CLASE GENERAL DE PROBLEMAS II: PCR APLICADA AL CLONADO

Docente: Cecilia L. Balaban

APLICACIONES DE LA PCR Y SUS VARIANTES: • DIAGNÓSTICO/FORENSE: IDENTIFICACIÓN, PRESENCIA O AUSENCIA DE UNA

SECUENCIA DE ADN BLANCO.

• GENERACIÓN DE SONDAS/ NIVELES DE EXPRESIÓN: TRANSCRIPCIÓN REVERSA→PCR.

• CLONADOS MOLECULARES

DISEÑO DE OLIGOS CON SITIOS DE RESTRICCIÓN: • Secuencia inicial : 3-6 nt extra en el extremo 5’ para apoyo de la ER. (NNN)

• Sitio de restricción:

No existe otro en el inserto. Se encuentra sólo una vez en el vector.

• Secuencia de hibridación: 18-21 nt. Clonado en fase para expresión de un ORF. Se agregan 0/1/2 nt. Antes del ATG. Inclusión codón START(ATG)/ STOP(TAA,TGA, TAG)

¿clonando un ORF?

¿clonando con fusión

N/C-Terminal?

TEMPERATURA ANILLADO PROTOCOLO DE PCR PARA INSERTO: ADN molde: plasmídico/genómico/ biblioteca cADN Temperatura de anillado (Ta): Se calcula teniendo en cuenta sólo los nt del oligo que hibridan con el molde. Se puede aumentar la Ta en ciclos avanzados para aumentar la especificidad de la reacción. Ej.:

5'-TAAGCAGAATTCATGTGGCATATCTCGAAGTAC-3'

Ta=Tm-4°C= (2x(A+T) + 4x(G+C)) -4°C= (2x(6+6)+4x(5+4)) - 4°C = (24 + 36) -4°C= 56 °C

Usted desea amplificar por PCR un gen bacteriano cuya secuencia se muestra a continuación (se subrayan los sitios de inicio y terminación de la traducción). HindIII 5’GGT CCC AAG CGA ATG TTC GGT CAG GAA CTG -582 nt- ACA TAA AAG CTT ATC TTC

AGC TGC ATT 3’

La proteína que codifica se debe obtener con todos los aminoácidos y se la quiere purificar introduciendo un tag de histidina amino terminal, para lo cual se realizará el clonado en el vector pET28. En el laboratorio se dispone sólo de las enzimas HindIII, BamHI y EcoRI, las cuales no se encontraron en la secuencia codificante. a- Diseñe los oligonucleótidos que usará, introduciendo sitios de restricción para realizar el clonado en el vector pET28, teniendo en cuenta que tengan temperaturas de anillado similares. b- Especifique cómo se induce la expresión, cuántos aminoácidos tendrá la proteína y cómo puede purificarla. c- ¿Cómo puede eliminar la cola de histidina una vez purificada la proteína?

PROBLEMA DE PCR PARA CLONADO MOLECULAR

a- Diseñe los oligonucleótidos que usará, introduciendo sitios de restricción para realizar el clonado en el vector pET28, teniendo en cuenta que tengan temperaturas de anillado similares.

5’ GGT CCC AAG CGA ATG TTC GGT CAG GAA CTG – 582

nt – ACA TAA AAG CTT ATC TTC AGC TGC 3’

Hind III

Enzimas en el laboratorio:

BamHI: G GATCC

EcoRI: G AATTC

HindIII: A AGCTT

Posibles combinaciones:

• D: BamHI - R: EcoRI

• D:BamHI - R: HindIII (A)

• D: EcoRI - R: HindIII (B)

BamHI: G GATCC

EcoRI: G AATTC

HindIII: A AGCTT

OLIGO REVERSO: 5’ GCTGAAGATAAGCTTTTATG 3’

5’ GGT CCC AAG CGA ATG TTC GGT CAG GAA CTG – 582 nt – ACA TAA AAG

CTT ATC TTC AGC TGC 3’

Hind III

Ta= Tm – 4°C= ((4x7)+(2x13)) – 4°C= 50°C; 20 nt.

5’ GGT CCC AAG CGA ATG TTC GGT CAG GAA CTG – 582 nt – ACA TAA

AAG CTT ATC TTC AGC TGC 3’

OPCIÓN A: oligo directo con sitio para BamHI incorporando

missmatches

BamHI: G GATCC

A T

OLIGO DIRECTO: 5’ NNNGGATCCAAGCGAATGTTCGG 3’

GATCCAAGCGAATG….

Ta= (Tm – 4°C x missmatch) – 4°C=

((4x11)+(2x9)) – (2 x 4°C) – 4°C= 50°C; 23 nt.

BamHI

5’ GGT CCC AAG CGA ATG TTC GGT CAG GAA CTG – 582 nt – ACA TAA

AAG CTT ATC TTC AGC TGC 3’

OPCIÓN B: oligo directo con sitio para EcoRI incorporando el sitio de

restricción entero.

EcoRI: G AATTC

OLIGO DIRECTO: 5’ NNNGAATTCATGTTCGGTCAGGAACTG 3’

Ta= (Tm – 4°C) = ((4x9)+(2x9)) – 4°C= 50°C; 27 nt.

AATTCATG….

EcoRI

b- Especifique cómo se induce la expresión, cuántos aminoácidos tendrá la proteína y cómo puede purificarla.

Para expresar la proteína recombinante se transformará una cepa de

Escherichia coli como la BL21(DE3) la cual posee el gen que codifica para la

T7 ARN polimerasa. Esta enzima reconoce el promotor del bacteriófago T7

que dirige la expresión del gen de interés en el vector derivado de la serie

pET28. La expresión será inducida mediante el agregado de IPTG (isopropil-β-

D-tiogalactósido) el cual se une al represor LacI y libera el sitio de unión para

la RNA polimerasa en el promotor.

La proteína de fusión tendrá 237 aminoácidos en ambas opciones de clonado.

La secuencia de polihistidinas amino terminal de la proteína recombinante

permitirá purificarla selectivamente mediante una columna cromatográfica

con resina de Ni-NTA. La proteína se eluye con imidazol.

5’ GGT CCC AAG CGA ATG TTC GGT CAG GAA CTG – 582 nt – ACA TAA

AAG CTT ATC TTC AGC TGC 3’

OPCIÓN A: oligo directo con sitio para BamHI incorporando

missmatches

194 aa + 1 aa 10 aa + …

+ 29 aa

+ 3 aa

10 +195+29+3= 237 aa

5’ GGT CCC AAG CGA ATG TTC GGT CAG GAA CTG – 582 nt – ACA TAA

AAG CTT ATC TTC AGC TGC 3’

194 aa + 1 aa 8 aa + …

+ 29 aa

+ 5 aa

8 +195+29+5= 237 aa

OPCIÓN B: oligo directo con sitio para EcoRI incorporando el sitio de

restricción entero.

c- ¿Cómo puede eliminar la cola de histidina una vez purificada la proteína?

El hexámero de histidinas amino terminal se puede eliminar de la proteína

purificada mediante un tratamiento de proteólisis con trombina.