TINCIÓN DE GRAM

Tinción de Gram •  La tinción de Gram o coloración de Gram es un tipo de

tinción diferencial empleado en microbiología para la visualización de bacterias, sobre todo en muestras clínicas.

• Debe su nombre al bacteriólogo danés Christian Gram, que desarrolló la técnica en 1884.

• Se utiliza tanto para poder referirse a la morfología celular bacteriana como para poder realizar una primera aproximación a la diferenciación bacteriana.

Tinción de Gram •  La tinción de Gram tiene valor diagnóstico y puede ser

aplicada a diversos y múltiples tipos de especímenes clínicos, como líquidos corporales estériles (LCR), exudados, excreciones (orina), secreciones (esputo), abscesos y tejidos.

•  También puede aplicarse a diferentes tipos de materiales de uso hospitalario.

•  EXUDADO: En medicina un exudado es el conjunto de elementos extravasados en el proceso inflamatorio, que se depositan en el intersticio de los tejidos o cavidades del organismo. Provoca el edema inflamatorio

Tinción de Gram •  La observación de esta tinción permite encontrar

características como forma (cocos, bacilos, etc.), agrupación (parejas, racimos, cadenas y empalizadas), y tamaño de las células bacterianas a partir tanto de las muestras clínicas como de cultivos bacterianos.

Tinción de Gram Reactivos para la tinción de Gram • Cristal violeta o violeta de genciana (colorante básico) •  Lugol de Gram (mordiente) • Alcohol-acetona (decolorante) •  Fucsina o Safranina (colorante de contraste)

Tinción de Gram Técnica 1.  Realizar un extendido delgado de la muestra clínica o de una colonia

sobre un portaobjetos y dejar secar. 2.  Fijar el material a estudio a la placa pasándola 2 o 3 veces por la llama

de un mechero evitando el calentamiento excesivo. 3.  Colocar la placa sobre un soporte y cubrirla con cristal violeta durante 1

minuto. 4.  Lavar con agua corriente. 5.  Cubrir la placa con lugol durante 1 minuto. 6.  Lavar con agua corriente. 7.  Cubrir la placa con alcohol acetona durante 5 segundos. 8.  Lavar con agua corriente. 9.  Cubrir la placa con fucsina durante 20 segundos. 10.  Lavar con agua corriente. 11.  Dejar secar al aire. 12.  Observar al microscopio con aceite de inmersión, objetivo 100X,

condensador abierto totalmente.

Tinción de Gram Resultados • Bacterias Gram +: Azul o negro. • Bacterias Gram-: Rosadas o rojas.

Tinción de Gram Fundamento de la técnica •  El Cristal violeta sirve como colorante básico uniéndose a la pared

celular bacteriana, con la ayuda del mordiente se refuerza la unión del colorante (La función del mordiente es favorecer la fijación del colorante en las fibras). Las bacterias Gram + debido a la estructura y composición bioquímica de su pared celular retienen el complejo Cristal violeta-lugol, y aun después del tratamiento con el decolorante conservan el colorante básico, por lo que se observan al microscopio de color azul oscuro o violeta una vez concluida la técnica de tinción.

•  Las bacterias Gram – pierden el colorante básico cuando son tratadas con el decolorante, debido a que el alcohol disuelve el contenido lipídico de la pared celular, lo que aumenta la permeabilidad celular, dando como resultado la perdida del complejo Cristal violeta-lugol. Las bacterias decoloradas captan entonces el colorante de contraste, razón por la cual son luego observadas de color rojo o rosado al terminar la tinción.

Tinción de Gram

Tinción de Gram

Tinción de Gram

Tinción de Gram

Tinción de Gram Bacterias Gram positivas •  La envoltura celular de las bacterias Gram-positivas

comprende la membrana citoplasmática y una pared ce lu lar compuesta por una gruesa capa de peptidoglicano, que rodea a la anterior. La capa de peptidoglicano confiere una gran resistencia a estas bacterias y es la responsable de retener el tinte durante la tinción de Gram. A diferencia de las Gram-negativas, las Gram-positivas no presentan una segunda membrana lipídica externa a la pared celular y esta pared es mucho más gruesa.

• En las bac ter ias Gram positivas la red de peptidoglicanos origina varias capas superpuestas, es gruesa y homogénea y no hay membrana e x t e r n a , e s t a s bacterias se tiñen de violeta/ azul con la tinción de Gram.

Tinción de Gram Bacterias Gram positivas •  Incluyen especies tanto móviles (vía flagelos) como

inmóviles con forma de bacilo (Bacillus, Clostridium, etc) o coco (Staphylococcus, Streptococcus); con gruesas paredes celulares o sin ellas. Algunas especies son fotosintéticas, pero la mayoría son heterótrofas. Muchas de estas bacterias forman endosporas en condiciones desfavorables. Realmente, no todas las bacterias del grupo son Gram-positivas (no se tiñen por la aplicación de ese método), pero se incluyen por su similitud molecular con otras bacterias Gram-positivas.

Tinción de Gram Bacterias Gram negativas •  Las bacterias Gram-negativas presentan dos membranas

lipídicas entre las que se localiza una fina pared celular de peptidoglicano, mientras que las bacterias Gram-positivas presentan sólo una membrana lipídica y la pared de peptiglicano es mucho más gruesa. Al ser la pared fina, no retiene el colorante durante la tinción de Gram.

• En las Gram negativas, bacterias que se tiñen de rojo con la tinción de Gram, hay una sola c a p a d e péptidoglucanos sobre la que se dispone una membrana externa constituida por una capa de fosfolípidos y otra de glicolípidos a s o c i a d o s , e s t o s últimos, a polisacáridos que se proyectan hacia el exterior.

Bacterias Gram negativas •  La envoltura celular de las bacterias Gram-

negativas está compuesta por una membrana citoplasmática (membrana interna), una pared celular delgada de peptidoglicano, que rodea a la anterior, y una membrana externa que recubre la pared celular de estas bacterias. Entre la membrana citoplasmática interna y la membrana externa se localiza el espacio periplásmico relleno de una sustancia denominada periplasma, la cual contiene enzimas importantes para la nutrición en estas bacterias.

Tinción de Gram

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Bacterias Gram negativas •  Muchas especies de bacterias Gram-negativas

causan enfermedades. Los cocos Gram-negativos causan la gonorrea (Neisseria gonorrhoeae), meningitis (Neisseria meningitidis) y síntomas respiratorios (Moraxella catarrhalis), entre otros. Los bacilos Gram-negativos incluyen un gran número de especies. Algunos de ellos causan principalmente enfermedades respiratorias (Haemophilus influenzae, Klebsiella pneumoniae, etc.), enfermedades urinarias (Escherichia coli) y enfermedades gastrointestinales (Helicobacter pylori).

Tinción de Gram

Peptidoglucano: El peptidoglicano o mureína es un copolímero formado por una secuencia alternante de N-acetil-glucosamina y el Ácido N-acetilmurámico unidos mediante enlaces β-1,4. La cadena es recta y no ramificada. Constituye la estructura básica de la pared celular de las bacterias

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