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COLEGIO DE POSTGRADUADOS
INSTITUCIÓN DE ENSEÑANZA E INVESTIGACIÓN EN CIENCIAS AGRÍCOLAS
CAMPUS MONTECILLO
POSTGRADO DE RECURSOS GENÉTICOS Y PRODUCTIVIDAD
GANADERÍA
EFECTO DE UNA FITASA EN VARIABLES in vitro Y PRODUCTIVAS DE CORDEROS CRIOLLOS EN FINALIZACIÓN ALIMENTADOS CON
UNA DIETA ALTA EN SORGO
GERMÁN BUENDÍA RODRÍGUEZ
TESIS
PRESENTADA COMO REQUISITO PARCIAL PARA OBTENER EL GRADO DE:
DOCTOR EN CIENCIAS
MONTECILLO, TEXCOCO, ESTADO DE MÉXICO
2009
AGRADECIMIENTOS
Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT). Por su apoyo económico
para realizar mis estudios de doctorado.
Al Colegio de Postgraduados, por las facilidades que me brindó para realizar mis
estudios de doctorado.
Al Dr. Sergio Segundo González Muñoz , por su apoyo, paciencia, amistad y por su
dedicación para dirigir esta tesis.
Al Dr. Germán David Mendoza Martínez , por su apoyo, amistad y por ser mí guía,
durante mis estudios de maestría y doctorado.
Al Dr. Juan Manuel Pinos Rodríguez, por su valiosa participación en la escritura del
artículo.
Al Dr. Emilio Manuel Aranda Ibáñez, por su colaboración para la realización de esta
tesis.
A la Dra. Luz María Melgoza Contreras, por sus consejos y apoyo para la realización
de esta tesis.
Al Dr. Luis Alberto Miranda Romero, por su apoyo y contribución para la realización
de esta tesis.
A la Dra. María Magdalena Crosby Galván , por su apoyo incondicional para realizar
los análisis de laboratorio.
Al Dr. José Ricardo Bárcena Gama , por participar en mi formación y por su
intervención en esta tesis.
Al Dr. David Hernández Sánchez , por su amistad y su cooperación para la realización
de esta tesis.
Al Dr. Ricardo Basurto Gutiérrez, por su comprensión, apoyo y sus valiosos consejos.
A mis amigos de Ganadería por los momentos agradables que compartimos.
i
DEDICATORIA
A mi esposa Karina, por su apoyo y comprensión, por estar a mi lado en todos
los momentos difíciles y por motivarme a ser mejor persona cada día.
A mi hijo Germán, por ser mi motivación para seguir adelante.
A mis padres Silvia y Enrique por motivarme a seguir preparándome y por su
apoyo incondicional.
A mis hermanos Martha Gabriela, Enrique y Emilio por su amistad y consejos.
A mi suegro José por su apoyo.
A mis amigos, Fernando, Octavio, Nicolas.
i
CONTENIDO
Página 1. INTRODUCCIÓN
2. REVISIÓN DE LITERATURA
2.1. Fuentes de fósforo
2.2. Fuentes de fósforo en alimentos
2.3. Contaminación por fósforo
2.4. Ácido fítico y fitatos
2.5. Biodisponibilidad de los fitatos
2.6. Fitasas
2.7. Fitasas exógenas
2.8. Fitasas vegetales
2.9. Fitasa ruminal
2.10. Uso de fitasa en especies pecuarias
3. OBJETIVO GENERAL
4. HIPÓTESIS
5. MATERIALES Y MÉTODOS
5.1. Localización
5.2. Análisis de laboratorio
5.3. Experimento in vivo
5.4. Análisis estadístico
6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
7. CONCLUSIONES
8. LITERATURA CITADA
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4
4
4
5
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45
LISTA DE CUADROS
Página
Cuadro 1. Composición (%) de las dietas experimentales en base seca.. 29
Cuadro 2. Efecto de la fitasa en variables productivas en corderos
criollos en finalización……………………………………………..
30
Cuadro 3. Ganancia de peso (g animal-1d-1) de corderos criollos en
finalización…………………………………………………………..
32
Cuadro 4. Consumo de materia seca (g animal-1 d-1) de corderos criollos
en finalización………………………………………………………
33
Cuadro 5. Conversión alimenticia de corderos criollos en finalización…... 34
Cuadro 6. Digestibilidad aparente e in vitro de la materia seca (%) de las
dietas para corderos criollos en finalización…………………….
36
Cuadro 7. Concentración (%) de fósforo, fibra detergente ácido (FDA) y
fibra detergente neutro (FDN) en muestras fecales de
corderos criollos en finalización…………………………………..
37
Cuadro 8. Concentración de fósforo (mg dL-1) en orina de corderos
criollos en finalización……………………………………………..
40
Cuadro 9. Concentración de fósforo (mg dL-1) en suero de corderos
criollos en finalización……………………………………………..
42
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Molécula de fitato……………………………………………….. 8
EFECTO DE UNA FITASA EN VARIABLES in vitro Y PRODUCTIVAS
DE CORDEROS CRIOLLOS EN FINALIZACIÓN ALIMENTADOS CON
UNA DIETA ALTA EN SORGO
Germán Buendía Rodríguez, Dr.
Colegio de Postgraduados, 2009
Hay poca información acerca de la utilización de fitasas en dietas para rumiantes; por
tanto, en el presente estudio se evaluó efecto de una fitasa (Natuphos5000G; BASF
Mexicana S. A. de C. V.) proveniente de Aspergillus niger (5000 FTU g-1), en
experimentos in vitro e in vivo con corderos. En el ensayo in vivo el diseño experimental
fue completamente al azar con cuatro tratamientos (0, 150, 300 y 450 g t-1 alimento) y 8
repeticiones por tratamiento. Se usaron 32 corderos Criollos (21.47 ± 2.24 kg PV)
alimentados con una dieta que contenía 70 % de grano de sorgo molido, y alojados en
jaulas metabólicas individuales. Los datos fueron analizados con el procedimiento
MIXED (SAS), y se compararon las medias de tratamientos usando Tukey. La
concentración de fitasa (0, 150, 300, 450 g enzima t-1) no afectó (p>0.05) la ganancia
diaria de peso (201, 220, 194, 198 g animal-1 d-1), consumo de alimento (995, 1166,
1078, 1149 g), conversión alimenticia (5.02, 5.39, 5.69, 6.03), rendimiento de la canal
(50.63, 52.84, 49.49, 49.51 %), ni la digestibilidad in vitro. Pero la adición de 450 g
enzima t-1 aumentó la digestibilidad aparente (62.40 %) y redujo la concentración de P
fecal (0.47 %) y sérica (9.03, 7.07, 6.28 y 6.94 mg dL-1) (p≤0.05), aunque no cambió
(p>0.05) la concentración de P en orina. Se concluye que la adición de fitasa no
modificó las variables productivas, pero disminuyó la concentración de P en heces.
PALABRAS CLAVE: corderos, enzima fitasa, grano sorgo, in vitro , productividad.
EFFECT OF A PHYTASE ON in vitro AND PERFORMANCE
VARIABLES OF FINISHING CRIOLLO LAMBS FED A DIET HIGH IN
SORGHUM
Germán Buendía Rodríguez, Dr.
Colegio de Postgraduados, 2009
There is little information about utilization of phytase on diets for ruminants; therefore, in
this work the effect of phytase (Natuphos 5000G, BASF Mexicana S.A. de C.V.) from
Aspergillus niger (5000 FTU g-1) was evaluated by means of in vitro and in vivo
experiments using lambs. For the in vivo trial the experimental design was completely
randomized with four treatments (0, 150, 300 and 450 g t-1 food) and 8 replicates per
treatment. Thirty two Criollo lambs (21.47 ± 2.24 kg BW) were individually fed a diet
containing 70% ground sorghum grain and housed in metabolic cages. The data were
analyzed using the procedure MIXED (SAS), and treatments means were compared
using Tukey. The concentration of phytase (0, 150, 300, 450 g enzyme t-1) did not affect
(p>0.05) daily gain (201, 220, 194, 198 g animal-1 d-1), food intake (995, 1166, 1078,
1149 g), feed conversion (5.02, 5.39, 5.69, 6.03), carcass yield (50.63, 52.84, 49.49,
49.51%), or in vitro digestibility. But the addition of 450 g t-1 enzyme increased apparent
digestibility (62.40%) reduced fecal P concentration (0.47%) and serum (9.03, 7.07,
6.28 and 6.94 mg dL-1) (p≤0.05), although it did not change (p>0.05) the concentration
of P in urine. It may be concluded that the addition of phytase did not affect productive
variables, but reduced the concentration of P in feces.
KEY WORDS: sheep, phytase enzyme, grain sorghum, in vitro, performance.
1
1. INTRODUCCIÓN
La biodisponibilidad del fósforo (P) es baja (30 a 40 %) en la mayoría de los
ingredientes utilizados en alimentación pecuaria porque una gran parte del elemento
está como ácido fítico (70 %), un componente poco utilizado por los no rumiantes
(Perney et al., 1993), debido a su escasa actividad fitásica. Así, en las dietas para no
rumiantes se usan suplementos con fuentes de fósforo inorgánico para cubrir las
necesidades del animal (Nelson et al., 1968).
Algunos cereales y leguminosas tienen altas concentraciones de proteína y
grasa pero contienen factores antinutricionales, como el ácido fítico que actúa como un
antinutriente debido a su capacidad para formar quelatos de minerales y secuestrar
proteínas por lo que disminuye la biodisponibilidad de proteínas y minerales
nutricionalmente importantes (Bing-Lan et al., 1998; El-Batal y Andel, 2001), junto con
la inhibición de enzimas como amilasa, tripsina, tirosinasa y pepsina (El-Batal y Abdel,
2001).
La incorporación de fitasa en dietas para rumiantes permitiría que una fracción
importante del fósforo fítico sea aprovechado en el tubo digestivo por hidrólisis del
compuesto, produciendo ortofosfatos inorgánicos y ésteres fosfóricos de alta
biodisponibilidad. Así se disminuye el uso de fosfatos inorgánicos y se reduce la
contaminación ambiental causada por el excedente de fósforo eliminado por las
excreciones. Hasta mediados de la década de 1980 las excretas tenían un valor
residual como fertilizante de las tierras de cultivo por su alto aporte de nitrógeno (N),
fósforo (P) y otros nutrientes, pero la intensificación de la producción y la concentración
2
de la ganadería en áreas específicas, junto con las nuevas normas de conservación del
ambiente, limitó esta vía de disposición de las excretas. La cantidad de estiércol a
esparcir en un campo de cultivo está limitada por la capacidad de las plantas para
extraer del terreno los minerales aportados por las excretas; un exceso sobre las
necesidades causa contaminación ambiental (Knowlton et al., 2004). Las materias
primas de origen vegetal contienen alrededor de dos tercios del P en forma de fitatos
cuya disponibilidad para no rumiantes es prácticamente nula. Por lo tanto, en
situaciones normales el P fítico consumido por el animal aparece en las heces casi
completo. Una vez en el terreno este P es liberado mediante la acción de las fitasas de
los microorganismos del suelo y pasa a ríos y lagos, causando eutrofización de las
corrientes de agua y de los reservorios acuáticos. En estas condiciones hay un
crecimiento acelerado de las algas y un agotamiento del contenido de oxígeno del agua
lo que provoca mortalidad de la fauna acuática. Así, la escasa disponibilidad del fósforo
fítico crea dos problemas al ganadero: la necesidad de un suplemento con P inorgánico
para las dietas, lo cual encarece el producto final y la excreción al medio de altas
cantidades de este macromineral. En los países desarrollados la legislación acerca del
ambiente tiende a penalizar este exceso y se han propuesto medidas en los Países
Bajos y otros países europeos (Jongbloed et al., 1996; Rodehutscord, 1998). Los
rumiantes especializados para producción de carne y leche en condiciones intensivas y
en estados fisiológicos de altos requerimientos aún en sistemas no intensivos
requieren, además del forraje, una alta proporción de alimento concentrado a base de
granos de cereales, oleaginosas y sus subproductos, para cubrir sus elevados
requerimientos nutricionales. Las dietas altas en concentrados contienen una gran
3
proporción del fósforo total (>70 %) en forma orgánica, como fitatos. rumiantes. Por lo
que el objetivo de esta investigación fue evaluar el efecto de una fitasa sobre variables
in vitro y productivas en finalización de corderos criollos alimentados con una dieta alta
en grano sorgo.
4
2. REVISIÓN DE LITERATURA
2.1. Fuentes de fósforo
Las fuentes de fósforo incluyen principalmente harinas de carne, pescado y
plumas, las fuentes vegetales (Summers, 1997) y las de origen geológico como los
fosfatos de calcio, naturales y procesados, de sodio, de amonio (mono y diamónico) y
el ácido fosfórico (Thompson, 1980). En las fuentes de origen vegetal el fósforo se
encuentra principalmente en forma de fitatos y ácido fítico, que representa
aproximadamente 50 a 80 % del P total del grano. El fósforo restante (20 a 30 %) forma
parte de fosfolípidos, fosfoproteínas y ácidos nucleicos (Oberleas, 1971; Ogawa et al.,
1975; Kirby y Nelson, 1988).
2.2. Fuentes de fósforo en alimentos
Según Eeckhout y De Paepe (1994), el contenido de fósforo total en granos de
cereales varía entre 0.27 y 0.37 %, mientras que para los subproductos es más elevado
(0.65 a 1.71 %); en las pastas de oleaginosas el P total varía de 0.53 a 1.0 %; el
contenido de P fítico en los cereales es 0.13 a 0.25 %, para los subproductos de
cereales 0.42 a 1.10 %; en las pastas de oleaginosas 0.18 a 0.44 %; la proporción de
fósforo fítico en relación al P total es en maíz (43 %), gluten de maíz (54 %) y en pastas
de oleaginosas (34 a 53 %).
La concentración de fósforo varía no sólo entre fuentes sino también dentro de
cada fuente. En materias primas de origen vegetal el contenido en P depende del tipo
de suelo, variedad cultivada, estado de maduración, condiciones de cultivo,
5
climatología, etc. (Ravindran et al., 1995). En los productos de origen animal, el nivel de
P varía en función del contenido en huesos por lo que es inferior pero más constante
en los subproductos derivados de la sangre o de la leche (McDowell, 1992). El nivel de
P en los suplementos minerales depende de múltiples factores como el material de
origen, proceso de fabricación y el grado de hidratación (Mateos y De Blas 1998). El
contenido en P de las materias primas utilizadas en la alimentación de especies
pecuarias presenta una amplia variación. En general, los forrajes de gramíneas tienen
un contenido superior a los de leguminosas y las semillas (granos de cereales,
leguminosas y oleaginosas) mayor que los forrajes. Los subproductos del procesado de
granos (salvados de trigo, gluten de maíz o harinas de oleaginosas) son especialmente
ricos en fósforo, mientras que tubérculos, raíces y bulbos son los más pobres. Los
productos lácteos y las materias primas de origen animal que incluyen parte del
esqueleto son los alimentos con mayores niveles de P (Eeckhout y De Paepe, 1994).
2.3. Contaminación por fósforo
En muchas regiones del mundo con producción pecuaria intensiva se monitorea
el potencial de contaminación de las unidades de producción; en otras se han
propuesto estrategias de manejo nutricional para evitar las pérdidas de nutrientes a los
cuerpos de agua y disminuir su potencial contaminante. El desarrollo de estrategias
nutricionales permite el cumplimiento de los estándares ambientales establecidos por la
Agencia Federal de Protección Ambiental (EPA, en inglés) y mejorar el manejo de
nutrientes en los hatos lecheros (Spears et al., 2003; Powers y Van Horn, 2001; Beede
y Davidson, 1999).
6
El fósforo junto con el nitrógeno son nutrientes que favorecen el desarrollo
vegetal, incluyendo el de las algas cianofitas en lagos y ríos (Satter, 2003), lo cual
contribuye a la eutrofización de las aguas (Komisarczuk et al., 1987b; Bravo y Meschy,
2003). Algunos lagos con un mínimo de 25 µg o más P L-1 agua, son considerados
como eutrofizados (Ekelund, 2003). Aunque el exceso de P no tiene efecto directo en la
salud humana, como la contaminación del agua debida a compuestos nitrogenados, sí
tiene efecto en los ecosistemas acuáticos disminuyendo la disponibilidad de O2 y
poniendo en riesgo el equilibrio ecológico. En algunos países la agricultura genera sólo
20 % de la contaminación por P, la actividad humana 60 % y la industria 20 % (Hénin y
Sebillote, 1990). El uso de fertilizantes fosfatados en la producción de cultivos es otra
fuente de contaminación para los cuerpos acuícolas, mientras que el manejo
inadecuado de las excretas animales en las producciones pecuarias contribuye al
depósito de P en el suelo (Ekelund et al., 2003; Satter, 2003).
El crecimiento demográfico y la urbanización han contribuido a la intensificación
de la producción (mayor número de animales por unidad de superficie) y han
disminuido las áreas de cultivo donde se depositaban excretas. Esto ha causado la
aplicación de excretas en cantidades superiores a las utilizadas por los cultivos,
aumentando en ocasiones el contenido de P en suelo; el agua de riego o de la lluvia
puede arrastrar el mineral, con su consecuente acumulación en el suelo y en los
cuerpos de agua (Satter, 2003).
La aplicación del estiércol de los animales como fuente de nutrimento a los
cultivos es una recomendación para reciclar los nutrientes; este reciclado, realizado
7
correctamente, disminuye las pérdidas de los nutrientes al agua y la atmósfera. Por el
contrario, el mal manejo del estiércol puede generar un problema ambiental mayor. La
aplicación de los residuos orgánicos de la unidad de producción en exceso de los
requisitos de extracción de P por los cultivos ha ocasionado una sobrecarga de
nutrientes en el suelo (Combs y Peters, 2000; Bundy, 1998).
2.4. Ácido fítico y fitatos
El fitato, inhibidor de la absorción de hierro puede ser degradado por la fitasa.
Los efectos de dos formas de fitasa, fitasa de cereal y fitasa microbial de Aspergillus
niger sobre la absorción de hierro, han sido investigados. El análisis de los resultados
sugiere que la degradación efectiva y completa del fitato ocurre en el intestino del pollo
cuando la fitasa de Aspergillus niger incrementó la disponibilidad de fósforo del
alimento para animales no rumiantes por relación del fosfato a su sustrato ácido fítico
(Bing-Lan et al., 1998).
El ácido fítico se forma por la esterificación del alcohol inositol cíclico con un
máximo de seis grupos de ácido fosfórico, mio-inositol cíclico hexafosfato (Figura 1;
Thompson, 1986). Según la nomenclatura química es llamado Mio-inositol 1,2,3,4,5,6-
Hexakis; C6H18O24P6, PM=659.86 (Oberleas, 1971). Es un compuesto esencial de los
granos (cereales y leguminosas); sin embargo, los fitatos pueden limitar la
disponibilidad de los minerales, principalmente, calcio, magnesio, zinc, hierro y cobre
(Pointillart, 1994).
8
Figura 1. Molécula de fitato.
La molécula de fitato presenta una proporción elevada de fósforo (28.2 %), y seis
radicales de ácido fosfórico con una afinidad variable por los cationes Fe, Ca, Mn, Co,
Cu y Zn (Erdman, 1979). Los fitatos naturales son principalmente los de Mg y K,
compuestos más solubles que los fitatos de Ca, Fe y Zn. Una molécula de ácido fítico
puede unir de 3 a 6 moles de calcio, formando fitatos insolubles a pH intestinal, por lo
cual el P y Ca no están disponibles en el intestino.
El ácido fítico representa una reserva de fósforo y de glúcidos utilizados por la
planta durante la germinación, por lo que el ácido fítico o los fitatos de Na, K y Mg
deben ser hidrolizados para liberar ortofosfatos e inositol, proceso donde la enzima
responsable es una fosfatasa ácida, la fitasa (EC 3.1.3.8). La desfosforilación del ácido
fítico (IP6) produce inositol-5 fosfato (IP5), -4 fosfato (IP4), -3 (IP3), -2 (IP2), -1 fosfato
(IP1).
En los granos casi todo el ácido fítico se encuentra como IP6. En los cereales, el
ácido fítico está asociado a las estructuras parietales del grano: en el arroz y el trigo los
9
principales sitios de acumulación son el germen y en las envolturas (pericarpio, testa y
aleurona) de los granos, mientras que en el maíz se encuentran esencialmente en el
germen, en las leguminosas (dicotiledóneas) el ácido fítico se concentra en los
cotiledones asociado con proteínas (Yoon et al., 1996).
En el salvado de arroz hidrolizado se encontró una enzima que cataliza la
hidrólisis del ácido fítico a inositol y ácido ortofosfórico; los principales productos finales
de la acción de la fitasa son ácido fosfórico y mio-inositol, pero los fosfatidilinositoles
representan varios grados de desfosforilacion de inositol hexakisfosfato a inositol que
son generados como intermediarios, o en algunos casos como productos finales (Bing-
Lan et al., 1998). El contenido de fósforo total en granos de cereales y oleaginosas, a
pesar de ser relativamente elevado, es de baja disponibilidad para los no rumiantes por
el alto contenido (50-85 %) de fósforo fítico (Eeckhout, 1994).
2.5. Biodisponibilidad de los fitatos
En las fuentes vegetales el fósforo presente en la molécula de fitato es de baja
disponibilidad para los no rumiantes, lo cual está relacionado principalmente con la
forma química del elemento, la proporción de otros minerales y nutrientes en la dieta
(proteína y energía) y la especie animal (De Groote, 1983). La hidrólisis del ácido fítico,
en granos y polen de plantas altas, a mio-inositol y ácido fosfórico es muy importante
en los procesos metabólicos en muchos sistemas biológicos. Esta desfosforilación de
fosfato inositol libre o ligado es principalmente influenciado por la fitasa. La fitasa tiene
una amplia distribución en plantas, tejidos animales y microorganismos; en plantas, la
10
fitasa está presente en cereales y leguminosas, y varias especies de granos y polen
(El-Batal y Abdel, 2001).
En la naturaleza, la molécula de fitato puede presentar diferentes tipos de
uniones: proteína-almidón, catión-proteína, catión-almidón (Thompson, 1986). En el
caso de los cationes, el fitato no digerido precipita el calcio y otros cationes, impidiendo
su absorción (Maynard y Loosli, 1969). Forman complejos no solamente con cationes
divalentes sino también con proteínas, haciéndola poco soluble en soluciones acuosas,
la formación de complejos fitato-proteína depende del pH y de la concentración de los
iones metálicos del medio (Thompson, 1986). El ácido fítico se une primero con grupos
terminales α-amino, seguido por grupos β-amino de los aminoácidos lisina e histidina
(Lathia y Koch 1989).
Con relación a la especie animal, la biodisponibilidad del fósforo de los alimentos
en el caso de los no rumiantes es variable, dependiendo de la proporción de fósforo
fítico, de la solubilidad de los fitatos y del aporte asociado de fitasas vegetales y
digestivas (intrínsecas y microbianas) que permiten hidrolizarlo (Pointillart, 1991).
2.6. Fitasas
Las fitasas digestivas e intrínsecas son enzimas que degradan el fósforo fítico
produciendo ortofosfatos inorgánicos, ésteres fosfóricos y mio-inositol, lo que permite
que una mayor fracción del fósforo orgánico sea transformada en una forma
aprovechable para el animal. Consecuentemente, para comprender mejor la utilización
del fósforo fítico presente en granos de cereales en dietas para aves, se caracterizó
11
químicamente el fósforo y la actividad fitásica intrínseca en granos de cereales (trigo,
maíz y sorgo), la actividad fitásica endógena en el intestino delgado de las aves y la
absorción del fósforo de las dietas en aves alimentadas con diferentes cereales
(Hernández et al., 2006).
La fitasa o mio-inositol hexakisfosfato fosfohidrolasa está en muchos tejidos de
plantas (El-Batal y Abdel, 2001). Además el fitato constituye 1 a 4 % del peso de los
cereales y usualmente va de 60 a 90 % del fósforo total. Las fitasas pueden ser
derivadas de varias fuentes como plantas, animales y microorganismos. Se ha
observado que las fuentes microbianas son más prometedoras para la producción
comercial de fitasas y en alimentos basados en cereales (De Angelis et al., 2003).
La importancia de las fitasas en la alimentación de no rumiantes se relaciona con
la eliminación de los efectos antinutricionales del ácido fítico por hidrólisis del
compuesto y a la mejor utilización del fósforo presente como fitatos, lo que reduce la
incorporación de fuentes inorgánicas del elemento en las dietas para aves,
disminuyéndose sustancialmente la contaminación ambiental (Denbow et al., 1995).
La actividad de la enzima se expresa en unidades de fitasa y se define como la
cantidad de enzima que libera 1 µmol P inorgánico min-1 de 5.1mM de fitato de sodio, a
un pH de 5.5 y 37 ºC (NRC, 1994). El número de unidades de fitasa (UFT) requeridas
para reemplazar 1 g de fósforo inorgánico varía considerablemente con la forma
química del compuesto, composición de la dieta, edad y estado fisiológico del animal
(Schoner et al., 1993; Kornegay et al., 1996; Yi et al., 1996a,b; Kornegay et al., 1997).
12
2.7. Fitasas exógenas
Las fitasas sintéticas que hidrolizan ácido fítico, al igual que las intrínsecas de
los vegetales, son llamadas fitasas (Mio-inositol hexafosfato hidrolasa). Son
fosfomonoesterasas capaces de hidrolizar el ácido fítico (mio-inositol 1, 2, 3, 4, 5, 6
hexakisfosfato) produciendo ortofosfatos inorgánicos y una pequeña proporción de
esteres fosfóricos, pentafosfato a monofosfato, como productos intermediarios, y
finalmente a mio-inositol libre (Nayini y Markakis, 1986; Lasztity y Lasztity, 1988;
Harland y Morris, 1995). La IUPAC-IUB (1976) ha reportado la 3-fitasa (EC 3.1.3.8), la
cual hidroliza primero la posición 3 del mio-inositol a 1, 2, 4, 5, 6-pentakisfosfato,
aislada en animales y microorganismos (Reddy et al., 1982; Lasztity y Lasztity, 1988).
Las fitasas microbianas son usadas para reducir el contenido de acido fítico y se
ha probado la capacidad de varios microorganismos para producir fitasa; algunos de
ellos se usaron en la reducción del contenido de acido fítico en harina de soya y harina
maíz durante un estado sólido de fermentación (El-Batal y Abdel, 2001). Las fitasas
exógenas se han encontrado en microorganismos como hongos (Aspergillus sp),
levaduras (Saccharomyces cerevisae) y bacterias (Bacillus subtilis, Pseudomonas). Las
fitasas obtenidas del Aspergillus sp siguen un orden para la hidrólisis de fitato, es decir,
después de liberar el fosfato de la posición 3, continúa en el 4, 5, 6 y 2 (Venekamp et
al., 1995). La fitasa producida por el Aspergillus ficuumm es una glicoproteína
purificada, con una actividad enzimática que varía con la temperatura y cambios de pH;
la temperatura óptima de la enzima es 60 a 70 ºC, pero a 68 ºC durante 10 min, la
actividad se reduce 60 %. Las enzimas de Aspergillus niger son termoestables,
13
resistentes al proceso de peletización y su actividad mínima es 5000 FTU g-1 (Nasi,
1990). Las enzimas tienen actividad a pH 2.5 y 5.5, siendo 40 % menos efectiva a pH
2.5. Es importante debido a que la mayor absorción de fósforo ocurre en las
proximidades del intestino delgado, donde el pH 5.5 es óptimo para que la fitasa
hidrolice los fosfatos y es necesario que la enzima se active en el medio ácido (pH 2.5)
del estómago (Power y Khon, 1993).
La fitasa puede incrementar el uso de fósforo fítico (Qian et al., 1997; Yi et al.,
1996a,b; Carlos et al., 1998; Maenz y Classen, 1998; Pan et al., 1998; Denbow et al.,
1998). El uso de fitasa (400, 800, ó 1200 U kg-1) en una dieta baja en fósforo aumentó
linealmente la ganancia de peso, el contenido de cenizas del hueso del dedo, la
resistencia a la ruptura de las tibias y mejoró la digestibilidad del fósforo en aves
(Nelson et al., 1971; Denbow et al., 1995; Kornegay et al., 1996; Yi et al., 1996). En
estos experimentos se observó que se requieren 821 U kg-1 de fitasa para reemplazar
un gramo de fosfato inorgánico como fosfato desfluorinado, en términos de ganancia de
peso y porcentaje de cenizas.
Simons et al. (1990) usaron fitasa (750 U kg-1) en una dieta maíz-soya para
pollos, con lo cual aumentó la disponibilidad de fósforo y calcio a 62 % y disminuyó la
excreción de fósforo fecal y urinario (2 g kg-1 MS). En pollos de engorda alimentados
con una dieta maíz-soya (0.38 % P disponible), y 500 U kg-1 de fitasa, se mejoró la
resistencia a la ruptura de tibia, sin cambios en el consumo y ganancia de peso (Perney
et al., (1991). Estos resultados fueron similares a los reportados por Edwards (1993)
14
quien observó una baja respuesta debido a la baja concentración de la fitasa en dietas
deficientes de fósforo.
2.8. Fitasas vegetales
La mayoría de los componentes alimenticios de origen vegetal tienen actividad
fitásica intrínseca variable. Así, la actividad fitásica en ingredientes comunes,
expresada en U kg-1, es: trigo 1200, centeno 2700, triticale 1100, cebada 580, arroz
120, maíz 12, sorgo 24, soya 31 y avena 42 (Eeckhout, 1994). Es importante verificar si
es necesario incorporar fitasas microbianas, o si se obtiene el mismo resultado
mezclando ingredientes vegetales que tengan alto contenido de fitasas. En cerdos
alimentados con dietas bajas (maíz-soya) o altas (salvado de centeno) en fitasas, sin
fósforo inorgánico, hubo deficiencias de fósforo sólo en los cerdos que consumieron la
dieta maíz-soya; el fósforo absorbido (55 vs 36 %) y el retenido (50 vs 36 %) fue mayor
en la dieta con fitasas (salvado de centeno) que la dieta testigo (Pointillart 1991).
Se ha encontrado fitasa en arroz, trigo, maíz, soya, lechuga, frijoles enanos,
alubias, centeno, leguminosas y oleaginosas, pero sólo la fitasa de cotiledones de trigo,
alubias y soya se ha purificado, homogenizado y caracterizado. En la germinación de
granos o polen, la fitasa puede degradar la fitina. El incremento en la actividad de la
fitasa es concomitante con una disminución del ácido fítico durante la germinación; sin
embargo, si se eleva la actividad de la fitasa se debe a la activación de la enzima
preexistente o a la síntesis de la proteína de novo (El-Batal y Abdel, 2001).
15
En granos de cereales y oleaginosas la actividad fitásica, expresada como
porcentaje de la actividad total, se encuentra principalmente en la aleurona (39.5 %) y
en el endospermo (34.1 %); la actividad restante se ubica en el escutelo (15.3 %), testa
(4.8 %), germen (2.9 %) y capas epidérmicas (1.9 %). Son fosfomonoesterasas,
llamada también 6-fitasas (EC 3.1.3.26), por comenzar la hidrólisis del mioinositol en el
fosfato en posición 6.
Las fitasas son extremadamente débiles expresando su máxima actividad a pH
de 5.0 a 7.5. Pero el pH (2 a 3) en el estómago limita su actividad con un pH menor de
3.0; por tanto, hay una ruptura considerable de la molécula de fitato de la dieta en el
buche de los pollos y en estómago de no rumiantes, antes de que la secreción gástrica
baje el pH de la ingesta a un nivel que interrumpa la actividad enzimática (Simons et
al., 1992). La enzima es fuertemente inhibida por exceso de substrato (fitato) y
producto (fósforo inorgánico), y por altas temperaturas (Power y Khon, 1993).
La actividad fitásica en el intestino se encontró por primera vez en ratas; luego
se comprobó que dicha actividad está en la mucosa del duodeno de cerdos, conejos,
becerros y pollos (Bitar y Reinhold, 1972), con la forma de meso-inositol-hexafosfato
fosfohidrolasa. El uso de fitasa como suplemento es una forma para incrementar la
disponibilidad de fósforo en dietas basadas en granos para animales y, además, para
reducir la contaminación con fosfato en el ambiente (Xiao-Yun et al., 2004).
Hay controversia en relación a si la fitasa es una enzima independiente o si su
actividad se atribuye a una fosfatasa alcalina, que también hidroliza el ácido fítico. Las
enzimas son dependientes de Mg o Zn, tienen el mismo pH óptimo y son modificadas
16
por la presencia de vitamina D3 o por baja concentración de fósforo en la dieta. Según
Bitar y Reinhold (1972), la fitasa y fosfatasa alcalina son enzimas independientes; una
proteína purificada de la mucosa intestinal de ratas mostró actividad de fitasa y de
fosfatasa pero con propiedades diferentes, sugiriendo dos diferentes sitios activos en
una misma enzima, por lo que es probable que la fitasa y la fosfatasa alcalina sean
partes de una misma estructura. La fosfatasa alcalina tiene mayor actividad que la
fitasa: 50 a 200 veces en cerdos, 50 a 100 en aves y 1000 en humanos; la rata tiene
una fuerte actividad fitásica (30 mg-1 U mg-1) de proteína de la mucosa del intestino,
mientras que, en aves la actividad de la enzima es mínima (Pointillart, 1994).
La actividad de la fitasa es influenciada por factores genéticos y nutricionales y
hay diferencias en el uso de fósforo fítico entre especies y entre razas: mayor actividad
de la fitasa en la rata que en el conejo; uso de fósforo fítico de 7, 37 y 44 % en aves,
cerdos y ratas; en gallinas ponedoras hay mayor retención de fósforo fítico que en pollo
de engorda con dietas deficientes en P, mostrando un efecto de la edad sobre la
actividad de la enzima (Edwards et al., 1983). Pollos jóvenes tienen una capacidad
limitada para hidrolizar fitatos, pero aumenta con el incremento de la edad. Los fitatos
son hidrolizados en el tubo intestinal por las fitasas de las células de la mucosa pero
también por las enzimas en la microflora y las diferencias entre especies o edades
pueden deben a la actividad fitásica bacterial (Wise, 1983).
17
2.9. Fitasa ruminal
Las fitasas exógenas se han encontrado en microorganismos ruminales como
Selenomonas ruminantium, Megasphaera elsdenii, Prevotella ruminicola, Mitsuokella
multiacidus, Treponema spp., así como Saccharomyces cerevisae, Aspergillus spp.,
Bacillus subtilis y Pseudomonas spp. (Yanke et al., 1998). Schwanniomyces castellii,
una cepa de levadura, hidroliza 90 a 95 % del P fítico en salvado de trigo y harina de
semilla de algodón (Sequeilha et al., 1993). Estas enzimas pueden hidrolizar el ácido
fítico de los vegetales y granos produciendo ortofosfato inorgánico y mioinositol libre,
por lo cual el P queda disponible para la absorción en el intestino delgado.
La tasa de degradabilidad in vitro del fitato fue 90 % del P en trigo, harina de
soya y subproductos de destilería, y el ácido fítico desapareció luego de 6 a 8 h de
incubación; el P fítico de la semilla de algodón desapareció entre 12 a 24 h de
incubación (Morse et al., 1992a). En 13 vacas Holstein consumiendo una dieta con 38.3
y 42.6 g P fítico d-1, 98 % fue hidrolizado a P inorgánico (Morse et al., 1992b, Clark et
al., 1986). En becerros de 1 a 6 semanas de edad que consumieron 0.83 kg d-1 de
concentrado y 4.1 L d-1 de leche y en becerros de 13 semanas que consumieron 6.05
kg d-1 de grano, se observó que el ácido fítico fue degradado en el rumen pero el fitato
no fue hidrolizado completamente, lo cual puede deberse a que el rumen de los
becerros no está bien desarrollado (Duskova et al., 2001), y por tanto no tienen
suficientes bacterias en el rumen para hidrolizar el P fítico.
La actividad fitásica en el rumen ha sido documentada pero es necesario
entender completamente su modo de acción (Godoy y Meschy, 2002; Godoy y Meschy,
2001). En cabras Alpina que consumieron dietas de forrajes y concentrados, aumentó
18
la actividad fitásica a las 2 y 4 h de fermentación en dietas altas y bajas en P fítico
cuando se añadió un amortiguador orgánico (fitato de sodio de maíz) comparado con
un amortiguador inorgánico (fosfato de monosodio) en un sistema semi-continuo de
fermentación (RUSITEC), pero la actividad de la enzima disminuyó al extender el
tiempo de incubación a 4 h (Godoy y Meschy, 2001). En un estudio similar se concluyó
que la actividad fitásica aumentaba al incrementar el fitato de la dieta, pero disminuía al
aumentar el P inorgánico liberado de las moléculas del ácido fítico (Godoy y Meschy,
2002). Esta disminución se puede deber al efecto de la inhibición por la saturación del
P libre sobre la actividad de la enzima (Raun et al., 1956). Con base en un análisis de
muestras de granos, ensilaje y heces se ofrecieron dietas con 3.8 g P kg-1 como fitato
(69 % del P total en la dieta) y se usó cromo como marcador; se encontró que 99 %
del ácido fítico fue hidrolizado in vivo en vacas lecheras, pero en vacas jóvenes se han
reportado valores inferiores para la hidrólisis del fitato (Morse et al., 1992a).
Clark et al. (1986) evaluaron en vacas Holstein el efecto de la fuente (aragonita,
calcita y albacar) y la cantidad (0.6 y 0.9 %) y de calcio agregado a dietas (50 % grano
maíz y 50 % de ensilaje maíz) y con 6.3 g P kg-1 MS consumida (3.34 g P kg-1 como
fósforo fítico); la digestibilidad aparente del P fue 98 %, pero no hubo efecto de la
cantidad y la fuente de Ca sobre la absorción del P. En vacas lecheras alimentadas con
dietas de alfalfa, cebada y avena, la digestión intestinal del P estuvo entre 71 y 85 %
(Khorasani et al., 1997). El análisis de los resultados indica que el P contenido en los
alimentos está disponible para rumiantes entre 71 a 98 % y que agregar un suplemento
de P para compensar por el P fítico en las dietas para rumiantes como margen de
19
seguridad, promueve un aumento de P en las heces y no necesariamente mejora la
eficiencia productiva.
Dos factores que han propiciado la sobrealimentación con P, al menos en
ganado lechero, son la asociación de un mejor desempeño reproductivo con un alto
consumo del mineral y la ausencia de pruebas de lactancia que precisen la cantidad
mínima de P requerida para soportar una producción láctea alta o moderada (Setter,
2003). La alimentación con cantidades en exceso respecto a las recomendadas por el
NRC (2001) no tuvieron un efecto detectable en el desempeño reproductivo de vacas
en lactancia (López et al., 2004). El problema ha aumentado al incorporar cantidades
importantes de granos en las dietas en sistemas con una intensa presión de
producción, como en vacas lecheras, donde el consumo de dietas incluye hasta 50 %
de esos alimentos, lo cual es una sobrealimentación del mineral (Godoy y Meschy,
2001). Esta sobrealimentación podría reducirse si se logra liberar el 100 % del P de los
alimentos, lo cual podría hacerse incrementando la actividad fitásica del rumen.
Los rumiantes especializados para producción de carne y leche en condiciones
intensivas y en estados fisiológicos de altos requerimientos aún en sistemas no
intensivos requieren, además del forraje, una alta proporción de alimento concentrado a
base de granos de cereales, oleaginosas y sus subproductos, para cubrir sus elevados
requerimientos nutricionales. Las dietas altas en concentrados contienen una gran
proporción del fósforo total (>70 %) en forma orgánica, como fitatos. En rumiantes, al
utilizar dietas con aproximadamente 50 % del fósforo como fitatos, más del 90 % es
hidrolizado por las fitasas producidas por los microorganismos del rumen (Clark et al.,
1986; Morse et al., 1992).
20
Los rumiantes excretan más del 95 % del P a través de las heces (Satter, 2003).
La pérdida inevitable del mineral es la suma del P de los residuos microbianos, células
muertas y secreciones intestinales, las cuales son 1 g kg-1 de MS ingerida (Spiekers et
al., 1993), y posiblemente 25 a 50 % del P fecal proviene de los residuos microbianos
originados de la fermentación digestiva (Wu et al., 2000; NRC, 2001). Cuando hay un
exceso de P en la dieta, los animales utilizan la orina como vía de excreción secundaria
para mantener la fosfatemia dentro de límites fisiológicos; así, vacas que reciben
cantidades adecuadas de P dietario excretan en la orina menos de 1 g P d-1, en tanto
que vacas sobrealimentadas con 20 a 30 % de P excretan 3 a 5 g P d-1. La reducción
en la dieta y como consecuencia, la disminución del elemento excretado por caprinos y
vacas lecheras, es una herramienta de manejo que puede ser efectiva para disminuir el
efecto de contaminación por P (Valk et al., 2000; Godoy y Meschy, 2001; Satter, 2003).
Sin embargo, para disminuir los aportes dietarios del elemento es necesario verificar
las necesidades de los microorganismos ruminales, cuya función es un
aprovechamiento eficiente de los nutrimentos de la dieta. De manera contrastante, la
deficiencia de P en rumiantes y no rumiantes es un problema en algunas regiones del
mundo, principalmente en los países tropicales, donde los forrajes tienen bajos
contenidos (<0.15 %) del elemento (Underwood y Suttle, 1999). La deficiencia de este
macromineral es la causa de bajos índices productivos (McDowell et al., 1993).
En rumiantes, a pesar de la actividad fitásica de los microorganismos del rumen,
cuando se utilizan regímenes alimenticios que exigen la incorporación de altos niveles
(>70 %) de concentrados (Ellis y Tillman 1960) la actividad fitásica de los
microorganismos es limitante, probablemente debido a una saturación de su capacidad
21
de hidrolizar el sustrato (Godoy y Meschy, 2000). Los tratamientos químicos o térmicos,
usados en el procesamiento de los materiales, pueden también cambiar la degradación
del fósforo fítico presente (Konischi et al., 1999). La disponibilidad biológica es la
proporción en que un nutriente ingerido es absorbido, para ser utilizado en los procesos
metabólicos o almacenados en los tejidos del animal (Forbes y Erdman 1983). Dietas
altas en concentrado reducen el tiempo de retención de la digesta lo que puede
también disminuir la hidrólisis de los fitatos en el rumen (Sauvant et al., 1999). La
utilización de un nutriente debe demostrarse mediante su participación en un proceso
metabólico normal del animal, a fin de establecer la biodisponibilidad del elemento. El
fosfato proveniente de cualquier fuente, inorgánica u orgánica, no siempre está
completamente disponible o es utilizado porque una fracción se pierde en las funciones
digestivas y metabólicas normales. Las técnicas de procesamiento, como la aplicación
de tratamientos físicos y químicos en los ingredientes alimenticios, son factores que
pueden afectar la eficiencia de la actividad fitásica ruminal. Así, los tratamientos con
formaldehído disminuyen la degradabilidad ruminal de la proteína y del almidón y
además reducen la actividad fitásica de los microorganismos del rumen (Park et al.,
2000). En general, para las diferentes especies, las fuentes de fósforo de origen animal
son de alta biodisponibilidad cuando se comparan con las de origen mineral de mayor
valor biológico, como los mono, di y trifosfatos inorgánicos (Fox et al., 1981).
La respuesta productiva de los no rumiantes a un suplemento enzimático en las
dietas, se mide con variables como peso vivo, consumo alimenticio, ganancia de peso,
conversión alimenticia, peso de canal, tamaño y peso de órganos internos, porcentaje
de retención de calcio y fósforo en las tibias, mediante la obtención de cenizas,
22
cantidad de fósforo eliminado en las heces y cantidad de fósforo y calcio en la sangre.
Los resultados son variables y dependen del tipo de enzima aplicado (Boros et al.,
1995; Swain et al., 1996; Thacker et al., 1991).
2.10. Uso de fitasa en especies pecuarias
Los alimentos balanceados para aves y cerdos están elaborados principalmente
con granos de cereales y oleaginosas. La disponibilidad del fósforo en la mayoría de
estos ingredientes alimenticios es baja (30 a 40 %), debido a que alrededor del 70 %
está como fitatos, compuestos poco utilizados por los no rumiantes (Perney et al.,
1993). Consecuentemente, para cubrir las necesidades de cerdos y aves en es
necesario agregar un suplemento con fuentes de fósforo inorgánico en las dietas
(Hernández et al., 2006).
El fósforo en los cereales y forrajes no está completamente disponible para la
absorción y utilización por los no rumiantes (Guyton et al., 2002). Cerca del 70 % del P
en los granos está unido orgánicamente como ácido fítico, mientras que esta forma del
mineral es baja en el forraje. En el caso de los rumiantes hay poca información acerca
de la utilización de fitasas, pero el uso de enzimas exógenas en otros sustratos ha
mostrado que pueden ser útiles en ciertas condiciones y, por tanto, no debe
descartarse su utilización potencial.
23
3. OBJETIVO GENERAL
Evaluar el efecto de una fitasa en variables in vitro y productivas de corderos
criollos en finalización alimentados con una dieta alta en sorgo.
4. HIPÓTESIS
La adición de fitasa mejora la eficiencia de liberación de fósforo del grano de sorgo.
24
5. MATERIALES Y MÉTODOS
5.1. Localización
Los análisis químicos fueron realizados en el laboratorio de Nutrición Animal y la
prueba con ovinos en la Unidad Metabólica del Programa de Ganadería en el Colegio
de Postgraduados, carretera Los Reyes-Texcoco, km 36.5, Montecillo, Estado de
México. La altitud es 2240 m; el clima (García, 1981) es (Cwo) (w) b (i') (g), esto es
clima templado subhúmedo con lluvias en verano, época seca en invierno, una
temperatura promedio anual de 15.2 ºC y 650 mm de precipitación promedio anual.
5.2. Análisis de laboratorio
En muestras de la dieta y heces fue determinada la materia seca (MS), materia
orgánica (MO), nitrógeno (N) y cenizas (AOAC, 1990), fibra detergente neutro (FDN) y
ácida (FDA) (Van Soest et al., 1991) y P según Fiske y Subbarow (1925) (Cuadro 1). La
digestibilidad in vitro de las dietas fue realizada con la primera fase de la técnica de
Tilley y Terry (1963): las muestras fueron tomadas de dos borregos (peso vivo 65 kg)
con cánula ruminal alimentados ad libitum con la dieta testigo (Cuadro 1); los borregos
recibieron la dieta durante 15 d. La muestra fue mezclada con saliva de McDougall, pH
6.8, y líquido ruminal (4:1), 50 mL se colocaron en tubos de polipropileno (100 mL) con
tapones y válvulas de Bunsen, que contenían 0.5 g de la dieta; CO2 fue agregado a
cada tubo, que fue tapado para mezclar su contenido, colocado en un baño maría a 38
°C, e incubado por 3, 6, 12, 24 y 48 h; por triplic ado.
5.3. Experimento in vivo
El diseño experimental fue completamente al azar en cuatro tratamientos y ocho
repeticiones: 0, 150, 300 y 450 g t-1 dieta de la fitasa (Natuphos5000G; BASF
Mexicana S. A. de C. V. proveniente de Aspergillus niger; 5000 FTU g-1). Se usaron 32
corderos Criollos (peso vivo inicial 21.47±2.24 kg) los cuales, antes de iniciar el
25
experimento, recibieron antiparasitarios internos y externos con 0.5 mL de Ivermectina
vía subcutánea; además, se aplicó bacterina toxoide contra clostridios (2.5 mL animal-1)
y vitamina ADE (1 mL animal-1). Los corderos estaban en jaulas individuales y fueron
alimentados ad libitum y agua durante 60 d, y 15 d de adaptación a la dieta (Cuadro 1).
El consumo diario de alimento fue medido restando el rechazo de lo ofrecido;
para medir la ganancia de peso los corderos fueron pesados a las 07:00 h (0, 15, 30,
45 y 60 d) en una báscula digital (capacidad 300 kg; precisión 0.05 kg); la conversión
alimenticia fue calculada con los datos de consumo de alimento y cambio de peso: se
midió el rendimiento en canal determinando el porcentaje en peso de la canal caliente
con respecto al peso del cordero vivo.
La eficiencia parcial de utilización del alimento (EPUA) se calculó como la
pendiente de la regresión del consumo de alimento y la ganancia de peso y se
calcularon las pendientes (β1) para cada tratamiento y se compararon con intervalos de
confianza (95%).
Fueron tomadas muestras de: 1) heces de 72 h (15, 30, 45 y 60 d), 10 % de las
muestras fueron mezcladas y secadas en una estufa a 55 ºC y molidas; 2) sangre
directamente en yugular (30 y 60 d), se centrifugaron a 3500 rpm durante 15 min para
separar el suero del plasma; 3) orina por recolección directa (15, 30, 45 y 60 d), y se
determinó P según Fiske y Subbarow (1925).
La digestibilidad aparente se calculó con la siguiente fórmula (Merchen, 1988):
26
5.4. Análisis estadístico
El diseño fue completamente al azar con cuatro tratamientos y para evaluar el
efecto del tiempo se utilizó el procedimiento MIXED (SAS, 1999) de acuerdo con lo
propuesto por Litell et al., (1998) y Wang y Goonwardese (2004). El modelo estadístico
fue el siguiente;
Yijk = µ + δi + dij + tk + (δt)ij + εijk
Donde,
Yijk = variable de respuesta
µ = media general
δi = efecto fijo del i-ésimo tratamiento
dij = efecto aleatorio asociado con el j-ésimo cordero en el i-ésimo tratamiento
tk = efecto fijo del k-ésimo periodo
(δt)ik = efecto fijo de la interacción del i-ésimo tratamiento con el k-ésimo periodo
εij = error aleatorio asociado con el j-ésimo borrego en el i-ésimo tratamiento al k-ésimo
muestreo.
Los datos de rendimiento en canal fueron analizados con el procedimiento GLM
(SAS, 1997) y las medias se compararon con la prueba de Tukey (P≤0.05) (Steel y
Torrie, 1996).
27
El modelo estadístico para estas variables fue el siguiente;
ijijiij XXtY ξβµ +−++= ..)( ti ...3,2,1= rj ...3,2,1=
Donde:
=ijY Variable respuesta en tratamiento i , repetición j .
=µ Media general.
=it Efecto de tratamiento.
=β Coeficiente de regresión.
=ijX Variable dependiente o covariable.
=ijξ Error aleatorio.
28
6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
En el Cuadro 1 se muestra la composición química de las dietas
experimentales. Los valores para contenido de MS, MO, FDA, FDN y P fueron
similares entre los tratamientos, lo cual concuerda con lo planteado en la elaboración
de las dietas. La cantidad de fósforo está dentro del valor óptimo sugerido por NRC
(1985), que reporta una cantidad de 0.21 % para ovinos en finalización con una
ganancia de peso esperada mayor a 200 g d-1. Los valores para el contenido de FDN
son óptimos para mantener una función ruminal adecuada. Al respecto, Mertens
(1997) menciona que con un mínimo de 20 % de FDN se evitan problemas de
acidosis, laminitis y desplazamiento abomasal.
29
Cuadro 1. Composición (%) de las dietas experimentales en base seca.
g fitasa t-1 *
Ingredientes 0 150 300 450
Rastrojo de maíz 9 9 9 9
Paja de avena 9 9 9 9
Grano de sorgo 70 70 70 70
Melaza 10 10 10 10
Urea 2 2 2 2
Composición química1:
Materia seca 87.90 85.60 86.70 85.70
Materia orgánica 96.55 96.29 96.35 96.43
Proteína cruda 13.45 13.63 13.21 13.55
FDN 23.85 24.58 23.30 21.11
FDA 11.89 12.95 12.65 12.37
Cenizas 3.45 3.71 3.65 3.57
Fósforo 0.22 0.20 0.21 0.22
No hubo diferencias significativas (P>0.05); *Natuphos5000G (BASF Mexicana S. A.
de C. V.; 5000 FTU g -1); 150 g fitasa t-1 = 750,000 FTU; 300 g fitasa t-1 = 1,500,000
FTU; 450 g fitasa t-1 = 2,250,000 FTU. 1Análisis realizados en el Laboratorio de
Nutrición Animal, Colegio de Postgraduados.
El uso de fitasa exógena no modificó la ganancia de peso, el rendimiento en
canal, el consumo de alimento ni la EPUA en corderos criollos en finalización (Cuadro
2). Los rendimientos en canal son similares a los reportados (51.64 %, 48.65 %) por
30
Martínez (2001), en corderos alimentados con dietas que contenían 50 % de grano de
sorgo. Reddy et al. (1982) y Greiner et al. (1993) sugieren que en rumiantes
alimentados con dietas altas en concentrados (>70 %) la actividad fitásica de los
microorganismos ruminales es limitante, probablemente debido a una saturación de su
capacidad para hidrolizar el sustrato (Greiner et al., 1993; Godoy y Meschy, 2000).
Cuadro 2. Efecto de la fitasa en variables productivas en corderos criollos en
finalización.
Variables g fitasa t-1 EL EC
0 150 300 450 EEM P>
GDP 201 220 194 198 0.024 0.743 0.769
CMS 995 1166 1078 1149 0.098 0.246 0.488
CA 4.95b 5.30ab 5.55ab 5.80a 0.423 0.041 0.961
R.C. 50.63 52.84 49.49 49.51 2.000 0.261 0.410
EPUA 0.196 0.196 0.219 0.282
Intervalos de
Confianza
L.I. 0.063 0.013 0.091 0.163
L.S. 0.328 0.378 0.346 0.400
a, b Medias en una hilera con diferente literal, son diferentes (P≤0.05), EEM = error
estándar de la media; EL = efecto lineal; EC = efecto cuadrático; GDP = ganancia diaria
de peso; CMS = consumo de materia seca; EPUA = eficiencia parcial de utilización de
alimento; CA = conversión alimenticia; R.C. = rendimiento en canal (%); 150 g fitasa t-1
= 750,000 FTU; 300 g fitasa t-1 = 1,500,000 FTU; 450 g fitasa t-1 = 2,250,000 FTU.
31
Aun cuando no existen diferencias estadísticas en la GDP, en el primer período
hubo una tendencia lineal (P=.09) a una mayor ganancia de peso a medida que se
incrementaba la dosis de fitasas (Cuadro 3). Sin embargo las diferencias finales fueron
mínimas (19 g animal-1 d-1) al comparar el tratamiento de 150 g fitasa t-1 y el testigo. La
GDP de los corderos en este experimento concuerda con los reportados por NRC
(1985) para ovinos machos enteros con un peso promedio inicial de 20 a 25 kg-1 y una
GDP de 200 a 250 g animal-1 d-1. Godoy y Chicco (2004) reportaron GDP en corderos
mestizos West African alimentados con una dieta similar a la del presente trabajo con
72 % de grano de maíz y concentraciones de 0.37v% de P, de 112 y 108 g animal-1d-1.
Lo anterior sugiere que la enzima hidrolizó el fitato, haciendo disponible el P para su
absorción y para mantener GDP similares a las observadas en ovinos alimentados con
una concentración mayor de P en la dieta.
32
Cuadro 3. Ganancia de peso (g animal-1d-1) de corderos criollos en finalización.
g fitasa t-1 P>
Periodo+ 0 150 300 450 EEM EL EC
1 193 272 198 202 0.039 0.787 0.351
2 204 216 176 227 0.039 0.793 0.473
3 168 145 199 194 0.039 0.133 0.642
4 241 248 205 171 0.039 0.024 0.396
Promedio 201 220 194 198 0.024 0.743 0.769
No hubo diferencias significativas (P>0.05). EEM = error estándar de la media; EL =
efecto lineal; EC = efecto cuadrático. +Periodos: 1 = 0-15 d; 2 = 16-30 d; 3 = 31-45; 4 =
46-60 d; 150 g fitasa t-1 = 750,000 FTU; 300 g fitasa t-1 = 1,500,000 FTU; 450 g fitasa t-1
= 2,250,000 FTU.
En los tres tratamientos hubo un mayor consumo de MS con respecto al testigo,
probablemente debido a que por acción de la fitasa se liberó más fósforo y se
incrementó la eficiencia ruminal para la degradación de MS; esto se reflejó en la GDP
para los primeros 3 periodos con 450 g fitasa t-1 (Cuadro 4). No se encontraron
diferencias entre tratamientos para la conversión alimenticia de los corderos (Cuadro
5).
33
Cuadro 4. Consumo de materia seca (g animal-1 d-1) de corderos criollos en finalización.
g fitasa t-1 P>
Periodo+ 0 150 300 450 EEM EL EC
1 786 878 874 977 0.115 0.091 0.937
2 1011b 1258a 1106b 1167b 0.115 0.340 0.210
3 1075 1189 1180 1268 0.115 0.177 0.892
4 1109 1338 1153 1185 0.115 0.917 0.288
Promedio 995 1166 1078 1149 0.098 0.246 0.488
a, b Medias en una hilera con diferente literal, son diferentes (P≤0.05). EEM = error
estándar de la media; EL = efecto lineal; EC = efecto cuadrático; +Periodos: 1 = 0-15 d;
2 = 16-30 d; 3 = 31-45; 4 = 46-60 d; 150 g fitasa t-1 = 750,000 FTU; 300 g fitasa t-1 =
1,500,000 FTU; 450 g fitasa t-1 = 2,250,000 FTU.
La falta de una diferencia significativa en dichas variables puede deberse a que
se cumplieron los requerimientos de P con el fósforo liberado. En rumiantes se ha
demostrado que cuando se utilizan dietas con aproximadamente 50 % del fósforo en la
forma de fitatos, más de 90 % es hidrolizado por las fitasas producidas por los
microorganismos del rumen (Ellis y Tillman, 1960; Morse et al., 1992). Según Reid et al.
(1947), los ovinos pueden utilizar fitatos naturales y la mayoría de la hidrólisis ocurre en
rumen en menos de 8 h. Raun et al. (1956) simularon la función ruminal artificialmente
y observaron que los microorganismos del rumen de novillos hidrolizan fitato de calcio,
lo cual sugiere la presencia de fitasas. Otros autores (Tillman y Brethour, 1958;
Lofgreen, 1960; Ellis y Tillman, 1960) confirmaron que los rumiantes (ovinos y bovinos)
34
son capaces de utilizar fósforo fítico. El valor biológico para fitato dietario en ovinos y
ganado productor de leche fue establecido en 66 y 50 % (Lofgreen, 1960).
Cuadro 5. Conversión alimenticia de corderos criollos en finalización.
g fitasa t-1 P>
Periodo+ 0 150 300 450 EEM EL EC
1 4.48 4.40 4.79 6.04 0.813 0.109 0.339
2 5.34 5.63 6.31 4.96 0.813 0.855 0.152
3 6.06 6.23 5.62 6.46 0.813 0.693 0.318
4 4.20b 5.32b 6.03ab 6.68a 0.813 0.007 0.817
Promedio 5.02b 5.40ab 5.69ab 6.04a 0.423 0.040 0.961
a, b Medias en una hilera con diferente literal, son diferentes (P≤0.05); EEM = error
estándar de la media; EL = efecto lineal; EC = efecto cuadrático; +Periodos: 1 = 0-15 d;
2 = 16-30 d; 3 = 31-45; 4 = 46-60 d; 150 g fitasa t-1 = 750,000 FTU; 300 g fitasa t-1 =
1,500,000 FTU; 450 g fitasa t-1 = 2,250,000 FTU.
La digestibilidad in vitro de las dietas experimentales no se modificó por efecto
de la fitasa en ningún periodo (Cuadro 6). Sin embargo, en los periodos 1, 2 y 3; la
digestibilidad aparente fue mayor con respecto al testigo, mostrando un marcado efecto
cuando se utilizó 450 g fitasa t-1; empero, este incremento no modificó las variables
productivas. El fósforo es esencial para el desarrollo de los microorganismos ruminales;
interviene en diferentes sistemas enzimáticos y es particularmente importante en la
fermentación de los carbohidratos estructurales principalmente de la celulosa (Durand
et al., 1983).
35
En rumiantes, los minerales que entran al tubo digestivo tienen efecto sobre el
metabolismo de los microorganismos directa o indirectamente. Directamente, actúan
como cofactores enzimáticos, elementos precursores de síntesis, o cambiando pH y
osmolaridad del medio; indirectamente modifican la fisiología del hospedero, por
ejemplo, alterando el tiempo de permanencia de la digesta o la velocidad de absorción
de los metabolitos (Broudiscou et al., 1998).
La digestibilidad aparente (Cuadro 6) de las dietas experimentales fue mayor
(P≤0.05) en ovinos que recibieron 450 g t-1, durante el experimento; esto sugiere que
al liberar una cantidad mayor de P se incrementó la eficiencia ruminal y aumentó la
digestibilidad de MS. Las dietas altas en concentrado reducen el tiempo de retención
de la digesta, lo cual podría también disminuir la hidrólisis de los fitatos en el rumen
(Sauvant et al., 1999).
36
Cuadro 6. Digestibilidad aparente e in vitro de la materia seca (%) de las dietas para
corderos criollos en finalización.
g fitasa t-1 EL EC
Periodo+ 0 150 300 450 EEM P>
1 56.63b 56.10b 62.47a 63.17a 0.934 0.009 0.001
2 48.35d 60.56b 54.74c 66.35a 0.934 0.001 0.499
3 50.81c 60.33b 58.06b 65.47a 0.934 0.001 0.182
4 54.86a 43.81c 50.31b 54.63a 0.934 0.001 0.489
Promedio 52.66c 55.20b 56.40b 62.40a 0.453 <.001 <.001
in vitro
(h)
3 18.92 17.16 17.77 17.77 3.123 0.108 0.008
6 23.77 23.91 23.41 24.27 3.123 0.842 0.751
12 37.69 37.44 40.09 38.25 3.123 0.051 0.587
24 51.85 56.06 56.98 51.47 3.123 0.857 0.504
48 70.91 68.90 69.65 68.50 3.123 0.470 0.923
a, b, c, d Medias en una hilera con diferente literal, son diferentes (P≤0.05); EEM = error
estándar de la media; EL = efecto lineal; EC = efecto cuadrático; +Periodos: 1 = 0-15 d;
2 = 16-30 d; 3 = 31-45; 4 = 46-60 d; 150 g fitasa t-1 = 750,000 FTU; 300 g fitasa t-1 =
1,500,000 FTU; 450 g fitasa t-1 = 2,250,000 FTU.
En el Cuadro 7 se muestran las concentraciones de fósforo en las muestras
fecales. En el primer periodo no hubo diferencias, pero en los periodos 3 y 4 la
concentración de P fue menor cuando se usaron de 300 y 450 g fitasa t-1, lo cual indica
37
que el P ligado al ácido fítico fue liberado por la fitasa y fue asimilado por el cordero,
por lo que se encontró una menor concentración de fósforo en las heces. El fósforo
presente en heces corresponde en promedio a 66.6 % del P consumido (Field et al.,
1983; Vitti et al. 1992).
Cuadro 7. Concentración (%) de fósforo, fibra detergente ácido (FDA) y fibra detergente
neutro (FDN) en muestras fecales de corderos criollos en finalización.
g fitasa t-1 EL EC
Periodo+ 0 150 300 450 EEM P>
1 0.68 0.60 0.64 0.51 0.629 0.100 0.677
2 0.52ab 0.62a 0.45b 0.49b 0.629 0.082 0.299
3 0.58a 0.56ab 0.49ab 0.41b 0.629 0.006 0.509
4 0.50ab 0.61a 0.46b 0.46b 0.629 0.109 0.181
Promedio 0.57ab 0.60a 0.51bc 0.47c 0.382 0.002 0.189
FDA 68.46 68.61 71.87 69.45 1.404 0.197 0.232
FDN 50.73ab 48.34b 51.07ab 52.35a 1.336 0.077 0.057
a, b, c Medias en una hilera con diferente literal, son diferentes (P≤0.05); EEM = error
estándar de la media; EL = efecto lineal; EC = efecto cuadrático; +Periodos: 1 = 0-15 d;
2 = 16-30 d; 3 = 31-45; 4 = 46-60 d; 150 g fitasa t-1 = 750,000 FTU; 300 g fitasa t-1 =
1,500,000 FTU; 450 g fitasa t-1 = 2,250,000 FTU.
Los rumiantes excretan más del 95 % del P a través de las heces (Satter, 2003).
La pérdida inevitable del mineral es la suma de la concentración de fósforo en los
38
residuos microbianos, células muertas y secreciones intestinales, las cuales son 1 g
kg-1 de MS ingerida (Spiekers et al., 1993). Además, probablemente 25 a 50 % del
fósforo fecal proviene de los residuos microbianos originados de la fermentación
digestiva (Wu et al., 2000; NRC, 2001).
La implementación de estrategias para disminuir el contenido de P en las dietas
causó una reducción de 33 % en su excreción (Cerosaletti et al., 2004). Morse et al.
(1992) ofrecieron una dieta con 0.41 % P y luego la redujeron a 0.31 %, lo cual
disminuyó en 22.7 % la excreción de fósforo en vacas lecheras; por el contrario, en
otro estudio, Wu et al., (2001) encontraron que el contenido de fósforo en las heces se
incrementó al aumentar su contenido en la dieta.
Los cereales tienen además contenidos elevados de almidón, el cual es
degradado muy poco en el rumen, para luego ser hidrolizado a glucosa en el intestino
(Sauvant y Van Milgen, 1995). La glucosa y el fósforo compiten por la absorción
dependiente del gradiente de sodio, por lo que, la absorción de fósforo puede ser
limitada por exceso de glucosa intestinal; lo anterior se presentaría en rumiantes
alimentados con dietas altas en cereales que no han sido procesados para aumentar
su fermentación ruminal.
En rumiantes, típicamente de 95 a 98 % de la excreción total de fósforo ocurre a
través de las heces (Horst, 1986; NRC, 2001; Bravo et al., 2003). El fósforo fecal se
puede clasificar en las siguientes tres fracciones: 1) P de origen dietético, no disponible
para absorción; 2) P de origen endógeno, una fracción que puede considerarse como
pérdidas inevitables; y 3) P de origen dietético y endógeno, excretado como resultado
39
de la homeostasis del fósforo o por la eliminación del fósforo en exceso (Spiekers et al.,
1993; Knowlton et al., 2001; NRC, 2001; Bravo et al., 2003). En varias investigaciones
se ha determinado que la excreción fecal de fósforo está relacionada con su consumo
(Dayrell y Ivan, 1989; Sansnon et al., 1990; Van Horn et al., 1991; Spiekers et al., 1993;
Wu et al., 2000; Weiss y Wyatt, 2004; Ekelund et al., 2006). En un estudio realizado por
Weiss y Wyatt (2004) se encontró que la excreción fecal de fósforo aumentaba
linealmente conforme se incrementaba el consumo de este mineral. Dichos autores
utilizaron los datos de ocho experimentos que incluían 162 vacas y derivaron las
siguientes dos ecuaciones que relacionan el consumo de fósforo con la excreción de
fósforo fecal en vacas lecheras:
P fecal = 2.5 + (0.64 * consumo de P)
P fecal = 7.5 + (0.78 * consumo de P) – (0.702 * producción láctea)
Donde: la unidad es g-1 d-1 para el consumo de P y P fecal, y para producción láctea es
kg-1 d-1.
Wu et al. (2000) reportaron también una relación lineal entre el P consumido y el
excretado en las heces, y obtuvieron la siguiente ecuación:
P fecal = 0.643 * consumo de P + 5.2
Clark et al. (1986) evaluaron en vacas Holstein el efecto de la fuente (aragonita,
calcita y albacar) y de la cantidad (0.6 y 0.9 %) de calcio agregado a dietas (50 % grano
maíz y 50% de ensilaje maíz) y con 6.3 g P kg-1 MS consumida (3.34 g P kg-1 como
fósforo fítico). Dichos autores encontraron que la digestibilidad aparente del fósforo fue
98 %, pero no hubo efecto de la cantidad y la fuente de Ca. En otro experimento con
40
vacas lecheras alimentadas con dietas de alfalfa, cebada y avena, la digestión intestinal
del P varió de 71 a 85 % (Khorasani et al., 1997).
En el presente estudio la concentración de fósforo en la orina no fue modificada
por efecto de la fitasa (Cuadro 8). Al respecto, las concentraciones normales de fósforo
en orina se encuentran en un intervalo de 6.2 a 9.3 mg 100 mL-1 según Challa et al.
(1989). Los bajos valores reportados para fósforo en la orina se deben a que las heces
son la principal fuente de excreción de este elemento.
Cuadro 8. Concentración de fósforo (mg dL-1) en orina de corderos criollos en
finalización.
g fitasa t-1 EL EC
Periodo+ 0 150 300 450 EEM P>
1 7.73 6.06 5.93 6.82 1.937 0.716 0.467
2 5.32 5.76 6.03 4.85 1.937 0.821 0.482
3 5.91 6.92 5.06 4.61 1.937 0.264 0.524
4 6.15 7.20 3.67 7.38 1.937 0.976 0.314
Promedio 6.28 6.49 5.17 5.92 1.375 0.539 0.759
No existen diferencias (P≥0.05); EEM = error estándar de la media; EL=efecto lineal;
EC=efecto cuadrático; +Periodos: 1 = 0-15 d; 2 = 16-30 d; 3 = 31-45; 4 = 46-60 d; 150 g
fitasa t-1 = 750,000 FTU; 300 g fitasa t-1 = 1,500,000 FTU; 450 g fitasa t-1 = 2,250,000
FTU.
La concentración de fósforo en suero fue más baja en los corderos que
recibieron fitasa, con respecto al grupo testigo: 9.75, 6.85, 5.71 y 7.74, para 0, 150,
41
300 y 450 g fitasa t-1, en el primer muestreo. En cambio, en el segundo muestreo no se
encontraron diferencias entre tratamiento y la respuesta observada fue muy variable
(Cuadro 9). En relación a los valores del presente estudio, Louvandini y Vitti (1996)
observaron que las concentraciones en plasma variaron de 5.3 a 6.4 mg 100 mL-1 en
borregos alimentados con diferentes porcentajes de inclusión de harina de hueso
como fuente de fósforo. Además, dichos autores tampoco encontraron diferencias
entre las concentraciones de fósforo circulante en sangre y con valores de 5.0, 4.7 y
5.4 mg, pero superando el valor crítico de 4.5 mg postulado por McDowell (1992). El
valor inicial de fósforo en suero (5.3) fue ligeramente más alto que el intervalo normal,
de 4 a 8 mg dL-1, reportado por NRC (1985). Los resultados anteriores confirman la
limitada utilidad de usar los valores de fósforo circulante como un indicador de las
reservas en rumiantes y, específicamente para el presente estudio, en corderos en
finalización.
42
Cuadro 9. Concentración de fósforo (mg dL-1) en suero de corderos criollos en
finalización.
g fitasa t-1 EL EC
Muestreo 0 150 300 450 EEM P>
1 9.75a 6.85ab 5.71b 7.74ab 1.758 0.128 0.023
2 8.30 7.29 6.85 6.14 1.758 0.278 0.914
Promedio 9.03a 7.07ab 6.28b 6.94ab 1.506 0.116 0.189
a, b Medias en una hilera con diferente literal, son diferentes, (P≤0.05); EEM = error
estándar de la media; EL=efecto lineal; EC=efecto cuadrático; Muestreo 1 = 30 d; 2 =
60 d; 150 g fitasa t-1 = 750,000 FTU; 300 g fitasa t-1 = 1,500,000 FTU; 450 g fitasa t-1 =
2,250,000 FTU.
Wise et al (1961) evaluaron distintas fuentes de fósforo inorgánico en terneras
utilizando las variables de crecimiento corporal, crecimiento óseo, cenizas en huesos,
fósforo en suero y concentraciones de fosfatasas en sangre. Esos autores encontraron
que el fósforo del suero sanguíneo fue la variable más sensitiva y real para medir la
disponibilidad biológica de ese elemento. El análisis de sus resultados evidenció que el
fosfato dicálcico produjo una mayor concentración de fósforo en el plasma, seguido en
sentido decreciente por el fosfato defluorinado, fosfato de roca bajo en flúor y fosfato
suelto.
De 80 a 85 % del fósforo presente en el organismo animal se localiza en el
sistema óseo como fosfato cálcico Ca3(PO4)2 e hidroxiapatita Ca10(PO4)6(OH)2,
mientras que el 15 a 20 % restante se encuentra como fósforo orgánico en los tejidos
43
muscular y nervioso y, especialmente, en los glóbulos rojos. La sangre contiene entre
35 y 45 mg de fósforo 100 mL-1 localizado en su mayor parte en el interior de las
células. Debido a que la fracción plasmática sólo posee entre 4.5 y 6.0 mg P 100 mL-1
en adultos y entre 6 y 9 mg P 100 mL-1 en rumiantes jóvenes (McDowell, 1992). Las
concentraciones de fósforo en suero del presente trabajo estuvieron dentro de los
intervalos reportados por McDowell (1992).
44
7. CONCLUSIONES
De acuerdo con las condiciones experimentales descritas en el presente trabajo,
es posible concluir que la adición de una fitasa en las dosis evaluadas no modificó las
variables productivas en corderos en finalización. A pesar de que aumentó la
digestibilidad aparente de la materia seca de las dietas, no hubo cambios en la
ganancia diaria de peso de los corderos. Sin embargo, hubo una disminución
significativa en la concentración de fósforo de las heces de los corderos en finalización.
Con base en este último resultado se puede sugerir la relevancia de evaluar el efecto
potencial de la adición de una fitasa, en dietas para rumiantes, respecto a los efectos
contaminantes del fósforo.
45
8. LITERATURA CITADA
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