COMUNICACIÓN INFORMÁTICA Y DE SISTEMAS DE DIRECCION

AUTORIDADES DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE

Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo

Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis.

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TRUJILLO QUE OTORGAN EL TÍTULO PROFESIONAL DE

BIÓLOGO-MICROBIÓLOGO

Dr. Orlando Velásquez Benites

RECTOR DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

Dra. Vilma Julia Méndez Gil

VICE-RRECTOR ACADÉMICO DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE

TRUJILLO

Dra. Flor Marlene Luna Victoria Mori

VICERRECTORA ADMINISTRATIVA DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL

DE TRUJILLO

Dr. Regné Cortez Lara

SECRETARIO GENERAL DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO



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AUTORIDADES DE LA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO QUE

OTORGAN EL TÍTULO PROFESIONAL DE BIÓLOGO-

MICROBIÓLOGO

Dr. Hermes Mario Escalante Añorga

DECANO DE LA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

Dr. César Jara Campos

SECRETARIO DE LA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

MsC. Pedro Arnaldo Alvarado Salinas

DIRECTOR DE LA ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE

MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA

MsC. Iván Wilfredo Ángulo Castro

JEFE DEL DEPARTAMENTO DE LA ESCUELA ACADÉMICO

PROFESIONAL DE MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA



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DEL ASESOR

El que suscribe: Ms.C. Juan Héctor Wilson Krugg asesor de la presente tesis

titulada: Efecto “in vitro” de especies nativas de Trichoderma sobre la germinación y

crecimiento de Colletotrichum sp. aislado del distrito de Jaén – Cajamarca.

CERTIFICA:

Que la investigación ha sido desarrollada de conformidad con

su correspondiente proyecto y con las orientaciones pertinentes brindadas a la

tesista.

Que el presente informe ha sido redactado bajo mi asesoramiento, y acoge las

sugerencias y observaciones pertinentes. Por ello, autorizó a la Bachiller Sussy

Yolanda Torres García para continuar con los procedimientos según sus fines.

MSC Juan Hector Wilson Krugg

ASESOR



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PRESENTACIÓN

Cumpliendo con las disposiciones establecidas por el Reglamento de Grados y Títulos

de la Universidad Nacional de Trujillo, presento a su consideración y elevado criterio la

presente Tesis titulada: Efecto “in vitro” de especies nativas de Trichoderma sobre la

germinación y crecimiento de Colletotrichum sp. aislado del distrito de Jaén –

Cajamarca, con el objetivo de obtener el título profesional de Biólogo-Microbiólogo.

Esperando que vuestro criterio sea de comprensión por errores u omisiones

cometidos en la elaboración del presente trabajo, me someto a vuestro dictamen.

Trujillo, Mayo del 2012

Br. Sussy Yolanda Torres García



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MIEMBROS DEL JURADO

Blgo. Mlgo. Gerardo Alayo Espinoza

PRESIDENTE

Ms.C. Juan Héctor Wilson Krugg

SECRETARIO

Ms.C. Eduardo Muñoz Ganoza

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APROBACIÓN

Los profesores que suscriben, miembros del Jurado dictaminador, declaran que el

presente Informe de Tesis titulado: Efecto “in vitro” de especies nativas de Trichoderma

sobre la germinación y crecimiento de Colletotrichum sp. aislado del distrito de Jaén –

Cajamarca, ha cumplido con los requisitos formales y fundamentales, siendo

APROBADO por UNANIMIDAD.

Blgo. Mlgo. Gerardo Alayo Espinoza

PRESIDENTE

Ms.C. Juan Héctor Wilson Krugg

SECRETARIO

Ms.C. Eduardo Muñoz Ganoza

VOCAL



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DEDICATORIA

A Dios por darme la vida, salud, fortaleza, bienestar, ser mi guia y por las muchas

bendiciones en cada momento de mi vida

A mis queridos abuelitos, Juan José y Susana, y a mi madre Norma quienes

con su ejemplo, amor y confianza infinita; trabajo, esfuerzo y sacrificio

diario, lograron darme todo lo que necesito e hicieron posible la

culminación exitosa de mis estudios.

A mi hermana y mejor amiga Grecia que gracias a su ejemplo he podido aprender

muchas cosas importantes y a mi hermano Víctor quien me ayudó con su silencio para

cumplir mis objetivos.



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AGRADECIMIENTOS

Al Mblgo. Juan Wilson Krugg, profesor de la cátedra de Micología y

Fitopatología, por brindarme su amistad, confianza, sugerencias, apoyo constante y

asesoramiento para la realización y culminación este trabajo.

A mi familia, por su apoyo emocional y moral, en especial a esos

maravillosos abuelitos: Susana Pablo y Juan José García, que sin su ayuda,

tolerancia y comprensión no estuviera culminado el presente trabajo.

A mi Madre Norma Ruth García Pablo por su amor maternal, apoyo familiar

y económico, ya que sin su ayuda no se hubiera llevado a cabo la ejecución del

presente trabajo.

A un hombre maravilloso, José Miguel Nuntón León, por su amor

incondicional, apoyo y confianza depositada en mí.

Al círculo de tesistas de Fitopatología y grandes amigos como lo son

Daniela, Alexander, Cristofer, Nilda y el Profesor Miguel Muñoz; por su

desinteresado apoyo, pero sobre todo por su amistad y confianza depositada.



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RESUMEN

Se evaluó el efecto “in vitro” de tres especies nativas de Trichoderma sobre la

germinación y crecimiento de Colletotrichum acutatum. Para esto se recolectaron frutos

y hojas de café con síntomas de antracnosis y muestra de suelo de cultivo de café; de

los cuales se obtuvieron aislamientos nativos de Colletotrichum acutatum y

Trichoderma sp, respectivamente.

Para la evaluación de la germinación de C. acutatum, se obtuvieron mediante recuento

directo de conidias; el porcentaje promedio de la germinación conidial de C.

acutatum frente a Trichoderma viride, Trichoderma aureoviride y Trichoderma

harzianum nativas se encontró estadísticamente una diferencia significativa en dos de

las especies. Para la evaluación de la actividad antagónica de las tres especies

nativas de Trichoderma sobre C. acutatum se empleó la técnica de cultivo dual en

placa, donde los Trichoderma nativos obtuvieron un grado antagónico I según la

escala de Bell et al., los que fueron capaces de crecer sobre el fitopatógeno en condiciones

de laboratorio y Finalmente se realizó la técnica microcultivo con el método del bloque,

evidenciándose mediante observaciones microscópicas, los diferentes mecanismos de

micoparasitismo tales como; fragmentación, formación de clamidosporas,

enrollamiento, penetración y adherencia de las hifas del antagonista; además de la

deformación de las hifas del patógeno por efecto del antagonista.

Concluyendo, que Trichoderma viride, Trichoderma aureoviride y Trichoderma

harzianum nativas disminuyen la germinación conidial y el crecimiento de

Colletotrichum acutatum, siendo Trichoderma harzianum y Trichoderma viride las que

presentan mayor efecto sobre C. acutatum.



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INDICE

Pag.

AUTORIDADES DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO i

AUTORIDADES DE LA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS DE LA

UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO QUE OTORGAN EL TÍTULO

PROFESIONAL DE BIÓLOGO-MICROBIÓLOGO ii

ASESOR iii

PRESENTACIÓN iv

MIEMBROS DEL JURADO v

APROBACIÓN vi

DEDICATORIA vii

AGRADECIMIENTOS viii

RESUMEN ix

ÍNDICE x

INTRODUCCION 1

MATERIAL Y METODOS 6

1. Material biológico 6

2. Procedimiento 6



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2.1. Aislamiento y determinación de C. acutatum 6

2.1.1. Recolección de muestra 6

2.1.2. Aislamiento de C. acutatum 7

2.1.3. Determinación de C. acutatum 7

2.2. Aislamiento y determinacion de Trichoderma nativas 8

2.2.1. Recolección de muestra 8

2.2.2. Aislamiento de Trichoderma nat ivas 8

2.2.3. Determinación de Trichoderma nativas 9

2.3. Selección de Trichoderma “nativo” según su Crecimeinto 9

2.4. Evaluación del efecto invitro de Trichodermas nativas sobre C. acutatum. 9

2.4.1. Evaluación sobre la germinación 9

2.4.2 Evaluación sobre el crecimiento 10

RESULTADOS 13

DISCUSION 19

CONCLUSIONES 24

RECOMENDACIONES 25

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS 26



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ANEXOS 39

Anexo 1: Hoja de Coffea arabica “café” con síntomas de antracnosis

Anexo 2: Observación macroscópica de Colletotrichum acutatum

Anexo 3: Observación microscópica de Colletotrichum acutatum

Anexo 4: Observación macroscópica de Trichoderma sp. “nativas”

Anexo 5: Acción de Trichoderma "nativas" sobre la germinación de C. acutatum

Anexo 6: Número de conidias germinadas de C. acutatum frente a la presencia de

Trichoderma nativas

Anexo 7: Anava de las esporas germinadas de C. acutatum



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INTRODUCCION

La antracnosis es una enfermedad de zonas altas y húmedas pero está en todas las

zonas cafetaleras1, donde afecta principalmente las plantas que tienen mala

fertilización5, que les falta agua

6y que tiene demasiados herbicidas en su sistema

7. Los

principales síntomas son: Las hojas con manchas negras y halo clorótico de bordes

regulares, esto generalmente comienza desde el borde de la hoja y causa su caída

incluso hasta de las ramas, de la misma manera en los frutos comienza con la aparición

de manchas negras para luego producir pudrición2,3,4

, por lo que causa grandes

pérdidas economicas1 La enfermedad suele aparecer cuando hay mucha lluvia, mucho

sol y poca fertilidad.8,9,10,11,12

Colletotrichum sp., causante de la antracnosis, es un hongo que en la naturaleza vive

de la materia orgánica y en ocasiones especiales tiene la capacidad de volverse

patógeno, prefiriendo atacar tejidos muy jóvenes o tejidos muy viejos y físicamente

débiles. Los ataques más severos a los frutos ocurren cuando coinciden el estado más

susceptible del cultivo (floración, fructificación) con un tiempo lluvioso y días de

permanente humedad relativa, mayor del 90%.13

Al menos tres especies de

Colletotrichum se han asociado comúnmente con las plantas de café: C. gloesporoides,

C. acutatum y C. coffeanum, causando enfermedades como la antracnosis de las hojas,

muerte regresiva, quemazón de los frutos maduros y la enfermedad de las cerezas

verdes del café o CBD14

. La alta diversidad encontrada en el amplio grupo de especies

del genero Colletotrichum han sido muy problemática, ya que el diagnostico

fitopatológico requiere identificar con precisión patógenos específicos a fin de realizar

un mejor control de enfermedades. 15,16,17,18,7



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La incidencia de esta enfermedad se incrementa debido a factores como la selección

inadecuada de zonas agroecológicas, distancias de siembra, drenaje, podas,

fertilización, deficiente recolección de frutos afectados e inadecuado uso de

fungicidas.19,8.

Son diversos los métodos de control que se emplean para disminuir la

densidad de Colletotrichum sp., asi tenemos métodos preventivos y prácticas

culturales como un buen programa de fertilización y drenaje, control de maleza y poda

fitosanitaria anual, también el control del exceso de exposición solar favorece el

desarrollo de la enfermedad. Pero el método más usado y el cual tiene mayor

importancia actualmente es el uso de métodos químico incluyendo los productos a

base de cobre (oxicloruro de cobre 50%, Hidroxido de cobre 50%, sulfato de cobre

llamado caldo bordeles o caldo sulfocalcico)20,11

, también conocidos comercialmente

como el Benlate, Dithane M – 45, Daconil, los que representan del 40 al 60% del costo

total de producción21 y 22

. Sin embargo, su uso inadecuado e indiscriminado contamina

el ambiente, desencadenando resistencia del hongo a los fungicidas y toxicidad a

diferentes organismos23

, así como la aparición de organismos plagas secundarios

debido a la eliminación de sus enemigos naturales, acumulación de residuos químicos

en el medio ambiente, un progresivo deterioro del agroecosistema, e intoxicaciones y

enfermedades en el hombre. 24 y 25

Esto ha motivado la búsqueda de métodos alternos de control eficientes, estables,

económicas y compatibles con el medio ambiente26, 12

para el manejo integral de la

enfermedad en particular y el cultivo en general, proponiéndose así el uso de

organismos, entre ellos los hongos, como agentes de control, es decir, el control

biológico. 21,27, 28 29



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Entre los controladores biológicos tenemos a Trichoderma spp.30, 31

que es un hongo

antagonista de hongos fitopatógenos que afectan a cultivos hortícolas. 32, 33

Los

antagonistas contribuyen a la atenuación de los daños que causan las enfermedades, en

los agroecosistemas donde existan condiciones para su desarrollo y conservación. Para

lograr este objetivo los microorganismos beneficiosos presentan diferentes modos de

acción que les permitan ejercer su efecto bioregulador. Estos atributos, junto con la

capacidad que tienen de multiplicarse, se encuentran entre los de mayor importancia

para su selección como agentes de control biológico. 34,35

Se conocen numerosos hongos que se comportan como antagonistas de

Collectotrichum sp.; especies saprofitas del género Trichoderma, habitantes del suelo,

figuran entre los biocontroladores más prometedores e investigados. En el país se

ensayaron varias especies de Trichoderma, obtenidas de diferentes cultivos y

procedencias, para determinar su capacidad antagónica frente a aislamientos del

fitopatógeno. 36,37,10

El género Trichoderma presenta varias especies como T. viride, T.

harzianum, T. virens, T. aureoviride, T. hamatum, T. koningii, de las cuales la primera

ha sido la mas estudiada entre numerosos agentes de control biológico, por sus

características de antagonismo en condiciones naturales12,38,39

; además se comporta

como un hiperparásito frente a un amplio rango de hongos fitopatogenos entre los

cuales esta Rhizoctonia solani40

, Sclerotium cepivorum41,42

, Pythium spp43

,

Phytophthora capsici29

, Fusarium oxysporum

44,45 y Colletotrichum spp.

46

Trichoderma como antagonista tiene diferentes mecanismos de acción entre los que se

encuentran el micoparasitismo que se refiere al parasitismo de las hifas del

fitopatógeno por las hifas del Trichoderma, la competencia por el sustrato y nutrientes

y, la actividad antibiótica producida por metabolitos que inhiben la actividad parasítica



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de los fitopatogenos. 38,47,48,49,50,51,52,53

. En la búsqueda del desarrollo de una tecnología

para la producción de un agente de control biológico se debe dar énfasis a la obtención

de aislamientos nativos, considerados potenciales controladores biológicos ya que

reducen enfermedades en plantas al ser aplicados en campo debido a que presentan un

comportamiento que se adecua a las condiciones agroecológicas de una determinada

región 28,8

que estos a su vez son capaces de mantener su viabilidad, patogenicidad y

virulencia. En este sentido, Smith et al54

señalan que es mejor el aislamiento de un

antagonista que proviene de la misma zona de donde se encuentra el fitopatógeno,

debido a que cada zona geográfica presenta durante el año rangos propios de

temperatura, humedad relativa, pH, etc. 48,55, 56.

Dado que la localidad de Jaén es una de las principales zonas que exporta café

orgánico en nuestra región3 y siendo la antracnosis una enfermedad importante hoy en

día que afecta la calidad del café y produce grandes pérdidas económicas para los

agricultores, los biocontroladores como Trichoderma sp. ofrecen buenas posibilidades

para controlar esta enfermedad y reducir el impacto negativo sobre el medio ambiente,

además que se esta estudiando el uso de hongos antagonistas del genero Trichoderma

“nativos” que tienen ventajas selectivas frente a Trichodermas exógenas, debido a la

gran tolerancia a las condiciones ambientales de su región (Temperatura, humedad

relativa, radiación solar), y fácil adaptación a los cultivos contaminados con

significativas cantidades de productos agroquímicos. Es necesario el conocimiento del

efecto que pueden ejercer las Trichoderma “nativas” al Colletotrichum sp. para

generar información básica para el control biológico de la antracnosis en café

ofreciendo una alternativa ecológica a nuestro agro ecosistema. Por lo que el presente



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trabajo tiene como objetivo conocer el efecto “in vitro” de tres especies nativas de

Trichoderma sp. sobre Colletotrichum sp aislado de Coffea arabica.



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MATERIAL Y METODOS

1. Material de estudio

Diez racimos de Coffea arabica “café arabica" con síntomas característicos de ataque

por Colletotrichum sp. recolectados de la provincia de Jaén del departamento de

Cajamarca.

Un Kg de suelo del cultivo de Café proveniente de la provincia de Jaén del

departamento de Cajamarca.

Cultivo puro de Trichoderma viride proveniente del SENASA

proporcionado por la Cátedra de Fitopatología del Departamento de

Microbiología y Parasitología. Universidad Nacional de Trujillo.

2. Procedimiento

2.1. Aislamiento y determinación de Colletotrichum sp.

2.1.1. Recolección de muestra57

Se recolectaron frutos y hojas de Café con síntomas de

antracnosis por Colletotrichum acutatum, los que se colocaron en

bolsas de papel de primer uso, previamente rotulados, para

posteriormente ser trasladados al Laboratorio de Fitopatología del

Departamento de Microbiología y Parasitología de la Facultad de

Ciencias Biológicas de la Universidad Nacional de Trujillo.; las



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muestras fueron procesadas con el fin de diagnosticar infección por

Colletotrichum acutatum.

2.1.2. Aislamiento de Colletotrichum spp.

De las muestras de hojas de Café recolectadas se separaron las

que presentaban estado de infección intermedia a partir de las cuales se

cortaron los bordes obteniendo parte sana y parte enferma de la hoja

teniendo un tamaño aproximado de 0.5cm2. Previa descontaminación se

continuó el proceso de aislamiento sembrándolo en placas Petri

conteniendo el medio de cultivo Agar Sabouraud más antibiotico, las

mismas que se incubaron en estufa a (25 ± 2ºC). Luego de 5 días se

observó el color, forma y textura de las colonias que se formaron.

2.1.3. Determinación de C. acutatum.

Las colonias que macroscopicamente correspondían a

Colletotrichum sp. se sembraron en tubos de ensayo conteniendo

Agar Sabouraud (ASb) y fueron incubadas a temperatura ambiental

(25 ± 2°C) por cinco días, a fin de obtener un cultivo puro, luego a partir

de éstos se realizaron los microcultivos correspondientes para que

finalmente según las características culturales macroscópicas y mediante

el uso de claves taxonómicas de Gilman58

y Barnett59

determinar que las

colonias obtenidas correspondían a C. acutatum.



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2.2. Aislamiento y determinación de Trichoderma nativas

2.2.1. Recolección de muestra

Se seleccionaron cinco puntos al azar del terreno de cultivo de

café y de cada punto, a una profundidad de 10cm. se recolectó 200g

de suelo, los que se depositaron en bolsas plásticas de primer uso

previamente rotuladas, las que posteriormente se trasladaron al

Laboratorio de Fitopatología de la Facultad de Ciencias

Biológicas Departamento de Microbiología y Parasitología de la

Universidad Nacional de Trujillo para su procesamiento.

2.2.2. Aislamiento de Trichoderma nativas60

Se pesó 10g de la muestra de suelo previo homogenizado, los

cuales se vertieron en 90mL de agua destilada estéril (dilución 10-1

),

posteriormente se tomó 1 mL de la dilución mencionada y se mezcló

en 9mL de agua destilada estéril (dilución 10-2

); repitiéndose

sucesivamente este procedimiento hasta la obtención de una dilución

de 10-4

. Terminado el protocolo anterior se sembró 0,1mL de cada una

de las tres últimas diluciones en placas de Petri conteniendo Agar

Sabouraud (ASb) más estreptomicina (antibiótico), luego se

homogenizó con ayuda de una asa de Drigalsky y finalmente se

incubaron a temperatura ambiental (25 ± 2°C) durante cinco días.



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2.2.3. Determinación de Trichoderma nativas

Las colonias que correspondían a Trichoderma .spp se

sembraron en tubos de ensayo conteniendo Agar Sabouraud (ASb), e

incubaron a temperatura ambiental (25 ± 2°C) por cinco días a fin de

obtener cultivos puros. Transcurrido el tiempo de incubación, se

realizaron los microcultivos correspondientes posteriormente según las

características culturales macroscópicas, microscópicas observadas en el

microcultivo y mediante el uso de claves taxonómicas de Kubicek y

Harman52

se determino las especies de Trichoderma.

2.3. Selección de Trichoderma nativas según su crecimiento.

Se sembraron por puntura en placas de Petri conteniendo ASb, a cada

una de las Trichoderma spp. nativas aisladas del suelo, se incubaron a temperatura

ambiental (25 ± 2°C) y se midió el crecimiento cada 12 horas hasta que cubriera

la placa de Petri, seleccionándose las Trichoderma nativas que presentaron

el mayor crecimiento y esporulación en comparación con Trichoderma

viride utilizado como testigo.

2.4. Evaluación del efecto in vitro de especies nativas de Trichoderma spp.

sobre la germinación y el crecimiento de Colletotrichum acutatum

2.4.1. Evaluación sobre la germinación62

Se obtuvo un inóculo de esporas para cada especie nativa de

Trichoderma mediante una suspensión en agua destilada estéril y se

realizaron diluciones sucesivas hasta conseguir una concentración

de 3.4 x103 esporas/mL. Paralelamente se preparo un inóculo de



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esporas de C. accutatum también con una concentración de 3.4

x103 esporas/mL.

Se colocaron 0.01mL de la suspensión de esporas de C. acutatum en

un frasco de penicilina al cual se le agrego 0.01m1 de la suspensión de

esporas de Trichoderma nativa obtenida previamente. Se prepararon

controles que consistían en colocar 0.01 ml de la suspensiones

de esporas de C. acutatum en 0.01mL de agua destilada estéril. Todos

los frascos en evaluación se incubaron a temperatura ambiental (25 ± 2°C)

durante 24 horas, a cuyo termino se realizo el conteo microscópico de

conidias germinadas y no germinadas de C. acutatum cuyos resultados

se expresaron en porcentajes de la germinación conidial de C.

acutatum.

Finalmente el análisis estadístico se llevó a cabo en base a la prueba

de Análisis de Varianza mediante el Programa Estadístico SPSS, para la

comparación entre los resultados de el porcentaje de la germinación de

C. acutatum frente a cada especie de Trichoderma "nativas"

2.4.2. Evaluación sobre el crecimiento

a. Observación macroscópica del micoparasitismo

En placas de Petri conteniendo ASb se sembraron en

posiciones opuestas y equidistantes a C. acutatum y a cada una de las

especies nativas seleccionadas de Trichoderma, las que se incubaron

a temperatura ambiental (25 ± 2°C) durante siete días. Se

procedió de la misma manera para el caso de Trichoderma



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viride procedente de SENASA, que fue utilizado como control.

A los siete días de incubación se evaluó el grado de

antagonismo según la escala de Bell y col.23

, donde:

Grado Antagónico l: Trichoderma spp. crece completamente sobre la

colonia del patógeno y cubre la superficie del medio de cultivo.

Grado Antagonico 2: Trichoderma spp. crece al menos en las dos

terceras partes de la superficie del medio de cultivo.

Grado Antagonico 3: Trichoderma spp. y el patógeno cubren

aproximadamente la mitad de la superficie del medio de cultivo.

Grado Antagonico 4: El patógeno crece al menos en las dos terceras

partes del medio de cultivo limitando el crecimiento de Trichoderma .spp.

Grado Antagónico 5: El patógeno crece sobre la colonia de

Trichoderma .spp. ocupando toda la superficie del medio de cultivo.

b. Observación microscópica del micoparasitismo48, 61

En una cámara húmeda constituida por una placa de Petri estéril en

cuyo interior se encontraba una lámina portaobjeto ubicada sobre

soportes de vidrio, se colocó en forma aséptica sobre el portaobjeto en

posiciones opuestas y equidistantes dos bloques de ASb de 1 cm2, luego

en uno de los bloques de ASb se sembró C. acutatum y se incubaron

durante 24 horas. Una vez transcurrido este tiempo se procedió a sembrar

en el otro bloque a una de las especies nativas de Trichoderma, se



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procedió de la misma manera para enfrentar contra C. acutatum a las

otras especies nativas así como para Trichoderma viride procedente

de SENASA utilizada como control. A continuación se coloco una

lámina cubreobjeto estéril encima de los bloques de ASb y se agregó al

fondo de la placa, agua destilada estéril; finalmente se incubaron a

temperatura ambiental (25 ± 2°C). Después de cinco días se retiro en

forma cuidadosa el cubreobjeto al cual se habían adherido los hongos y se

coloco sobre una lámina portaobjeto con una gota azul de lactofenol, e

inmediatamente se sello por los bordes; para finalmente realizar

una observación microscópica a fin de observar el

micoparasitismo.



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RESULTADOS

En la figura 1 se observa que los porcentajes de germinación conidial de C.

acutatum, disminuyen frente a las especies nativas de Trichoderma viride, Trichoderma

aureoviride y Trichoderma harzianum y de Trichoderma viride SENASA.

En la figura 2 se muestra que T. viride, T. aureoviride y T. harzianum nativas

presentan un antagonismo clase 1 sobre el crecimiento de C. acutatum , a diferencia de T.

viride SENASA que presento un grado antagónico 2.

En la evaluación microscópica se evidencio los niveles de micoparasitismo de T.

viride, T. aureoviride y T. harzianum nativas obre C. acutatum. tales como;

fragmentación, vocuolización y adherencia de las hifas del antagonista, así mismo la

deformación y formación de clamidosporas de las hifas del fitopatógeno por efecto del

antagonista (Figura 3, 4, 5).



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Fig. 1. Porcentaje de la germinación conidial de Colletotrichum acutatum frente a

Trichoderma viride SENASA y a Trichoderma viride, Trichoderma

aureoviride y Trichoderma harzianum nativas.

.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Control T.viride (SENASA)

T. viride T. harzianum T. aureoviride

100

53.8

24.3

29.9

48.2

% de la germinacion conidial de C. acutatum

a

b

c

c

b

a: p< 0.05 : Si existe diferencia significativa.

b: p> 0.05 : No existe diferencia significativa.

c: p> 0.05 : No existe diferencia significativa.

T.viride SENASA y especies nativas de Trichoderma



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Figura 2. Efecto antagónico de Trichoderma viride SENASA y de las especies nativas

de Trichoderma sobre el crecimiento de C. acutatum, evaluado mediante la técnica de

cultivo dual, observándose un antagonismo de clase 2; a) T. viride SENASA frente a C.

acutatum. y antagonismo de clase 1 b) T. viride frente a C. acutatum c) T. aureoviride

frente a C. acutatum.; d) T. harzianum frente C. acutatum

a) T. viride SENASA

vs C. acutatum

b) T. viride vs

C. acutatum

c) T. aureoviride vs

C. acutatum

d) T. harzianum vs

C. acutatum



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Figura 3. Vista microscópica del efecto micoparasitico de las hifas de Trichoderma viride

sobre las hifas de C. acutatum donde se observa: a) adherencia b) Formación de

clamidosporas c) fragmentanción d) Deformación.

a b

c d

Clamidospora

Adherencia

Deformación Fragmentación



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Figura 4. Vista microscópica del efecto micoparasitico de las hifas de Trichoderma

aureoviride sobre las hifas de C. acutatum donde se observa: a) Adherencia b)

Fragmentación c) Vacuolización d) Formación de clamidosporas.

a b

c d

Fragmentación

Vacuolizacion Clamidosporas

Adherencia



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Figura 5. Observación microscópica del efecto micoparasitico de las hifas de Trichoderma

harzianum sobre las hifas de C. acutatum: a) Adherencia b) Fragmentación c) Formación

de clamidosporas d) Deformación e) Penetración f) Enrollamiento.

c d

f e

a

b Adherencia

Fragmentación

Clamidospora Deformación

Penetración Enrollamiento



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DISCUSION

Los resultados de esta investigación demostraron que los aislamientos nativos

de Trichoderma viride, Trichoderma aureoviride y Trichoderma harzianum presentan

un claro efecto antagónico sobre la germinación y el crecimiento del aislamiento nativo

de Colletotrichum acutatum. En relación a la evaluación in vitro de la germinación

conidial de C. acutatum, esta disminuye significativamente en presencia de las

conidias de T. viride, T. aureoviride y T. harzianum nativas al compararse con el

control, teniendo un porcentaje de germinación entre un 24.3 a 48.2 % (Figura 1), Esta

disminución de la germinación se debe a que las especies Trichoderma tiene la

capacidad de generar enzimas hidroliticas y otras sustancias que disminuyen la

germinación, respecto a esto Carsolio et al.81

menciona al sistema quitinolitico

de un aislado de Trichoderma (aislado TM), el cual está compuesto de dos

enzimas β 1.4-Nacetilglucosaminidasa y cuatro endoquitinasas, donde la enzima

individual más interesante del complejo es la endoquitinasa (42-kDa), la cual puede

hidrolizar in vitro la pared celular de C. acutatum y reducir la germinación de las

esporas y del tubo de elongación de diversos hongos fitopatogenos. Por otra parte, Lorito

et al.33

agregan que la purificación de dos enzimas de Trichoderma harzianum,

degradadoras de la pared celular, la N-acetyl-13-glucosaminidase y 13-1,3-

glucanasa (glucan 1,3-0- glucosidasa) poseen un efecto inhibitorio sinérgico, sobre

la germinación y elongación del tubo germinativo del fitopatógeno, cuando estas

enzimas son aplicadas juntas. También se conoce que Trichoderma genera sustancias

hidrófobas las cuales recubren las esporas del hospedero evitando de esta manera la

afinidad por el agua y así mismo el ingreso de ésta, inhibiendo así la germinación de la

espora del fitopatógeno.



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También podemos evidenciar mediante los resultados que existe una disminución

estadísticamente significativa de la germinación conidial de C. acutatum en presencia de

T. viride y T. harzianum nativos en relación a T. viride procedente de SENASA. Al

respecto Baker y Cook 90

mencionan que los controladores biológicos nativos presentan

una ventaja frente a los controladores biológicos foráneos, de que estos nativos ya

tienen caracteres fisiológicos adaptados a las condiciones ecológicas locales en pro del

control del fitopatógeno. 91

y además tienen como ventaja el reconocimiento inmediato

del fitopatógeno lo cual le brinda un ataque antagónico más agresivo y menor

resistencia del fitopatógeno por lo que puede hacer un control más efectivo.85,92

También se evidencia un porcentaje de germinación conidial menor de C. acutatum

frente a T. viride y T. harzianum nativos los cuales tienen diferencia significativa con

respecto al control y en cuanto a T. aureoviride, esto es debido a que T. harzianum y T.

viride son las especies que tienen la habilidad de generar mayor producción de

metabolítos y enzimas como lectinas las cuales están involucrados en el reconocimiento

y especificidad del ataque al hospedero por parte del agente antagónico79

y en la

interacción hospedero – micoparasito.89

En relación a la evaluación antagónica se puede observar que los T.viride T. harzianum

y T. aureoviride nativos presentan un grado antagonista clase 1 a diferencia del T.

viride procedente de SENASA el cual presenta un grado antagonista clase 2. Estos

resultados confirma lo reportado por varios autores quienes obtuvieron una eficiencia

entre 70% y un 100% de la actividad biocontroladora de cepas nativas de

Trichoderma, de grado antagonico 1, frente a patógenos como Phytophthora capsici29

,

Fusarium oxysporum44,45,64

, Pythium spp43

, Rhizoctonia solani40,65,66

, Botrytis cinerea y



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Oidium sp.67

, Sclerotium cepivorum41,42,68

,Sclerotinia sclerotiorum69

, Alternaria dauci70

y

Colletotrichum spp.46,71,72

Según Suton J. et al. nos menciona que Trichoderma se

caracteriza por un crecimiento rápido el cual ofrece una ventaja importante en la

competencia por espacio y nutrientes el cual ejerce biocontrol al reducir o detener

completamente el desarrollo del micelio del fitopatogeno63,73

y asi mismo crecer cubriendo

la colonia del fitopatogeno.75,40,94

Uno de los mecanismo que utiliza Trichoderma es la producción de

moléculas toxicas volátiles o enzimas hidrolíticas76,77

como son quitinasas, glucanasas,

lipasas y proteasas; las cuales se inducen durante la acción parasítica de las especies de

Trichoderma sobre algunos hongos patógenos80,81

donde las enzimas disuelven o dañan

polímeros estructurales, como quitina y glucanos de la pared celular de los hongos

fitopatógenos, produciendo un efecto adverso sobre su desarrollo82

. En cuanto a los

resultados, en la Figura 2 nos permite visualizar que los Trichoderma nativos tienen

un grado mayor de antagonismo in vitro logrando sobrecrecer en su totalidad en la

colonia de C. acutatum, esto se debe a que son hongos antagonistas adaptados a las

condiciones ambientales y generan un ataque in vitro mas agresivo por tener un previo

reconocimiento del fitopatógeno, atribuyendo a su actividad antagónica de

micoparásitos, la producción de ciertos metabolítos difusibles y altamente tóxicos de

naturaleza enzimática acompañados por otros compuestos antibióticos encargados de la

inhibición del crecimiento y la actividad parasítica del patógeno tales como;

viridin, trichodermin, gliotoxin, harzaniolide83

, trichotoxina, gliovirina entre otros84

generados en cantidades que causan la muerte o destrucción de su hospedero78,79

;.



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Estas observaciones coinciden con Malajczuk95

donde señala que cepas nativas de

Trichoderma sobrecrecen y parasitan mejor a Phytophthora que las Trichoderma

exógenas. De la misma manera Aranzazu et al.13

obtuvieron resultados semejantes,

donde especies nativas de Trichoderma viride y T. harzianum nativos, especies

ampliamente citadas como antagonistas para el control de Colletotrichum sp., fueron

capaces de inhibir el crecimiento de este fitopatógeno; además resultados comparados por

Freeman et al.88

quienes aislaron cepas nativas de Trichoderma, capaces de reducir el

crecimiento de C. acutatum en ensayos en condiciones controladas.

En el micoparasitismo, cuando el micoparásito llega al hospedero, las hifas se enrollan

alrededor o son adheridas al hospedero y algunas veces penetran en él81

, siendo la

penetración del antagonista al micelio del fitopatógeno aparentemente debida a la parcial

degradación de la pared celula79

. Mediante observaciones microscópicas de los

puntos de interacción entre los micelios de las especies T. viride, T. harzianum,

T. aureoviride nativos y C. acutatum (Figura 3, 4, 5), se observa que el antagonista

establece un contacto estrecho con el patógeno mediante la adherencia (Figura 3.a , 4a

y 5a ) y el enrollamiento de las hifas y (Figura 5f ); resultados similares fueron

reportados por Elad et al79

, Benhamou y Chet85

y Benhamou et al.86

, quienes presentaron

evidencias del enrollamiento de Trichoderma spp. en hifas de varios fitopatógenos, entre

ellos R. solani, S. rolfsii . Después de cinco días, el antagonista se multiplico

abundantemente; observándose signos de deformación, como las aparentes arrugas

de las hifas del hospedero (Figura 3d y 5.d); hallazgos también reportados por

Benhamou et al.86

y Calistru et al.87

quienes sugieren que este fenómeno es debido a la

excreción de metabolítos extracelulares o compuestos volátiles una vez que el contacto



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entre ambas panes se establece, ocurriendo posteriormente la pérdida de turgencia del

micelio del fitopatógeno provocando su muerte.

Estos resultados junto con las pruebas de enfrentamiento demuestran la capacidad

antagónica que tienen los aislamientos nativos de Trichoderma en condiciones de

laboratorio; ya que además de inhibir el crecimiento vegetativo y la formación de

clamidosporas en el patógeno (Figura 3b, 4d, 5c) parasitan sus hifas, fragmentándolas

(Figura 3c, 4b, 5b) e impidiendo su desarrollo61

; asi los tres aislamientos nativos reúnen

las características para ser catalogados como controladores biológicos de C.

acutatum destacando la mayor efectividad en las especies T. viride y T.

harzianum las cuales tienen buenas perspectivas para ser utilizados en campo

por ser aislamientos nativos con comportamientos que se adecuan a las condiciones

agroecológicas como son temperatura, humedad relativa, radiación solar, además de

poseer tolerancia y adaptación a cantidades significativas de productos

agroquímicos.



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CONCLUSIONES

Trichoderma viride, Trichoderma aureoviride y Trichoderma harzianum

nativos disminuyen la germinación conidial de Colletotrichum acutatum.

Trichoderma harzianum y Trichoderma viride son las especies que presentan

mayor efecto sobre la germinación de C. acutatum, no existiendo diferencia

significativa entre estas últimas.

T. viride, T. aureoviride, T. harzianum nativas disminuyen el crecimiento de C.

acutatum.

T. viride, T. aureoviride, T. harzianum nativas presentan adherencia,

enrollamiento, fragmentación, vacuolización y penetración sobre las hifas de C.

acutatum.



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RECOMENDACIONES

Tener en cuenta los factores ambientales como la temperatura y la

humedad para el crecimiento de Trichoderma spp. Para poder identificar las

variaciones fisiológicas de Trichoderma frente a los distintos factores ambientales

locales en donde será aplicado como controlador biológico.

Realizar ensayos en condiciones semicontroladas (en invernadero) y en

condiciones de campo. Para identificar ciertos factores que influyen negativamente o

positivamente con la optima función controladora.



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ANEXOS



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Anexo 1: Hojas de café con síntomas de antracnosis producidas por Colletotrichum

acutatum recolectados de Jaen – Cajamarca.



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Anexo 2: A) Observación macroscópica de Colletotrichum acutatum aislado a partir de

hojas de café. B) Observación microscópica de Colletotrichum acutatum aislado a partir

de hojas de café



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Anexo 3: Observación macroscópica de las Trichodermas spp. “nativas” aisladas a

partir de suelo de cultivo de Café.



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Anexo 4. Número de conidias germinadas de C. acutatum frente a la presencia de las

conidias de T. viride T. harzianum y T aureoviride a las 24 horas de incubación.

Ensayo

A.D.E Conidias

de T. viride

SENASA

Conidias de

T. viride

Conidias

de T.

harzianum

Conidias de

T.

aureoviride

1 73 41 18 16 32

2 83 61 17 18 35

3 58 65 17 30 36

× 71.3 55.7 17.3 21.3 34.3

Nº de conidias germinadas de C. acutatum Vs.



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Anexo 5. Análisis de varianza del porcentaje de germinación ce C. acutatum frente a las

diferentes especies de Trichoderma

ANOVA de un factor

ANOVA

PG

Suma de

cuadrados gl

Media

cuadrática F Sig.

Inter-

grupos 10728.964 4 2682.241 95.095 .000

Intra-

grupos 282.060 10 28.206

Total 11011.024 14



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Anexo 6. Poblaciones estadísticas encontradas al comparar el porcentaje de C. acutatum

frente a las diferentes especies de Trichoderma

Subconjuntos homogéneos

PG

HSD de Tukey

TTO N Subconjunto para alfa = .05

1 2 3 1

C. acutatum

vs T. viride

3 24.2667

C. acutatum

vs T.

harzianum

3 29.9000

C. acutatum

vs T.

aureoviride

3 48.1667

C. acutatum

vs T. viride

SENASA

3 53.7667

C. acutatum 3

100.000

0

Sig. .698 .702 1.000

Se muestran las medias para los grupos en los subconjuntos homogéneos.

a Usa el tamaño muestral de la media armónica = 3.000.



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COMUNICACIÓN INFORMÁTICA Y DE SISTEMAS DE DIRECCION

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