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CONCLUSIONES

Las hortalizas crecidas en cámaras OTC con aire filtrado presentaron un aspecto normal, pero las plantas expuestas a ozono durante su crecimiento mostraron claros y diferentes síntomas en hojas.

Investigaciones a nivel de la ultraesctructura celular pusieron en evidencia una sensibilidad selectiva de las células del parénquima en empalizada, alteraciones de la membrana celular así como de los cloroplastos; permaneciendo sin alteraciones aparentes las mitocondrias y los tejidos vasculares en todas las especies de hortalizas ensayadas; exceptuando la acelga, que aunque sí mostró síntomas de daños en la superficie de las hojas, estas lesiones no llegaron a afectar la ultraestructura celular de la misma o al menos no pudimos llegar a observarlas.

Por consiguiente, el ozono puede ser considerado el agente causal de los efectos fitotóxicos descritos.

BIBLIOGRAFÍA Gerlach D. 1969. A rapid safranin-crystal violet-light green staining sequence for

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Heagle A.S., R.B. Philbeck, H.H. Rogers, M.B. Letchworth. 1979. Dispensing and monitoring ozone in open-top field chambers for plant-effects studies. Phytopathol .69,15-20.

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Figura 5. Acelga

Figura 6. Guisante

5a 5d

5b 5c

6a

6b

6d

6c

6

Figura 3. Perejil

Figura 4. Alcachofa

3a

3b 3c

3d

4a

4b 4c

4d

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tamaño, discontinuidad de la membrana, la desorganización de los mismos y la desintegarción de los tilacoides llegando a afectar la capacidad fotosintética de la planta. Los tejidos vasculares estaban aparentemente íntegros Las mitocondrias tampoco presentan anormalidades.

Figura 1. Judía

Figura 2. Patata

1a 1e

1b 1d 1c

2a 2d

2b 2c

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las células sólo difieren del estado vivo normal en el hecho de estar congeladas y la segunda es que la fractura no se produce según un plano sino a lo largo de superficies de mínima resistencia (región hidrofóbica de las membranas, preferentemente) lo que da lugar a imágenes tridimensionales. 5.- Procesado de las muestras para su observación al microscopio electrónico de transmisión (MET): Las muestras fueron observadas en un MET (Philips M-400) y para ello previamente fueron procesadas siguiendo la técnica convencional de preparación de muestras biológicas para el estudio de secciones mediante microscopia electrónica de transmisión y que comprenden las siguientes etapas: Fijación en glutaraldehido al 2%. Inclusión en resina Spurr de baja viscosidad (Taab Laboratories Equipment, Reino Unido). Esta resina, introducida en 1969, está dotada de excelentes cualidades de penetración que la hacen especialmente adecuada para tejidos y muestras duras. Asimismo es ampliamente utilizada en muestras con un alto contenido lipídico, en tejidos con paredes lignificadas, y en muestras de tejido parenquimático altamente vacuolado. Ultramicrotomía para obtener secciones menores de 100nm de espesor con un ultramicrotomo (Reichert).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN Síntomas macroscópicos

Las hortalizas crecidas en cámaras OTC con aire filtrado presentaban un aspecto normal (ver como ejemplo la figura 1e: judía crecida en AF), con modesta clorosis a cargo del follaje basal, debido a la tasa de actividad fotosintética, transpiración y producción significativamente superior a aquellas expuestas al aire ambiente.

Las plantas expuestas a ozono durante su crecimiento mostraron claros y diferentes síntomas en hojas adultas (Figs. 1a, 2a, 3a, 4a, 5a y 6a). Estos síntomas consistían en clorosis generales o puntuales, áreas con puntos rojizos-necróticos uniformemente repartidos por la superficie de las hojas, decoloraciones que adquirían, en estado más avanzado, un aspecto plateado que podía llegar a cubrir toda la hoja o formar manchas circulares. Los tejidos inmediatamente adyacentes al nervio principal de las hojas tendían a mantener su aspecto normal. En la superficie del envés de las hojas se observaba una clorosis difusa y algo irregular.

Síntomas a nivel ultraestructural

Los estudios realizados mediante el empleo de microscopia pusieron en evidencia que la sintomatología observada en las diferentes hortalizas estudiadas se correspondía con alteraciones de la membrana celular y modificaciones ultraestructurales a nivel de la epidermis, parénquima lagunar, parénquima en empalizada y en ocasiones se podía observar un completo vaciado del contenido celular, con el consecuente colapso de las paredes celulares y formación de un amplio espacio intercelular (Figs 1b, 2b, 3b, 4b, 5b y 6b), así como la suberificación o lignificación de dichas células (teñidas de rojo) (Figs.1c, 2c, 3c, 4c, 5c y 6c). Estas alteraciones en la membrana celular podrían provocar una alteración de la permeabilidad; y en consecuencia la fotosíntesis y la respiración quedarían afectadas, debido a desequilibrios iónicos en el plasmalema y la subsiguiente alteración de los procesos metabólicos. Dichas alteraciones ustrestructurales no se observaron en tejidos de hortalizas crecidas en cámaras OTC con aire filtrado (Figs. 1d, 2d, 3d, 4d, 5d y 6d). En los cloroplastos se observaron alteraciones tales como reducción de su

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Las plantas fueron sembradas en bandejas de alveolos de plástico negro e introducidas en estas cámaras OTC. Fueron utilizados filtros de carbono para eliminar el ozono en las cámaras de aire filtrado (AF), y así poder comparar la evolución de los síntomas respecto a las cámaras con aire no filtrado (ANF) y fumigadas con ozono (FU). Las plantas fueron fertirrigadas utilizando un sistema de riego por goteo. A los 30 días de entrar las plantas en estas cámaras fueron procesadas para el estudio de los cambios ultraestrucurales. Aunque las cámaras abiertas (OTC) afectan el ambiente en el que se encuentra la planta, estos efectos son menores que en cámaras cerradas y además no se ha encontrado ninguna prueba de que cambien la sensibilidad de las plantas (Heagle et al., 1979). 3.-Procesado de las muestras para su observación al microscopio óptico (MO): La técnica empleada en la preparación de las muestras biológicas para el estudio de secciones mediante microscopía óptica se realizó en las siguientes etapas: Fijación del material con solución fijadora de FAE (formaldehido del 40%, ácido acético glacial, alcohol etílico del 60%; 2:1:17 en volumen) durante 24 horas. Deshidratación en soluciones de concentraciones crecientes de alcohol etílico y alcohol butílico terciario (ABT) (Johansen, 1940), Inclusión en parafina de 56-58ºC de fusión (Histosec, Merck) de forma progresiva en una estufa a 60ºC. Tras la infiltración de la parafina, las muestras utilizadas fueron incluidas individualmente en moldes donde se había puesto parafina fundida para que al solidificarse formara un bloque. Cortes con microtomo par la obtención de cortes histológicos del material vegetal incluido empleando un microtomo de guía (Reichert OmE) con un espesor de 25 µm. Desparafinado e hidratación con xileno y etanol Tinción de Gerlach con una combinación de tres colorantes: safranina, cristal violeta y verde claro amarillento. El uso de esta tinción permite teñir diferencialmente las paredes celulares lignificadas y el nucleolo (color rojo), granos de almidón (color violeta), citoplasma y celulosa (color verde) (Gerlach, 1969). 4.- Procesado de las muestras para su observación al microscopio electrónico de barrido (MEB): En el MEB, la imagen se obtiene generalmente a partir de los electrones secundarios emitidos por la muestra tras incidir sobre ella el haz de electrones y recorrer el área de estudio. Por tanto, permite el estudio de la superficie de la muestra y no son necesarias secciones de la misma, aportando una visión tridimensional. Para obtener imágenes de buena calidad, se requiere que la composición de la superficie de la muestra, sea buena emisora de electrones. Dado que esto último no se cumple cuando se estudia material biológico, es necesario recubrir la superficie del mismo con una fina capa metálica (oro, platino o paladio), concretamente en éste trabajo se empleó oro. Las muestras fueron observadas en el MEB (Jeol JSM-5410 Scanning Microscope) y siguiendo un protocolo de preparación que consta de cuatro fases consecutivas: Fijación física por congelación (criofijación) con nitrógeno líquido, durante 10 minutos a -190ºC. Fractura de las secciones a estudiar (criofractura) de la hoja de 4-5 mm2. Sublimación llevando la muestra de sólido (-190ºC) a vapor (-85ºC), durante 10-15. Recubrimiento con orgetal (oro) en una unidad de alto vacío. Esta vía de preparación del material presenta dos ventajas fundamentales respecto a la técnica convencional que se usa en microscopia electrónica. La primera es que se omiten las etapas de fijación química, deshidratación e inclusión, con lo que

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contaminación. Por sus peculiares características de generación y por ser un agente fitopatógeno en potencia; el ozono debe ser considerado como un problema así como un factor a tener en cuenta en los estudios de impacto ambiental en nuestras condiciones climáticas. Como inicio y previo al estudio de la interacción entre los factores enfermedad-hospedador-agente oxidante, en el presente trabajo se pretende conocer el propio daño y los cambios citopatológicos que desencadena el ozono en diferentes cultivos hortícolas expuestos a diferentes concentraciones del mismo, comparar su respuesta con plantas que no han sido expuestas a estos ambientes, y establecer una correlación entre síntomas visuales de daños y su correspondencia con modificaciones intracelulares.

MATERIAL Y MÉTODOS 1.-Material biológico: Las especies utilizadas en el trabajo fueron las siguientes: acelga (Beta vulgaris L. var. cicla L. vars. Giant y Amarilla de Lyon), alcachofa (Cynara scolymus L. var. Blanca de Tudela), Apio ( Apium graveolens L. var. autóctona), guisante (Pisum sativum L. vars. Paladio, Lincoln y Alaska), haba (Vicia faba L. var. Carmen y var. Histal), hinojo (Foeniculum dulce D.C. var. L´Horta), judía (Phaseolus vulgaris L. var. Perona), patata (Solanum tuberosum L. var. Desiree”B”), perejil (Petroselinum sativum Hoffn. var. Perejil común de hoja lisa), zanahoria (Daucus carota L. var. Mantesa5-Coral), lechuga (Lactuca sativa var. longifolia Lam var. Romana del Prat y var. capitata L. vars. Cogollo de Tudela e Iceberg-El Toro ), rábano (Raphanus sativus Merr. vars. Media larga Pernot y Cherry Belle) y bróculi (Brassica oleracea L. var. italica Plenck var. High Sierra). Para su observación y estudio al microscopio óptico, microscopio electrónico de transmisión y de barrido se seleccionaron aquellas hojas que presentaban síntomas visibles de supuestos daños por ozono provenientes de ambiente con fumigación de ozono y hojas provenientes de ambiente filtrado. 2.-Diseño experimental: Los experimentos se realizaron en cámaras descubiertas (Open Top Chamber, OTC) (Fig. 1) en la Finca Agricola "La Peira" en Benifayo (Valencia), con cuatro ambientes experimentales distintos: aire filtrado (AF), aire ambiente no filtrado (ANF), ANF enriquecido con 50 ppb de ozono (FU+50) y ANF enriquecido con 100 ppb de ozono (FU+100). En las cámaras fumigadas, la fumigación duraba 8 horas, desde las 8:30 hasta las 16:30 (hora solar).

Figura 1. Cámaras OTC donde se cultivaron las plantas ensayadas

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ESTUDIO DE LOS DAÑOS PROVOCADOS POR LA INCIDENCIA DE OZONO EN PLANTAS HORTÍCOLAS M.I. Font1, J.P. Rubio1, A. García2, M.J. Sanz3 y C. Jordá1 1 Instituto Agroforestal Mediterráneo, Universidad Politécnica de Valencia, Camino de Vera s/n 46022, Valencia. Email: mafonsa@upvnet.upv.es, 2Departamento de Biología Vegetal, Universidad Politécnica de Valencia, Camino de Vera s/n 46022, Valencia. Email: dgarcia@bvg.upv.es, 3Centro de Estudios Ambientales del Mediterráneo (C.E.A.M.), Parque Tecnológico, Sector Oeste, Calle 4, 46980 Valencia, España. E-mail: mjose@ceam.es RESUMEN En los últimos años se vienen observando daños en los cultivos que no siempre se corresponden con la incidencia de agentes fitopatógenos, atribuyéndose de forma totalmente gratuita a agentes contaminantes o directamente a daños ocasionados por ozono, sin existir estudios profundos sobre el tema o sin comprobar de forma exhaustiva tales afirmaciones; hecho que sí está abordado en otros países que, como nosotros, sufren la incidencia de agentes oxidantes. El presente trabajo estudia la sintomatología externa y los daños a nivel de la ultraestructura celular ocasionados por el ozono en varias especies de hortalizas mediante la observación de tejidos vegetales al microscopio óptico, microscopio electrónico de transmisión y barrido. Los resultados obtenidos demuestran que la sintomatología observada en diferentes hortalizas es debida a efectos fitotóxicos ocasionados por este oxidante y que se corresponden con modificaciones ultraestructurales a nivel de la epidermis, parénquima lagunar, parénquima en empalizada y a la destrucción de cIoroplastos, llegando a afectar la capacidad fotosintética de la planta. Palabras clave: O3, fitotoxicidad, oxidante, ultraestructura, MEB. INTRODUCCIÓN El aire constituye uno de los elementos básicos de todo ser vivo y es por eso que el estudio y control de la calidad del mismo es de gran importancia. Con el advenimiento de la era industrial, el problema de la contaminación atmosférica adquiere toda su magnitud, llegando en nuestros días a constituir un motivo de substancial inquietud, no sólo por los daños que puede provocar en la salud humana, sino por el perjuicio que puede inducir en la vegetación, y en especial en los cultivos agrícolas. Dentro de la contaminación ambiental, numerosos estudios han demostrado el relevante papel que representan los productos oxidantes como inductores del desencadenamiento de una mayor presencia de enfermedad en las plantas. Uno de los componentes oxidantes más importantes es el ozono troposférico, que se considera fitotóxico cuando supera los niveles de 65µgr/m3 como promedio de 24 horas. La formación de ozono proviene mayoritariamente de reacciones fotoquímicas a partir de humos ricos en óxidos de nitrógeno, procedentes de la combustión de combustibles fósiles (carbón, gas natural, petróleo y derivados) y de contaminantes orgánicos. Las nubes de humos procedentes de centrales térmicas, complejos petroquímicos, fábricas de abonos, tráfico de coches, etc. se transforman, en presencia de elevadas temperaturas, de radiación solar y de una estabilidad atmosférica, en diversos contaminantes; entre ellos el ozono, que puede ser trasladado por los regímenes de vientos a grandes distancia hacia zonas rurales, en las que será difícil correlacionar sus efectos sobre la vegetación con problemas de