Coccidioidomicosis sistémica: Desarrollo de un modelo ...

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL.

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS. SECCIÓN DE ESTUDIOS DE POSGRADO E INVESTIGACIÓN.

PROGRAMA DE BIOMEDICINA Y BIOTECNOLOGÍA

MOLECULAR.

T E S I S

QUE COMO UNO DE LOS REQUISITOS

PARA OBTENER EL GRADO DE

MAESTRO EN CIENCIAS EN

BIOMEDICINA Y BIOTECNOLOGÍA

M O L E C U L A R,

P R E S E N T A :

ADRIANA LETECHIPÍA SALCEDO.

MÉXICO D.F.

Coccidioidomicosis sistémica:

Desarrollo de un modelo murino con

Coccidioides posadasii.

Este trabajo se realizó en el laboratorio de Neuropatología del Instituto Nacional de Neurología y

Neurocirugía “Manuel Velasco Suárez” y en el Laboratorio de Bacteriología Médica de La

Escuela Nacional de Ciencias Biológicas de El Instituto Politécnico Nacional, bajo la dirección

de:

El Dr. Citlaltepetl Salinas Lara.

y

La Dra. Graciela Castro Escarpulli.

Así mismo, formó parte del programa:

Diagnóstico convencional y molecular de bacterias de interés médico, clave SIP 948, SIP 1079.

Agradecimientos.

Por la colaboración en el desarrollo de este trabajo al:

Instituto Nacional de Ciencias Médicas y Nutrición “Salvador Zubirán”,

por el uso de instalaciones y la donación de los animales de experimentación.

Colaborador: Dr. Rogelio Hernández Pando.

Colaborador: Biólogo Juan Carlos León Contreras.

Instituto Nacional de Enfermedades Respiratorias “Ismael Cosío Villegas”,

por el uso de instalaciones y la consultoría sobre el manejo de cepas de Coccidioides sp.

Colaborador: Q.B.P. Bertha Muñoz Hernández.

Colaborador: Biólogo Gabriel Palma Cortés.

Departamento de Microbiología Médica de la Facultad de Medicina de la Universidad

Autónoma de Nuevo León,

por la donación de la cepa de C. posadasii empleada en este trabajo y la consultoría en el

manejo de esta.

Colaborador: Dra. Gloria González González.

Instituto Nacional de Pediatría,

por el uso de instalaciones y la consultoría en técnicas histológicas.

Colaborador: Histotecnólogo Eduardo Farfán Morales.

Colaborador: M. en C. Francisco García Vázquez.

Agradecimientos.

Al Programa de Posgrado en Biomedicina y Biotecnología Molecular de La Escuela Nacional

de Ciencias Biológicas de El Instituto Politécnico Nacional y Al Consejo Nacional de Ciencia

y Tecnología por el apoyo.

Becaria No. 216245.

“He comenzado con la persona en el espejo,

le he preguntado sobre como cambiar su camino.

Ningún mensaje pudo ser más claro,

si tu quieres hacer de el mundo un lugar mejor,

mírate a ti mismo y has el cambio”

M. J.

BREVE HISTORIA.

Recuerdo con alegría cuando íbamos a casa de los vecinos y los amigos de Papá. Mamá me

repetía una y otra vez que no hiciera travesuras. Lo que verdaderamente hacia, y que solamente

conocía mi hermana, es que practicaba mis primeros experimentos.

Después de saludar a los anfitriones, Mariana y yo nos encerrábamos en el baño. Mariana

revisaba que nadie nos interrumpiera (o nos descubriera), mientras yo tomaba prestados el

perfume, las cremas, los limpiadores, el shampoo, el jabón y la pasta de dientes y me dedicaba

a revolver metódicamente los productos, con la finalidad de observar algún fenómeno que

expeliera humo o cambiara de color, nada de eso ocurrió; sin embargo, la mezcla que más me

llamaba la atención era la que resultaba de juntar una parte de perfume por cada tres de agua.

Esta última producía un coloide blanco lechoso. ¿Por qué razón pasaba esto? La verdad es que

no tenía ni idea, apenas tenía 5 años de edad y la teoría de las ciencias estaba a unos años de

distancia, pero como buena científica innata repetía el experimento tres, cuatro y hasta diez

veces para demostrar su reproducibilidad. Por supuesto que en el intento, me terminaba la

botellita de Channel No. 5.

Horas más tarde, una vez que los amigos de Papá se daban cuenta del olor a pasta de dientes en

el jabón líquido o a perfume en el inodoro, Mamá, con una risa tímida, pedía disculpas a mi

nombre.

En casa, Mamá me llamaba la atención y me hacia prometer que no repetiría nada de aquello.

¡Pobre de mi Madre!, ¿Quién diría que seguiría haciéndolo por algunos años más? Desde luego

los experimentos fueron subiendo de nivel, inclusive las lagartijas del patio de mi tía me temían

y con razón, pues la última murió ahogada y donó su cuerpo a la ciencia. Le practiqué la

autopsia mientras Mariana veía con un dejo de horror y fascinación.

Mamá decidió convertirse en mi segunda colaboradora (Mariana fue la primera), me alentó a

ver programas científicos y culturales por televisión en el Canal Once. “A la Cachi Cachi

Porra” y “El mundo de BeakMan” eran mis favoritos. A la edad de 10 años recibiría como

regalo un Juego de Química y un Microscopio “Mi Alegría”, que sin duda influenciaron en la

elección de mi carrera y ahora en lo que me he de dedicar de por vida.

DEDICATORIA.

A mi madre, Estela, por permitirme realizar mis primeros experimentos, por soltar mi mano para

dar mis primeros pasos en la vida que me entregó y por cada sonrisa, cada lágrima y cada palabra

que me ha dedicado. Mamá, te amo.

A mi padre, Pedro, por ser mi gran amigo y confidente, porque gracias a él he hecho de la música

de “The Rolling Stones” el sound track de mi vida.

¿A caso no es bueno estar vivos?

A Mariana, mi mejor amiga, confidente y definitivamente el mejor regalo que me han dado mis

padres. Hermana, gracias por acompañarme, por ser colega y por fungir como alumna de servicio

social, eres la mejor. Estas a punto de dar un gran paso en tu vida, se que serás una madre

maravillosa, dale lo más importante de este universo, amor.

A Luz y Laura por permitirme entrar en sus vidas y por llegar a la mía, por las palabras de aliento

y el apoyo, por la alegría, el Sheridan’s, las cenas y sobre todo, gracias por cuidar de Papá, Pasha,

Smuta y Luna. Las quiero.

“Talita cumi eim sof”.

A Yuya, por acompañarme y darme amor, por seguir a nuestro lado después de todo lo que hemos

vivido, por regañarme en cada desvelada, comida y juego, por esos ojos felinos.

A mi Pasha que recargó su cabeza en mi regazo como despedida. Patitas, gracias por haberme

elegido, como dice Papá, nos vemos en el rio.

A la Doctora Chela, por sus consejos, palabras y por haber confiado en mí a pesar de saber que

soy de otra galaxia. Gracias por la atención, el apoyo, la confianza, son cosas invaluables y que

aprecio mucho en usted. Gracias por haber guardado aquel trabajo de fitopatología, significa

mucho y me alienta a seguir siendo yo misma.

Al Doc Citlal, por ser mi tutor, mentor y amigo, por la libertad e imponerme retos, por

escucharme cada vez que lo necesito y por ser un humano con escala de grises. Doc, ¡me invita a

la siguiente expedición! realmente ha sido toda una experiencia su método de formación.

A mis amigas: Claudia, Ruby, Esmeralda y Diana, por aquellos momentos en Tepic. Gracias por

aceptarme, disfruté mucho su compañía y me volvieron fiel amante de Nayarit.

A Cecy, Erika, Cinthia, Dany Gorras, Memo y Fredy del laboratorio de “Bacter Médica” por su

amistad y el apoyo moral y emocional de cada día. Comprobé que las buenas relaciones sociales

influyen en el desempeño de cada uno.

A Benji, Vicky y July por su atención y enseñanzas y el valor de repetir el verano. Gracias por su

amistad que siguen cultivando.

A los 7 de la suerte: Omar, Amir, Ivonne, Dalí, Lili, Enrique y Gustavo, por tomar el servicio

social y ayudar a mi formación.

A mi clan: Masta Viasho, Lalo y Chuchin, por los viernes de Halo y las hamburguesas matutinas.

Primo, gracias por ofrecerme un espacio para crecer, te considero un hermano y te expreso mi

cariño incondicional.

Y por último y no por eso menos importante, a Carlos Sánchez Garibay, por reconocer a Mokona

aquel día 12 de Agosto, por no agotar sus sentimientos, por los buenos y malos momentos, por

preocuparse más que el autor de esta tesis, por quedarse con el Sol y darme la Luna, por la torre

oscura, los ambigramas, las batallas, el omelett, por el pasado y el futuro y sobre todo por

permanecer a mi lado hoy. Carlo, eres mi mejor amigo, mi ideología no me permite creer en el

destino, sin embargo, tu eres el único que me hace dudar hasta en mis momentos más certeros,

quizá sea el amor o quizá hayas roto una muralla en mi vida. En tus propias palabras, gracias por

iniciar este viaje, hacerlo conmigo y esperar a que nunca acabe.

Te amo.

“Gracias a la vida, que me ha dado tanto”.

ÍNDICE.

INDICE DE FIGURAS. i

RESUMEN. ii

ABSTRACT. iii

1. INTRODUCCIÓN.

1

1.1 Coccidioidomicosis.

1

1.1.1 Clasificación taxonómica del género Coccidioides.

1

1.1.2 Biología del género Coccidioides.

1

1.1.3 Ciclo de vida del género Coccidioides.

2

1.1.4 Características clínicas.

3

1.1.5 Epidemiología.

4

1.1.6 Hábitat y distribución.

5

1.1.7 Patogenia.

6

1.1.8 Histopatología.

6

1.1.9 Diagnóstico.

7

1.1.10 Tratamiento.

8

1.2 Antecedentes del modelo experimental.

9

1.2.1 El modelo murino.

9

2. JUSTIFICACIÓN.

10

3. PREGUNTA DE INVESTIGACIÓN.

11

4. HIPÓTESIS.

11

5. OBJETIVO GENERAL.

12

5.1 Objetivos particulares.

12

6. DESARROLLO EXPERIMENTAL.

13

6.1Material y métodos.

14

6.1.1. Inóculo.

14

6.1.1.1 Recuperación de la cepa.

14

6.1.1.2 Obtención del inóculo.

14

CONTINUACIÓN DEL ÍNDICE.

6.1.1.3 Inoculación.

14

6.1.2 Sacrificio.

15

6.1.3 Cuenta de unidades formadoras de colonias en pulmón.

15

6.1.4. Histología.

15

6.1.4.1 Análisis histopatológico. 15

6.1.4.2 Morfometría de pulmón.

15

6.1.4.3 Microscopía electrónica.

16

7. RESULTADOS.

17

7.1 Modelo con inóculo de 120 artroconidios.

17


25


32

8. DISCUSIÓN.

41

9. CONCLUSIONES.

46

10. PERSPECTIVAS.

46

11. PRODUCTOS. 47

12. REFERENCIAS.

48

i

INDICE DE FIGURAS.

Número de figura.

Página

1.- Ciclo de vida del género Coccidioides spp. 2

2.- Clasificación clínica de la coccidioidomicosis. 3

3.- Diagrama general de trabajo. 13

4.- Hallazgos histopatológicos en pulmón con el inóculo de 120 artroconidios. 18

5.- Morfometría de pulmón con el inóculo de 120 artroconidios 19

6.- Cuenta de unidades formadoras de colonias en pulmón con el inóculo de 120 artroconidios

20

7.- Hallazgos histopatológicos en hígado con el inóculo de 120 artroconidios. 21

8.- Hallazgos histopatológicos en bazo con el inóculo de 120 artroconidios. 22

9.- Hallazgos histopatológicos en corazón y riñón con el inóculo de 120 artroconidios.

23

10.- Hallazgos histopatológicos en cerebro con el inóculo de 120 artroconidios. 24


12.- Morfometría de pulmón con el inóculo de 60 artroconidios 27

13.- Cuenta de unidades formadoras de colonias en pulmón con el inóculo de 60 artroconidios

28





18.- Morfometría de pulmón con el inóculo de 30 artroconidios. 34

19.- Cuenta de unidades formadoras de colonias en pulmón con el inóculo de 30 artroconidios.

35

20.- Micrografías de formas parasitarias de C. posadasii en pulmón. 36




24.- Supervivencia de los animales de experimentación.

40

ii

RESUMEN.

La coccidioidomicosis es la micosis endémica respiratoria más frecuente y grave en humanos. Es

ocasionada por los hongos dimórficos Coccidioides immitis y C. posadasii. Sus manifestaciones

van desde la afección pulmonar hasta la diseminación sistémica. Esta última puede traer la muerte

del individuo. En México, el hongo que afecta principalmente a la población es C. posadasii, pero

debido a sus manifestaciones es comúnmente subdiagnosticado.

En la actualidad aun se desconocen muchos aspectos de la patogenia e histopatología de esta

enfermedad. Para ello el modelo experimental representa una herramienta útil para la elucidación

y comprensión de la patogénesis, resistencia del hospedero a la infección y a la búsqueda de

terapias antifúngicas más eficaces; sin embargo no se cuenta con un modelo no invasivo que

reproduzca la coccidioidomicosis sistémica por C. posadasii.

En el presente trabajo, se inocularon por vía intranasal tres grupos de ratones BALB/c con 30, 60

y 120 artroconidios respectivamente de una cepa mexicana de referencia de C. posadasii.

Se analizaron los cambios histopatológicos en pulmón, corazón, hígado, bazo, riñón, tubo

digestivo y cerebro. Se realizó la morfometría y la cinética micológica a partir de pulmón, además

de la microscopía electrónica de las fases parasitarias. La dosis de 120 artroconidios mostró un

patrón de enfermedad aguda, mientras que la dosis de 60 artroconidios mostró un patrón de

enfermedad más crónica. El número de muertes fue de 2 de 15 ratones inoculados (13.33%) tanto

para la dosis de 60 como para la de 120 artroconidios. La dosis de 30 artroconidios mostró

cambios histopatológicos heterogéneos, sin embargo, la dosis es suficiente para estimular al bazo

en la producción de linfocitos B. A pesar de la dosis, la infección no llegó a cerebro durante el

desarrollo del experimento (60 días). En todos casos la enfermedad parece autolimitarse y se

muestra evidencia de que la enfermedad está en función de la dosis inoculada.

Se lograron reproducir los daños más comúnmente observados en humanos al igual que

pericarditis e inflamación de pelvis renal, las cuales son poco comunes pero estan reportados en la

literatura.

iii

ABSTRACT.

Coccidioidomycosis is the endemic respiratory mycosis more frequent and severe in humans. It is

caused by dimorphic fungi Coccidioides immitis and C. posadasii. Its manifestations range from

lung disease to systemic dissemination. The last one could bring the individual's death. In Mexico,

the fungus that primarily affects the population is C. posadasii, but because of its manifestations

is often underdiagnosed.

Today are still unknown many aspects of the pathogenesis and histopathology of this disease. The

experimental model represents a useful tool for the elucidation and understanding of the

pathogenesis and host resistance to infection, as well as to finding more effective antifungal

therapies; however there is not a non-invasive model that reproduces coccidioidomycosis

systemic by C. posadasii.

In this study, were inoculated intranasally three groups of BALB/c mice with 30, 60 and 120

arthroconidia respectively with a Mexican reference strain of C. posadasii. We analyzed the

histopathological changes in lung, heart, liver, spleen, kidney, gastrointestinal tract and brain.

Morphometry was performed and mycological kinetics from lung, in addition to electron

microscopy parasitic forms. The dose of 120 arthroconidia showed a acute illness pattern, while

the dose of 60 arthroconidia showed a chronic disease pattern. The number of deaths was 2 of 15

mice inoculated (13.33%) for both doses of 60 and for 120 arthroconidia. 30 arthroconidia dose

showed a heterogeneous histopathological changes; however these dose is enough to stimulate the

spleen to produce linfocites B. Despite the dose, the infection did not reach the brain during

development of the experiment (60 days). In all cases the disease seems to limit themselves and

showed evidence that the disease is dependent on the dose inoculated.

Managed to reproduce the damage was more commonly observed in humans as well as

pericarditis and inflammation of renal pelvis, which are rare but are reported in the literature.

1

1. INTRODUCCIÓN.

1.1 Coccidioidomicosis.

La coccidioidomicosis, o fiebre del Valle de San Joaquín, es provocado por los hongos dimórficos

Coccidioides immitis y C. posadasii. Es la micosis endémica de origen respiratorio más frecuente

y grave.1

1.1.1 Clasificación taxonómica del género Coccidioides.

Según Fisher (2002), la clasificación taxonómica de Coccidioides es la siguiente: pertenece al

Reino: Eumycota; Phylum: Dikaryomycota; Sub-phylum: Ascomycota; Orden: Onygenales;

Familia: Onygenaceae; Género: Coccidioides; Especies: immitis / posadasii. Esto indica que debe

tener un teleomorfo correspondiente a un ascocarpo (estructura sexuada en forma de saco o

canasta) que posee ascas (esporas sexuadas encerradas en el ascocarpo). Sin embargo, hasta la

fecha no se han observado estas estructuras, por lo que se le considera un hongo mitospórico.2

Estudios filogenéticos han permitido definir dos especies, C. immitis y C. posadasii.3

1.1.2 Biología del género Coccidioides.

Coccidioides es un hongo dimórfico, que en el suelo y en cultivos bajo condiciones normales de

laboratorio, se desarrolla con forma filamentosa (forma saprofita). La forma parasítica, que se da

en los tejidos y bajo condiciones especiales de cultivo (medios líquidos a 40ºC), es la esférula con

endosporas.4

La forma filamentosa se desarrolla en un lapso de 3 a 15 días y produce colonias algodonosas, de

blanco a gris claro, pulverulentas; mismas que desarrollan hifas septadas que limitan y dan lugar

a estructuras cilíndricas pequeñas (2-4.5 μm) llamadas artroconidios. Estas partículas son

altamente infecciosas. En los cultivos especiales a 40ºC, el hongo empieza a desarrollar su ciclo

parasitario, cuando los artroconidios comienzan a redondearse, aumentan de tamaño y la pared

celular se hace más gruesa (esférulas); internamente, ocurre la división del núcleo y la

segmentación del citoplasma (endosporas), con la producción de hasta 800 de ellas. La esférula

termina por romperse, liberando su contenido. Al quedar libres, las endosporas conservan el

potencial para convertirse en una nueva esférula.5, 6, 7

2

1.1.3 Ciclo de vida del género Coccidioides.

En el suelo el hongo se encuentra en forma filamentosa y los artroconidios son dispersados por el

viento. Estos pueden ser inhalados por el ser humano. Se aloja en los pulmones y después de dos

o tres días, cada artroconidio se transforma en esférulas con endosporas.4 Las esférulas pueden ser

expectoradas y arrojadas al suelo, donde regresaran a la forma saprofita. El ciclo se completa en

pequeños roedores donde el hongo sigue una fase parecida a la del ser humano.8

Autores mexicanos (Muñoz et al.2008) proponen que este ciclo de vida sea modificado pues han

observado en pacientes con diabetes mellitus que presentan cavitación, y en pacientes con

afección al sistema nervioso central, la coexistencia de formas parasíticas diferentes, por ejemplo:

formas miceliales, esporas en diferentes estadios de filamentación, artroconidios en barril y

artroconidios que generan esférulas y/o micelio (Figura 1).9

Figura 1.- Ciclo de vida de Coccidioides spp. A) Ciclo de vida típico (Esférula). B) Nuevas formas

parasíticas; a) endospora, b) endospora en filamentación, c) esférula inmadura en filamentación, c1, cd y d esporas en diferentes estadios de filamentación (Muñoz y et al., 2008).

3

1.1.4 Características clínicas.

Cerca del 60% de las infecciones no causan síntomas, el 40% restante representa a los pacientes

sintomáticos cuyas manifestaciones son diversas, desde la afección pulmonar hasta la enfermedad

pulmonar progresiva o diseminación extrapulmonar. 10

La mayoría de los pacientes con

enfermedad primaria se recuperan espontáneamente, pero cuando el hongo se disemina, la

infección adquiere una gravedad considerable, afectando la piel, los huesos, las articulaciones, las

meninges y otros órganos; es en estos casos cuando la micosis puede adquirir un curso fatal. En la

figura 2, se puede observar el resumen de lo anteriormente descrito.11-13

Figura 2.- Clasificación clínica de la coccidioidomicosis. (Modificado de Arenas, 2005).

La mayor parte de los pacientes con coccidioidomicosis, presentan alteraciones respiratorias que

simulan una neumonía común o una tuberculosis.14, 15

En regiones donde la incidencia de tuberculosis es alta, pueden coexistir las dos enfermedades. La

tuberculosis y la coccidioidomicosis comparten características epidemiológicas, clínicas,

radiográficas e histopatológicas, lo que dificulta el diagnóstico correcto donde ambos

padecimientos están presentes. Por tanto, en áreas donde ambas enfermedades son endémicas, es

prudente realizar los estudios respectivos en cada paciente con características clínicas

compatibles, pues el diagnóstico de una de ellas no excluye la presencia de la otra.14

En la coccidioidomicosis, los procesos de curso agudo con infiltrados pulmonares localizados,

tienen síntomas y signos semejantes a los de una neumonía bacteriana con fiebre, tos, dolor

torácico, expectoración purulenta o hemoptisis, disnea, síndrome de condensación pulmonar e

4

infiltrados lobulares homogéneos. A veces se presenta derrame pleural y adenomegalias en hilios

pulmonares. Estos pacientes (15% de los casos) suelen responder bien a los antifúngicos y curan

rápidamente. Las complicaciones fatales más comunes son el dolor en el pecho y choque séptico

debido a la diseminación aguda de Coccidioides spp. Las localizaciones extrapulmonares más

frecuentes son los ganglios linfáticos, los huesos, la piel, el hígado, el bazo y el sistema nervioso

central (SNC). La afección al SNC se presenta en un 30 al 50% de los casos con enfermedad

diseminada. La meningoencefalitis por Coccidioides spp, es semejante a la tuberculosa: evolución

crónica, líquido cefalorraquídeo (LCR) con aspecto de agua de roca y baja concentración de

glucosa, ataque a los núcleos basales y tendencia a producir bloqueos de la circulación del LCR

con hidrocefalia, su pronóstico es grave.16, 17, 18

En México, la forma clínica más frecuentemente observada es la pulmonar y existe un escaso

número de casos reportados con diseminación a la piel y los huesos; de las formas meníngeas, la

gran mayoría de los registros proceden de pacientes pediátricos.18 Además se han reportado dos

casos de pericarditis por Coccidioides spp, en México, forma clínica muy poco común.19

1.1.5 Epidemiología.

Desde 1941, se ha informado de brotes y epidemias de coccidioidomicosis, ligados a actividades

humanas que producen aerosoles y a eventos naturales como tornados y terremotos. Ya que la

infección depende de la exposición al hongo, es más frecuente en campesinos, soldados,

arqueólogos y puede ser accidental en el laboratorio.20, 21

Se calcula que ocurren más de 100,000 infecciones de coccidioidomicosis cada año en las áreas

endémicas de Estados Unidos. En años recientes, la incidencia se ha incrementado en California y

Arizona.22, 23 Las infecciones ocurren más en el verano y el otoño. 24

En México, la coccidioidomicosis no se considera una enfermedad que deba notificarse

obligatoriamente, por lo que actualmente se desconoce su prevalencia en los estado considerados

como zonas endémicas.24

Las formas diseminadas son favorecidas por factores genéticos y raciales, grupos sanguíneos así

como en el segundo y tercer trimestre del embarazo y la administración de glucocorticoides.24

Entre los latinos la enfermedad sintomática y diseminada está asociada al tipo sanguíneo A y B,

respectivamente.16, 17, 18, 19, 25 Los residentes de áreas endémicas suelen infectarse tempranamente,

5

pero casi siempre lo hacen en forma subclínica.22 Por el contrario, los inmigrantes que entran a

dicha área experimentan trastornos más severos; de igual forma es severa la micosis en personas

que experimentaron una infección inaparente en áreas endémicas pero que años después

desarrollan la enfermedad en regiones libres de la coccidioidomicosis donde, debido a su rareza,

son diagnosticadas tardíamente.26

En México, no se cuenta con datos que indiquen la situación actual de la enfermedad en relación a

las tasas de infección y mortalidad, datos que son imprescindibles de conocer para tomar las

medidas de precaución necesarias, en pacientes con factores de inmunocompromiso.4, 5

1.1.6 Hábitat y distribución.

El hábitat del género Coccidioides es el suelo, esto fue demostrado por Stewart & Meyer (1932),

quienes lo aislaron por primera vez en las inmediaciones de una vivienda en la cual había ocurrido

un brote de coccidioidomicosis. Este hallazgo fue comprobado posteriormente por varios

autores.21

Coccidioides desarrolla su ciclo de vida en suelos alcalinos y con altas concentraciones de sales

en zonas áridas y semiáridas con estación seca seguida de varios meses de lluvias intermitentes y

precipitaciones pluviales reducidas, con temperatura anual promedio de 30ºC 28, presencia de

plantas xerófilas como lo son cactáceas, plantas espinosas, arbustos bajos y leñosos. Su presencia

esta relacionada a la planta Larrea tridentata, la cual es predominante en Sonora Inferior, (arbusto

de creosota). En los Estados Unidos esta planta es conocida con el nombre de “gobernadora”, y en

Colombia como “chaparral”.21, 29, 30

La fauna que predomina en las zonas endémicas de coccidioidomicosis, está compuesta por

roedores, perros salvajes, zorros, coyotes, serpientes y armadillos.31

Coccidioides se encuentra en las áreas endémicas de Norte y Centro América y C. posadasii, es

originaria de Texas, emigró a América Latina. Se ha postulado que en épocas prehistóricas

(aproximadamente 14.000 años), la migración tanto del hombre como de animales infectados que

llevaban consigo las esférulas, permitió que a su muerte, éstas se convirtieran en la fase micelial,

estableciéndose en suelos propicios.3

6

En EUA la zona endémica más importante es el sur, sobre todo Arizona, California, Nevada,

Nuevo México, UTA y Texas. En México, la coccidioidomicosis se presenta como continuación

de la zona endémica californiana, abarcando una amplia región de tres zonas, una en la franja

fronteriza norte, que abarca Chihuahua, Coahuila, Nuevo León y Tamaulipas, así como parte de

Durango, Zacatecas y San Luis Potosí; una zona en el litoral Pacífico incluye Sonora, Sinaloa y

Nayarit, así como una pequeña zona semidesértica entre Colima, Michoacán y Guerrero.16 La

intensidad de la endemia disminuye de norte a sur.32, 33

También existen zonas endémicas en Guatemala, Honduras, El Salvador; en Venezuela en los

estados de Falcón, Lara y Zulia21; Paraguay24; y en Argentina en el Chaco y la Patagonia. 29, 34 Una

nueva zona de endemia ha sido descrita recientemente en el noreste de Brasil, en los estados de

Piauí y Ceará.35, 36, 37 En Colombia, no existe una verdadera zona de endemia para la

coccidioidomicosis pues solo se han informado casos esporádicos en la Guajira y en el

Magdalena, siendo, además, bajos los índices de reactividad a la coccidioidina en estas zonas

áridas.38, 39

1.1.7 Patogenia.

Durante las primeras fases de la infección, las defensas contra el hongo son poco eficaces.

Después de aproximadamente tres semanas, la inmunidad específica mediada por células, origina

la formación de granulomas epitelioides compactos, con macrófagos activados, que poseen una

gran capacidad fagocitaria y lítica. De esta forma, la mayor parte de las infecciones respiratorias,

tanto sintomáticas como asintomáticas, son autolimitadas y de curso benigno.17 Cerca de un 60%

de las infecciones agudas no producen síntomas y la enfermedad sólo es reconocida por la prueba

de intradermorreacción positiva (IDR+) a la coccidioidina o esferulina.16, 17

Al igual que en el resto del mundo, en México la coccidioidomicosis grave es de pronóstico

frecuentemente fatal, se vincula a condiciones que producen déficit de la inmunidad mediada por

células (pacientes diabéticos, mujeres embarazadas, pacientes con SIDA, etc.).16, 17, 18, 19, 25

1.1.8 Histopatología.

Las esférulas, se pueden observar con la técnica de hematoxilina y eosina, miden 30 a 60 m,

tienen pared gruesa y citoplasma eosinófilo; pueden tener aspecto de cuerpo asteroide por un

7

fenómeno de Splendore-Hoeppli, en lesiones no activas se deforman y adoptan formas variadas, si

se rompen dan salida a endosporas mononucleadas de 2 a 5 micras de diámetro.8

En ocasiones las endosporas libres pueden ser confundidas con otras estructuras micóticas como

levaduras de Blastomyces dermatitidis o con otro tipo de artefactos.40

En los pulmones, hay reacción granulomatosa alrededor de la esférula, esta se caracteriza por la

presencia de histiocitos y células gigantes tipo cuerpo extraño con linfocitos, células plasmáticas,

monocitos, células epitelioides y después fibrosis, caseificación y calcificación.17

En los coccidioidomas se observa la cavidad con una pared fibrosa y centro necrótico, pueden

encontrarse esférulas e incluso filamentos. En lesiones pulmonares localizadas se señalan

granulomas con linfocitos T cooperadores en la parte central y supresores en la periferia. Las

lesiones en otros órganos también son granulomatosas y en piel se acompañan además de

hiperplasia seudoepiteliomatosa; a menudo se observa proliferación vascular con eosinofilia.12

1.1.9 Diagnóstico.

Para un diagnóstico confiable el médico debe sospechar de la enfermedad, de ello dependerá el

tipo de pruebas o análisis que integrarán el protocolo de estudio del paciente. Los hallazgos en las

radiografías de tórax o en las imágenes por resonancia magnética, no llegan a confirmar el

diagnóstico clínico, por lo que es necesario recurrir al laboratorio microbiológico. Los métodos de

diagnóstico son el examen directo de esputo, orina y pus en búsqueda de esférulas y

ocasionalmente formas hifales, así como la realización de cultivos en Agar Dextrosa Sabouraud

(SDA) con o sin cicloheximida y Agar Mycobiotic incubados a 25°C por 3 a15 días. 11, 22

De los trabajos actuales llevados a cabo en el campo de diagnóstico microbiológico, se encuentra

el de Muñoz-Hernández et al. (2004), quienes efectuaron el primer reporte documentado de

pacientes mexicanos con coccidioidomicosis pulmonar, en donde las formas hifales fueron

observadas frecuentemente (15 de 26 pacientes) en sus productos patológicos. 41

En los estudios anatomopatológicos, la observación de esférulas y/o endosporas en los tejidos del

paciente, utilizando las tinciones clásicas (H&E) o especiales (PAS o Grocott), también es

diagnóstica, mientras que el hallazgo exclusivo de formas hifales, es solamente sugerente. A nivel

8

de diagnóstico etiológico, los estudios llevados a cabo en EUA y México orientan a pensar que la

especie causante de coccidioidomicosis en nuestro país, es preferentemente C. posadasii.1

La utilidad de los hemocultivos, mediante la técnica de lisis-centrifugación, ha sido comprobada

para el diagnóstico de las formas pulmonares graves acompañadas de enfermedad

hepatoesplénica.16, 17

La serología es una herramienta de gran utilidad para el diagnóstico y pronóstico por medio de la

detección de anticuerpos anti-Coccidioides, las pruebas cutáneas y la prueba de fijación del

complemento. Cabe destacar los estudios realizados por Toriello et al. (1997), quienes

desarrollaron y probaron dos tipos de coccidioidinas (antígenos crudo y purificado), concluyendo

que los antígenos crudos (principalmente moléculas glucoprotéicas), muestran buena reactividad

en pruebas de precipitación e intradérmicas, mientras que los antígenos purificados (complejo

polisacárido-proteína desproteinizado) exhiben mayor grado de especificidad, por lo que su uso

debe restringirse a pruebas de alta sensibilidad como ELISA y reacción de fijación del

complemento. 42

1.1.10 Tratamiento.

Para el tratamiento de la coccidioidomicosis se utilizan los compuestos azólicos: ketoconazol,

itraconazol, fluconazol y voriconazol. El polieno anfotericina B (AMB) y sus fórmulas lipídicas

(complejo lipídico, dispersión coloidal, liposomal) se usan en las formas más graves. El

tratamiento de la coccidioidomicosis en Latinoamérica generalmente consiste en fluconazol o

itraconazol y/o AMB. Todos ellos actúan a nivel de la membrana celular fúngica.22

La dosis requerida de AMB supera los 2 g sin embargo, se observa gran cantidad de efectos

colaterales y de fallas terapéuticas. Los fracasos se producen en las formas pulmonares difusas

retículo-nodulillares y en las meningitis.16, 17

Se sugiere para el tratamiento la combinación de caspofungina con fluconazol para C. immitis

como alternativa de tratamiento para aquellos casos que no responden a la AMB. El voriconazol

también podría ser útil, ya que posee actividad in vitro contra C. immitis y tiene buena penetración

a sistema nervioso central.43, 44, 45, 46

Aunque la mayoría de los individuos infectados se sobreponen sin complicaciones, una minoría se

enfrenta a una enfermedad debilitante que conlleva a la falta de opciones terapéuticas

9

completamente efectivas. Para estas personas y en general, las vacunas representarían una opción

preventiva en un futuro no muy lejano.47

En nuestro país, se desconoce la proporción de pacientes que responden favorablemente a los

tratamientos, así como a qué antifúngico se presenta la mayor resistencia. Para los pacientes con

complicaciones graves de la enfermedad (generalmente inmunocomprometidos) el tratamiento es

muy costoso y se complica cuando la terapia de la que se dispone, no resulta adecuada.4, 20

1.2 Antecedentes del modelo experimental.

En la actualidad, el modelo experimental representa una herramienta útil para la elucidación y

comprensión de la patogénesis, la resistencia del hospedero y a la búsqueda de terapias

antifúngicas eficaces.

Se han empleado perros, conejos, cobayos y ratas en baja frecuencia para estudiar la respuesta del

hospedero y la eficacia de vacunas. Sin embargo, el costo y el aumento de las necesidades de

cuidado y cría de animales son las limitantes.48

1.2.1 El modelo murino.

El modelo murino es el más utilizado en el estudio de la coccidioidomicosis debido a la

disponibilidad de las cepas genéticamente definidas, reactivos inmunológicos, su facilidad de

manejo y los gastos, entre los más destacados se encuentran: el de enfermedad primaria pulmonar

por inoculación intranasal, enfermedad con diseminación por inoculación intraperitoneal,

enfermedad sistémica por inoculación intravenosa y el de infección meníngea por inoculación

intracraneal o intratecal. Cada uno ha sido utilizado para examinar diversos aspectos de la

resistencia del hospedero, patogenia, o terapia antifúngica.48

Los modelos sistémicos mencionados emplean métodos invasivos para generar la enfermedad, los

cuales por si mismos son capaces de generar daño. Los ratones empleados son hembras, que

además de ser más resistentes a la enfermedad, tienen variaciones hormonales.48-50 También se

han manejado cepas “outbred”, esto es con reproducción no consanguínea, lo cual produce

variaciones genéticas que por lo tanto también podrían repercutir en la respuesta del hospedero.

Por último, los modelos se han diseñado empleando en su mayoría a C. immitis (ATCC 288868),

y no aislamientos clínicos mexicanos, lo cual puede producir diferencias tanto en la respuesta del

hospedero, como en la patogenia debido a diferencia en la virulencia del hongo.

10

2. JUSTIFICACIÓN.

En la actualidad no se cuenta con un modelo experimental, que elimine las variaciones

hormonales y que mantenga una baja variación genética, además, no se han realizado estudios

empleando cepas mexicanas de Coccidioides posadasii y por esta razón, aún se desconocen

muchos aspectos de la patogenia e histopatología de esta enfermedad. Por lo anterior, se propone

un modelo murino experimental que representará una herramienta útil para la elucidación y

comprensión de la patogénesis y resistencia del hospedero a la infección, tanto como para la

búsqueda de terapias antifúngicas más eficaces.

11

3. PREGUNTA DE INVESTIGACIÓN.

¿Es posible desarrollar un modelo murino, de tal modo que se puedan estudiar las alteraciones

histopatológicas, microbiológicas y ultraestructurales, para conocer el desarrollo de la infección

sistémica por C. posadasii?

4. HIPÓTESIS.

Mediante la inoculación de C. posadasii por vía intranasal, es posible desarrollar en un modelo

murino la infección sistémica. Lo anterior hace posible estudiar las alteraciones histopatológicas,

microbiológicas y ultraestructurales.

12

5. OBJETIVO GENERAL.

Desarrollar un modelo murino de coccidioidomicosis sistémica capaz de reproducir el síndrome

característico de esta enfermedad en humanos.

5.1 Objetivos particulares.

Probar diferentes dosis de artroconidios de una cepa mexicana de C. posadasii para

desarrollar el modelo murino de coccidioidomicosis sistémica.

Estudiar los cambios anatomopatológicos e histopatológicos de la enfermedad.

Conocer las características microbiológicas de C. posadasii obtenido a partir de los tejidos

infectados.

13

6. DESARROLLO EXPERIMENTAL.

Todo el procedimiento, excepto la histología, se realizó en las instalaciones del bioterio de El

Instituto Nacional de Ciencias Médicas y Nutrición, cumpliendo con la Norma Oficial Mexicana

NOM-087-ECOL-SSA1-2002.

Todo el procedimiento se llevó a cabo en un gabinete de seguridad biológica nivel III. El

protocolo empleado, está aceptado por El Comité de Ética para la Experimentación en Animales

del mismo Instituto. El desarrollo experimental se resume en la figura 3.

Figura 3.- Diagrama general de trabajo.

14

6.1 Material y métodos.

6.1.1 Inóculo.

6.1.1.1 Recuperación de la cepa

Se trabajó con una cepa de referencia de Coccidioides posadasii donada por la Dra. Gloria

González González del Departamento de Microbiología Médica de la Facultad de Medicina de la

Universidad Autónoma de Nuevo León (90UANL), aislada en un área endémica de México. Se

recuperó en tubos con Sabouraud dextrosa agar (SDA) incubadas a 28º C por15 días.

6.1.1.2 Obtención de inóculo.

Se agregó solución salina estéril isotónica (SS) a un cultivo de 15 días de C. posadasii (evitando

crear aerosoles). Los artroconidios se desprendieron por movimiento suaves. Se tomó el

sobrenadante y se centrifugó para obtener un botón, el cual fue lavado 5 veces con SS.

Posteriormente, los artroconidios fueron resuspendidos en 1mL de SS para realizar una cuenta en

cámara de Neubauer con azul de algodón.

Se realizaron diluciones para obtener inóculos con intervalos aproximados de 30, 60 y 120

artoconidios por cada 20 L de SS.

Las diluciones, incluyendo el primer tubo, se mantuvieron en refrigeración a 4°C hasta el día de la

inoculación.

Los inóculos fueron verificados por en cultivo en placa con SDA por duplicado de 20 L de cada

dosis.

6.1.1.3 Inoculación.

Se inocularon tres grupos de quince ratones BABL/c macho de 6-8 semanas de edad y con 20 g de

peso con los inóculos de: 30 artroconidios/20 L, 60 artroconidios/20 L y 120 artroconidios/20 L

en SS. Cada ratón se anestesió con 100 L de Sevorane® en una cámara de 20x15x15cm. Un solo

inóculo de 20 L se repartió en ambos orificios nasales usando material estéril, en campana de

bioseguridad N3. Se esperó a que cada ratón aspirara el inóculo y se recuperara de la anestesia. Se

repartieron en cajas con un máximo de 10 ratones cada una. Todos los ratones contaron con agua

y comida abundante, con cambio periódico de cama y fotoperiodos estándar (12 por 12).

15

6.1.2 Sacrificio.

Se realizó el sacrificio de tres animales por grupo los días 3, 7, 14, 28 y 60 después de la

inoculación. Cada ratón se anestesió con éter-etílico, se inmovilizó y se sangró en blanco. Se

expusieron las vísceras y se extrajeron en el siguiente orden: hígado, bazo, riñón izquierdo, riñón

derecho, tubo digestivo y cerebro.

Los pulmones se dividieron a la mitad y se congelaron con nitrógeno líquido en criotubos estériles

para la cuenta de unidades formadoras de colonias. La otra mitad junto con los demás órganos

fueron preservados en formaldehido al 10% para la realización de cortes histológicos.

6.1.3 Cuenta de unidades formadoras de colonias en pulmón.

Las muestras congeladas se llevaron a temperatura ambiente y a cada uno se les agregó regulador

de fosfatos (estéril) hasta obtener un volumen de 0.5mL. Posteriormente fueron homogenizadas y

se llevó a un volumen final de 1mL con el regulador de fosfatos. Se realizaron diluciones

decimales con regulador de fosfatos en microplacas estériles de 96 pozos y se sembraron 20 L en

placas Petri con medio Mycobiotic. Se incubaron a 37°C con 5% de CO2 y se contaron las

colonias después de cuatro días.

6.1.4 Histología.

Los órganos fijados con formaldehido al 10% se deshidrataron con diferentes grados de alcohol y

xilol. Se incluyeron en parafina y se realizaron cortes de 3 a 5 micras de grosor. Los cortes se

montaron en portaobjetos para su tinción con las técnicas de hematoxilina y eosina (H&E), ácido

periódico de Schiff (PAS) y Grocott (TG).

6.1.4.1 Análisis histopatológico.

Cada laminilla fue observada y evaluada de forma cualitativa respecto al daño histopatológico. Se

realizó la morfometría de pulmones y la microscopía electrónica de las laminillas de interés .


Los cortes de pulmón fueron examinados con el analizador de imágenes IM1000® adaptado a un

microscopio óptico Leica. Se midió el daño histopatológico con respecto al área total de tejido.

16

6.1.4.3 Microscopía electrónica.

Después de observar los cortes histológicos, se seleccionaron aquellos con características de

interés y se tomaron muestras en los bloques de parafina de los cuales provienen. Se

desparafinaron con calor y solventes orgánicos. Posteriormente, se incluyeron en resina. Se

realizaron cortes finos de 90 a 100 nm, se montaron en rejillas de cobre y se contrastaron con una

solución saturada de acetato de uranilo y citrato de plomo de Ronald para su análisis al

microscopio electrónico.

17

7. RESULTADOS.

Se recuperó la cepa de referencia 90 UANL de C. posadasii en tubos de SDA. El crecimiento fue

lento. Se hicieron cultivos en placas Petri para observar su morfología, la cual fue típica, es decir,

las colonias que produce son blancas grisáceas por el anverso, algodonosas que se volvieron

pulverulentas por la producción de artroconidios, umbilicadas con pliegues radiales y reverso

color crema. Microscópicamente presentó micelio septado con producción de artroconidios típicos

en forma de barril y células disyuntivas. Los artroconidios se desarrollaron a partir del día siete de

crecimiento.

Los artroconidios fueron obtenidos y contados según la metodología descrita. Se realizaron

diluciones para obtener los inóculos de 30, 60 y 120 artoconidios. Estos fueron verificados por en

cultivo en placa con SDA. Las diluciones, incluyendo el primer tubo, se mantuvieron en

refrigeración a 4°C hasta el día de la inoculación.


El grupo de ratones cuya inoculación fue de 120 artroconidios de la cepa 90UANL de

C. posadasii, mostró los siguientes hallazgos histopatológicos.

7.1.1 Pulmón.

En el parénquima pulmonar se observó una respuesta inflamatoria a expensas de células

mononucleares en el sacrificio del día 3, en el sacrificio del día 7 además se presentó hemorragia

y congestión vascular. El día 14 se visualizó la progresión de las lesiones con la producción de

abscesos con necrosis e inflamación por células mixtas y destrucción tisular con vasculitis, edema

y fibrosis. Dentro de estas lesiones se encontraron esférulas de C. posadasii en diferentes estadios

de maduración. En el sacrificio del día 28 las lesiones únicamente son hemorragia, inflamación y

vasculitis, mientras que el día 60 el tejido pulmonar contiene hemorragia, congestión e

inflamación leve (figura 4).

18

Figura 4.- Hallazgos histopatológicos en pulmón con el inóculo de 120 artroconidios. a) Día 3,

inflamación; b) Día 7, hemorragia e inflamación; c) Día 14, absceso, esférulas en diferentes estadios de maduración (flecha), fibrosis; d) Día 28, inflamación, hemorragia moderada y congestión; e) Día 60, congestión vascular e inflamación leve. (H&E x400).

19


De acuerdo a la metodología, se midieron las lesiones histopatológicas por área de tejido

pulmonar en cada laminilla analizada. Se observó que al emplear la dosis de 120 artroconidios, el

porcentaje de inflamación al día 3 del experimento fue de 0.51%, en el día 7 la hemorragia se

presentó en el 28.78% del tejido. El mayor porcentaje de inflamación (55.19%), hemorragia

(41.35%), edema (83.5%) y absceso (24.18%) en pulmón, se presentó el día 14. En el día 28 se

presentó una inflamación del 10% y absceso en el 0.22 % del parénquima pulmonar y eln el día

60, el 0.14% del tejido.(figura 5).

Figura 5.- Morfometría de pulmón con el inóculo de 120 artroconidios. Los resultados de las lesiones

histopatológicas se presentan en porcentajes. Se observa que el mayor de ellos se presenta el día 14 posterior a la inoculación.

20

7.1.1.2 Cultivo y cuenta de unidades formadoras de colonias.

La infección pulmonar se comprobó por medio del cultivo micológico como anteriormente se ha

descrito y se construyó la cinética microbiológica que se describe en la figura 6. Para el inóculo de

120 artroconidios únicamente fueron detectables 106.66 UFC/pulmón en el día 14 (figura 6).

Figura 6.- Cuenta de unidades formadoras de colonias en pulmón con el inóculo de 120 artroconidios. Los resultados se muestran en unidades formadoras de colonias por pulmón.

21

7.1.2 Hígado.

En el parénquima hepático, al día 3 de posinfección, se observó hemorragia y necrosis

centrolobulillar, mientras que al día 7 solamente se encontró congestión vascular. El día 14

además de congestión vascular, se observaron abscesos. En el día 28, es posible observar necrosis

en los abscesos y al día 60 se observa congestión e inflamación leve (figura 7).

Figura 7.- Hallazgos histopatológicos en hígado con el inóculo de 120 artroconidios. a) Día 3 y b) Día

7, Tejido sin lesión; c) Día 14, necrosis centrolobulillar; d) Día 28, inflamación y congestión; e) Día 60, congestión. (H&E x400).

22

7.1.3 Bazo.

Durante el desarrollo del experimento, fue posible observar la progresión de la hiperplasia de la

pulpa blanca en bazo con la presencia franca de centros germinales en los folículos linfoides, lo

cual se demuestra en las microfotografías de la figura 8. El día 28 se observó además

esplenomegalia en uno de los tres animales sacrificados (figura 8a).

Figura 8.- Hallazgos histopatológicos en bazo con el inóculo de 120 artroconidios. a) Esplenomegalia

en el día 28. b) Día 3, c) Día 7 y d) Día 14, hiperplasia de centros germinales; e) Día 28 y f) Día 60, hiperplasia marcada de centros germinales. (H&E x100).

23

7.1.4 Corazón.

Durante los días 3 y 7 del experimento, fue posible observar congestión en el tejido cardiaco, y el

día 14 se presentó pericarditis con células mononucleares (figura 9a).

7.1.5 Riñones.

Durante el desarrollo del experimento, se observó inflamación leve por células mononucleares en

la pelvis renal de todos los animales (figura 9b). El día 14, además de esta lesión, se observó

congestión vascular.

7.1.6.1 Tubo digestivo.

A pesar de que se muestreó el estómago, el intestino delgado y el intestino grueso, no se

observaron lesiones en ninguno de ellos.

Figura 9.- Hallazgos histopatológicos en corazón y riñón con el inóculo de 120 artroconidios de

inóculo. a) Pericarditis H&E x100; b) Inflamación de pelvis renal H&E x400.

24

7.1.7 Cerebro.

Durante el desarrollo del experimento, los cortes de cerebro no mostraron lesiones

histopatológicas ni presencia de esférulas u otras formas fúngicas (figura 10). Cabe mencionar que

durante la autopsia, no se observaron lesiones macroscópicas.

Figura 10.- Hallazgos histopatológicos en cerebro con el inóculo de 120 artroconidios. a-e) Días 3, 7,

14, 28 y 60 respectivamente, el tejido no muestra lesiones. (H&E x400).

25


En los ratones que fueron inoculados con 60 artroconidios de la cepa 90UANL de Coccidioides

posadasii, se encontraron los siguientes hallazgos histopatológicos.

7.2.1 Pulmón.

El tejido pulmonar presentó hemorragia al día 3 después de la inoculación, la cual se encontró

disminuida al día 7. En el día 14 solo se observó congestión del parénquima pulmonar y en el día 28

se presentó inflamación abundante con células mixtas, fibrosis, células epitelioides y células gigantes,

en este día fue posible observar esférulas en diferente estadio de maduración, algunas de ellas

fagocitadas por células gigantes como lo demuestra la microfotografía de la figura 11d. En el día 60

se observa que la inflamación ha disminuido, además se observa también la presencia de edema y

congestión. Esta descripción, se puede notar en la figura 11.

26


hemorragia extensa; b) Día 7, hemorragia e inflamación leves; c) Día 14, congestión; d) Día 28, inflamación, fibrosis y células gigantes; e)Día 60, edema e inflamación moderada con congestión. (H&E x400).

27


Después de realizar la morfometría de pulmón, se observó que con el inóculo de 60 artroconidios,

se presenta un 0.10% de inflamación y 65.35% de hemorragia. El día 7 mostró 0.05% de

inflamación. El día 14 no se detectaron lesiones. El mayor porcentaje de inflamación (90.51%),

edema (13.17%) y absceso en pulmón (9.66%), se presentaron preferentemente durante el día 28,

mientras que el día 60 se presentó 77. 32% de inflamación en el parénquima pulmonar (figura

12).

Figura 12.- Morfometría de pulmón con el inóculo de 60 artroconidios. La mayor parte de las

lesiones evaluadas, se presentan el día 28. La hemorragia (rojo) además se presenta el día 3. La inflamación (azul) se presenta también el 60.

28


La infección pulmonar con el inóculo de 60 artroconidios, se comprobó por medio del cultivo

según la metodología previamente descrita y se construyó la cinética microbiológica que se

muestra en la figura 13. En ella se puede observar que el microorganismo únicamente se detecto

el día 28 con 61 UFC por pulmón.

Figura 13.- Cuenta de unidades formadoras de colonias en pulmón con el inóculo de 60 artroconidios. Los resultados se muestran en unidades formadoras de colonias por pulmón.

29

7.2.2 Hígado.

Durante el análisis del día 3, se observó necrosis centrolobulillar y congestión vascular en uno de los

ratones mientras que el hígado de los demás ratones no mostró lesión alguna. En el día 7 del

experimento, la congestión vascular fue general y en el día 14 se encontró además esteatosis de gota

fina, y dilatación sinusoidal. En el día 28 fue posible observar esférulas con endosporas rodeadas por

inflamación con producción de abscesos con necrosis y congestión del tejido. En el día 60 el tejido

solamente presentó inflamación leve (ver figura 14).

Figura 14.- Hallazgos histopatológicos en hígado con el inóculo de 60 artroconidios. a y b)Días 3 y 7 respectivamente, tejido sin lesiones; c) Día 14, esteatosis de gota fina; d) Día 28, inflamación, absceso con necrosis y congestión; e) Día 60, tejido sin lesiones. (H&E x400).

30

7.2.3 Bazo.

Al igual que con el modelo anterior, es posible ver la progresión de la hiperplasia de pulpa roja y

folículos linfoides con centro germinativo; sin embargo este es evidente el día 7 (figura 15). El día 28

de la infección fue evidente la esplenomegalia en uno de los tres animales sacrificados (figura 15a).

Figura 15.- Hallazgos histopatológicos en bazo con el inóculo de 60 artroconidios. a) Esplenomegalia

en el día 28. b) Día 3, tejido normal; c y d) Días 7 y 14 respectivamente, hiperplasia leve de los centros germinales; e y f) Día 28 y 60 respectivamente, hiperplasia marcada de los centros germinales. (H&E x100).

31

7.2.4 Riñones.

Se observó inflamación leve por mononucleares de pelvis renal durante el desarrollo del experimento

con congestión vascular el día 14.

7.2.5. Corazón, tubo digestivo y cerebro.

El corazón y tubo digestivo no presentaron signo alguno de lesión en ningún día del experimento. De

igual forma, el cerebro no presentó lesión como lo muestra la figura 16.

Figura 16.- Hallazgos histopatológicos en cerebro con el inóculo de 60 artroconidios. a-e) Días 3, 7,

14, 28 y 60 respectivamente, tejido normal. (H&E x400).

32


El grupo de ratones que fueron inoculados con 30 artroconidios de la cepa 90 UANL de

Coccidioides posadasii, presentaron los siguientes hallazgos histopatológicos.

7.3.1 Pulmón.

Las lesiones pulmonares muestran hemorragia, edema e inflamación por células mononucleares,

mientras que en el día 7 y 14, se observó inflamación por células mononucleares y congestión

vascular. En el día 28 la inflamación predomina con fibrosis y esférulas de C. posadasii en

diferentes estadios de maduración. Al día 60 del experimento, se presentó inflamación moderada.

Estos hallazgos pueden observarse en la figura 17.

33


hemorragia, edema e inflamación por mononucleares; b) Día 7, congestión e inflamación leve; c) Día 14, congestión e inflamación moderada con edema leve; d) Día 28, inflamación y fibrosis con esférulas en diferentes estadios de maduración; e) Día 60, inflamación moderada. (H&E x400).

34


Tras la inoculación de 30 artroconidios se observó que en el día 3 la inflamación se encuentra en

el 0.20% del parénquima pulmonar, la hemorragia en el 98.54% y el edema en el 77.83%,

mientras que en el día 14 hay 40.66% de inflamación y en el día 28 existe 75.8% de inflamación,

15.19% de edema y 7.5% de tejido con abscesos. En el día 7 y 60 no se detectaron las lesiones

evaluadas (figura 18).

Figura 18.- Morfometría de pulmón. Inóculo de 30 artroconidios. Los datos se muestran en

porcentajes, como se puede observar, las lesiones histopatológicas se presentan de manera heterogénea..

35


La infección pulmonar se comprobó por medio del cultivo micológico y se construyó la cinética

microbiológica que se presenta en la figura 19. Las cuentas fueron de 0.33 y 0.15 UFC por

pulmón en los días 7 y 28 respectivamente (esto es al menos una colonia en uno de los

especímenes). En los demás días, el hongo no fue detectado.

Figura.19.- Cuenta de unidades formadoras de colonias en pulmón con el inóculo de 30 artroconidios. Los resultados se muestran en UFC por pulmón.

36

7.3.1.3 Microscopía electrónica de formas parasitarias en pulmón.

Para realizar la microscopía electrónica de transmisión, fueron tomadas muestras del bloque de

pulmón del día 28 con inóculo de 30 artroconidios (flechas de la figura 17d). Las micrografías se

muestran en la figura 20. Cabe mencionar que no es posible observar los organelos de las

endosporas, probablemente debido a defectos en la fijación de las muestras; sin embargo, es

posible observar que la pared celular de las endosporas es muy gruesa y electrón-densa. No se

observa la membrana celular. En las esférulas, se observa también una pared celular gruesa,

misma que se puede observar inclusive a 400 aumentos en la figura 17d.

Figura 20.- Micrografías de formas parasitarias de C. posadasii en pulmón. a y b) endosporas

10000x y 12500x respectivamente. c y d) pared celular de esférulas inmaduras 25000x.

37

7.3.2 Hígado.

Durante el análisis histopatológico, se observaron inflamación a expensas de células

mononucleares y microabscesos en el día 3 del experimento, el día 7 y 14 se observó congestión

vascular. En el día 28 se observaron solamente microabscesos y en el día 60 se observó que el

tejido no presentaba lesiones (figura 21).

Figura 21.- Hallazgos histopatológicos en hígado con el inóculo de 30 artroconidios. a) Día 3,

inflamación por mononucleares y microabscesos; b y c) Días 7 y 14, tejido sin lesión; d) Día 28, inflamación y microabscesos; e) Día 60, tejido sin lesión. (H&E x400).

38

7.3.3 Bazo.

Con el inóculo de 30 artroconidios de C. posadasii, se observa la progresión de la hiperplasia de

la pulpa roja y folículos linfoides con centro germinal desde el día 3 del experimento (figura 22).

Figura 22.- Hallazgos histopatológicos en bazo con el inóculo de 30 artroconidios. a-e) Día 3, 7, 14, 28

y 60 respectivamente, hiperplasia ascendente de centros germinales y folículos linfoides con centros germinales. (H&E x100).

39

7.3.4 Corazón y riñones.

El tejido cardiaco mostró únicamente congestión a lo largo del experimento. Los riñones

mostraron inflamación de la pelvis renal durante el desarrollo del trabajo.

7.3.5 Tubo digestivo y cerebro.

El estómago, intestino delgado e intestino grueso, no mostraron daño alguno. El tejido cerebral

tampoco mostró signos de lesión durante el desarrollo del experimento (figura 23).

Figura 23.- Hallazgos histopatológicos en cerebro con el inóculo de 30 artroconidios. a-e) Días 3, 7, 14, 28 y 60 respectivamente, tejido normal. (H&E x400).

40

7.4 Sobrevivencia de los animales de experimentación.

Durante el desarrollo del trabajo, se contaron el número de animales que murieron antes de ser

sacrificados para construir la curva de sobrevivencia. El número de muertes con el inóculo de 120

artroconidios fue de 2 de 15 animales (13.33%) entre el día 28 y 60. El número de muertes con el

inóculo de 60 artroconidios fue de 1 de 15 animales entre el día 14 y 28, y 1 de 15 animales entre

el día 28 y 60 (Total 13.33%).

Para el inóculo de 30 artroconidios, no hubo muertes (figura 24).

Figura 24.- Supervivencia de los animales de experimentación. Los resultados se muestran en

número de ratones por día posinfección. Azul, inóculo de 120 artroconidios. Rojo, inóculo de 60 artroconidios. Verde, inóculo de 30 artroconidios. El total de muertes fue de dos para el inóculo de 120 artroconidios; dos para el inóculo de 60 artroconidios; ninguno para el inóculo de 30 artroconidios.

41

8. DISCUSIÓN.

Como anteriormente se había mencionado, la coccidioidomicosis es la micosis endémica de

origen respiratorio más frecuente y grave. Es ocasionada los hongos dimórficos Coccidioides

immitis y C. posadasii. Ésta enfermedad se encuentra confinada únicamente al continente

americano y los reportes en otros países se deben a personas que visitaron las zonas endémicas

americanas.1, 4

Se sabe que una de las áreas endémicas de mayor importancia es la zona sur de E.U.A que se

extiende al norte de México. Se ha calculado que cada año, ocurren más de 100,000 infecciones

de coccidioidomicosis en Estados Unidos y en años recientes, la incidencia se ha incrementado. 22,

23 En México, se desconoce las cifras epidemiológicas de esta enfermedad, en su mayoría debido a

la falta de una norma que exija el reporte inmediato de casos diagnosticados, inclusive, se cuenta

con pocos trabajos comunitarios que apoyen el estudio de esta enfermedad; Sin embargo, se sabe

que el agente etiológico de la coccidioidomicosis más comúnmente aislado es Coccidioides

posadasii. 4, 51

La coccidioidomicosis tiene varias presentaciones clínicas, la más frecuente es la pulmonar en la

cual el 60% de las personas que la padecen son asintomáticas, y el 40% restante pueden referir

fatiga, tos, dolor de pecho, disnea y, ocasionalmente, hemoptisis. 10, 52

Debido a que los síntomas

son poco específicos, suele ser confundida con otras enfermedades, entre ellas la tuberculosis,

pues además de compartir síntomas respiratorios, comparten las áreas endémicas.53

Debido a

esto, la enfermedad fúngica es comúnmente subdiagnosticada54

y por lo tanto mal tratada. En el

Instituto Nacional de Neurología y Neurocirugía, se han encontrado casos (no reportados) en los

que pacientes con síntomas respiratorios, son diagnosticados con tuberculosis y a pesar de recibir

tratamiento (para tuberculosis) producen signos meníngeos y mueren en poco tiempo. En estas

personas, después de la autopsia, se reveló que la verdadera enfermedad que padecían era

coccidioidomicosis. Generalmente, la enfermedad debería autolimitarse, pero en algunos casos, y

sobre todo posiblemente con la presencia de factores de riesgo o en este caso probablemente

debido a la administración de corticoesteroides, puede diseminarse al organismo causando la

muerte del individuo.11-13

Las formas más graves de la enfermedad, son aquellas extrapulmonares como la meningitis 24

y se

reconoce que aspectos como la patogénesis, respuesta del huésped, inmunidad humoral y celular,

42

virulencia entre cepas, mecanismo de patogenicidad y otros, aun no han sido bien estudiados por

la falta de un modelo adecuado.55

En la actualidad, el modelo experimental ofrece una alternativa

para el estudio de la respuesta del hospedero, la patogenia, la efectividad de vacunas y

antifúngicos. Un modelo que logre reproducir el daño que experimentan los humanos durante la

infección con Coccidioides sp., es un punto de partida para estudiar los aspectos antes

mencionados con el fin de hacer frente a esta enfermedad.

En la literatura se encuentran algunos modelos que son capaces de desarrollar la enfermedad

sistémica diseminada, la extrapulmonar y la meníngea, en estos la inoculación es intravenosa,

intraperitoneal, intratecal e intracraneal respectivamente.50, 55, 56

Sin embargo este tipo de

inoculación es invasiva (no natural) y por si sola genera un daño.57

La técnica de inoculación

propuesta en este trabajo, es la vía natural, es decir, la inhalación de artroconidios por inoculación

intranasal. 1, 15, 19, 24

Poco se sabe sobre la dosis infectiva en humanos, pero en estudios previos se ha reportado que 10

artroconidios por vía intranasal, son suficientes para producir la enfermedad pulmonar en ratones.

Autores como Magee y Cox han empleado dosis de 25 a 35 artroconidios de C. posadasii para

documentar las diferencias en la virulencia de diferentes cepas en ratones BALB/c (datos no

publicados).58

Para producir la enfermedad sistémica, esta reportado que la cantidad necesaria es

de 50 artroconidios de C. immitis por vía intravenosa (una vía no natural que por si misma genera

un daño) y 50 artroconidios de C. posadasii cepa Silveria por vía intranasal en ratones hembra

C57BL/6, DBA/2n, y Swiss-Webster; para ratones macho Beige y Nude se reportan hasta 200

artroconidios por vía intranasal.50, 59

Estos dos últimos estudios tienen la desventaja de manejar

ratones hembras con variaciones hormonales y ratones no singénicos susceptibles con variaciones

genéticas respectivamente. Un mejor modelo debería eliminar estas dos variantes.

Se ha reportado que los ratones BABL/c son susceptibles a la coccidioidomicosis y sobre todo los

machos son más propensos debido a la producción de testosterona; 60, 61

sin embargo, sus

características hacen que sean propuestos como huéspedes modelo, pues debido a que pertenecen

a cepas singénicas de reproducción consanguínea (inbred), se disminuyen al mínimo las

variaciones genéticas entre los animales empleados y por lo tanto las diferencias entre su

respuesta al reto impuesto. A pesar de que el ratón macho es más susceptible a la enfermedad, de

esta forma se controla la variación hormonal pues se eliminan los ciclos estrogénicos que tienen

lugar en las hembras, lo que disminuye la variación en la respuesta inmune. También se ha

43

reportado que no hay diferencias cualitativas entre la histopatología de ratones con reproducción

consanguinea resistentes y susceptibles, 60

por lo cual es indiferente utilizarlos; no obstante, por

razones de bioseguridad, es más conveniente emplear ratones susceptibles para manejar dosis

bajas de artroconidios.

Por todo lo anteriormente descrito, en el presente trabajo, se probaron las dosis de 30, 60 y 120

artroconidios para infectar ratones macho BALB/c. La cepa fúngica elegida es un aislamiento

clínico mexicano de Coccidioides posadasii donada por la Universidad Autónoma de Nuevo León

con morfología típica al que denominamos 90UANL, esta cepa fue identificada por métodos de

biología molecular. 62

Todos los grupos de ratones inoculados con las diferentes dosis de artroconidios mostraron una

infección pulmonar y lesiones extrapulmonares; sin embargo, las formas parasitarias solo fueron

observadas en pulmón e hígado. La respuesta inflamatoria temprana fue a expensas de células

mononucleares principalmente, lo cual contrasta con publicaciones previas, en las cuales los

neutrófilos fueron las células que predominaron. 59

En el caso de los grupos de ratones inoculados

con 120 y 60 artroconidios, se observó la presencia células epitelioides binucleadas en pulmón

después del día catorce, signo de inflamación crónica, lo cual refiere qué el sistema inmune

necesita de otra estrategia para deshacerse de la infección, pues los macrófagos no son suficientes.

Este tipo de inflamación está referida en el caso de coccidioidomicosis pulmonar. 63

En humanos,

los pulmones presentan una reacción granulomatosa alrededor de las formas parasitarias

(esférulas) y se caracteriza por la presencia de histiocitos y células gigantes tipo cuerpo extraño

con linfocitos, células plasmáticas, monocitos, células epitelioides y después fibrosis,

caseificación y calcificación.17 El modelo desarrollado, muestra precisamente este patron, aunque no

se logró observer calcificación.

Aunado a esto, los datos muestran que los signos en bazo son progresivos, la hiperplasia de pulpa

blanca, la presencia de centros germinales y la esplenomegalia están relacionadas con las

infecciones activas que tienden a la producción de linfocitos B con producción células plasmáticas

y anticuerpos.

El grupo de ratones inoculados con 120 artroconidios, además mostró lesiones poco comunes

como la congestión cardiaca y la pericarditis, esta última se ha reportado en pacientes

mexicanos;32

por otro lado, entre las especificaciones de la cepa de ratón empleada, se tiene que

44

los ratones BALB/c muestran alta incidencia en defectos cardiacos y calcificación cardiaca.64 Otro

hallazgo, fue el de inflamación de pelvis renal a lo largo del experimento, esto podría ser signo de

infección, la cual se encuentra reportada como infección genitourinaria en la literatura. 65

Algo que llama la atención, es que en ninguna de las dosis probadas, se observaron lesiones o

infección en el cerebro. Algo que podría explicar esto es que la barrera hematoencefálica está

intacta y no permite que ocurra la diseminación a este tejido. Otra hipótesis es que aunque el

estímulo (patógeno) se encuentra presente, el tiempo máximo de sacrificio (60 días) es poco para

observar la infección del cerebro. Por último queda que probablemente el patógeno no tenga

tropismo a cerebro y realmente lo está evadiendo.

En cuanto a la cronicidad de la enfermedad desarrollada en los animales, el modelo con 120

artroconidios mostró que era menor en comparación con el de 60 artroconidios. En los tres

modelos, las lesiones coinciden con las cuentas más altas de UFC, esto da evidencia de que la

respuesta del hospedero, está en función del inóculo y de la carga micológica en el órgano.

Probablemente el modelo con 120 artroconidios, podría ser empleado cuando se necesita analizar

la respuesta a una enfermedad aguda, mientras que el de 60 artroconidios podría emplearse para

estudiar la respuesta a una enfermedad crónica.

En el caso del modelo con inoculación de 30 artroconidios, probablemente el sistema inmune de

los animales de experimentación está logrando contener la infección desde el principio del

experimento, pues las cuentas micológicas no llegan ni a dos UFC por pulmón en ninguno de los

animales. Los cambios histopatológicos son heterogéneos y no se observó esplenomegalia, pero si

hay progresión de la hiperplasia de la pulpa blanca y presencia de centros germinales en los

folículos linfoides del bazo, esto hace suponer que 30 artroconidios son suficientes para estimular

al bazo para la producción de linfocitos B y que se trata de una infección activa.

En ningún modelo, se observaron formas filamentosas o diferentes a las endosporas o esférulas en

diferentes estadios de maduración. Los reportes realizados por investigadores mexicanos indican

que se han observado en cavitaciones y en productos biológicos de pacientes con algún factor de

inmunosupresión. 9, 41

En cuanto a la microscopía electrónica de transmisión, no es posible ver los organelos ni la

compartimentación del citoplasma en los diferentes estadios de las formas parasitarias que ha sido

45

previamente descrita, 66

probablemente debido a una mala técnica de fijación, pues el tejido fue

extraído de bloques de parafina con una metodología que sigue ciclos de calor y exposición a

solventes, mismos que podrían dañarlo al punto de borrar los detalles de su ultraestructura.

Durante el experimento, solo hubo dos pérdidas de animales (13.33%) en el modelo con el

inóculo de 120 artroconidios antes del día 60. En el modelo con 60 artroconidios también hubo

dos muertes, una antes del día 28 y otra entre el día 28 y 60 (13.33%). Esto llama la atención, pues

en otros modelos como el de Magee y Cox, la mayoría de los animales (>50% ratones BALB/c)

murieron al día 14 después de ser inoculados por vía intratraqueal e intranasal con dosis de 19 a

35 artroconidios de diversos aislamientos de C. posadasii (datos no publicados), 58

esto nos lleva a

pensar en diferencias en la virulencia entre los aislamientos de C. posadasii.

Recapitulando, el modelo propuesto para la coccidioidomicosis sistémica, posee las ventajas de

manejar una cepa mexicana de C. posadasii y ratones macho BALB/c, que son susceptibles y que

desarrollan la enfermedad sistémica con dosis bajas de artroconidios (120, 60 y 30 artroconidios).

Debido al género y la composición genética de la cepa de ratón empleada, las variaciones en la

respuesta entre cada individuo, es reducida al mínimo. La enfermedad desarrollada con 120 y 60

artroconidios es sistémica y muestra signos de inflamación crónica a los días 14 y 28 después de

la infección respectivamente, con una duración aguda y crónica también respectivamente. La

sobrevivencia en el modelo con ambos inóculos es alta.

Cabe mencionar que es importante reproducir el experimento en hembras de la cepa BALB/c,

pues de esta manera se podrían comparar los resultados y observar si las diferencias son

significativas. En experimentos futuros, el tiempo del experimento se podría prolongar para

observar si efectivamente el patógeno es eliminado o si existe latencia y reactivación de la misma.

También como perspectiva, sería posible inducir un estado de inmunosupresión o de enfermedad

diabética, lo cual aportaría información valiosa. Consideramos que además sería atractivo realizar

pruebas inmunohistoquímicas para la obtención del patrón de interleucinas de los modelos, así

como la caracterización bioquímica.

Reiteramos que el modelo murino propuesto, es uno de los primeros pasos en el estudio de la

coccidioidomicosis sistémica y es importante que se le dé seguimiento, pues de esto depende la

mejor atención y tratamiento a las personas que padecen o pueden llegar a padecer esta

enfermedad.

46

9. CONCLUSIONES.

Los grupos de ratones macho BALB/c inoculados con 120 y 60 artroconidios muestran

una enfermedad sistémica con inflamación crónica y baja mortalidad.

El grupo de ratones inoculados con 120 artroconidios puede reproducir las lesiones

reportadas en humanos.

Los grupos de ratones inoculados con 120 y 60 artroconidios podrían emplearse para

emular la enfermedad sistémica aguda y crónica respectivamente.

El grupo de ratones inoculados con 30 artroconidios muestra una respuesta heterogénea en

los animales de experimentación.

10. PERSPECTIVAS.

Aumentar el número de ratones en el estudio.

Obtención del perfil de interleucinas en el modelo desarrollado.

Caracterización bioquímica del modelo.

Desarrollar del modelo en ratones inmunosuprimidos y/o con diabetes.

47

11. PRODUCTOS.

Diploma. Durante el periodo del 09 de Junio al 04 de Julio del 2008 se curso el VII Diplomado

Teórico Práctico en Micología Médica “Dr. Amado González Mendoza”

organizado por el Departamento de Microbiología y Parasitología de la Facultad de

Medicina de la UNAM, con una duración de 200 horas de las cuales128.5 fueron horas

teóricas y 71.5 fueron horas prácticas. Fue aprobado obteniendo un Diploma con valor

de 20 créditos.

Constancia. Participación como COORDINADORA del curso monográfico “Introducción a la

Patología Infecciosa y Tropical” en el marco del Verano de la Investigación

Científica 2008, de la Academia Mexicana de Ciencias y el programa Delfín. Del 3 de

Julio al 4 de Agosto de 2008, en el Instituto Nacional de Neurología y Neurocirugía

“Manuel Velasco Suarez”. México D.F.

Constancia. Participación como PONENTE del curso monográfico “Introducción a la Patología

Infecciosa y Tropical” en el marco del Verano de la Investigación Científica 2008, de

la Academia Mexicana de Ciencias y el programa Delfín. Del 3de Julio al 4 de Agosto

de 2008 en el Instituto Nacional de Neurología y Neurocirugía “Manuel Velasco

Suarez”. México D.F.

Constancia. Participación como PONENTE en la modalidad de cartel del trabajo titulado

“Predicción de la estructura secundaria y terciaria de la ureasa de Coccidioides

posadasii por homología con la ureasa de Bacillus pasteuri” (81472), en las VII

Jornadas de Biomedicina y Biotecnología Molecular “Dr. Guillermo Carvajal

Sandoval” del 24 al 27 de Marzo de 2009, en la Escuela Nacional de Ciencias

Biológicas del IPN, México D.F.

Constancia. Participación como COORDINADORA del curso monográfico “La investigación en

medicina” en el marco del Verano de la Investigación Científica 2009, de la Academia

Mexicana de Ciencias y el programa Delfín. Del 6 de Julio al 14 de Agosto de 2009, en

el Instituto Nacional de Neurología y Neurocirugía “Manuel Velasco Suarez”. México

D.F.

Constancia. Participación como PONENTE del curso monográfico “La investigación en

medicina” en el marco del Verano de la Investigación Científica 2009, de la Academia

Mexicana de Ciencias y el programa Delfín. Del 6 de Julio al 14 de Agosto de 2009, en

el Instituto Nacional de Neurología y Neurocirugía “Manuel Velasco Suarez”. México

D.F.

48

12. REFERENCIAS.

1. Fisher MC, Koenig GL, White TJ and Taylor JW. Molecular and phenotypic description of

Coccidioides posadasii sp. nov., previously recognized as the non-California population of

Coccidioides immitis. Mycologia. 2002; 94:73-84.

2. Bowman HB, White JT, and Taylor WJ. Human pathogenic fungi and their close nonpathogenic

relatives. Molecular Phylogenetics Evolution. 1996; 6:89-96.

3. Fisher MC, Koenig GL, White TJ, San-Blas G, Negroni R, Gutiérrez-Alvarez I, Wanke B and

Taylor JW. Biogeographic range expansion into South America by Coccidioides immitis mirrors

New World patterns of human migration. Proceedings of the National Academy of Science. 2001;

98(8): 4558-4562.

4. Castañón OLR, Aroch CA, Bazán ME y Córdova ME. Coccidioidomicosis y su escaso

conocimiento en nuestro país. Revista de la Facultad de Medicina, UNAM. 2004; (47)4:145-148.

5. Stevens AD. Coccidioidomycosis. The New England Journal of Medicine. 1995; 332(16): 1077-

1082.

6. Huppert M and Sun SH. 1980. Mycological diagnosis of coccidioidomycosis, p. 47-61. In D. A.

Stevens (ed.), Coccidioidomycosis: A Text. Plenum Medical Book Company, New York, NY.;

Ampel, N. M., C. L. Dols, & J. N.

7. Ampel MN, Dols LC, and Galgiani NJ. Coccidioidomicosis during human immunodeficiency

virus infection: results of a prospective study in a coccidiodal endemic area. The American Journal

of Medicine. 1993; 94(3): 235-240.

8. Arenas R. 2005. Coccidioidomicosis, p 155-162, En R Arenas. Micología Médica ilustrada. (2ª

edición). Mc Graw Hill.

9. Muñoz-Hernández B, Martínez-Rivera MA, Palma Cortés G, Tapia-Díaz A and Manjarrez Zavala

ME. Mycelial forms of Coccidioides spp. in the parasitic phase associated to pulmonary

coccidioidomicosis with type 2 diabetes mellitus. European Journal of Clinical Microbiology &

Infectious Diseases. 2008; 27(9):813–820.

10. Saubolle AM, McKellar PP and Sussland D. Epidemiologic, clinical, and diagnostic aspects of

coccidioidomycosis. Journal of Clinical Microbiology. 2007; 45: 26-30.

11. Kirkland TN and Fierer J. Coccidioidomycosis: a reemerging infectious disease. Emerging

infectious diseases 1996; 2(3):192-199.

12. Kleinschmidt-DeMasters BK and Mazowiecki M. Coccidioidomycosis meningitis with massive

dural and cerebral venous trombosis and tissue arthroconidia. Archives of Pathology &

Laboratory Medicine. 2000; 124(2):310-314.

49

13. Kolivras KN and Comrie AC. Modeling valley fever (coccidioidomycosis) incident on the basis of

climate conditions. International Journal of Biometeorology. 2003; 47(2):87-101.

14. Castañeda GR y Laniado LR. Coexistencia de tuberculosis y coccidioidomicosis. Presentación de

dos casos clínicos. Revista del Instituto Nacional de Enfermedades Respiratorias. 2002; 15(2): 98-

101.

15. Hurtado-Montalvo JA, Cerecer-Callu P y Esquer-Zamorano RA. Diagnóstico diferencial de

coccidioidomicosis y tuberculosis en él niño. Enfermedades Infecciosas y Microbiología. 1999;

19(4): 181-186.

16. Perea S and Patterson TF. Endemic Mycoses. In: EJ Anaissie, McGinnis MR, Pfaller MA. Clinical

Mycology. Philadelphia: Elsevier Science 2003. 352-369.

17. Pappagianis D. Coccidioides immitis. In: Ajello L, Hay RJ. Microbiology and microbial

infections vol 4. 9th Edic. Nueva York: Oxford University Press 2001: 357-72.

18. Ayala-Gaytán JJ, Condarco-Cortés BA, Pérez-Zuno JA y Moreno- Guevara P. El fluconazol en la

coccidioidomicosis meníngea. Revista de Investigación Clínica. 1997; 49(3): 205-208.

19. Aguilar JA, Summerson C, Granada MC, Jiménez C y De la Torre S. Pericarditis por

coccidioidomicosis. Informe de un caso. Archivos de Cardiología de México. 2001; 71: 313-318.

20. Smith CE, Beard RR, Rosenberger HG and Whiting EG. Effect of season and dust control on

coccidioidomycosis. Journal of American Medical Association. 1946; 132(14): 833-838.

21. Pappagianis D. Epidemiology of Coccidioidomycosis. Current Topics in Medical Mycology.

1988; 2:199-238.

22. Galgiani JN. Coccidioidomycosis: A regional disease of national importance. Rethinking our

approaches to its control. Annals of Internal Medicine. 1999; 130: 293-300.

23. Ampel NM, Mosely DG, England B, Vertz PD and Komatsu K. Coccidioidomycosis in Arizona:

Increase in incidence from 1990 to 1995. Clinical Infectious Disease. 1998; 27: 1528-1530.

24. Pappagianis D. 1980. Epidemiology of Coccidioidomycosis, p. 63- 86. In Stevens DA (ed.),

Coccidioidomycosis. Plenum Medical Book Co, New York, NY.

25. Calderón GAL, Piña OK, Leal MAM y López CA. Mortalidad por coccidioidomicosis: estudios

de casos de autopsia en un hospital de referencia en Nuevo León. RESPYN, Edición Especial

No.1 – 2003.

26. Chaturvedi V, Ramani R, Gromadzki S, Rodeghier B, Chang HG and Morse DL.

Coccidioidomycosis in New York State. Emerging Infectious Disease. 2000; 6: 25-29.

27. Stewart EA and Meyer KF. Isolation of Coccidioides immitis (Stiles) from the soil. Proc. Society

Experimental Biology and Medicine. 1932; 29: 937-938.

50

28. Maddy K. 1957. Ecological factors possible relating to the geographic distribution of Coccidioides

immitis. In Proceedings of the Symposium on Coccidioidomycosis. U.S. Public Health Serv Public

Nº 575, pp 144-157.

29. Negroni P. 1966. Las Blastomicosis y Coccidioidomicosis, p. 133-145; 234-257. In Comisión de

Investigación Científica Micosis Profundas. Gobernación, Argentina., Provincia de Buenos Aires,

Buenos Aires, Argentina.

30. Espinal LS and Montenegro E. 1963. Formaciones vegetales de Colombia. Memoria explicativa

sobre el mapa ecológico. Inst Geogr Agustin Codazzi, Bogotá D.C.

31. Purtillo DT, Walsh GP, Storrs EE and Gannon C. The immune system of the nine-banded

armadillo (Dasypus novemcinctus). Anatomical Record. 1975; 181: 725-734.

32. González OA. 1967. Coccidioidomycosis in Mexico, p. 293- 301. In L. Ajello (ed.), The second

symposium on coccidioidomycosis. The University of Arizona Press, Tucson, AR.

33. Padua-Gabriel A, Martínez-Ordaz VA, Velasco- Rodriguez VM, Lazo-Saenz JG and Cicero R.

Prevalence of skin reactivity to coccidioidin and associated risk factors in subjects living in a

northern city of Mexico. Archives of Medical Research. 1999; 30: 388-392.

34. Negroni P. 1967. Coccidioidomycosis in Argentina, p. 273-278. In L. Ajello (ed.), The second

symposium on coccidioidomycosis. The University of Arizona Press, Tucson, Arizona.

35. Eulálio KD, Macedo RL and Cavalcanti MA. Coccidioides immitis isolated from armadillos

(Dasypus novemcinctus) in the sate of Piaui, northeast Brazil. Mycopathologia. 2001; 149: 57- 61.

36. Sidrim JJC, Silva LCI, N. JMA, Rocha MFG and Paixao GC. Le Nor-Este brésilien, region

d’endémie de coccidioidomycose? A propos d’une micro-épidemie. Journal de Mycologie

Médicale. 1997; 7: 37-39.

37. Wanke B, Lazera M, Monteiro PC, Lima FC, Leal MJ, Ferreira-Filho PL, Kaufman L, Pinner RW

and Ajello L. Investigation of an outbreak of endemic coccidioidomycosis in Brazil’s northeastern

state of Piaui with review of the occurrence and distribution of Coccidioides immitis in three other

Brazilian states. Mycopathologia. 1999; 148: 57 67.

38. Robledo M, Restrepo A, Restrepo M, Ospina S y Gutiérrez F. Encuesta epidemiológica sobre

Coccidioidomicosis en algunas zonas áridas de Colombia. Antioquia Méd. 1968; 18:505-522.

39. Vélez A, Robledo M, Tobón AM, Gómez CI, Upegui JJ, Hincapíe MI, Moncada LE, Arango M y

Restrepo A. Coccidioidomicosis pulmonar. Informe de un caso autóctono. Medicina UPB. 1997;

16:97-108.

40. Galgiani NJ, Ampel MN, Catanzaro A, Johnson RH, Stevens DA and Williams PL. Practice

guideline for the treatment of coccidioidomycosis. Infectious Diseases Society of America.

Clinical Infectious Disease. 2000; 30(4): 658-661.

51

41. Muñoz HB, Castañón LR, Calderón I, Vázquez ME and Manjarrez ME. Parasitic mycelial forms

of Coccidioides species in mexican patients. Journal of Clinical Microbiology. 2004; 42(3): 1247-

1249.

42. Toriello C, Reyes-Montes R y Taylor ML. Producción de antígenos fúngicos autóctonos en el

inmunodiagnóstico de micosis en México. Revista de Investigación Clínica. 1997: 49: 501-505

43. Park DW, Sohn JW, Cheong HJ, Kim WJ, Kim MJ, Kim JH and Shin C. Combination therapy of

disseminated coccidioidomycosis with caspofungin and fluconazole. BMC Infectious Diseases.

2006.; 15:6-26.

44. González GM, Tijerina R, Najvar KL, Bocanegra R, Rinaldi GM and Graybill JR. Efficacies of

amphotericin B (AMB) Lipid complex, AMB colloidal dispersion, liposomal AMB, and

conventional AMB in treatment of murine coccidioidomycosis. Antimicrobial Agents and

Chemotherapy. 2004; 48(6): 2140-2143.

45. Proia AL and Tenorio RA. Successful use of voriconazole for treatment of coccidioides

meningitis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 2004. 48(6): 2341.

46. Cortez KJ, Walsh TJ and Bennett JE. Successful treatment of coccidioidal meningitis with

voriconazole. Clinical Infectious Disease. 2003; 36: 1619-1622.

47. Deresinski SC. Coccidioidomycosis: efficacy of new agents and future prospects. Current Opinion

in Infectious Disease. 2001; 14(6): 693-696.

48. Clemons VK, Capilla J and Stevens DA. Experimental animal models of coccidioidomycosis.

Annals of New York Academy of Science. 2007; 1111:208-224.

49. Lawrence RM, Huston AC and Hoeprich PD. Reproducible method for induction of pulmonary

coccidioidomycosis in mice. Journal of Infectious Disease. 1977; 13:117-119.

50. Clemons VK, Leathers RC, and Lee WK. Systemic Coccidioides immitis Infection in Nude and

Beige Mice. Infection and Immunity. 1985; 47(3):814-821.

51. Viriyakosol S, Fierer J, Brown DG and Kirkland NT. Innate immunity to the pathogenic fungus

Coccidioides posadasii is dependent on toll-like receptor 2 and Dectin-1. Infection and Immunity.

2005; 73(3): 1553-1560.

52. Laniado-Laborín R. Coccidioidomycosis and other endemic mycoses in Mexico. Revista

Iberoamericana de Micología. 2007; 24: 249-258.

53. Meyer PR, Hui AN, and Biddle M. Coccidioides immitis meningitis with arthroconidia in

cerebrospinal fluid: report of the first case and review of the arthroconidia literature. Human

Pathology. 1982; 13:1136–1138.

54. Nosanchuk JD, Snedeker J, and Nosanchuk JS. Arthroconidia in coccidioidoma: case report and

literature review. International Journal of Infectious Disease. 1998; 3:32–35.

52

55. Kamberi P, Sobel AR, Clemons VK, Stevens AD, Pappagianis D, and Williams LP. A Murine

Model of Coccidioidal Meningitis. The Journal of Infectious Diseases. 2003; 187:453–460.

56. Fierer J, Walls L, Eckmann L, Yamamoto T and Kirkland NT. Importance of Interleukin-10 in

Genetic Susceptibility of Mice to Coccidioides immitis. Infection and Immunity. 1998; 66(9):

4397–4402.

57. Hernández PR, Orozco EH, Aguilar LD, López CF and Rook G. Inmunopatología de la

tuberculosis pulmonar experimental. Mensaje Bioquímico. 2004; 28:129-153.

58. Cox RA and Magee DM. Coccidioidomycosis:Host Response and Vaccine Development. Clinical

Microbiology Reviews. 2004; 17(4): 804-839.

59. Shubitz FL, Dial MS, Perrill R, Casement R, and Galgiani NJ. Vaccine-Induced Cellular Immune

Responses Differ from Innate Responses in Susceptible and Resistant Strains of Mice Infected

with Coccidioides posadasii. Infection and immunity. 2008; 76(12): 5553-5564.

60. Kirkland NT and Fierer J. Inbred Mouse Strains Differ in Resistance to Lethal Coccidioides

immitis Infection. Infection and Immunity. 1983; 40(3): 912-916.

61. Drutz JD, Huppert M, Sun HS and McGuire LW. Human Sex Hormones Stimulate the Growth

and Maturation of Coccidioides immitis. Infection and Immunity. 1981; 32(2):897-907.

62. Castañon Olivares LR, Gëreña-Elizalde D, González-Martínez MR, Licea Navarro AF, González-

González GM and Aroch-Calderón A. Molecular identification of Coccidioides isolates from

Mexican patients. Annals of New York Academic of Science. 2007; 1111:326-335.

63. Wiebe BM, Stenderup J, Grode GW and Jacobsen GK. Pulmonary coccidioidomycosis. Ugeskrift

of Laeger. 1993. 331;155(22):1722-1723.

64. Ace Animals, Inc. & Media Fusion Technologies Inc. Copyright © 2006. Características del ratón

BALB/c. http://www.aceanimals.com/BalbC.htm Consultado el 19 de diciembre de 2009.

65. Chiller MT, Galgiani NJ and Stevens AD. Coccidioidomycosis. Infectious Disease Clinics of

North America. 2003. 17; 41-57.

66. O’Hern EM and Henry BS. A citologycal study of Coccidioides immitis by electron microscopy.

Journal of Bacteriology. 1956. 72(5):632-45.

http://www.aceanimals.com/BalbC.htm

Coccidioidomicosis sistémica: Desarrollo de un modelo ...

Documents

Transcript of Coccidioidomicosis sistémica: Desarrollo de un modelo ...