa celular y metabolitos. Cada una de estas conversiones pueden ser quantitized por un coeficiente de rendimiento expresado como la masa de células o de producto formado por unidad de masa de nutrientes consumidos, Yxts y YPIS para las células y de productos, respectivamente. Así, el coeficiente de rendimiento representa la eficiencia de conversión. El significado de los rendimientos celulares y el producto pueden verse a partir del examen de la estequiometría para el crecimiento y formación de producto:

Xxxx

El coeficiente de rendimiento celular en la fuente de energía de carbono se convierte en:

XXX

donde r es la fracción de masa celular representada por ceniza (por ejemplo, r ~ 0.07-0.10). El rendimiento del producto de una manera similar se convierte en:

XXX

Tanto en las Ecuaciones 19 y 20, términos IHE en paréntesis los pesos moleculares de arco. La manera usual de los rendimientos de cálculo es medir la masa de células o producto producido y el sustrato consumido durante un período de tiempo y calcular:

XXX

Los valores anteriores representan observados coeficientes de rendimiento. Es posible calcular los rendimientos teóricos de la masa celular y los productos de los respectivos sustratos esenciales. Aunque mucha discusión todavía se realiza en el sentido de los rendimientos teóricos celulares, todavía proporcionan una guía con la que diseñar experimentos y evaluar los resultados.

Hay dos métodos comúnmente utilizados para el cálculo de los rendimientos teóricos celulares en la fuente de carbono y energía, uno se basa en los electrones disponibles y el otro sobre el concepto de un rendimiento constante en el ATP (trifosfato de adenosina). El número de electrones disponibles se encuentran fácilmente multiplicando por cuatro moles de los 02 requeridos para oxidar completamente un compuesto de carbono orgánico en dióxido de carbono y agua. Por ejemplo

XXXXXX

Por lo tanto, la glucosa tiene 24 electrones disponibles. Mayberry et al. (1967) encontraron que el rendimiento medio de la masa de células por electrón disponible es 3,14 ± 0,11 independientemente de sustrato o un organismo, cuando se usa amoníaco como fuente de nitrógeno.

Bauchop y Elsdon (I960) originalmente propuesto el uso de un rendimiento de ATP> AT (, basado en la observación de que muchos de los microorganismos se derivan del catabolismo de ATP con la misma eficiencia, como consecuencia de un valor de 10,5 g de células / mol de ATP producido ha sido utilizado como una constante para la estimación de los rendimientos celulares teóricas. Variación del valor se ha observado y demostrado ser dependientes de las condiciones para el crecimiento y la demanda de mantenimiento celular (Siouthamer y Bettenhausser, 1973). Sin embargo, cuando algún conocimiento de la ruta catabólica existe , este es un método útil para estimar el rendimiento celular. Variación de valor de rango VATP 6 a 29.

Estimación de los rendimientos del producto requiere algún conocimiento de la estequiometría de la formación de producto. En el caso de los productos directos catabólicos de la glucosa, tales como etanol, la estequiometría es conocido:

Xxxxx

por lo tanto la conversión máxima es de 2 moles de etanol / mol de glucosa o glucosa 0,51 g / g. En la práctica, los rendimientos teóricos no se puede lograr ya que parte del sustrato entra en la masa celular, pero con frecuencia se puede obtener cerca. Los rendimientos de 90 95% de la teórica se puede conseguir fácilmente para la producción de etanol.

La estequiometría es más complejo para productos tales como aminoácidos y antibióticos y la evaluación del rendimiento teórico es más difícil. Sin embargo, se puede resumir la secuencia de reacciones que conducen a la formación de producto. Este enfoque se ilustra por Cooney y Acevedo (1977) para la síntesis de penicilina a partir de glucosa, amoníaco y sulfato. Uso de la vía postulado por Domain (1974) para la conversión:

Xxxx

donde el ácido fenilacético se añade exógenamente, y conociendo las vías de cisteína y valina, el rendimiento teórico de la penicilina a partir de glucosa se calculó en II penicilina g / g de glucosa. Mientras que este rendimiento no tiene en cuenta el uso de la glucosa para la síntesis de la masa de células o de mantenimiento, documentos de proporcionar un punto de referencia para evaluar la eficiencia de la fermentación.

6.4.4 Cinética de la utilización de los nutrientes y la formación de producto

En el principio de este capítulo, el crecimiento fue descrito primero en términos de una simple ecuación de primer orden y luego tasa relacionada con la utilización del sustrato a través de una relación estequiométrica. Formación de producto metabólico puede ser igualmente relacionada con el consumo de nutrientes. Además, la formación de producto no puede ocurrir sin la presencia de células. Así, se espera que el crecimiento y formación de producto están estrechamente acoplado a la utilización de nutrientes y que, dependiendo de los controles de regulación metabólica, la formación de producto se acoplará al crecimiento y / o la concentración de la masa de células. Esto se ve en las siguientes ecuaciones de balance de materiales para el crecimiento, la utilización del sustrato, y la formación de producto:

Crecimiento.

Xxxx

Sustrato utilización.

Xxx

Estas ecuaciones son adecuados tanto para fermentaciones en estado estacionario y no estacionario rancios. Sin embargo, en el último caso, su solución explícita es difícil.

Si no hay alimentación de sustrato o la retirada de producto desde el proceso, entonces la ecuación 24 para la utilización de la fuente de carbono y energía se convierte en:

Xxx

y se hace evidente que la fuente de carbono, que es generalmente el componente de medio más costoso, entra en la síntesis de la masa de células y mantenimiento, así como la síntesis del producto. Reordenando esta ecuación,

donde qs es la tasa específica de la utilización del sustrato, la interrelación de crecimiento, el mantenimiento y la síntesis de producto se ve.

Dos términos que se presenta aquí, las tasas volumétricas y específicas. Las unidades son g / l-hr para las tasas volumétricas y g / g de células en serie hr para la tasa específica. El caudal volumétrico Q es dependiente de la concentración de la masa de células y es de gran interés para el gerente de la planta de fermentación ya que describe la tasa de producto de síntesis o de la demanda de materiales por unidad de capacidad fermentador. La tasa específica q es independiente de la concentración de la masa de células y describe la eficacia de las células en la síntesis del producto o la utilización del material. Tasa específica es especialmente útil para comparar los resultados entre las fermentaciones para evaluar cual es la más efectiva.

La relación entre la cinética de crecimiento y formación de producto depende de la función del producto en el metabolismo celular. Los dos patrones cinéticos más comunes son aquellos que describen la síntesis de productos durante el crecimiento y el crecimiento después de haya cesado. Un tipo menos común, se aplica al caso en que el crecimiento se produce inicialmente

sin la formación de producto pero después de algún periodo el producto comienza a aparecer, mientras que el crecimiento continúa. Estos patrones cinéticos se il'ustrated en la Figura 6.9.

Figura 6,9 patrones cinéticos de crecimiento y formación de producto en fermentaciones en lote: (a) formación de crecimiento asociada a producto. (b) mezclado - crecimiento asociada a la formación de producto, y c) no crecimiento - formación asociada producto.

Productos sintetizados en una forma asociada a crecimiento son generalmente productos directos de una vía catabólica, tales como la fermentación anaeróbica de la glucosa a etanol. O que son producidos como metabolitos intermediarios normales tales como aminoácidos o vitaminas. La tasa de producción de metabolitos primarios relacionados directamente con el crecimiento viene dada por

Xxxx

donde YPLC es el gramo de producto por gramo de células.

La tasa específica de formación de producto se puede definir como

Xxxx

junto con la tasa de crecimiento específico t /, se representa en la figura 6.10 para ilustrar] a sus relaciones para el perfil cinético.

Figure 6.10 Relationship of specific growth rate /i and specific product synthesis rate </,, for (a) growth-associated, (b) mixed-growth -associated. and (c) non growth-associated product fermentations.

En algunas fermentaciones, el crecimiento y la formación de producto son sólo parcialmente;. Vinculado (mixto crecimiento asociado). Un ejemplo de esto es el ácido láctico de fermentación descrito por Lucdeking y Piret (1959). Se encontró que la tasa de formación de producto fue descrito por:

Xx

, Después de dividir por X:

Xx

Así, hay un crecimiento y no crecimiento término-asociado. Este modelo tiene una utilidad general para cualquier crecimiento fermentación mixta. Cuando el producto se asocia con el metabolismo de la energía como un calabolite de la fuente de carbono (PIRT, 1975), también se puede escribir:

Xxx

relación formación de producto y el consumo de fuente de carbono

xxx

De esto se puede ver que A y B de la ecuación 32 se relacionan con YP / S / YXIS y Vp / s / n, respectivamente.

Productos no-crecimiento asociado están históricamente llamados metabolitos secundarios ya que son producidos secundaria para el crecimiento. Mientras que todos los productos no-crecimiento asociados pueden ser llamados metabolitos secundarios, todos los metabolitos secundarios no son necesariamente no-crecimiento asociado. Por lo tanto, es importante definir metabolitos secundarios como productos de fermentación no necesarias para el crecimiento del organismo. Ejemplos de productos que no incluyen el crecimiento asociado a la mayoría de los antibióticos y toxinas microbianas.

La tasa de producción de estos materiales es difícil de relacionar con el crecimiento o porque la disociación de crecimiento y formación de producto. La tasa específica de producción, sin embargo, todavía está dado por la Ecuación 25 y también se representa en la figura 6,10. Esta tasa específica es la forma más útil para expresar y comparar los datos debido a que el efecto de la concentración celular se elimina. Además, si las tasas de utilización de los nutrientes se expresan de la misma manera, es fácil para calcular los rendimientos de conversión. Por ejemplo, el rendimiento de producto de los yps fuente de carbono se calcula

Crecimiento mixto, asociados no crecimiento-productos son algo más difíciles de describir analíticamente, y los módulos de frecuencia empíricos se derivan para este propósito.

6,5 PRODUCTIVIDAD EN LOS PROCESOS DE FERMENTACION DE LOS LOTES

Productividad volumétrica se expresa como gramos de producto por litro por hora y es una medida del rendimiento global de un proceso. en un proceso por lotes es necesario para calcular la productividad durante el tiempo de procesamiento completo, que incluye no sólo el tiempo de fermentación, sino también el tiempo requerido para vaciar el fermentador de la ejecución anterior, lavar el recipiente, y por lotes y esterilizar nuevo medio. Este intervalo de tiempo puede ser tan corto como seis horas en la fabricación de levadura o tanto como 20 horas en la producción de antibióticos. Una composición típica del ciclo de fermentación total se muestra en la Figura 6,11. La productividad general está representada por la pendiente de una línea desde el origen hasta el punto de terminación de la fermentación. La productividad máxima viene dada por una línea similar a través del origen, sino tangente a la curva de crecimiento, lo que ocurre en una célula o concentración de producto menor que la máxima.

Figura 6.11 La productividad en cultivo discontinuo: t,. r ". y son el cambio cultural, retardo y tiempos de retardo, respectivamente:

Xxx

El tiempo total para la fermentación puede ser calculada a partir de la Ecuación 37

donde Ft, t,, y f0 son el cambio de tendencia, retardo, y el retardo (por ejemplo, para la dosificación medio y esterilización) limes muestra en la Figura 6,11, A'0 y A ', - son las concentraciones celulares iniciales y finales. Por lo tanto, la productividad total P viene dada por la Ecuación 38

De esta ecuación, es posible determinar los efectos de los cambios del proceso en la productividad global. Un tamaño del inóculo grande aumentará la A'0 y acortar el proceso. Disminuir el tiempo de respuesta o tiempo de retardo del mismo modo se acorta el ciclo, así como el uso de un cultivo en crecimiento activo de arranque para eliminar la fase de latencia. Si un ciclo de fermentación es corto (por ejemplo, 18-48 hr), tal como por la levadura de panadería o la producción de ácido glutámico, los tiempos de respuesta son importantes para la productividad global. Por otro lado, con fermentaciones largas (por ejemplo, 150-200 hr), como en la producción de antibióticos, una diferencia de unas pocas horas es de poca importancia.

6.6 EVOLUCIÓN DE CALOR DURANTE LA FERMENTACIÓN

La evolución de calor durante los procesos de fermentación está estrechamente relacionada con la utilización de la fuente de carbono y energía. Cuando la fuente de carbono está siendo activamente incorporado en la masa de células a través de crecimiento, típicamente alrededor de 40-50% de la entalpía disponible se conserva en la biomasa, y el resto es emitido en forma de calor. Por otro lado, cuando la fuente de carbono está siendo metabolizada por el mantenimiento de células, todos de la entalpía asociada con la combustión se libera en forma de calor. Si un producto se está formando, a continuación, el calor desprendido por unidad de fuente de carbono es metabolizado entre los dos extremos. Así, la cantidad de calor está relacionado con la estequiometría para el crecimiento y formación de producto, mientras que la tasa de evolución de calor es proporcional a la cinética del proceso. El interés en la evolución de calor se deriva de la necesidad de eliminar durante el proceso de fermentación y de la utilidad de calor como un indicador de la actividad metabólica.

Durante el crecimiento activo cuando el requisito de mantenimiento es bajo, la evolución de calor es directamente proporcional a la síntesis de la masa de células (véase la ecuación 6). Como se señaló en la sección (6.2.2), esto proporciona un método para la medición de la masa de células en presencia de sólidos no celulares sin requerir una muestra fermentador.

Durante un período de poco o ningún crecimiento, tales como la fase estacionaria, cuando el mantenimiento de la actividad metabólica es dominante, la evolución curar se desacopla de crecimiento, pero todavía es una medida de la fuente de carbono y energía que se cataboliza. Esto se muestra en la Figura 6,12, que es un gráfico del calor total desprendido durante la fermentación. La zona inferior representa la entalpía conserva en la masa celular y el área sombreada es la entalpia liberada como calor durante la fase estacionaria. Estos resultados son para una fermentación de Streptomyces novobiocina por nivalis (Mou y Cooney, l976). Desde el área sombreada de la proporción de mantenimiento puede ser calculado en 0,104 kcal / g de células - hr.

Figura 6.12 Evolución de carne durante la fermentación de Streptomyces nirem. El área sombreada representa el calor desprendido por la cultura y el mantenimiento del área libre es la entalpía conserva en la masa de células

Figura 6,13 Correlación de evolución de calor con el consumo de oxígeno para una variedad de fermentaciones microbianas.

El calor de combustión de la glucosa es 3,7 kcal / g, por lo que el término mantenimiento se convierte en 0,028 g de glucosa / g de células-hr, que es típica de los valores obtenidos por otros trabajadores de mantenimiento (PIRT, 1975).

xxxxxx

Calor evolución Qf (kcal / litro-hora) también se ha demostrado por Cooney et al. (1968) para ser relacionado con la tasa de consumo de oxígeno (Q0. (m moles / l h-)) a través de la correlación

Xxxx

Esta expresión es válida en general y se muestra en la Figura 6,13 para una variedad de microorganismos que crecen en diferentes sustratos.

6.7 CRECIMIENTO DE MICROORGANISMOS EN LA PRESENCIA DE FUENTES DE CARBONO Y MÚLTIPLES MEDIOS COMPLEJOS

la curva de crecimiento se muestra en la Figura 6,7 es típico del patrón para el cultivo de microorganismos en un medio definido con un único carbono y fuente de energía. La velocidad a la que una célula crezca es muy dependiente de la naturaleza de esta fuente de carbono tal como se ilustra en la Tabla 6,3 para E. coli. en crecimiento por lotes en presencia de más de una fuente de carbono y energía, por lo general sólo uno de los sustratos de carbono se utiliza a la vez, un ejemplo comúnmente citado es el crecimiento de microorganismos en un medio que contiene glucosa y lactosa. La cinética de crecimiento y la utilización del sustrato se muestran en la Figura 6,14. Este tipo de comportamiento con dos fases de crecimiento se llama crecimiento diauxic. La glucosa, la fuente de carbono más fácilmente utilizada, se utiliza primero y ejerce la represión catabólica en la utilización de lactosa.

Si muchos sustratos de carbono están disponibles en el medio, una serie de fases de crecimiento dará como resultado, cada uno con una tasa de crecimiento disminuye sucesivamente. En un medio complejo en el que no sólo hay múltiples fuentes de carbono, sino también una amplia variedad de compuestos, tales como aminoácidos, nucleótidos, vitaminas y otros intermediarios metabólicos, las células pasan a través de muchas transiciones

Figura 6,14 crecimiento por lotes en presencia de dos fuentes de carbono y energía (. S, y S,) showing.diauxic cinética.

Figura 6.15 Cinética de crecimiento en medios complejos que muestran sucesivamente decrecientes tasas de crecimiento como el medio se agota de nutrientes.

durante el crecimiento. Cuando las células se cultivan en presencia de compuestos intermedios prefabricados, los sistemas de enzimas para la síntesis de estos compuestos no se realizan hasta que los compuestos se utilizan plenamente. Por lo tanto, a medida que avanza el crecimiento en medios complejos, la célula sucesivamente agota el medio de intermediarios útiles y por lo tanto necesita para sintetizar sistemas más y más enzima con el tiempo. Así como los intermedios formados previamente y nutrientes más fácilmente utilizados se agotan, la tasa de crecimiento disminuye. El resultado es la curva de crecimiento se muestra en la Figura 6,15 donde las células no parecen crecer exponencialmente. En realidad, la curva se compone de una serie de curvas exponenciales, tal como se muestra por las líneas discontinuas, cada una con una pendiente decreciente a medida que avanza el tiempo. Esta forma de la curva de crecimiento es bastante común en las fermentaciones industriales que generalmente emplean medios complejos para el crecimiento y formación de producto.

6,8 MICROBIANA CRECIMIENTO Y SU RELACIÓN CON EL MEDIO AMBIENTE

La capacidad de un microorganismo para crecer y sintetizar productos en un ambiente dada está determinada por las características genéticas del organismo. El desarrollo exitoso de los procesos de fermentación es primero dependiente de la obtención de buenas cepas mediante la selección y mutación, y segundo en dilucidar el efecto de los parámetros ambientales en el crecimiento celular y la formación de producto. El objetivo aquí es examinar algunas respuestas comunes de microorganismos y su medio ambiente.

6.8.1 Efecto de la Temperatura

El crecimiento microbiano y la formación de producto son el resultado de una compleja serie de reacciones químicas. Al igual que todas las reacciones químicas, que están influenciados por la temperatura. El crecimiento puede ser descrito por:

Xxxx

donde a es la rale muerte específica. Así, la tasa observada growlh específica (\ / X) TLX / (LT es un equilibrio de crecimiento y muerte. Listo microorganismos se cultivan cuando un ft y-J. Puede despreciarse. Sin embargo, ya que tanto U y una es probable que la temperatura sea dependiente de ambos serán considerados aquí.

Tres curvas típicas de temperatura de crecimiento cansan ilustra en la Figura 6.16. Estas curvas corresponden a crecimiento psicrófilo, mcsophilic, y termófilas. Aunque hay excepciones individuales, la mayoría de los microorganismos sólo crecerá en un rango de temperatura de 20-30 ° C. Además, la mayoría de los microorganismos caer en uno de estos patrones. Aquellos con una temperatura de máxima tasa de crecimiento por debajo de 20 "C son psicrófilo, aquellos alrededor de 30-35 ° C son mesófilas, y aquellos por encima de 50 ° C arco termófilo.

Las curvas son iguales en forma. Cuando la temperatura se incrementa hacia la temperatura óptima de crecimiento, la tasa de crecimiento se duplica en un rango de 10 ° C. Por encima de la temperatura óptima de crecimiento, tasa de crecimiento disminuye rápidamente al aumentar la temperatura. La razón de este patrón característico se ve fácilmente por el

trazado de la tasa máxima de crecimiento específico para cada temperatura en un gráfico de Arrhenius (por ejemplo en Umax vs T-1. Donde T es el absoluto

Figura 6,16 Crecimiento típico versus las relaciones de temperatura para psicrófilos, mesófilos y termofilos.

Figura 6,17 gráfico de Arrhenius de crecimiento versus absolutos de temperatura aerogenes Enterobacter {lor-A -) y Candida utilis (-O-).

temperatura ° K) como se muestra en la Figura 6,17. La porción decreciente de la curva (por encima de la temperatura óptima) es una consecuencia de una tasa de mortalidad creciente. Tanto el crecimiento y la muerte puede ser descrito por la relación de Arrhenius:

xxxx

y

xxxxx

donde A y A 'son constantes, EA y £ "■ son las energías de activación, R es la constante de los gases (R = 1,98 cal/mole- ° K) y T es la temperatura absoluta (° K).

Energías típicas de activación para el crecimiento son 15-20 kcal / mol y para la muerte de 60-70 Kcal / mol. Así, la tasa de mortalidad es mucho más sensible a la temperatura que es la tasa de crecimiento. El significado físico de las energías de activación no es obvio ya que no sabemos en qué cantidad molar se refieren. Sin embargo, la relación de Arrhenius todavía es extremadamente útil como un medio de calcular los efectos de temperatura.

La formación de producto por microorganismos es también dependiente de la temperatura de una manera similar al crecimiento. Sin embargo, la temperatura óptima para el crecimiento y formación de producto no son necesariamente los mismos y deben examinarse por separado. Así pues, un compromiso puede ser necesario.

Figura 6,18 rendimiento celular en metanol para un cultivo mixto de bacterias (tomado de Sncdecor y Cooney, 1974).

La temperatura también puede afectar a otros aspectos importantes del crecimiento microbiano. En la producción de biomasa o de proteína unicelular, es esencial para lograr la conversión máxima del substrato a la masa celular. Así, el coeficiente de rendimiento celular es una preocupación primaria. Este coeficiente de rendimiento de la temperatura, se muestra en la Figura 6,18 para las bacterias que crecen en metanol. Por lo tanto, es la relación temperatura-rendimiento que es probable que se determine la temperatura de operación.

La principal razón para la disminución en el rendimiento celular aumento de la temperatura es el aumento de los requisitos de mantenimiento. El coeficiente de mantenimiento aumenta al aumentar la temperatura con 15-20 kcal / mol energía de activación. Como consecuencia de ello, como la temperatura de crecimiento se incrementa, la utilización de la fuente de carbono y energía de mantenimiento aumenta.

La temperatura también afecta a los procesos controlados por difusión. difusión Molecular se caracteriza por una energía de activación de aproximadamente 6 kcal / mol. De hecho, cuando el crecimiento o formación de productos exhiben una dependencia de la tempera tura ¬ de menos de 10 kcal, no hay razón para sospechar limitaciones difusionales en el proceso.

6.8.2 Efectos del pH

PH del medio, es un parámetro importante que afecta el crecimiento y formación de producto. La mayoría de los organismos funcionarán en un rango de pH de 3-4 unidades de pH.

El pH para la máxima tasa de crecimiento con frecuencia cae sobre un -1 I] intervalo de pH unidad. Debido a que el pH es tan importante, que es controlado en la mayoría de las fermentaciones ya sea por medio de un tampón o un sistema ph control.

Si bien hay excepciones, algunas generalizaciones útiles pueden hacerse sobre la dependencia del crecimiento microbiano en el pH. Las bacterias crecen generalmente en el intervalo de pH 4-8. Las levaduras suelen preferir 3-6, 3-7, moldes y células eucarióticas superiores 6.5-7.5. Como consecuencia, el pH se puede utilizar para seleccionar preferentemente para la levadura sobre las bacterias y, a veces para ayudar en el mantenimiento de un entorno con una susceptibilidad mínima a la contaminación. Por ejemplo, una fermentación de la levadura a pH 3 es poco probable que se contamine con bacterias.

Durante la fermentación el pH tiene una tendencia a cambiar por varias razones. Cuando el amoníaco es la fuente de nitrógeno, el pH tiende a disminuir. Amoniaco en solución (por debajo de pH 9) existe como NH4 +; el microorganismo se incorpora en la célula como R - NH3 +, donde R es un esqueleto de carbono. En el proceso, una + H permanece en el medio. Si el nitrato es la fuente de nitrógeno, a continuación, los iones de hidrógeno se eliminan del medio para reducir la N03 a = R - NH3 + y el pH tiende a subir. Si los compuestos orgánicos de aminoácidos se utilizan para el crecimiento y después el pH se presta a subir como los compuestos son desaminados. Otra razón para los cambios de pH cuando se produce ácidos orgánicos tales como ácido láctico, ácido acético, o ácido pirúvico se producen. Si la razón predominante para los cambios de pH se conoce, a continuación, mediante la medición de la adición de ácido o álcali para neutralizar el cambio, es posible obtener alguna información sobre el crecimiento y formación de producto.

6.8.3 Efecto de la concentración de nutrientes de alta

El efecto de la concentración de nutrientes en el crecimiento celular se discuten en la Sección 6.3.2 y el crecimiento fue demostrado que exhiben cinética de saturación de tipo como la concentración de nutrientes se incrementó. En muchos casos, cuando la concentración de nutrientes se incrementa aún más, una región de la inhibición de sustrato se produce. Esto se ilustra en la Figura 6,19. Hay una variedad de razones para esta inhibición. Para los nutrientes tales como la glucosa de la inhibición no suele ocurrir hasta niveles de azúcar muy altos (por ejemplo, mayor que 100-150 g / 1), pero por el momento la concentración alcanza 350-500 g / 1, el crecimiento de la mayoría de los organismos es imposible . La explicación más probable es una deshidratación de las células en solución concentrada tal. Sólo los organismos osmofílicas

o osmotolerante puede crecer en estas soluciones. Un fenómeno similar ocurre con soluciones de sal alta, tales como los de arriba 40 g / 1 de NaCl, en la que sólo los organismos halófilos puede crecer. Estos dos ejemplos son extremadamente importantes en la preservación de algunos alimentos.

Otras razones para la inhibición de sustrato incluyen efectos tóxicos o inhibidores de los compuestos específicos de enzimas clave o componentes estructurales celulares. Muchos organismos son inhibidas por compuestos tales como fenol, formaldehído, tolueno y metanol en concentraciones por encima de un g / 1. Sin embargo, estos materiales son fácilmente utilizados para el crecimiento por algunos organismos si la concentración es suficientemente baja. en el capítulo siguiente continuo cultura será demostrado ser muy útil para este propósito.

Figura 6,19 Efecto de la inhibición de sustrato sobre la tasa de crecimiento específico.

Límites de referencia para algunos arco frecuentemente utilizado nutrientes: ion amonio, 5 g / 1; sales de fosfato, 10 g / 1; nitrato, 5 g / 1; etanol, 100 g / 1; glucosa, 100 g / 1.

6.8.4 Efecto de insoluble en agua Nutrientes

Cuando los microorganismos se cultivan en insolubles en agua, los nutrientes esenciales para el crecimiento, el crecimiento puede llegar a ser limitada por la velocidad de difusión o la velocidad de disolución de dicho nutriente. Esto ocurre comúnmente, por ejemplo, cuando las células se cultivaron en condiciones aeróbicas en matraces de agitación o inamovible a altas concentraciones de células en un matraz de agitación o fermentador. El oxígeno es un gas escasamente soluble en agua y, como consecuencia, es necesario para transferir continuamente oxígeno de las burbujas de aire o una superficie aire-líquido para el medio de cultivo. La dependencia de la tasa de crecimiento en la concentración de oxígeno disuelto sigue una dependencia saturación Monod-como tal que por debajo de un nivel crítico, el oxígeno disuelto una disminución en los resultados de oxígeno disuelto en una disminución en la tasa de crecimiento específico. Para las bacterias y la levadura, los críticos disueltos rangos de nivel de oxígeno de 3-10% de saturación de aire. El nivel crítico para el aceite de moldes por otro lado puede variar desde 10 hasta 50% de saturación de aire o superior, dependiendo de la forma de crecimiento y el grado de formación de sedimento.

Una vez que se encuentran oxígeno disuelto cae por debajo del valor crítico, la dependencia del crecimiento de la transferencia de masa de oxígeno es descrito por las siguientes ecuaciones. La transferencia de oxígeno rale (OTR) está dado por:

Xxx

donde K es el coeficiente de transferencia de masa, u es el área de transferencia de masa, y ('• y C, son la presión parcial de oxígeno en equilibrio con la fase gas y en el líquido, respectivamente (g 0 :/ l-hr ).

La tasa de consumo de oxígeno, Na, puede ser expresada en términos de la concentración celular y la tasa de crecimiento y el coeficiente de rendimiento de oxígeno

Xxxxx

Igualando las ecuaciones 43 y 44 y la solución para la tasa de crecimiento específica da:

Xxxx

Recordando que xxxx

De esta ecuación se ve que el crecimiento de microorganismos en virtud de la limitación de oxígeno es una función lineal de la fuerza motriz para la transferencia de oxígeno (C * - C,).

Situaciones análogas ocurrir con el crecimiento de las células en sustratos insolubles en agua, tales como celulosa y los hidrocarburos. Wang y Ochoa (1972) examinó el crecimiento de Candida intermedia en hexadecano y se observaron los resultados mostrados en la Figura 6,20. El crecimiento celular fue inicialmente exponencial hasta que el área superficial de las gotitas de hidrocarburos se saturó con células. En este punto, la tasa de crecimiento se hizo lineal y, como se ve a partir de los datos, depende de la velocidad de agitación, ya que este último controla área superficial disponible para la transferencia de masa.

Durante la utilización de la celulosa, el crecimiento puede llegar a ser limitada por la velocidad de hidrólisis de la celulosa en azúcares fermentables. Puesto que la hidrólisis es una reacción en la superficie, una cinética lineal de crecimiento resultará si la demanda de azúcar es mayor que el suministro de azúcar o si el contacto entre la célula y la celulosa es necesario para la hidrólisis.

. El crecimiento lineal también puede ocurrir cuando las células se recubren con un material capsular gruesa o cuando los gránulos de micelio se forman a través de la cual los nutrientes tienen que difundirse (ver fig. 6.2). Muchos organismos se cultivan en medios con contenidos altos en carbohidratos formar cápsulas, especialmente los organismos que pertenecen a los géneros Streptococcus y géneros Mycobacterium. Además, muchas fermentaciones industriales pueden formar pellets durante al menos una parte del proceso.

Figura 6.20 Cinética de crecimiento showsng la transición de crecimiento exponencial a lineal para Candida lipolytica creciente de n - alcanos en un fermentador se agita a diferentes velocidades de agitación.

6.9 FORMULACIÓN DEL MEDIO

El diseño de un medio nutriente para el crecimiento y formación de producto es un paso clave en asegurar un experimento exitoso o ciclo de producción. Los componentes químicos del medio debe cumplir todos los requisitos elementales para la masa celular, y productos y debe suministrar energía apropiada para la síntesis y el mantenimiento. También deben cumplir con los requisitos específicos de nutrientes tales como vitaminas y minerales traza. Esta sección proporciona algunas reglas generales y una justificación para el diseño de un medio de fermentación.

6.9.1 Composición de la célula

Como un primer paso en el diseño del medio, un examen de la composición de células proporciona información importante. Usualmente, el análisis detallado de la composición elemental no está disponible, por lo que los valores utilizados están concebidos como directrices para el diseño de medio. La composición típica elemental para una célula microbiana se muestra en la tabla 6.4. Cualquier medio para el crecimiento microbiano debe contener, como mínimo, estos elementos en las proporciones correctas. Excepto para el carbono, el oxígeno y el hidrógeno, la formulación de medio nutriente se basa en la Tabla 6,4 de datos. Por ejemplo, si se desea sintetizar 30 g / 1 de la masa celular de la levadura utilizando sulfato de amonio como la fuente de azufre y nitrógeno, es necesario suministrar 12 g / l de (NH4) 2S04. Esto proporciona 2,4 g / 1 de nitrógeno y 3,0 g / 1 de azufre. Uno puede ver que haciendo coincidir las necesidades de nitrógeno, el azufre requisito se cumple en exceso.

Cálculos similares permiten a uno diseñar el medio mínimo que se muestra en la Tabla 6,5 para la síntesis de 30 g / 1 de biomasa de levadura. El oligoelemento requisitos son más difíciles de estimar con precisión, ya que se requieren en cantidades variables como cofactores bioquímicos y componentes estructurales. Sin embargo, como regla general, se puede comenzar con la adición de los elementos traza se muestran en la Tabla 10 en 6,5 ~ 4-I0 ~ 5M concentración de 30-3 g / 1 de células respectivamente. Es importante entender que algunos organismos pueden tener requisitos inusualmente alta para uno o más elementos traza y una cierta modificación de la solución de sal de rastreo inicial puede ser requerido.

6.9.2 Requisitos bioquímica específica

Mientras que muchos microorganismos son capaces de crecer muy bien en simples sales minerales medios de comunicación, hay muchos que requieren uno o más compuestos bioquímicos específicos. Esto es debido a que algunos microorganismos son incapaces de sintetizar

Tabla 6.5 Crecimiento medio diseñado para apoyar la producción de 30 g / litro de levadura en fuentes de carbono seleccionados

todos sus componentes bioquímicos propios. Los requisitos más frecuentes son las vitaminas y aminoácidos. Las levaduras, por ejemplo, con frecuencia tienen requisitos para la biotina, tiamina y riboflavina. Algunos organismos son muy exigentes y requieren diez o veinte compuestos bioquímicos preformados. En general, el "requisito de vitaminas es pequeño y se añade típicamente en cantidades de miligramos por litro.

6.9.3 Necesidades de Energía

Aunque los microorganismos son capaces de convertir los productos químicos básicos en moléculas complejas, no viola la segunda ley de la termodinámica en el proceso. La compleja serie de reacciones de síntesis realizadas en la célula requiere el gasto de energía. Esta energía procede, en la mayoría de los casos, a partir de la oxidación controlada de la reducción de compuestos orgánicos. Así, los compuestos de carbono se usan para producir energía para la

biosíntesis, así como para cumplir con el requisito de la celda elemental de carbono. Esto se ha ilustrado mediante la Ecuación 6:

De esta relación, se puede ver que la relación de la masa celular formada por unidad de sustrato consumido (M / A) dependerá de la proporción de sustrato utilizado para la energía (combustión a C02 y H20) y para la incorporación directa en la masa de células.

Desde un punto de vista bioquímico, la mayoría se desprende calor durante la Etapas terminales de oxidación donde conductoras de energía cofactores se usan para reducir el oxígeno a agua. En el proceso, generar trifosfato de adenosina (ATP), un compuesto rico en energía, para su uso en reacciones que requieren energía biosintéticas. Además de la biosíntesis, la célula requiere energía para el mantenimiento de la estructura celular, el transporte activo de moléculas, el establecimiento de gradientes de concentración entre la célula y su entorno, y, en algunos casos, la movilidad celular.

Así, con el fin de satisfacer los requerimientos de la célula para el carbono y energía, se debe suministrar suficiente carbono para la biosíntesis y para la generación de energía. Ambos de estos se incluyen en el coeficiente de rendimiento celular, YXI5. La estimación de los requisitos de fuente de carbono para el crecimiento celular son hechas por densidad dividiendo celda deseada con el rendimiento celular esperado. Por ejemplo, para obtener 30 g / 1 de las células a partir de metanol cuando el rendimiento es de 0,5 g de células / g de metanol, se necesita 60 g de metanol / l como se muestra en la Tabla 6,5.

El nutriente único que queda es el oxígeno. Como el oxígeno es un gas escasamente soluble J su suministro a una fermentación es un problema especial de transferencia de masa. I o razón de esto, se discute en el capítulo 10 "La aireación y agitación". Basta decir en este punto, sin embargo, que la demanda de oxígeno dependerá de la naturaleza de la fuente de carbono y la eficiencia de su utilización.