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INACTIVANTES Concepto: La inactivacion consiste en eliminar la capacidad reproductiva o tóxica de un inmunógeno sin afectar, o haciéndolo en el menor grado posible, su capacidad inmunogénica y especificidad serológica, Lo ideal es inhibir de forma irreversible las estructuras que determinan la capacidad de multiplicación y/ o toxigénica sin alterar la estructura y función de las proteínas antigénicas. Condiciones:

• Debe garantizar la eficacia • Debe garantizar la inocuidad • Debe determinar la total inexistencia de microorganismos viables o la detoxificación de toxinas en forma irreversible.

Modo de acción de los inactivantes A.-Daño al DNA: Cierto número de agentes antimicrobianos actúan dañando al DNA, entre éstos se incluyen las radiaciones ionizantes, la luz ultravioleta y los compuestos químicos que reaccionan con este ácido. En la última categoría están los agentes alquilantes y otros compuestos que reaccionan en forma covalente con las bases púricas y pirimidínicas para formar secciones demasiado próximas de DNA o enlaces cruzados en la misma cadena. Las radiaciones dañan al DNA de varias maneras: por ejemplo, la luz ultravioleta induce al

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entrecruzamiento entre pirimidinas adyacentes en una u otra de las dos cadenas de polinucleótidos, formando dímeros de timina; las radiaciones ionizantes producen rupturas en las cadenas simples y en las dobles. Las lesiones al DNA inducidas por radiación y compuestos químicos , destruyen la célula, en particular por interferir en la replicación del DNA. B.- Desnaturalización de la proteína: Las proteínas existen plegadas en un estado tridimensional, determinado por los enlaces disulfuro covalentes intramoleculares, y por los enlaces hidrófobos, iónicos y de hidrógeno. Este estado se denomina estructura terciaria de la proteína; ésta es fácilmente fragmentada por diversos agentes físicos o químicos, que provocan que la proteína deje de funcionar. La fragmentación de la estructura terciaria de una proteína se denomina desnaturalización de la proteína. C.- Eliminación de grupos sulfhidrilo libres: Las proteínas enzimáticas que contienen cisteína (b-Mercapto-L-Cisteína), tienen cadenas laterales que terminan en grupos sulfhidrilo (SH-). Además, coenzimas como la coenzima A y el dihidrolipoato contienen grupos sulfhidrilo libres. Tales enzimas y coenzimas no pueden funcionar a menos que los grupos sulfhidrilo permanezcan libres y reducidos. Los agentes oxidantes, por lo tanto, interfieren en el metabolismo, ligando grupos sulfhidrilo vecinos para dar uniones disulfuro:-S-S-.

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Muchos metales, como el ión mercúrico, también interfieren por combinación con los sulfhidrilos: Existen en la célula muchas enzimas que contienen grupos sulfhidrilo; por consiguiente, los agentes oxidantes y los metales pesados causan un daño considerable. Inactivacion bacteriana. Básicamente, la célula bacteriana consiste en una pared celular que incluye al citoplasma envuelto en la membrana citoplasmática. En condiciones favorables está sujeta a crecimiento y multiplicación por simple fisión asexual y este ciclo es regulado y ordenado por virtud de la constitución enzimática. De acuerdo a Gale las enzimas de que esta equipada la célula tienen las siguientes funciones 1. liberar energía para su contínua existencia y división.

2. proveer nutrientes y metabolitos esenciales. 3. detoxificar productos metabólicos tóxicos. 4. estabilizar el desarrollo interno en un medio externo variable.

Por estas acciones el organismo es capaz de seleccionar nutrientes del medio que lo rodea y modificarlo, por ruptura y síntesis, en material para la estructura celular y su reproducción. Regido por el código genético.

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Estos procesos complejos comprenden el ciclo metabólico de la célula. La función de las enzimas es actuar de catalizador para las reacciones específicas individuales y no es difícil de imaginar la multiplicidad de ellas que tienen que estar presentes en cada microorganismo. Las enzimas comparten la estructura y propiedades de las proteínas. En general están constituídas por dos fracciones: una de naturaleza proteica y un grupo prostético más pequeño que generalmente no es proteico, ligados por fuerzas que varían entre diversas enzimas. Porque las enzimas tienen composición en la mayor parte proteica, es así que comparten sus propiedades y están sujetas por lo tanto a inactivación por coagulación o desnaturalización por calor u otros medios físicos y un grado amplio de agentes químicos. Cualquier tratamiento que actúe inactivando una o más enzimas esenciales de la célula bacteriana o que afecte a un metabolito esencial haciéndolo “no disponible” para la enzima produce una ruptura del ciclo de vida, de la cual resulta que ésta no se reproduce y por definición se presupone muerta. Pero este proceso no es de “ todo o nada “ y hay así varios grados de inactivación y de ello puede resultar un efecto letal o solamente inhibitorio o bacteriostático. Este postulado implica que el efecto letal o bacteriostático es el resultado de diferentes procesos que envuelven reacciones diferentes y diferentes locus en la célula.

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Cuando la acción es bacteriostática el efecto es reversible y puede pasar que el organismo transferido a condiciones favorables pueda reiniciar su normal ciclo reproductivo. Cuando la acción es letal el daño del sistema enzimático es más extenso, o son afectadas enzimas esenciales, y la restauración de la viabilidad no es posible lograrla bajo ninguna circunstancia. Hoy sabemos que el proceso de inactivación no puede ser explicado en todos los casos en función de mecanismos de inactivación enzimática sino que también esta ligado a interferencias en el sistema reproductivo de la célula ,ligado a los ácidos nucleicos.

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Métodos de inactivación Físicos * Calor: Raramente se utiliza como inactivamente. Antiguamente era utilizado como método de inactivación de autovacunas, generalmente somáticas por ej Estafilocócicas. Tiene muchos inconvenientes debido a que las temperaturas de inactivación( 60 a 65 ºC) permiten la aparición de frecuentes controles positivos. Por otra parte la aplicación de temperaturas más altas o durante tiempo prolongado causan una gran destrucción de inmunógenos con la correspondiente baja de inmunogenicidad. Es de aplicación en algunas vacunas como la coqueluchosa donde el uso de inactivantes químicos, si bien inactivan a los microorganismos, no le hacen perder totalmente la toxicidad debida a la toxina. El método corriente de inactivación es: 1) Colocar la suspensión en un frasco de paredes no muy gruesas, no sobrepasando la mitad del volumen. 2) Poner en baño de agua a 60-65 ºC totalmente sumergido ( los gérmenes que quedan en el líquido de las paredes sin contacto con el calor ,escapan a la inactivación), con agitación contínua o bien cada 5 minutos en forma manual. 3) Aplicar el procedimiento durante 30’ a 60 ‘ según técnica. Químicos

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Condiciones. Para que el procedimiento sea efectivo se deben cumplir los siguientes pasos: 1. absorción del compuesto 2. penetración dentro del protoplasma. 3. reacción del compuesto con uno o más componentes celulares.

Fenol Penetra en la célula bacteriana. Desnaturaliza las proteínas complejándose con ellas. Se decía que potenciaba la inmunogenicidad( no comprobado) Se utiliza al 5 %o. El Ácido Fénico es sólido hay que licuarlo en baño maría hasta su estado líquido y luego medir con pipeta (5 ml / litro )( esto es aproximado, porque si se quiere hacer correctamente habría que pesarlo en estado líquido o hacer el cálculo en base a su PE) Metales pesados Precipitan proteínas. Actúan en los grupos tiol -SH Los más utilizados son los compuestos de mercurio y entre ellos el Metorgan,Tiomersal o timerosal ( etilmercurio tiosalicilato de sodio) El metal forma una capa externa con las proteinas que puede impedir la entrada de más inactivante a la célula y actuar como bacteriostático. El germen recobra viabilidad por lavados o por el agregado de azufre soluble.

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Se utiliza más como conservador de vacunas y sueros que como inactivante debido a las causas mencionadas. Es un polvo blanco que se diluye en agua o sol fisiológica dando soluciones transparentes a las concentraciones habituales. Se prepara en solución al 10% y normalmente se agrega 1ml / litro de vacuna o suero para concentración final como conservador de 1/10.000. con variaciones permitidas entre 1/5.000 a 1/20.000. En los medios de control de esterilidad de vacunas y sueros esta incorporado al medio el tioglicolato de sodio que como posee azufre permite que se pongan de manifiesto gérmenes que están en estado de bacteriostasis pero no muertos por el conservador mercurial agregado. Actualmente está prohibido el uso de este conservador para preparaciones de uso humano. Formol Inactivante de uso muy corriente en bacterias, toxinas y virus. Como inactivante bacteriano es efectivo a concentraciones de 1 a 2 %o. Desnaturaliza las proteínas y puede alterar la estructura antigénica . Para toxinas o anavacunas el uso corriente es al 4-7 %o según el germen a inactivar (ver toxinas) Para virus ( ver inactivacion viral ) esta siendo abandonado su uso por su efecto cola de inactivacion,

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Detoxificación o Inactivación de toxinas En 1923 Ramon demostró que la toxina diftérica tratada con formalina no posee capacidad tóxica pero es capaz de producir una buena respuesta inmunogénica Esta observación fue de un inmenso valor y llevó a la virtual eliminación de la difteria en aquellos países que introdujeron programas de inmunización controlados. Desafortunadamente en el pasado se han reportado muertes luego de la inyección de toxoide difterico. En Kyoto, Japón, luego de la inmunización con un batch tóxico de toxoide diftérico 600 niños exhibieron síntomas de intoxicación por toxina diftérica con 68 muertos,. Este accidente fue explicado por una reversión del toxoide a toxina en ciertos frascos o por reversión in vivo, El estudio de la cinética de la detoxificación muestra que ella comienza desde la adición del formol. Así para la toxina tetánica una disminución notable de la toxicidad se observa 1 minuto después de la adición del reactivo. La detoxificación puede seguir a un ritmo exponencial decreciente hasta las 24 hs., en la que la toxicidad es baja, más no nula. Esta toxicidad residual decrece ahora, muy lentamente para ser nula al 5º día. En éste estado la reacción del formol con la toxina no ha terminado (fase de fijación rápida pero reversible) y la forma no tóxica puede ahora revertir parcialmente o totalmente hacia la forma tóxica (la reversión se observa por diálisis o dilución). Es así que es indispensable

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prolongar el contacto del formol con la toxina a 37º C durante 15 días o más, según las toxinas. Durante este período las reacciones suplementarias que se producen llevarán a derivados irreversiblemente detoxificados. Para ciertas toxinas purificadas (toxina diftérica, colérica), la adición de lisina es necesaria para la detoxificación por el formol. Esta característica se explica por la reacción de éste aldehído con la toxina. La detoxificación induce transformaciones moleculares complejas. La molécula de toxoide es más resistente a los agentes desnaturalizantes como los ácidos y el calor que la toxina correspondiente. Esta estabilización reforzada de la estructura molecular está dada por la formación de ligazones nuevas entre el formol fijado y los residuos aminoácido de la proteína. La formación de polímeros se observa para ciertas toxinas (tetánica y enterotoxina estafilocócica). Mecanismo químico de la detoxificación por el formol: Los fenómenos de reversión, polimerización y las características físico químicas de las anatoxinas pueden ser explicados por las propiedades particulares que caracterizan la reactividad del formol con las proteínas. La elucidación del mecanismo reaccional ha sido realizado gracias al análisis químico de hidrolizados de anatoxina y el empleo de formol radio marcado. En una primera etapa el formol (en solución acuosa) da nacimiento a las metil aminas (o iminas) por reacción con los grupos protónicos de los residuos aminoacil.

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Estos derivados son ácido lábiles e inestables a la diálisis (estado de formol reversiblemente ligado). La incubación prolongada con el formol entraña una segunda etapa donde se crean ligazones metilénicas (-C H2-) ácido estables entre los grupos e-NH2 de residuos de lisina y los residuos aminoacil que poseen un H reactivo sobre los grupos ó núcleos amida, guanidil, imidazol, fenol e indol. Estas reacciones de condensación irreversibles conocidas en química orgánica con el nombre de reacción de Mannich , se efectúan por eliminación de una molécula de agua proveniente del oxígeno del formol y los dos átomos de Hidrógeno de dos grupos reaccionantes como lo muestra la reacción siguiente entre residuos lisil y tirosil. Por éste mecanismo el formol se puede comportar como un agente de reticulación si las ligazones Mannich se establecen entre dos moléculas proteicas idénticas o no (puentes intermoleculares) que explican la polimerización de ciertas anatoxinas. Dentro de una misma molécula las mismas ligazones formarán puentes intercatenarios si existe más de una cadena, contribuyendo así a dar a la proteína formolada una estabilidad muy grande. Según Selon Bizzini y Raynaud (1974), se puede representar esquemáticamente el efecto del formol como conducente a la formación en diferentes puntos de la molécula de toxina de uniones fijas representados por los puentes metilénicos, uniendo residuos aminoacil. La contribución de grupos e-NH2 de la lisina permite una estimación cuantitativa.

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Test de reversión. Después del terrible accidente de Japón las autoridades japonesas introdujeron en 1973 en sus minimos requerimientos un test de reversión especifico pero no fue hasta 1983 que se incluyo en los manuales de la OMS. El test básico es diluir el toxoide y guardar la muestra a 4 y 37 ºC por un periodo extenso, usualmente por un mínimo de 3 a 4 semanas . Luego son inyectados cobayos con 5 ml ( 50 Lf/ ml) subcutánea y se observan 21 dias. Si aparecen síntomas o muerte la especificidad de la reacción puede ser confirmada mezclando antitoxina especifica con diluciones del toxoide problema ,si no enferman o mueren la toxicidad corresponde a toxina libre o revertida. Criterios de eficacia de las anatoxinas: Una anatoxina deberá responder al ensamble de una serie de criterios , si va a ser usada eventualmente a los fines de la vacunación: a.- Que esté perfecta e irreversiblemente depurada de toda toxicidad b.- Que sea inmunogénica y produzca anticuerpos neutralizantes en el hombre y los animales, a tasas séricas suficientes, y que posea una afinidad elevada que permita al enfrentarlos con la toxina pueda neutralizar en vivo todos los efectos biológicos determinados por la misma.

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c.-Que induzca los anticuerpos apropiados (por ej. IgA) a nivel tisular ejercidos por el efecto de la toxina: mucosa intestinal, para las toxinas enterotropas ( toxina colérica y toxinas producidas por E. Coli y otras enterobacterias); músculo traqueal para la toxina coqueluchosa,etc. d.- Inducir respuesta inmunitaria durable e.- Que esté desprovista de efectos secundarios, y en particular, que sea lo menos alergizante posible. La obtención de anatoxinas que respondan a estos criterios no es posible para todas las toxinas. Como regla general las que provienen de gérmenes G(+) se detoxifican fácilmente, con conservación del poder inmunogénico. La inmunogenicidad de las anatoxinas está fuertemente potenciada por la asociación con adyuvantes, que se traducen en la aparición de tasas séricas altamente elevadas de anticuerpos neutralizantes y precipitantes, como los descriptos por Raynaud. La situación es diferente para los gérmenes G(-) y para los venenos. El formol asegura bien la detoxificación, pero las anatoxinas correspondientes no son, hasta hoy, buenos inmunógenos

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Temperatura de Inactivacion Salvo casos especiales la temperatura de inactivacion con agentes químicos es de 37 ºC durante un tiempo que es variable según el sustrato a inactivar. Inactivacion fraccionada En algunas toxinas bacterianas la aplicación de metodos clásicos de inactivacion como el agregado de formol por ej al 6%o ocasionan la inactivacion pero a su vez ,destrucción de parte o gran parte de su poder inmunogenico. En estos casos puede recurrirse a la inactivacion fraccionada, a la inactivacion a temperatura ambiente o a ambas. En la inactivacion fraccionada por ej toxoide botulínico C y D , Se agrega formol 2 %o al cultivo total luego se incuba cuatro a cinco dias a 37 ºC y se clarifica y luego vuelve a agregarse formol hasta completar en total el 6 %o. Otro metodo es agregar el total de formol pero incubar a temp. de laboratorio durante un tiempo mas prolongado hasta que los test de detoxificación y reversión sean satisfactorios . Inactivacion de virus Historia: formol, fenol, secado sobre hidróxido de potasio, U.V., etc. Cinética de la inactivación: Idealmente, la inactivación debería seguir una relación exponencial, por ej. El rango de supervivencia debería decrecer exponencialmente en función del tiempo. Sin

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embargo lo más común es la salida de esta ley, y esto se conoce como efecto cola, y se ha tratado de explicar de diversas maneras como por ej. agregación de partículas de virus en grumos , resistentes al inactivante; adsorción de virus en las paredes de los recipientes; presencia de gotas de aerosol en la superficie del líquido;etc. Según la teoría de Gard la permeabilidad estaría reducida por la interacción con la cubierta proteica, y esto ha encontrado asidero adaptándose a la ecuación empírica y a los datos experimentales . La inactivación viral se discute principalmente entre la teoría de simples y múltiples impactos. En la primera, la sola modificación de una base simple dentro del ácido nucleico sería suficiente para inactivar la molécula entera; en la segunda; se requiere la acumulación de un número de impactos subletales antes que el microorganismo sea aniquilado. Qué mecanismo se aplica a una mezcla de inactivante-virus, dependerá de un número de factores, incluyendo la naturaleza de la modificación del ácido nucleico, por ej. la predisposicón a la hidrólisis, y la presencia o ausencia de regiones genéticamente inactivas en el genoma viral. Generalmente han sido y son usados como inactivantes de particulas virales agentes fisicos como los rayos ultravioletas o agentes químicos como el formol, betapropiolactona, glicilaldehido, Hidroxilamina y un grupo conocido como aziridinas : etilenimina ( EI) Acetiletilenimina( AEI) etilenimina binaria (BEI) etc

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Aunque teóricamente también el primer mecanismo podría asimilarse a una reacción cinética de 1º orden, esto en la práctica no se cumple, y lo que aparece es una curva escalonada. Estos agentes actúan como alquilantes cuya acción ya fue descripta. El formol actúa reaccionando con los hidrógenos libres de los grupos aminos de las bases púricas y pirimídicas del ácido nucleico el grado de inactivación es relacionado con el grado de caida del RNA(en el caso de aftosa) infeccioso La curva de inactivación del virus aftoso es muy similar al virus de la polio: una rápida caída inicial, un progresivo retardo en la declinación que es una fase más o menos prolongada y otro retardo al final de la reacción que se realiza en zonas de concentración no medibles por los métodos habituales de control de inactivación llamada efecto de cola que puede prolongarse por un tiempo largo haciendo difícil estimar cuando la inactivación ha terminado realmente. Factores que influyen en el efecto cola de Inactivación: a.- Ambientales: • Almacenamiento prolongado • Temperatura de agregado de formol • Falta de homogeneidad de partículas • Existencia de partículas protegidas • Importancia de la clarificación por filtros • Purificación • PH b.- Propiedades de la partícula vírica

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• Partículas parcialmente inactivadas que dificultan la accesibilidad del formol a la partícula. • Efecto de retardo: puede simular una reacción reversible para aumentar la seguridad, se aumenta el tiempo de contacto. conc. “Reacción no lineal o de 1º orden” viral cola de inactivación tiempo La persistencia de partículas infecciosas a bajas concentraciones pueden ocasionar cuando son aplicadas a campo sobre numerosos individuos :afecciones por vacuna. Naturalmente ello implica restos de virus activo que queden enmascarados en el adyuvante y estas fallas en la inactivación pueden deberse a la forma y tiempo de inactivación, la presencia de partículas gruesas (restos de células o tejidos donde quede enmascarado el virus, temperatura de inactivación etc pero también puede ser ligado al tipo de inactivante

Rápida caída

inicial

Retardo

progresivo

Zona no medible

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Por muchos años la mayoría de las vacunas virales de antígeno inactivado fueron preparadas con formaldehído como agente inactivante. El trabajo de Sven Gaud y col. sobre poliovirus en 1956-1958 demostró que la inactivación de este virus con formaldehído no es lineal o reacción de primer órden y similares resultados fueron obtenidos para aftosa en 1963. Una reciente publicación ha dado la linealidad de la inactivación con formol como una conclusión errónea porque la titulación de la infectividad en la curva de inactivación fue basada en la lectura final de unidad formadora de placa a los 2 dias cuando un virus tratado por formol puede extender marcadamente el período de incubación para su primera replicación en cultivo de células. El período extendido de incubación para virus tratado por formaldehído puede también mostrar que el test de inocuidad en animales es inapropiado para detectar pequeñas cantidades de virus infeccioso residual. Cuando el virus comienza a replicarse entre varios dias y 2 semanas, el animal inicia la producción de Ac. El virus puede ser entonces neutralizado por estos y el animal abortar la infección o hacer enf. subclínica. Esta infección subclínica puede ser detectada testeando el animal para antígeno asociado a la infección viral, la viral RNA polimerasa (VIAA). En 1975 Alonso reportó que animales expuestos a aftosa, vacunados con virus inactivado con formol, de 18 animales, 5 fueron positivos, a VIAA y de 16 animales

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vacunados con vacunas inactivadas con AEI no hubo + a VIAA. Pinto y Gauland vieron más tarde que en animales revacunados con vacunas con AEI hubo + a VIAA , pero la respuesta es mucho más débil y transitoria. Lo mismo fue confirmado para vacunas oleosas, pero sólo luego de la revacunación .

Inactivantes: QUIMICOS: 1.- AZIRIDINAS: Obedecen al desarrollo de gases mostaza en la Iº y IIº Guerra Mundial en particular, la beta-cloroetilamina o mostazas nitrogenadas. La etilenamina (EI) es comunmente preparada por ciclización de la Br-Etilamina hidrobromuro bajo condiciones alcalinas:

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Br-CH2-CH2-NH2 OHNa CH2 CH2 NH . HBr Propiedades de las aziridinas: • Miscibles con el agua y la mayoría de los líquidos orgánicos

• Estructura cíclica abierta cuantitativamente por el tiosulfato

• La sustitución de grupos alquilos en uno de los anilllos de átomos de carbono aumenta el rango de apertura de anillos

• La sustitución en el anillo nitrogenado disminuye el rango de apertura de anillos a pesar que los grupos contiene un grupo electronegativo (ej. Acetil) cuando el rango es aumentado

• Los derivados comunes tienen un bajo punto de ebullición ej. 56.7ºC para EI. La presión de vapor alta es suficiente para que sean un riesgo de inhalación.

• Es objetable su olor amoniacal. • La etilenimina es conocida por reaccionar con grupos alfa o epsilon amino, imidazol, carboxil, sulfidril y fenólicos de las proteínas, fosfatos inorgánicos, glicero y hexosa fosfatos y grupos amino de adenina y tiamina.

imidazol

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Grupos epsilon amino etc Usos: para la producción de vacunas antiaftosas inactivadas, rábicas (0,05%,AEI-6.5 hs,37ºC), seudorabia y parvovirus porcino, también han sido usadas para inactivar hog cólera y virus de influenza A. Hay

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alguna evidencia que AEI es menos efectiva con los virus de doble RNA. También se usan aparte de AEI y EI , propilenimina y etiletilenimina. Condiciones operacionales: AEI y EI inactivan FMDV en una reacción de primer orden. EI se prepara in vitro y se hace la ciclización en el momento previo a su adición al cultivo. Preparada en forma reciente, EI es más activa que AEI , probablemente debido a su vida media mayor. Hay reportes de Bahnemann de EI conservada a 20-40 ºC no perdió potencia. A temperatura ambiente y más las aziridinas tienen tendencia la polimerización. No hay evidencia que sugiera que se afecte la inmunogenicidad de las cepas de virus estables por el tratamiento con las aziridinas . Cuando se hace la ciclización in situ el EI presenta menos riesgo potencial para el personal, pero la eficiencia de la inactivación es más baja. Según Bahnemann, la presencia de bicarbonato en el medio tiene un efecto inhibitorio sobre la reacción de ciclización. AEI y EI pueden ser neutralizados en el medio por la adición de tiosulfato. Aziridinas: 1.- Acetiletilenimina:

Ventajas: • Acción rápida • TºC variable • Sin efecto cola

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• No afecta poder inmunogénico • Mantiene las propiedades serológicas • No degrada las proteínas víricas • Se puede neutralizar con tiosulfato de sodio • Facilita la producción industrial: se pueden mantener partidas inactivadas y conservarse por meses a 4ºC. Uso: 0,05% AEI- 26ºC, a pH 7.6 0,05% AEI a las 24 hs termina la inactivación en otras 24 hs Inconvenientes: • Alta toxicidad para humanos, falta de estabilidad a temperatura ambiente.

2) Etilenimina:

• Sin efecto cola • Conserva poder inmunizante • No degrada el virus • Conserva propiedades serológicas • Curva de inactivación más lenta que AEI pero más rápida que formalina. • Más estable que AEI • Más vida útil. Un año a temperatura ambiente. • Difícil de obtener

3) Otros derivados de la aziridina:

• N- Carbenetani etilenimina • N-acetil etilen imina

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• Etilenimina: aumenta la velocidad de inactivación, aumenta la estabilidad a tºC ambiente. Iguales ventajas que la AEI, EEI y EI, sin peligro tóxico, no hay degradación de partículas de 140 S. • Propilenimina Glicidaldehído: agente alquilante, grupos activos: epoxi y aldehído

2.- FORMALDEHIDO Y OTROS ALDEHIDOS. Química y modo de acción: Muchos de los aldehídos, incluídos el formaldehído y el glutaraldehído, tienden a polimerizar en una serie de derivados de acción no bien definida. El formaldehído reacciona con ambos ácidos nucleicos y proteínas a través de grupos amino expuestos. A pesar de la adición reversible del formaldehído a los grupos amino, hay reacciones de enlaces cruzados más lentos y estables de metilol aminos a través de la condensación con otras cadenas laterales de aminoácidos por puentes metilénicos. Reacciones similares ocurren con los grupos amino de los ácidos nucleicos y probablemente dan lugar a enlaces cruzados dentro del ácido nucleico y entre el ácido nucleico y la proteína adyacente. En la inactivación de poliovirus hay una considerable modificación en la carga de superficie de la partícula viral con la probable formación de puentes entre las moléculas de proteínas adyacentes. “La partícula comienza a hacerse impermeable al formaldehído durante la inactivación, lo que explicaría la presencia de

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partículas sin inactivar tanto en este virus como en aftosa.” Las trágicas experiencias con este inactivante, ha hecho que se restringiera mucho su uso, sobre todo después de los accidentes con vacuna antipolio. 3.- OTROS INACTIVANTES QUÍMICOS: Beta-propiolactona: CH2 -----CH2-------C = O O Ventaja: + rápida acción que el formol. Desventaja: zona estrecha entre la inactivación y pérdida de valor antigénico. Conversión rápida a lactona, baja pH: detiene la inactivación; solución: incorporar buffer de glicina de pH 9. Cancerígeno. Para evitar el efecto cola, complementar con rayos U. V. Hidroxilamina: Conserva propiedades inmunizantes. Desventaja: efecto cola; libera ácido nitroso; tiene efectos mutagénicos. Glicilaldehído: alquilante 0,05% Mantiene propiedades antigénicas; inactivación casi instantánea Ejemplos Sobre virus aftoso: Degradación del antígeno: Por GDA aprox. el 10% ( gliceraldehído) BEI: nula ( etilenamina primaria) Formaldehído: 80%

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Acción sobre péptidos: GDA y BEI: ligera pérdida de péptidos VP, y aparición de VP1a y VP1b Formol: desprendimiento de péptidos externos VP1 y VP1b. Aumento de la densidad flotante de 140S. Beta-propiolactona: semejante al formol. • La zona de pérdida de valor antigénico y la inactivación es más estrecha que para el formol. • Formación de lactona: detiene el efecto inactivante, baja el pH, con posible acción degradante de la proteína 140S. • Efecto cola. Hidroxilamina: • Variación de actividad según el pH y los distintos medios de cultivo. • Influencia deteriorante y mutagénica con el tiempo de por sí o por productos de descomposición , como ácido nitroso. En la última década, la tecnología del DNA recombinante ha supuesto la creación de una nueva generación de vacunas que permiten obviar las limitaciones de las clásicas. La disponibilidad de clonación de genes ha permitido a los investigadores contemplar nuevas estrategias en el desarrollo de vacunas: 1.- Se pueden eliminar (curar) los genes de virulencia de un agente infeccioso y que mantenga la habilidad de estimular una respuesta inmune. En este caso, el organismo modificado genéticamente puede usarse como una vacuna viva sin las preocupaciones acerca de la

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reversión a la virulencia, ya que es imposible que un gen completo pueda ser readquirido espontáneamente durante el crecimiento en cultivo puro. 2.- Se pueden crear sistemas vivos no patógenos que transporten determinantes antigénicos de un agente patógeno con el que no estén relacionados. De esta forma el sistema transportador facilita la inducción de una fuerte respuesta inmunológica dirigida contra el agente patógeno. 3.- Para aquellos agentes infecciosos que no se pueden mantener en cultivo, los genes que codifican para las proteínas que tienen determinantes antigénicos se pueden aislar, clonar y expresar en un huesped alternativo tal como Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae o líneas celulares de mamíferos. Estas proteínas pueden ser formuladas en vacunas de subunidades. Las vacunas de subunidades utilizan sólamente aquellos fragmentos antigénicos más adecuados para estimular una respuesta inmunitaria potente. Los genes de estas subunidades proteicas pueden ser introducidos en el genoma de una bacteria o levadura mediante las técnicas de ingeniería genética. La bacteria o levadura produce estas subunidades en cantidad y son después recolectadas y purificadas para utilizarlas como vacunas.

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INACTIVACIÓN GENICA Otro tema que es conveniente incorporar es la inactivación génica para las vacunas con genes modificados. Se han ensayado diversos métodos desde la utilización de agentes mutagénicos como la luz ultravioleta o agentes químicos, que no dieron los resultados esperados. Más tarde se utilizaron técnicas como el empleo de vectores adecuados que incluyen plásmidos, fagos , trasposones, que permiten la inactivación de los genes por recombinación homóloga y la generación de mutaciones al azar. Muchas veces en estos casos se utilizan vectores suicidas para introducir la modificación que se desea, por ej. se trabaja con un plásmido con un gen que codifica para un producto que resulta en toxicidad o letalidad para la bacteria, este vector puede ser utilizado para introducir una copia inactivada del gen blanco, asegurándose que la recombinación homóloga resulte en un cromosoma recombinante en el cual el gen letal o tóxico se encuentre ausente. Si se produce una recombinación parcial con integración del plásmido en el cromosoma, la transcripción resultante del gen letal impedirá que se aislen recombinantes. Todo esto está en estudio para muchas bacterias vacunales y para su mejor comprensión se deberían tratar en detalle para cada caso particular. g.m.g.2012_Inmuno II