INSTITUTO POLITCNICO NACIONALEscuela Nacional de Ciencias BiolgicasLaboratorio de Bioqumica Microbiana Balance de fermentacin.Integrantes:Esquivel Arviz LizbethGarca Paredes JazmnMartnez Arce Claudia LizetheMorn Carpio AbigailVilchis Torrez Joel David

Grupo 5IV1Seccin 1

Profesores: Susana Alfaro AguilarEduardo Montoya Daz

Hiptesis y diseo experimental3%

Objetivos1%

Registro de datos3%

Manejo de datos4%

Discusin de resultados5%

Conclusiones3%

Referencias Biliogrficas1%

Hiptesis. Si la fermentacin llevada a cabo por Saccharomyces cerevisiae es una fermentacin alcohlica entonces tendr como productos el Etanol y liberacin de CO2. S las determinaciones por el mtodo de Conway para etanol, gravimtrico de CO2 y glucosa residual se llevan a cabo con la mayor precisin posible, entonces tendr un ndice de O/R cercano a 1.Diseo experimental.Se realiza un micro-ensayo de fermentacin con Saccharomyces cerevisiae, utilizando glucosa como sustrato, en el cual se cuantificar los productos obtenidos: etanol y dixido de carbn, as como la glucosa residual.Mtodo de Conway Se basa en el poder oxidante del dicromato de potasio (K2Cr2O7) en cido sulfrico (H2SO4), el Cr2O7= de color amarillo-naranja produce, por reduccin, al in cromoso de una tonalidad verde-azul que es oxidado cuantitativamente cido actico (CH3COOH) y agua.2 K2Cr2O7 +8 H2SO4 + 3 CH3CH2OH 2 K2SO4 + 2 CH3CHOO + 2 Cr2(SO4)3 + 11 H2OEl in reducido es colorido, se puede leer en el espectro visible a 445nm debido a que sta es la longitud de onda mxima a la que absorbe el dicromato de potasio. Lo que se lee realmente es el dicromato que no reaccion, ya que al aumentar la concentracin de etanol aumenta el cromato. La grfica resulta ser una recta cuya pendiente es negativa.Determinacin de C02 por gravimetra.A partir de la formacin de bicarbonato de sodio por la reaccin del CO2 con el NaOH se pone a reaccionar con BaCl2 se forma el precipitado BaCO3 que se recolecta en papel filtro y por diferencias de pesos entre el papel filtro sin el precipitado y el papel filtro con el precipitado se obtiene la cantidad de precipitado que en base a la conversin por un factor gravimtrico se cuantifica la cantidad de CO2 producido durante la fermentacin.2 NaOH + CO2 Na2CO3 + H2ONa2CO3 + BaCl2 BaCO3 + 2 NaCl CO2 BaCO3Determinacin de la glucosa residualSe realizara por medio del mtodo del DNS. El cual se basa en la reduccin del DNS (color amarillo) por la Glucosa (azcar reductor) al acido 3-amino-5-nitrosalicilico (Fig. 1) de color rojo previo calentamiento por 10 min en bao mara en ebullicin. El cual el 3-amino-5-nitrosalicilico es equivalente a la concentracin de glucosa en el medio, siendo as que se leer la absorbancia a 540nm en el espectrofotmetro.

Ilustracin 1. Reaccin del DNS con la glucosa como azcar reductor.

Reactivos.ReactivoFuncin

N2Crea una atmosfera de anaerobiosis dentro del matraz lo que permitir el desarrollo de la fermentacin.

cido tricloroacticoDetiene el proceso de fermentacin.

Agua destiladaLlevar a volmenes indicados, realizar lavado o aforar.

Agua detilada libre de CO2Realizar los lavados del precipitado formado por el mtodo de gravimetra para la determinacin de CO2.

DNS en tartrato de sodio-potasioLa determinacin de azcares reductores, involucra la oxidacin del grupo funcional aldehdo presente.

Carbonato de potasio saturadoAgente liberador del etanol.

Cloruro de bario al 5% en agua libre de CO2Forma un precipitado (BaCO3) con el CO2, para ser determinado por gravimetra.

Dicromato de potasioAgente atrapante de etanol, este realiza una oxidacin sobre el etanol

GlucosaSustrato a fermentar.

Glucosa 100 mg/mLSe realiza la curva tipo para determinar la glucosa residual.

Etanol 1500mg/mLSe realiza la curva tipo para la derminacin de etanol por el mtodo de Conway.

NaOH 10%Reacciona con CO2 de la fermentacin para la formacin de Na2CO3.

KOH 10%Neutralizante de Ac. Tricloroactico.

Regulador de fosfatosMantiene el pH a 6.8 constante durante la fermentacin.

Suspensin CelularMicroorganismo que realiza la fermentacin. S. cerevisiae.

Objetivos generales. Realizar un micro ensayo para la fermentacin de glucosa por la levadura Saccharomyces cerevisae para la cuantificacin de sus productos. Llevar a cabo un proceso de fermentacin utilizando una levadura de uso industrial y conocer la eficiencia de dicho proceso.Objetivos especficos. Cuantificar los productos de inters liberados durante un proceso de fermentacin (etanol y dixido de carbono) a travs del mtodo de Conway, para el caso del etanol y gravimetra, para el caso de CO2. Realizar un balance de fermentacin utilizando los datos obtenidos experimentalmente. Determinar la prdida de carbono efectuada durante el proceso de fermentacin de Saccharomyces cerevisiae.Registro de datos.1. Curva tipo etanol.Tabla 1. Curva tipo de etanol 1500 mg/mL leda a 445nm.g de etanolAbsorbencia a 445nm

01.075

2500.979

5000.849

10000.691

15000.520

20000.432

25000.220

2. Determinacin de etanol formado en la fermentacin.Tabla2. Absorbancia obtenida a 445nm por el etanol producido en la fermentacin de glucosa por S. cerevisiae.MuestrasAbsorbencia a 445 nm

0.2 mL de muestra fermentada0.419

0.4mL de muestra fermentada0.551

1.0 mL de muestra testigo0.902

3. Curva tipo de glucosaTabla 3. Curva tipo de glucosa 100 mg/mL a 540nm por mtodo colorimtrico DNS.g de glucosaAbsorbencia a 540nm

00

1000.188

2000.405

3000.656

4000.883

5001.098

4. Determinacin de glucosa residual por la fermentacinTabla 4. Absorbancia obtenida a 540nm por la glucosa residual producida de la fermentacin de glucosa por S. cerevisiae.MuestrasAbsorbencia a 540nm

0.2 mL de sobrenadante diluido 1:10

0.4 mL de sobrenadante diluido 1:200.325

1 mL de sobrenadante testigo sin diluir0.221

5. Determinacin de CO2Tabla 5. Determinacin de BaCO3 por el mtodo gravimtrico a travs de diferencia de pesos de papel filtro.MuestrasPeso en gramos (g)

Papel filtro0.8131

Papel filtro + BaCO30.9261

BaCO3 de fermentacin0.1130

Papel filtro Testigo0.8158

Papel filtro + BaCO3 Testigo0.8548

BaCO3 Testigo0.0390

Manejo de datos. 1. Determinacin de etanol producido durante la fermentacin.Ecuacin de la recta y = ax+bEcuacin emprica y= - 3.28x10-3 X + 1.0445r2=0.9899a=-3.28x10-3b = 1.0445Despeje de x

Se sustituyen los datos de A (445nm) obtenidos en la tabla anterior en la ecuacin de la recta obtenida de la curva tipo de Etanol.

Problema:Alcuota 0.2ml:

Alcuota 0.4ml:

Testigo:

Se obtiene un promedio de la interpolacin de los testigos:

y se le resta al testigo el promedio del problema para obtener:

Y se obtiene al fin el nmero de moles deEtanol formado en la fermentacin en mmoles, tomando en cuenta que se tienen 46mg/mol de Etanol tericamente:

n= 2. Determinacin de glucosa residual.Ecuacin de la recta y = ax+bEcuacin emprica y= 2.236 x10-3 X + 0.0206

r2=0.999a= 2.236x10-3b = 0.0206Despeje de x

Se sustituyen los datos de A (540nm) obtenidos en la tabla anterior en la ecuacin de la recta obtenida de la curva tipo de Glucosa.Problema (dilucin 1:20):

Testigo:

y se le resta al testigo el resultado del problema para obtener:

Se obtiene la glucosa fermentada, tomando en cuenta que se tienen 180mg/ml de Glucosa inicial:Glucosa inicial:180g --- 1M--- 1000 ml360g --- 2M ---1000 ml x-------------- 0.5 ml

Y se obtiene as el nmero de moles de Glucosa fermentada en mmoles:

3. Determinacin de CO2.Fg= factor gravimtrico Se resta BaCO3 testigo a BaCO3 de fermentacin para despus multiplicarlo por el factor gravimtrico y obtener con este el nmero de moles de BaCO3 obtenidos en la fermentacin.

4. Balance de fermentacin.Tabla 6. Balance de fermentacin.1 (mmol)2 (mmol)3456 (mmol)N de C

Fuente de Carbono

Glucosa0.6631066

Productos

EtOH1.3582.048- 2-4.0964.0962

CO20.3750.566+ 21.1310.5661

= 4.662

Columna 3: H=-0.5 O= +1Etanol (CH3-CH2-OH):CO2:H = -0.5 X 6 =-3O = +1 X 2 = +2O = +1 X 1 = +1 = -2

Columna 4: Productos oxidadosColumna 5: Productos reducidosCO2= (0.564)(2)= 1.131EtOH= (2.048)(-2)= -4.096Columna 6:

% de Carbono recuperado: 6 mol --- 100 %4.662 mol --- x % X=77.7 %1 mmol x 6= 6mmol 2.048mmol x 2= 4.096 mmol0.566 x 1 = 0.566 mmolndice O/R:

Discusin.Cuando en una fermentacin se producen varios productos finales la bacteria dispone de diferentes alternativas para reoxidar del NADH, no existe a priori una estequiometria definida. En cada caso concreto, segn sea la bacteria y las condiciones de cultivo, puede cuantificarse tanto el consumo de glucosa (u otro sustrato) como la produccin de productos finales I.Las levaduras como microorganismos quimiohetertrofos, necesitan compuestos orgnicos como fuentes de carbono y energa (FCE). Los glcidos, principalmente las hexosas, son los compuestos ms utilizados como FCE tanto para el metabolismo aerbico como anaerbico VIII. Saccharomyces cerevisiae es un microorganismos muy utilizado en la microbiologa industrial, en la produccin de pan, grasas glicerina y la ms importante la de bebidas fermentadas I. En las levaduras, bajo condiciones anaerbicas el NAD+ se regenera por medio de la fermentacin alcohlica: la conversin del piruvato en etanol y CO2. Mediante dos reacciones consecutivas catalizada por dos enzimas III (ilustracin 2). Por cada mol de glucosa que entra en la va Embden Meyerhof Parnas se producir 2 moles de piruvato, los cuales al incorporase al metabolismo fermentativo (fermentacin alcohlica), se producir 2 moles de dixido de carbono y 2 moles de etanol. Esto es muy importante que sea tomado en cuanta en el momento de elaborar un balance de fermentacin IX.

Ilustracin 2. Reacciones llevadas a cabo en fermentacin alcohlica.

Por lo anterior podemos decir que S. cereviciae, en condiciones de anaerobiosis, por cada mol de glucosa produce 1 mol de Dixido de carbono y 1 mol de etanol, por esta razn nuestros clculos dependen de muchos factores, tales como el mtodo y los errores cometidos durante su ejecucin. Saccharomyces cerevisiae, Zymomonas mobilis (fermentacin del pulque) y otras levaduras como Leuconostoc descomponen la glucosa para producir etanol, reoxidando NADH aunque cabe mencionar que la estequiometria vara dependiendo el microorganismo, pues tericamente no tienen la misma relacin de productos oxidados y reducidos y en la prctica estos pueden variar an ms. La fermentacin alcohlica es un proceso muy complejo; el incremento de la concentracin de etanol a medida que transcurre la fermentacin supone un obstculo para el correcto crecimiento y desarrollo de la levadura por los efectos negativos que esto conlleva. El etanol afecta la permeabilidad de la membrana celular disminuyendo su selectividad, de forma que las levaduras en un medio con alta concentracin alcohlica pierden propiedades funcionales y no pueden retener cofactores y coenzimasVIII. Una diferencia importante entre las levaduras silvestres y las levaduras de vino cultivadas es su tolerancia al etanol. La mayor parte de las levaduras silvestres pueden tolerar solamente alrededor de un 4 % v/v de etanol; cuando la concentracin de alcohol llega a este punto, la fermentacin se detiene.XLos balances de fermentacin son esenciales para su aplicacin en la industria, el principal objetivo del anlisis de las fermentaciones es el de dirigir tanto carbono como sea posible desde un sustrato hacia un producto metablico de importancia industrial, y obtener el mximo rendimiento posible. VIIIAhora bien en la prctica se realizo un microensayo de una fermentacin alcohlica, una de las fermentaciones que solo tiene dos productos metablicos: el etanol y el dixido de carbono. Los cuales se les determin su concentracin por los mtodos de Conway y gravimtrico, respectivamente, para conocer el % de carbono recuperado en el proceso fermentativo, as como tambin se determin la concentracin de glucosa fermentada. Estos mtodos pueden presentar interferencias que afectan los balances de fermentacin.El mtodo de Conway, como ya hemos mencionado, se basa en la oxidacin del alcohol por accin de una solucin de dicromato de potasio en medio cido por cido sulfrico. El alcohol es oxidado cuantitativamente a cido actico y el dicromato es reducido a cromo trivalente, de acuerdo con la siguiente reaccin.2 K2Cr2O7 +8 H2SO4 + 3 CH3CH2OH 2 K2SO4 + 2 CH3CHOO + 2 Cr2(SO4)3 + 11 H2OEn cuanto a la manera en que fue llevado a cabo el experimento, podemos decir que fue adecuada, ya que se estuvo al tanto de que no se mezclaran el contenido de la cmara central (K2Cr2O7), con el contenido de la cmara externa (H2SO4 y K2CO3) y se procur recuperar la mayor cantidad posible de K2Cr2O7.

El rendimiento terico estequiomtrico para la transformacin de glucosa en etanol es de 0.511 g de etanol y 0.489 g de CO 2 por 1g de glucosa XI. Nosotros obtuvimos una recuperacin de 1.358 mmol de Etanol que correspondera a 67.9% del total, tomando como base 2 mmol de Etanol. Por lo que podemos decir que nuestro rendimiento fue bueno.

Como resultados observamos en la tabla 6 el balance de fermentacin obtenido, el rendimiento de la reaccin se aprecia en el porciento de carbono recuperado, siendo este entre 80% y 100%. Cuando hay un bajo rendimiento es atribuido a una prdida de productos, en el caso del CO2, una fuga en el sistema, o en el caso de que en el sistema presentara un escaso residuo de oxigeno en el medio, el cual se vera afectado por el efecto PasteurI. En el caso de la glucosa pudo ser una interferencia del mtodo del DNS como no controlar el Ph, ya que el mtodo reacciona en condiciones alcalinas, el no controlar la temperatura ya que es a ebullicin durante 10 minutos,se podra utilizar un mtodo como el de glucosa oxidasa es un mtodo de referencia por su alta especificidad gran sensibilidad. El mtodo se basa en la siguiente reaccin enzimtica:

-D-Glucsa + NADD-glucono-lactona +,

catalizada por la glucosa-dehidrogenasa; por adicin simultnea de mutarotasa se aumenta la velocidad de la reaccin. Se determina finalmente la cantidad delformado, la cual es proporcional a la concentracin de glucosa. La lectura se hace fotomtricamente a una longitud de onda de 340 366 nm.XIIEste mtodo es apropiado para la determinacin de glucosa en diversos jugos y nctares de fruta (naranja, durazno, tomate) y de verduras (zanahoria), como tambin en vinos y mieles. Dada la especificidad de la glucosadehidrogenasa frente a la glucosa, no reacciona con la fructosa, ni la sacarosa. Se eliminara la incubacin a ebullicin ya que la incubacin es a temperatura ambiente y el tiempo de incubacin ya que son 5 mim adems de poder trabajas con alcuotas pequeas.VIII

La ventaja del mtodo de Conway, es que el material y el equipo que se utiliza para la determinacin es ms accesible, aunque tambin presenta una fuerte desventaja, ya que es relativamente inespecfico, ya que otros alcoholes, cetonas y aldehdos reducen el dicromato, as como tambin existe la posibilidad de la descomposicin del dicromato por exposicin a la luz y considerando que es un mtodo indirecto de oxido reduccin colorimtrico y depende del complejo colorido que se forma por la reaccin del dicromato con el etanol, ste no es muy estable, con lo que se pierde la intensidad del color y el complejo colorido no tiene la misma absorcin por lo que produce una seal distinta a la inicial y existe prdida. Otra situacin a considerar por prdida es que el etanol presenta una elevada presin de vapor, en donde es parcialmente miscible y la presin atmosfrica es relativamente baja. Otras formas para determinar etanol son: Cromatografa de gases Micro difusin Determinacin por picnmetro Determinacin enzimtica (Alcohol Deshidrogenasa) TitulacinSi bien los mtodos sugeridos requieren del tratamiento previo el que podra presentar mayores inconvenientes sera la determinacin por medio de una titulacin, ya que presenta interferencias en el mtodo, al no ser especfico para un sola especie qumica y en general para un cambio de vire solo depende el pH.Asimismo, la relacin de productos oxidados entre productos reducidos es de 0.276 (donde el producto oxidado es CO2 y el reducido es el CH3CH2OH), lo que significa que existe mayor cantidad de productos reducidos que de oxidados y a sabiendas de que para determinar la cantidad de CO2 se realiz por un mtodo gravimtrico, podemos pensar que de entrada, el CO2 no se captur totalmente en el NaOH acuoso y por consiguiente en los lavados no se encontrara el CO2 en su totalidad, tambin podemos considerar como una prdida con slo destapar el matraz microfermentador ya que el gas contenido en este es CO2. Sabiendo que se trata de un mtodo gravimtrico, tambin se puede considerar que hay prdidas al momento de realizar los lavados, ya que pudieran quedar trazas de BaCO3 en el matraz y obviamente estas no son cuantificadas.Viendo las anteriores situaciones podemos considerar que la relacin entre la cantidad de productos oxidados y reducidos (O/R) no es cercana a uno debido a que durante las determinaciones para cada producto, pudieron haber tenido prdidas de producto en la determinacin de la relacin, y podemos corroborarlo con nuestro por ciento de carbono recuperado. Notamos que la cantidad de carbono recuperado en funcin de la glucosa suministrada a Saccharomyces cerevisiae, existe un rendimiento del 77.7 %, cuando las prdidas de CO2 permitidas estn en un intervalo del 87-95%. Por lo que en cuanto a recuperacin de CO2 podemos decir que fue deficiente.Tomando en cuenta, la citas bibliogrficas y los antecedentes, podemos dar anlisis de la prdida de producto que existi o que delimit la cuantificacin total de los productos en medida de la glucosa que se aadi para obtener etanol y dixido de carbono y deducir que las variaciones presentadas por la relacin de los productos oxidados y reducidos se debi meramente a errores aleatorios tanto del mtodo como de los analistas, sabiendo que Saccharomyces cerevisiae se encontraba en las condiciones ptimas para llevar a cabo la fermentacin.Conclusiones. El ndice O/R fue de un valor de 0.276 donde el producto oxidado es CO2 y el reducido es el CH3CH2OH por lo que no se llev a cabo un flujo de carbonos correspondiente nicamente a la fermentacin alcohlica. La recuperacin de CO2 fue deficiente al tener un rendimiento de 77.7% con respecto a los intervalos establecidos de 87-95% Los errores en la fermentacin representados en el balance de fermentacin pudieron verse en su mayora por errores de los analistas al formarse ms producto reducido durante la fermentacin. La fermentacin por Saccharomyces cerevisiae debido al anlisis de sus productos fue una fermentacin alcohlica. Para un mejor balance de fermentacin para la cepa utilizada S. cerevisiae es necesario utilizar equipos para evitar su prdida de gas y un equipo que se encuentre estable para su ptimo manejo.Referencias bibliogrficas.I. Pars I Farras, R., y et. al., Bioqumica de los microorganismos. Editorial Revert, Espaa. 1997. pp. 79-81.II. Brock J. Biologa de los microorganismos.10 ed., Editorial Pearson Prentice Hall, pp. 585-587.III. Voet D. Voet J. G. Bioqumica. 3ra ed., Editorial John Wiley and Sons. 2004., pp. 343, 476-480.IV. 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