CONTAMINACIÓN MICROBIANA DE LOS ALIMENTOSVENDIDOS EN LA VÍA PÚBLICA EN CIUDADES DE

AMÉRICA LATINA Y CARACTERÍSTICASSOCIO-ECONÓMICAS DE SUS

VENDEDORES Y CONSUMIDORES

Organización Panamericana de la SaludOficina Sanitaria Panamericana . Oficina Subregional de la

Organización Mundial de la Salud

Instituto Panamericano de Protección de Alimentos y ZoonosisPrograma de Salud Pública Veterinaria

COMITE EDITORIAL

Dr. Claudio R. AlmeidaMédico VeterinarioAsesor RegionalPrograma de Salud Pública VeterinariaOrganización Panamericana de la SaludWashington, DC - USA

Dra. Dulce Maria T. SchuchMédico VeterinarioLaboratorio de Referencia AnimalMinistério da Agricultura e do AbastecimentoPorto Alegre, RS - Brasil

Dra. Dilma Scala GelliMicrobiólogo de AlimentosInstituto Adolfo LutzSecretaria de Saúde do Estado de São PauloSão Paulo, SP - Brasil

Dr. Juan A. CuéllarMédico VeterinarioConsultorInstituto Panamericano de Protección de Alimentos y ZoonosisPrograma de Salud Pública VeterinariaOrganización Panamericana de la SaludMartínez, Pcia. de Buenos Aires - Argentina

Dra. Ana V. DiezMédicoSchool of Public HealthThe Johns Hopkins UniversityBaltimore, MD - USA

Dr. José A. EscamillaMédicoSchool of Public HealthThe Johns Hopkins UniversityBaltimore, MD - USA

TABLA DE CONTENIDO

Prólogo .....................................................................................................................................5

1. RESUMEN...........................................................................................................................6

2. INTRODUCCION...............................................................................................................7

3. REVISIÓN DE LA LITERATURA...................................................................................9

4. OBJETIVOS ..................................................................................................................... 27

5. MATERIAL Y METODOS.............................................................................................. 28

6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN...................................................................................... 36

7. CONCLUSIONES............................................................................................................ 65

Referencias Bibliográficas .................................................................................................. 67

ANEXOS................................................................................................................................ 77

Anexo 2.................................................................................................................................78

Anexo 3.................................................................................................................................81

Anexo 4.................................................................................................................................85

Anexo 5.................................................................................................................................87

Anexo 6...............................................................................................................................113

Anexo 7...............................................................................................................................117

AgradecimientosAgradecimientos

La Organización Panamericana de la Salud desea expresar suLa Organización Panamericana de la Salud desea expresar suagradecimiento a todas las personas y entidades que prestaron suagradecimiento a todas las personas y entidades que prestaron sucolaboración decidida a este estudio y en especial:colaboración decidida a este estudio y en especial:

C A las autoridades nacionales y locales de salud en las ciudadesA las autoridades nacionales y locales de salud en las ciudadesparticipantes, por su apoyo en la fase operativa del estudio.participantes, por su apoyo en la fase operativa del estudio.

C A las entidades no gubernamentales que apoyaron el desarrollo delA las entidades no gubernamentales que apoyaron el desarrollo delestudio.estudio.

C Al Banco Interamericano de Desarrollo (BID), por su valioso aporteAl Banco Interamericano de Desarrollo (BID), por su valioso aportefinanciero a través del Convenio BID/OPS ATN/TF-3879-RE, parafinanciero a través del Convenio BID/OPS ATN/TF-3879-RE, paraapoyo al control y prevención de la epidemia de cólera.apoyo al control y prevención de la epidemia de cólera.

C Al Instituto AdolfoAl Instituto Adolfo Lutz, por sus servicios como laboratorio deLutz, por sus servicios como laboratorio dereferencia para el estudio.referencia para el estudio.

C A los vendedores y consumidores de alimentos en vía publica de lasA los vendedores y consumidores de alimentos en vía publica de lasciudades participantes en el estudio.ciudades participantes en el estudio.

C Al personal de campo que colaboró en la realización de encuestas yAl personal de campo que colaboró en la realización de encuestas yrecolección de muestras.recolección de muestras.

C Al cuerpo de analistas de los laboratorios de microbiología deAl cuerpo de analistas de los laboratorios de microbiología dealimentos mencionados alimentos mencionados enseguida:enseguida:

Instituto Nacional de Laboratorios de Salud - La Paz, BoliviaInstituto Nacional de Laboratorios de Salud - La Paz, Bolivia

UniversidadUniversidad AJorge Jorge Tadeo Tadeo LozanoLozano@ - - Santafé de Bogotá, ColombiaSantafé de Bogotá, Colombia

Departamento de Laboratorios del Municipio de Quito, EcuadorDepartamento de Laboratorios del Municipio de Quito, Ecuador

Instituto de Nutrición, Alimentación y Control de Calidad de AlimentosInstituto de Nutrición, Alimentación y Control de Calidad de Alimentos- Lima, Perú- Lima, Perú

Instituto Dominicano de Tecnología Industrial - Santo Domingo,Instituto Dominicano de Tecnología Industrial - Santo Domingo,República DominicanaRepública Dominicana

Laboratorio Unificado de Control de Alimentos y Medicamentos -Laboratorio Unificado de Control de Alimentos y Medicamentos -Ciudad de Guatemala, GuatemalaCiudad de Guatemala, Guatemala

Laboratorio Nacional de Salud Pública - Ciudad de México, México.Laboratorio Nacional de Salud Pública - Ciudad de México, México.

Laboratorio Estatal de Salud Pública del Estado de Sinaloa - Culiacán,Laboratorio Estatal de Salud Pública del Estado de Sinaloa - Culiacán,México.México.

Prólogo

Pocas manifestaciones de la vida moderna en nuestras ciudades dePocas manifestaciones de la vida moderna en nuestras ciudades deAmérica Latina han tenido tanta repercusión en el diario vivir de suAmérica Latina han tenido tanta repercusión en el diario vivir de supoblación y han sido objeto de tanta polémica como la venta de alimentos enpoblación y han sido objeto de tanta polémica como la venta de alimentos enlas vías públicas.las vías públicas.

Un aspecto indiscutible en relación con la venta callejera deUn aspecto indiscutible en relación con la venta callejera dealimentos, es el riesgo potencial de causar enfermedad en la población poralimentos, es el riesgo potencial de causar enfermedad en la población porlas dificultades que entraña su preparación y venta en condiciones delas dificultades que entraña su preparación y venta en condiciones deinocuidad, frente a lo cual la epidemia de cólera que afectó a nuestrainocuidad, frente a lo cual la epidemia de cólera que afectó a nuestraRegión, acrecentó la crisis de confianza en cuanto a la calidad de estosRegión, acrecentó la crisis de confianza en cuanto a la calidad de estosalimentos.alimentos.

Considerando que una oportunidad de investigar la eventualConsiderando que una oportunidad de investigar la eventualprevalencia de cólera en los alimentos callejeros en ciudades de Américaprevalencia de cólera en los alimentos callejeros en ciudades de AméricaLatina, podría facilitar el conocimiento de la situación de los mismosLatina, podría facilitar el conocimiento de la situación de los mismosrespecto de su contaminación por otros patógenos reconocidos enrespecto de su contaminación por otros patógenos reconocidos enalimentos, la Organización Panamericana de la Salud, en colaboración conalimentos, la Organización Panamericana de la Salud, en colaboración consus Estados Miembros, decidió la realización del presente estudio.sus Estados Miembros, decidió la realización del presente estudio.

Con sus resCon sus resultados, esperamos brindar un aporte al conocimientoultados, esperamos brindar un aporte al conocimientocientífico no solo los aspectos puramente biológicos relacionados con lacientífico no solo los aspectos puramente biológicos relacionados con lacalidad sanitaria de alimentos vendidos en las vías públicas, sino aquelloscalidad sanitaria de alimentos vendidos en las vías públicas, sino aquellosde orden social y económico que puedan contribuir a una mejor de orden social y económico que puedan contribuir a una mejor formulaciónformulaciónde las acciones de intervención tendientes a corregir la problemática de lasde las acciones de intervención tendientes a corregir la problemática de lasenfermedades transmitidas por alimentos (ETA). Además, se espera que laenfermedades transmitidas por alimentos (ETA). Además, se espera que lametodología analítica, metodología analítica, estandarizada para la búsqueda e identificación deestandarizada para la búsqueda e identificación delos microorganismos estudiados y el programa de garantía de calidad que selos microorganismos estudiados y el programa de garantía de calidad que sepreparó especialmente para el estudio, sean útiles en la conducción futurapreparó especialmente para el estudio, sean útiles en la conducción futurade trabajos similares.de trabajos similares.

George A. O. George A. O. AlleyneAlleyneDirectorDirector

1. RESUMEN

Se evaluó la contaminación microbiana de los alimentos vendidos en la vía pública deLa Paz-Bolivia, Santafé de Bogotá-Colombia, Quito-Ecuador, Lima-Perú, Santo Domingo-República Dominicana, Ciudad de Guatemala-Guatemala, Ciudad de México y Culiacán-México. Fueron analizadas 2433 muestras para investigar la existencia de Vibrio cholerae,Staphylococcus aureus, Bacillus cereus y Clostridium perfringens en número próximo delnecesario para producir enfermedad, además de la presencia de Salmonella y Escherichiacoli O157:H7 en 25 g de muestra. El conteo de organismos coliformes fecales fue tambiénincluido, como indicador de contaminación de origen fecal. Se seleccionaron los alimentoslistos para servir de mayor consumo en cada ciudad, agrupandose en alimentos a base decarnes, frutas y verduras, granos y cereales, dulces, productos lácteos, jugos naturales,helados y pescados y mariscos. Las determinaciones se realizaron bajo control de calidad,después de la capacitación in situ del personal de los laboratorios colaboradores, en lasmetodologías seleccionadas para la evaluación microbiológica. Además, en cada ciudad seencuestó a 300 vendedores y igual número de consumidores, a fin de permitir conoceraspectos sanitarios de los locales y características socio-económicas de vendedores yconsumidores. Entre los microorganismos estudiados, el S. aureus demostró un riesgoporcentualmente mayor de contaminar los alimentos, registrándose su presencia en 8,42%,con variación entre las ciudades y entre los grupos de alimentos. El B. cereus estuvopresente en 7,89% y el C. perfringens en 5,07%, en tanto que el V. cholerae no se encontrópresente en ninguna de las muestras, en número suficiente para producir la enfermedad. Sedemostró la presencia de Salmonella en 0,95% de las muestras y se confirmó la presencia deE. coli O157:H7 en una muestra, como primer hallazgo de este patógeno emergente enalimentos callejeros. Las condiciones higiénicas deficientes en que se expenden estosproductos y los hábitos de vendedores y consumidores sugieren un riesgo evidente de lasventas de alimentos en las calles para causar enfermedades transmitidas por alimentos en laregión y demanda intensa acción de las autoridades y la comunidad para prevenirlas.

2. INTRODUCCION

Las dificultades económicas que enfrentan los países del Tercer Mundo conllevan undeterioro de las condiciones socioeconómicas en las poblaciones de bajos ingresos y de lasque habitan en las áreas rurales, promoviendo un creciente movimiento migratorio hacia loscentros urbanos.

La limitada oferta de trabajo de los centros urbanos junto a la falta de capacitacióncalificada y las necesidades de supervivencia, lleva a estas poblaciones a buscar alternativaspara la obtención de ingresos económicos, una de las cuales encuentran en el comercioinformal, incluida la venta de alimentos.

Esta actividad, al tiempo que satisface la necesidad de obtención de comidas rápidasde bajo costo junto al lugar de trabajo, especialmente por la población de más bajos ingresos,presenta beneficio adicional de satisfacer tradiciones de consumo de alimentos típicos y unaalternativa para derivar el sustento a miles de personas (1, 2).

Así mismo esta actividad es una característica importante del estilo de vida en lamayoría de los países de América Latina y constituye un factor socio-económico importanteque moviliza gran cantidad de recursos y emplea cantidades considerables de personas,ayudando a disminuir los niveles de pobreza y marginalidad.

A pesar de las ventajas conocidas del comercio informal de alimentos, durante laelaboración pueden ocurrir riesgos para la salud de la población toda vez que en la mayoríade los casos, los alimentos son preparados por personas sin la capacitación para suadecuada manipulación que lo hacen en condiciones precarias de higiene.

La escasa calidad nutritiva de los alimentos, los bajos valores proteícos de la dieta, yla insuficiente disponibilidad de alimentos para la población son factores predisponentes acuadros diarréicos agudos originados por las Enfermedades Transmitidas por los Alimentos -ETA (3) que están relacionados con altas tasas de mortalidad infantil, baja productividad en eltrabajo y disminución de la capacidad de aprendizaje.

A pesar de no existir información adecuada sobre el papel que desempeñan losalimentos vendidos en la vía pública en relación con la incidencia de las ETA en los países deAmérica Latina, se considera que las comunidades que tienen malas condiciones de higiene yhabitan áreas climáticas con predominio de altas temperaturas, están bajo un mayor riesgode contraer algunas enfermedades como la salmonelosis (3).

Estudios realizados en América Latina han revelado que gran porcentaje de losvendedores ambulantes no cuentan con un sistema de abastecimiento de agua de buenacalidad, ni en cantidad suficiente para las necesidades diarias, siendo común la reutilizacióndel agua para el lavado de utensilios (4), las manos y las superficies de trabajo entre otras,situación que la convierte en fuente de contaminación al facilitar la proliferación demicroorganismos.

La no aplicación de buenas prácticas higiénicas por parte de quienes preparan ymanipulan alimentos, que en algunos casos pueden ser portadores asintomáticos demicroorganismos patógenos (5) o que pueden llevarlos del medio ambiente al alimento,aumenta el riesgo de contraer enfermedades.

La deficiente calidad higiénica de las materias primas frecuentemente utilizadas en lapreparación de estos alimentos y su inadecuada conservación (tiempo/temperatura dealmacenamiento) aumentan aún más el riesgo de que se produzcan ETA (5).

Al evaluar la calidad microbiológica de alimentos vendidos en vías públicas, esnecesario tomar en consideración factores como la calidad higiénica de las materias primasutilizadas en su preparación, practicas de manipulación inadecuada que permiten lacontaminación cruzada, volumen de comercialización de los mismos y número de personasque los consumen diariamente. Además, los factores requeridos por los microorganismosresponsables de brotes de ETA para su multiplicación o para la producción de toxinas talescomo temperatura, uso de un substrato rico en elementos nutritivos, actividad acuosa (aw),pH, potencial redox (Eh), grado de salinidad, etc. (3, 6), se hallan presentes en los alimentospreparados y comercializados en esas condiciones. Así, pues, es de suponer que estosalimentos son potencialmente causas importantes de enfermedades gastrointestinales y otrasde mayor gravedad.

Teniendo en cuenta el distinto rol que los alimentos comercializados en la vía públicajuegan en diferentes ciudades de América Latina, fueron elegidas las ciudades de SantoDomingo-República Dominicana, Ciudad de México y Culiacán-México, Ciudad deGuatemala-Guatemala, Santafé de Bogotá-Colombia, Quito-Ecuador, Lima-Perú y La Paz-Bolivia, como representantes de las ciudades en donde la venta callejera de alimentos esimportante desde el punto de vista socio-económico y cultural.

3. REVISIÓN DE LA LITERATURA

Para la evaluación del riesgo para los consumidores de alimentos comercializados enla vía pública se han considerado los microorganismos de mayor prevalencia en diversasregiones del mundo y los que han emergido o re-emergido como patógenos importantes enlos últimos años. Por este motivo, se ha investigado la presencia o cuantificado el númerode células del Vibrio cholerae, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Clostridiumperfringens, Salmonella, organismos coliformes de origen fecal y Escherichia coli O157:H7.

3.1 Vibrio cholerae

A raíz de las epidemias de cólera que aparecieron en varios países de América Latinaa partir de 1991, este microorganismo comenzó a tener una importancia inusitadacomo patógeno potencial en algunos alimentos y los primeros estudios realizados enalgunos de los países afectados, revelaron la posibilidad de transmitir la enfermedada la población por el consumo de comidas, especialmente aquellas vendidas en víapública.

El V. cholerae se caracteriza como un bastonete recto o curvo, Gram negativo,oxidasa y catalasa positivas, no esporulado, que fermenta la glucosa sin producciónde gas, con crecimiento no dependiente de la presencia de Na+, móvil por flagelopolar (3), aeróbico facultativo y que muestra crecimiento exuberante en condicionesde alcalinidad (7).

El hábitat natural del vibrión colérico es el ambiente acuático, estuarios y aguas dulcesde clima templado (3).

El V. cholerae serogrupo O1 es el microorganismo responsable de las epidemias decólera (6). Este serogrupo se divide en tres serotipos: Ogawa, Inaba e Hikojima (8). Esos serotipos pueden pertenecer al biovar clásico, que produce una enfermedadmuy grave, o al biovar El Tor, responsable de la mayoría de los casos de cólera en elmundo y que se caracteriza por producir infecciones de menor severidad (3).

El cólera presenta un período de incubación de 6 h a 5 d y se caracteriza por causardiarrea de severidad variable (según el biotipo), heces acuosas (aspecto de agua dearroz), y puede conllevar a perdidas de líquidos en volúmenes de más de 1 litro/h. Enlos casos más graves, la perdida masiva de fluidos y electrólitos puede llevar alchoque hipovolémico, acidosis metabólica, colapso circulatorio (8) y muerte en 16 a18 h, si no se hace rehidratación oportuna (5). Las tasas de mortalidad varían del 0%,en las regiones más desarrolladas, al 30% en las naciones menos desarrolladas, endonde el diagnóstico y tratamiento pueden tardar (3).

La vía fecal-oral es la principal para la transmisión del V. cholerae (7, 9), en especialpor la ingestión de agua contaminada por heces de portadores humanos (4, 7, 10) y

por alimentos contaminados que juegan un importante rol en la difusión del cólera (3,8). Personas enfermas y convalecientes de cólera eliminan por las heces un grannúmero de V. cholerae, contribuyendo a la diseminación de la enfermedad (7).

La ingestión de dosis de 108 UFC de V. cholerae por personas con acidez estomacalnormal y de 104 UFC por personas con acidez gástrica neutralizada, es suficientepara producir el cuadro colérico (11).

Cepas de V. cholerae pertenecientes a serogrupos diferentes del O1, que no aglutinanfrente al suero anti-O1, se denominan "V. cholerae no O1" o "V. cholerae noaglutinante" (NAG) (3, 6, 7, 9) y pueden causar enfermedad diarréica no epidémicasemejante al cólera (10, 12). Los vibriones no O1 solo por casualidad producen latoxina colérica y la enfermedad correspondiente (13).

Con base en varios autores, se han elaborado (3) un listado de los factores depatogenicidad de los serogrupos O1 y "no O1" del V. cholerae, los cuales serelacionan con la producción de toxinas: una de esas toxinas, la "Cólera Toxina" (CT),es una potente enterotoxina capaz de causar diarrea con la administración oral de unadosis de solamente 5 Fg; las demás son toxinas que producen tanto las cepas de V.cholerae O1 CT-positivas como las CT-negativas (distinta naturaleza antigénica,receptores y mecanismo de acción diferentes de la CT), y que recibieron ladenominación genérica de "nuevas toxinas coléricas" (NCT); la hemolisina (NAG-rTDH) que producen las cepas de V. cholerae no O1; la toxina termoestable similar ala toxina termoestable de la E. coli enterotoxigenica (NAG-ST); una toxina confunción inhibidora del canal de sodio, similar a la tetrodotoxina que producen losvibrios mutantes CT-negativos; y una toxina similar a la Shiga toxina de la Shigelladysenteriae.

Algunos grupos de alimentos pueden venir contaminados con esa bacteria desde suorigen, si se tiene en cuenta que su presencia ha de considerarse normal endeterminados ambientes acuáticos, lo mismo puede suceder con verduras y otraslegumbres en cuyo cultivo se utilizan heces como fertilizante o aguas residuales parasu regadío (7), o pueden aun contaminarse durante la preparación y/o manipulaciónpor portadores con hábitos higiénicos deficientes.

Casi todos los alimentos, incluidos los platos rápidos para consumo, pueden sercontaminados o recontaminados por contacto con el agua, por contaminacióncruzada en el ambiente de su manipulación a través del flujo de productos crudossimultáneamente con productos cocidos, aderezos de platos rápidos, unamanipulación inadecuada, superficies de trabajo y utensilios, entre otros.

Las observaciones sobre la capacidad de multiplicación rápida del V. cholerae atemperatura ambiente en productos tales como las ensaladas de legumbres cocidas,con o sin mayonesa y condimentos similares, arroz con carne, pescado cocido y/omarinado con jugo de limón (cebiche) y masas alimenticias preparadas (4), indican

que los alimentos inapropiadamente manipulados y conservados pueden presentar ungrave riesgo para la salud de los consumidores.

Considerando el corto tiempo de generación del V. cholerae y la caracterización delalimento como de alto riesgo (factores intrínsecos que favorecen la multiplicación deeste microorganismo, tales como el pH neutro a alcalino, presencia de proteínas yotros elementos nutritivos, agua químicamente disponible, etc. (3, 6), elmantenimiento de temperaturas favorables por un período de tiempo prolongado ycompatible con la multiplicación, resulta en que el alimento pueda transmitir el cólera,pues el número final de células puede ser suficiente para infectar y desencadenar lossíntomas de la enfermedad en el consumidor (5). Por eso, se recomendó labúsqueda del V. cholerae en todos los tipos de alimentos comercializados en la víapública de las ciudades seleccionadas, con excepción para los alimentos ácidos sinproteínas.

3.2 Staphylococcus aureus

Otro microorganismo que ha sido considerado de gran importancia para el estudio esel S. aureus, debido a su potencial para ocasionar intoxinación en el consumidormediante ingestión de alimentos que presenten la enterotoxina estafilocócicapreformada (14).

El hombre es el principal reservorio del S. aureus, el cual se puede encontrar en lasfosas nasales de donde se propaga directa o indirectamente a la piel y heridas (15),pudiendo ser encontrado en la garganta y piel de personas sanas (16). Se encuentracomúnmente en la garganta, la piel y conducto intestinal, contaminando fácilmente elambiente (6).

El S. aureus se caracteriza por ser un coco Gram positivo que puede ser encontradoen el suelo, agua y aire, teniendo como mejores reservorios al hombre y animales(16), y crece en forma de racimos, es anaeróbico facultativo, no esporulado, capazde sobrevivir por largos períodos en objetos inanimados secos (fómites),relativamente resistente al calor y altas concentraciones salinas y lipídicas (15). Algunos serotipos pueden producir enterotoxinas (17).

Las enterotoxinas producidas por S. aureus son proteínas de peso molecular entre28.000 e 35.000 daltons, imunologicamente distintas, con características deresistencia al calor y de hidrosolubilidad. Las toxinas se denominan A, B, C1, C2, C3,D, E y TST (Toxic Shock Toxin). De ellas, solamente la TST no está relacionada aintoxicaciones alimentarias, mientras las toxinas A y D son las que, con másfrecuencia se asocian (3).

Las temperaturas de crecimiento se sitúan entre los 7EC y los 47,8EC, con latemperatura óptima de 37oC, y la formación de enterotoxinas ocurre a temperaturasentre 10EC y 46EC , con una temperatura óptima para su producción en la franja de

los 40 a 45EC (3). La multiplicación y producción de toxinas en este rango detemperaturas depende de la calidad del substrato, la temperatura del alimento, suactividad acuosa, la concentración salina, el pH del alimento, etc.(6).

La mayoría de las cepas de Staphylococcus crece en la franja de pH 4,5 a 9,3, y elvalor de pH más adecuado para la producción de toxina se sitúa en la franja deneutralidad (16).

El S. aureus es el patógeno relacionado a ETA que posee la capacidad de crecer enel más amplio rango de aw (0,83 a 0,99) en condiciones aerobicas y cuando lasdemás condiciones se aproximan al óptimo. La producción de enterotoxina esposible a partir de una aw de 0,86, siendo la óptima 0,99 (18).

El calentamiento es el método más efectivo para eliminar S. aureus de los alimentos(16) por lo cual los alimentos cocidos, cuando se recontaminan con éste patógenomediante una manipulación inadecuada, facilitan su multiplicación, especialmentedebido a la escasa competencia microbiana que resulta de la cocción (17). Sinembargo, el calentamiento no elimina las toxinas pre-formadas en las materias primas(3, 6).

La manipulación inadecuada de los alimentos por parte de los portadores, o porpersonas con heridas en los brazos y las manos, constituye la principal fuente decontaminación de los alimentos con el S. aureus (17).

Cuando se hallan presentes en los alimentos números mayores de 104 células de S.aureus por gramo, se pueden producir cantidades suficientes de enterotoxina (200 ng)de forma que desencadenen intoxinación en los consumidores (6).

La toxina puede ser identificada cuando números iguales o mayores que 106 están oestuvieron presentes en el alimento; y que durante brotes de intoxinaciónestafilocócica se ha verificado que cantidades inferiores a 1 Fg de toxina A (la máscomún en brotes de intoxinación estafilocócica) han sido ingeridas por las personasque enfermaron (14).

Los alimentos producidos o manipulados de forma inapropiada, y almacenados entemperaturas superiores a 28EC, por 2 a 4 h pueden presentar cantidades deenterotoxina suficiente para producir brotes de intoxinación por estafilococos (19).

D. S. Gelli (Instituto Adolfo Lutz, comunicación personal, 9 de febrero de 1996)observó que en más del 95% de los brotes de esta etiología ocurridos en una ciudadde la Región, la contaminación del alimento ocurrió después de la cocción, dado quela bacteria se encontró en números mayores y raras veces iguales a la dosisinfectante. Esa experiencia se refiere a los alimentos elaborados en cocinasindustriales y a los alimentos servidos en reuniones en grupo tales como fiestas yclubes. Los alimentos contaminados fueron principalmente productos de confitería,

dulces y bocadillos.

La intoxinación estafilocócica se caracteriza por la aparición de nauseas, vómito ydiarrea (menos frecuente) (3) muchas veces acompañadas de dolor abdominal, dolorde cabeza y contracciones musculares luego de 1 a 6 h después de la ingestión dealimentos contaminados por S. aureus (16).

En las regiones en las que el cólera es endémico, la aparición de la sintomatología dela intoxinación por estafilococos (diarrea y vómitos, sin fiebre) puede confundirse conun cuadro colérico.

Los métodos diagnósticos que se utilizan con más frecuencia están basados en laverificación de la capacidad del S. aureus para producir varias enzimas, como lacatalasa, la coagulasa, la lipasa, la lecitinasa la DNAsa y la termonucleasa (19).

El criterio más difundido, ampliamente utilizado y aceptado para el diagnóstico de S.aureus en laboratorios clínicos, se basa en su habilidad para coagular el plasma. Algunas cepas de S. lugdunensis y especies asociadas al área de la salud animalcomo el S. intermedius, S. hyicus, S. delphini e S. schleiferi (20, 21, 22) también sonresponsables de reacciones de coagulasa y/o factor de coagulación positivos y poreste motivo se recomiendan pruebas diferenciales adicionales (16, 19).

Características bioquímicas de algunas especies de Staphylococcus

Microorganismo Coagulasa Factor decoagulación

Termonucleasa Manitol Maltosa Hemólisis

S. aureus Pos Pos Pos Pos Pos Pos

S. epidermidis Neg Neg Neg Neg Pos +/- t

S. intermedius Pos +/- Pos +/- t d+ t +/-

S. hyicus +/- Neg Pos Neg Neg Neg

S. delphini Pos Neg Neg Pos t Pos Pos

S. schleiferi Neg Pos Pos Neg Neg Pos t

S. lugdunensis Neg Pos t Neg Neg Pos Pos t

Pos = 90% o más son positivasNeg = 90% o más son negativas+/- = 11 a 89% son positivasd+ = 90% o más son débilmente positivast = reacción tardía

Fuente: Bergdoll, 1989 (16) y Kloos y Labbe, 1991 (23)

Para involucrar o no a un alimento en un brote de intoxinación es necesario laverificación de la presencia de enterotoxinas, lo que puede ser hecho directamente enel alimento a través de los métodos de Casman y Bennett (24), el de Reiser,Conaway and Bergdoll (24), o a través de la verificación de la capacidad deproducción de toxinas por cultivos de S. aureus, aislados de alimentos implicados, por métodos de AMicroslide Gel Double Diffusion@, AReverse Passive LatexAgglutination Assay@(RPLA) o por AEnzyme Linked InmunoSorbent Assay@(ELISA)(14).

Teniendo en cuenta que la condición usual de comercialización en la vía pública de losalimentos cárnicos, mezclados o no con granos y cereales, dulces y productos deconfitería, productos lácteos, helados, pescados y mariscos, propician el desarrollodel S. aureus, como también la producción de toxina, se recomendó proceder a subúsqueda y conteo en los mismos.

3.3 Bacillus cereus

El B. cereus se ha encontrado responsable por 1% a 23% de los brotes de ETAreportados, en los cuales la enfermedad puede presentarse clínicamente en las

formas de síndrome diarréico o emético (25).

El B. cereus es un microorganismo que se halla ampliamente distribuido en el medioambiente, pudiendo ser encontrado en suelo, polvo, vegetación, cereales y derivadosde cereales, alimentos, aguas naturales, leche, productos lácteos y condimentos. Sepresenta en forma de bastonetes grandes, Gram positivo, móvil, capaz de formaresporas bastante resistentes al calor y ha sido asociado con brotes de intoxinaciónalimentaria (3, 25).

Las temperaturas mínimas de multiplicación de las células vegetativas de B. cereus sesitúan alrededor de los 10EC (variantes psicrotroficas inician su crecimiento alrededorde 4 - 5EC), con límites máximos de 50EC, estando la temperatura óptima alrededorde 28EC a 35EC (24). Su crecimiento es posible en la gama de pH comprendidaentre 4,9 a 9,3 (6).

Las temperaturas mínima, óptima y máxima para el inicio de la germinación deesporas de B. cereus en condiciones de laboratorio fueron estudiadas (26)encontrándose los siguientes valores: -1EC, 30EC e 59EC, respectivamente.

En estudios hechos con arroz cocido (27), esporas de B. cereus presentaron untiempo de generación de 26 a 57 min cuando fue mantenido en temperatura próxima a30EC. Los mismos autores demostraron aun que el desarrollo fue mas intenso enarroz cocido que en caldo de soya tripticasa, cuando se realizaba la incubación entemperatura inferior a 15oC. El crecimiento de B. cereus en arroz cocido puede versefavorecido por la adición de proteínas al plato (28).

La alta resistencia térmica de las esporas de B. cereus han sido motivo depreocupación por parte de la industria de alimentos, y muchos investigadores se hanocupado en estudiarla. Algunos autores (29) aislaron de sopa enlatada condeficiencias en su proceso térmico, dos cepas de B. cereus cuyas esporas mostraronvalores D95

oC de 256,7 y 5122,3 min.

También se demostraron (30) la acción de protección ejercida por materiales lipidicoscontra el efecto del calor sobre esporas de B. cereus sometiéndolas a 95EC y 121ECsuspendidos en fosfato tampón, aceite de oliva y aceite de soya, observando valoresD95

oC de 13 min (para fosfato tampón), D121

oC de 17 a 30 min en aceite de oliva y

soja. Este estudio concluyó que los ácidos grasos libres pueden tener un efectoestabilizador sobre las esporas de B. cereus.

Los alimentos que sufrieron cocimiento y que son enfriados lentamente o que sonmantenidos a temperaturas entre 30EC y 50EC, en caso de contener esporas de B.cereus, permitirán la germinación de estas y la multiplicación del microorganismo conla subsecuente producción de toxinas, situación que comúnmente puede serobservada con platos de arroz cocido que son dejados enfriar a temperaturaambiente (31). Por eso, siempre se recomienda que el arroz cocido se enfríe con

rapidez (hasta menos de 15oC) y que no se los deje en temperatura ambiente por másde 2 h después de la cocción (25).

Los factores de virulencia del B. cereus están relacionados con la producción devarias toxinas extra celulares (31), entre ellas una toxina diarréica termolábil que esinactivada en 5 min a 56EC y una toxina termoestable de acción emética que semantiene inalterada después de 1 h a 120oC (32). La toxina diarréica es producidapor la forma vegetativa en la fase de multiplicación exponencial y la toxina emética esproducida en la fase de esporulación (3).

El síndrome diarréico presenta un período de incubación de 8 a 16 h, con duración de20 a 36 h (31) y generalmente está asociado al consumo de alimentos decomposición protéica, vegetales, salsas y pudines (25) contaminados con aproxi-madamente 106 UFC/g (33).

El síndrome ocasionado por la toxina emética reviste mayor gravedad que el de latoxina diarréica, presentando un período de incubación variable entre 1 y 6 h ygeneralmente se asocia con el consumo de arroz frito, cocido o de otros alimentoscon alto contenido de almidón; el número de células que se necesita paradesencadenar la sintomatología se cifra alrededor de los 109 UFC/g de alimento (6).

Considerando que la temperatura ambiente permite la multiplicación delmicroorganismo, los alimentos mal cocinados a base de cereales, o recontaminadosy mantenidos a temperaturas inadecuadas, constituyen un riesgo potencial para lasalud de los consumidores (3). En el presente estudio se recomendó el muestreo dedulces, productos lácteos, granos, cereales y los alimentos que tuvieron uno o más deellos en su composición.

3.4 Clostridium perfringens

El C. perfringens es un microorganismo anaeróbico, inmóvil, que forma esporas devariada resistencia al calor, tiene como hábitat normal el suelo y puede producircuatro tipos de exotoxinas termolábiles (alfa, beta, épsilon e iota) (34). En función deeso, el C. perfringens se clasifica como del tipo A, B, C, D o E (3). Las enterotoxinasse liberan en el intestino durante la esporulación (25).

Los alimentos cárnicos crudos o cocidos son los más comúnmente involucrados enbrotes por esta etiología (34), especialmente aquellos sometidos a cocción, posteriorenfriamiento y luego recalentados a temperaturas insuficientes para eliminar el C.perfringens (31).

Todos los casos de intoxicación alimentaria por C. perfringens estudiados hasta elmomento han sido producidos por la toxina del tipo A (6), excepto los raros casos deenteritis necrotica causados por el consumo repetido de gran cantidad de carne decerdo contaminada con C. perfringens tipo C que produce una beta-toxina tripsina-

sensible. Esta última síndrome se caracteriza por altas tasas de ataque y demortalidad (40%), la cual normalmente ocurre por perforación intestinal, doloresabdominales intensos, diarrea sanguinolenta, vomito y choque (31).

Por lo general, las manifestaciones clínicas de la intoxicación por C. perfringens tipoA ocurren entre 8 y 24 h pudiendo llegar hasta 72 h (31) después de la ingestión delalimento contaminado y se caracterizan por un dolor abdominal intenso (agudo)acompañado de diarrea intensa (34, 35).

El número de células necesarias para desencadenar la sintomatología de laintoxicación se halla comprendido entre niveles próximos al 105 o más por gramo dealimento (6).

Por lo general, la toxina no se forma previamente en el alimento, siendo liberada invivo al nivel de intestino (36), y son necesarias 8 a 10 mg de toxina paradesencadenar la enfermedad (37).

Basado en diversos autores, se relata (34) que la toxina se forma en pH entre 6,0 y8,0, aw entre 0,98 y 0,99, y temperaturas entre 35 y 40EC. Como la toxina del C.perfringens se forma durante la fase de esporulación, y esta se da después de laingestión del alimento contaminado, a nivel de intestino delgado, las temperaturas deesporulación se aproximan a la temperatura corporal del hombre.

Las células vegetativas de C. perfringens pierden rápidamente su viabilidad entemperaturas de congelación (38), pero las esporas no demuestran la mismasensibilidad que la forma vegetativa en bajas temperaturas (34).

Las temperaturas máxima y mínima que permiten la multiplicación de estemicroorganismo son, respectivamente, de 20EC y 50EC, siendo la faja que se sitúaentre los 43 y 45oC la más apropiada. El tiempo de generación a 45EC, encondiciones óptimas, es de 7 min (6). La temperatura mínima que permite elcrecimiento de C. perfringens es de 12EC, el valor mínimo de aw es de 0,93 y losvalores mas adecuados de pH se sitúan entre 6 y 7 (38). El microorganismo no creceen pH inferior a 5 ni superior a 8,3 (34). La aw mínima para el crecimiento de C.perfringens a partir de su forma esporulada es de 0,95 (38).

Se ha observado, en ensayos hechos con carne molida y una mezcla de cepas de C.perfringens, el tiempo de generación a 41oC fue de 13 min, en cuanto que a 45oC, fuede 31 min (34).

El potencial redox del medio que permite el crecimiento de C. perfringens seencuentra entre los límites +216 a -230 (38).

La forma esporulada de las distintas cepas de C. perfringens presenta una gran

variación en cuanto a su termoresistencia, resistiendo a la temperatura de 100oCdesde 0,3 min y 20 min (38) hasta algunas horas (3). En laboratorio, la formavegetativa se inactiva a 60oC, pero en los alimentos la temperatura de inactivaciónpresenta grandes variaciones, debido a su composición (34).

La cocción inadecuada, la aparición frecuente de cepas resistentes al calor y eltiempo prolongado normalmente ocurrido para la refrigeración completa de los trozosmayores de carne, junto con descuidos en cuanto a la temperatura dealmacenamiento, permiten la germinación de endosporas y la multiplicación bacterianaa niveles peligrosos para la salud pública (35). Los alimentos a base de carne,preparados con antelación, ocasionan con frecuencia brotes producidos por C.perfringens, razón por la cual se han incluido en este estudio.

3.5 Salmonella

A partir del cambio en su taxonomía (39), el genero Salmonella pasa a constituirse desolamente dos especies. Una de esas especies es la Salmonella enterica, con lassubespecies S. enterica subsp. enterica, S. enterica subsp. arizonae, S. entericasubsp. diarizonae, S. enterica subsp. houtenae y S. enterica subsp. indica. La otraespecie es la Salmonella bongori. Además, la denominación de los serovares deSalmonella también han cambiado (40), con la caracterización de 28 nuevosserovares (41) reconocidos en 1991 por el Centro Colaborador de la OMS paraReferencia e Investigación en Salmonella.

En función de la convención establecida en la nueva nomenclatura , en todas lacitaciones sobre el microorganismo, debe de escribirse el nombre del serovar enletras comunes con la primera letra mayúscula. Así, por ejemplo, el microorganismoconocido hasta entonces como Salmonella typhimurium, pasa a denominarseSalmonella serovar Thyphimurium, o solamente Salmonella Thyphimurium, sinnecesidad de indicarse que se trata de la subespecie enterica. De otra parte, losserovares de las demás subespecies y la Salmonella bongori, pasan a designarse porsu fórmula antigénica (40).

Los miembros del género Salmonella son agentes causantes de infección intestinal enseres humanos y animales que invaden la mucosa intestinal y se multiplican en lalamina propia y ganglios linfáticos mesentéricos (42) e inducen la secreción delíquidos por mecanismos aun no bien conocidos (43).

El hábitat principal de los microorganismos de este género es el conducto intestinaldel ser humano, de los animales domésticos, de los pájaros, de los reptiles (3) y,ocasionalmente, de los insectos (6). Debido a que es una bacteria de origenintestinal, es excretada por las heces que contaminan el ambiente y las aguas. Cuando las aguas contaminadas o los alimentos contaminados son ingeridos por elser humano o por los animales, el microorganismo vuelve al sistema digestivo dondese multiplica y será nuevamente eliminado a través de las heces, continuando el ciclo

(6). Los insectos y roedores también participan en la diseminación ambiental deestos microorganismos.

Se sabe que, además de la característica de invasividad, la patogenia de laSalmonella está relacionada con la producción de enterotoxinas y una citotoxina. Lasenterotoxinas producidas por Salmonella actúan aumentando la permeabilidadvascular (3). Una de ellas es termoestable y de acción rápida y la otra termolábil deacción más lenta (44).

La Salmonella produce por lo menos una citotoxina que actúa como inhibidora en lasíntesis proteica y es parcialmente responsable por la lesión de las células epitelialesen la mucosa intestinal, lo que se verificó a través de la infección experimental deconejos sanos con el microorganismo (45).

Con base en diversas investigaciones, se puede afirmar que el 54% a 98% de lassalmonelas son enteropatogenicas y que las salmonelas generalmente producenenterotoxina y citotoxina (42). Como resultado de la acción de esta última, se exponela fibronectina (glicoproteina) subepitelial en la cual la Salmonella se adhiere,constituyendose en nuevo mecanismo de adherencia de la Salmonella al tejidointestinal (46).

Entre los agentes de ETA, el género Salmonella es uno de los principales causantesde casos mortales por razón de las complicaciones surgidas entre los pacientesafectados. La tasa de mortalidad se sitúa alrededor del 4,1% (6) y los huevos (3, 47),carnes y productos cárnicos derivados son los alimentos que más comúnmentetransmiten la Salmonella al hombre (6).

La dosis infectante es variable, según el serovar, alimento envuelto y especie deSalmonella (especies adaptadas al hombre poseen dosis infectantes menores que lasno adaptadas) (3); en general, el número de células necesarias para desencadenar lasintomatología (náusea, vómitos, dolores abdominales, cefaleas, escalofríos ydiarreas) oscila entre 103 y 106 UFC/g de alimento para algunas especies (3), y entre109 y 1011 para otras (6). Sin embargo, otros autores (42) relatan haber constatado, através de estudios epidemiológicos, que la Salmonella Thyphimurium fagotipo 10puede presentar dosis infectante de solamente una célula.

Cerca de 5% de las personas que sufren la enfermedad siguen siendo portadoras portiempo considerable (3, 6) y pasan a ejercer un importante papel en la diseminacióndel agente, especialmente si participan en la cadena de producción y comercializaciónde alimentos (5).

Tanto los portadores asintomaticos de Salmonella, que pueden eliminar cerca de 101

a 108 salmonelas/g de heces hasta 6 meses (48), como los manipuladores deutensilios utilizados durante la preparación y comercialización de alimentos puedenser el vehiculo para el acceso de Salmonella a los alimentos (49).

La Salmonella puede crecer en el rango de pH entre 4,5 a 9,0, estando el optimoentre 6,5 a 7,5. El pH 4,00 tiene acción bactericida para el microorganismo,situandose en 4,05 el valor mínimo de pH en el cual se observó algún crecimiento (6). Los efectos de pH extremos son afectados por otros factores como naturaleza delacidulante, temperatura, aerobicidad, contenido nutritivo y serovar en cuestión (6, 42). Su crecimiento es inhibido a 3% - 4% de sal.

Su multiplicación puede ocurrir entre 7EC y 47EC, actividad acuosa mayor a 0,94 ypH entre 4 y 8, siendo 37oC su temperatura optima de crecimiento (50). En ellaboratorio, generalmente las temperaturas mínimas de crecimiento son mayores encaldo que en medios sólidos y la habilidad de crecer en bajas temperaturas estárelacionada con el tipo de alimento y el serovar (38). Las temperaturas más bajas demultiplicación corresponden a los serovares Salmonella Bredeney, SalmonellaTyphimurium, Salmonella Agona (40), Salmonella Senftenberg y Salmonella Hadar(51).

No obstante que las tasas de crecimiento de Salmonella sean bajas en temperaturaspor debajo de 10EC, el problema se torna significativo donde las condiciones derefrigeración son inadecuadas debido a su capacidad de multiplicación en bajastemperaturas (3).

Estudios desarrollados en ratas que fueron sometidas a dieta hipoproteica (52)demostraron que esto puede promover la aparición de defectos inmunológicosmúltiples, los cuales pueden contribuir al aumento en la susceptibilidad a la infecciónpor Salmonella. Así, personas que viven en locales con malas condicioneshigiénicas, en climas calientes, donde existe el hábito de comer alimentos de origenanimal crudos, personas con dietas hipoproteicas, con edades extremas (muy jóveneso ancianos) y portadores de enfermedades crónicas, son más predispuestas a lasalmonelosis.

La refrigeración adecuada es el medio más seguro de prevención del crecimiento deSalmonella en alimentos y también los alimentos mantenidos por encima de 60ECofrecen buen margen de seguridad para la inhibición efectiva de su crecimiento (42).

Se puede evitar la multiplicación de Salmonella en carne de pavo cocinada si se lamantiene a temperaturas superiores a 55E C. Los alimentos con actividad acuosaelevada cuando son calentados a 74EC también se convierten en libres deSalmonella (50). Hay interacción entre la resistencia térmica y el pH del alimento paradiferentes serovares (3).

Algunos autores (53) verificaron que ocurre aumento de resistencia al calor con ladiminución de la actividad acuosa y conforme a la concentración lipidica del alimento. Estos autores (50) encontraron aun que en chocolate el valor D70 para cepas deSalmonella Senftenberg fue de 6 a 8 h y de 12 a 18 h para cepas de Salmonella

Typhimurium.

Considerando la gravedad de la infección por Salmonella y la característica de ser unagente etiológico ampliamente diseminado, que puede ocasionar epidemias como elV. cholerae, y que también tiene la característica de multiplicarse a la temperaturaambiente (50), es preocupante el hecho de que las condiciones de preparación ycomercialización de alimentos en la vía pública pueden permitir el acceso ymultiplicación de Salmonella en los alimentos.

El análisis de alimentos en busca de Salmonella se caracteriza por procedimientos deenriquecimiento diferentes de aquellos utilizados en los laboratorios clínicos debido albajo número de este microorganismo y a las condiciones fisiológicas de la célulabacteriana derivadas del proceso tecnológico o de preparación sufrido por el alimento(54), seguidos de enriquecimiento selectivo con diferentes niveles de selectividad(55), de procedimientos de aislamiento y confirmación bioquímica (43, 54, 56) yserologica (57). Teniendo en consideración que la literatura científica registra brotesde ETA por Salmonella involucrando a la mayoría de los alimentos, se recomendóbuscar la presencia de este microorganismo en todas las muestras analizadas.

3.6 Organismos coliformes fecales

El grupo coliformes fecales es formado por los coliformes capaces de crecer yfermentar la lactosa en temperaturas elevadas (44,5EC - 45,5EC), lo que incluye por lomenos, miembros de los géneros Escherichia, Enterobacter y Klebsiella (58).

El hábitat primario de los organismos coliformes fecales y de la E. coli es el conductointestinal de los animales de sangre caliente, entre ellos el ser humano, y por estemotivo se utilizan como indicadores de higiene y de la incidencia de contacto directoo indirecto de los alimentos con materia fecal (6) .

El grupo de coliformes es formado por bastonetes Gram-negativos, no esporulados,anaerobios facultativos, capaces de fermentar la lactosa con producción de gas a35EC en hasta 48 h (55).

Un bajo porcentaje de cepas de E.coli, por mutación, puede tener perdida lacapacidad de fermentar la lactosa, o lo hace tan lentamente al punto de no serdetectada dentro de los periodos normales de incubación utilizados (3). Por esto laprueba de producción de indol a partir de triptofano en alta temperatura es una pruebautilizada paralelamente a la fermentación de la lactosa que ofrece resultados másconfiables, pues cerca de 99% de las E. coli son indol positivas (59).

La presencia de coliformes de origen fecal en alimentos indica que existe el riesgo deque también hayan llegado al alimento otros patógenos entéricos (60) como laSalmonella, Shigella y otros. Los coliformes de origen fecal, así como los patógenosentéricos, son de transmisión fecal-oral y, por eso, se utilizan como microorganismos

indicadores.

Miembros del genero Enterobacter y Klebsiella pneumoniae habitan el tractogastrointestinal del hombre y animales, microorganismos del genero Enterobacter sepueden encontrar también en el suelo, alcantarillas, agua, plantas, vegetales yalimentos de origen animal. Raramente Enterobacter spp es reportado comopatógeno entérico, y Klebsiella puede ser también aislada en ambientes noasociados con la contaminación fecal (61).

Algunos investigadores sugieren que la E. coli sea utilizada como microorganismoindicador de la contaminación fecal, ya que microorganismos del genero Klebsiellaestán más ampliamente distribuidos de lo que se imaginaba (58).

El agua, alimentos de origen animal y vegetales son vehículos frecuentes de E. coli, yes importante el papel que desempeñan los manipuladores de alimentos en laspatologías por esta etiología, especialmente en zonas endémicas de diarrea (3).

Considerando las exigencias para el crecimiento de los coliformes fecales yespecialmente de E. coli, tales como temperatura entre 7EC y 48EC (óptimo de37EC), pH entre 4,4 y 9,0, aw>0,95 y en concentraciones de hasta 6% de cloruro desodio y las condiciones de manipulación y mantenimiento de los alimentos durante lapreparación y comercialización en la vía pública, los tipos de alimentoscomercializados por vendedores ambulantes pueden hallarse contaminados porcoliformes fecales, se recomendó que todas las muestras recolectadas para elestudio se analizaran para verificación del NMP de coliformes fecales .

3.7 Escheroichia coli O157:H7

La E. coli O157:H7 es un microorganismo emergente, es decir que viene produciendoenfermedad en humanos a un ritmo creciente en los últimos 20 años y amenazaaumentar en el futuro próximo (62).

Se trata de una variedad rara de E. coli, también llamada de E. colienterohemorrágica (EHEC), que es capaz de producir en el hombre enfermedadaguda no febril, inicialmente caracterizada por dolores abdominales severos,acompañadas de nausea y vomito y seguidas de diarrea acuosa, que pasa afrancamente sanguinolenta en corto tiempo (3, 63, 64).

La enfermedad es causada por la producción de grandes cantidades de una o mástoxinas producidas in vivo (64, 65) y que hasta el momento ha sido investigada yaislada con mayor frecuencia en los países desarrollados, siendo el serovar O157:H7el más comúnmente aislado en los Estados Unidos, Canadá e Inglaterra (64) y elserogrupo O26 particularmente aislado en los demás países desarrollados (43).

La transmisión zoonótica del microorganismo puede ocurrir (66) ya que los bovinos

sirven de reservório principal para la E. coli O157:H7. Otras especies de animalescomo porcinos, ovinos y algunas aves y pájaros también pueden servir de reservorio(3).

Estudiando la distribución de la E. coli O157:H7 en los órganos intestinales degallinas, algunos autores (67) observaron que ocurre colonización predominantementeen el ciego y colon, siendo la E. coli O157:H7 excretada en las heces por más de 90d.

Una de las características de patogenicidad presentada por este serovar de E. coli esla producción de grandes cantidades de una o dos citotoxinas (SLT I e SLT II) (39). Estas citotoxinas fueron denominadas Verotoxinas (VT) o "Shiga-like" toxinas (SLT),por su semejanza con la Shiga toxina producida por la Shigella dysenteriae (64, 68,69), en estructura, función, sitios de ligación y funciones enzimáticas utilizadas. LaSLT I y la Shiga-toxina son neutralizadas por el antisuero anti-Shiga (6).

Otra característica de patogenicidad es la presencia de un gene altamente homólogoal gene de adherencia de la E. coli enteropatogenica (EPEC), con función similar alEHEC (43). Este gene está relacionado a las lesiones producidas en las célulasepiteliales de la mucosa debidas a íntima adherencia de algunas cepasverotoxigenicas de E. coli (70).

La enfermedad producida, colitis hemorrágica, puede colocar en riesgo la vida delpaciente (43). En algunos brotes ocurridos la tasa de mortalidad observada fue de36%, en tanto que en otros no ocurrieron muertes (3).

En algunos grupos de edad, especialmente entre los muy jóvenes, la E. coli O157:H7conduce al desarrollo del síndrome hemolítico-urémico (HUS), que se caracteriza poranemia hemolítica microangiopatica y falla renal (3, 64, 71) pudiendo llevar a laperdida permanente de la función de este órgano (64). Las personas de edad avanzada pueden presentar púrpura trombocitopénicatrombótica (TTP), menos común, que cursa con fiebre, síntomas neurológicos ylesión renal crónica, lo que es una extensión del HUS (3) y en este caso la mortalidadpuede alcanzar tasas de hasta 50% (64, 65).

La evolución de la enfermedad hasta causar el HUS o la purpura trombocitopénicatrombótica (TTP), parece estar relacionada con la absorción sistémica de "Shiga-like"toxina, posiblemente asociada a una endotoxina (43).

Un número limitado de serovares de E. coli forman el grupo de las E.colienterohemorrágicas (43). Estos serovares, O157:H7, O26:H11 (3), O4:NM, O45:H2,O111:NM y el O145:NM (64) no son invasivos para las células intestinales y noproducen las clásicas enterotoxinas termolábiles y termoestables de las E. coli (72), sibien producen lesión en la mucosa del colon por acción de una o de las dos toxinas(43). Los serogrupos O5, O6, O8, O22, O113 y O128 estarían incluidos como

serogrupos asociados con diarreas o el HUS (68, 73). Algunos autores (74, 75),estudiando alimentos de origen animal detectaron la presencia de diferentesserogrupos de E. coli verotoxigenicos .

Los factores intrínsecos y extrínsecos que actúan sobre el crecimiento de E. coli soncomunes a la E. coli O157:H7. Las células de E. coli O157:H7 son resistentes atemperaturas de refrigeración y congelación, y se destruyen solamente cuandosometidas a temperaturas superiores a 71oC (76). El microorganismo tiene comocaracterísticas bioquímicas diferenciales las siguientes: no es capaz de fermentar elsorbitol o lo hace lentamente, no crece en las temperaturas utilizadas para diferenciarE. coli de los demás coliformes (44,5EC - 45,5EC) y no produce beta-glucuronidasa(3).

La mayoría de los brotes provocados por E. coli O157:H7 han sido atribuidos alconsumo de productos de carne bovina mal cocidos (77), aunque también se hanincriminado algunas veces otros tipos de alimentos tales como emparedadosmantenidos sin refrigeración, legumbres y carne de pavo, probablementecontaminados por carne de res. Otros alimentos, como frutas, ensaladas devegetales, yogur, alimentos ácidos (pH<4,6) y agua también pueden vehiculizar lainfección (78).

La capacidad de supervivencia de la E. coli O157:H7 en pH ácido ha sido estudiadapor algunos investigadores. Ensayos realizados con mayonesas industrializadas, conpH entre 3,6 y 3,9, mantenidas a temperaturas de 5oC y 20oC (79), concluyeron que laE. coli O157:H7 tiene la capacidad de sobrevivir más tiempo a 5oC (34 a 55 d) que a20oC (8 a 21 d). También se observaron (80) que el microorganismo se mantienebien en mayonesa y en salsas a base de mayonesa a 7oC y a 25oC y por lo tantoesos, y probablemente otros alimentos ácidos pueden participar en la transmisión delmicroorganismo. Los mismos autores (80) verificaron que la E. coli O157:H7 semantiene viable en alimentos ácidos por 35 d, si son conservados en refrigeración.

La investigación de un brote consecutivo a la ingestión de jugo fermentado demanzanas (81), demostró que la E. coli O157:H7 puede sobrevivir en medios decultivo con pH 2,0. La sospecha de que las manzanas se habían contaminadoexternamente con heces bovinas y la resistencia del microorganismo a bajos valoresde pH, justificaron la incriminación del jugo fermentado de manzana como alimentoresponsable por el brote.

Otros autores (82) reportan que también legumbres pueden constituirse en vehículo enla transmisión de la E. coli O157:H7. Los mismos autores (82) informan que unapartida de papas, que probablemente se contaminaron con heces bovinas, havehiculizado el microorganismo y causado un brote que involucro a por lo menos 24personas adultas, causando la muerte de una de ellas.

Si bien la vía fecal-oral es la más importante, la transmisión persona-persona también

puede ocurrir, cuando se utiliza practicas higiénicas inadecuadas (78).

La experiencia obtenida en el estudio de brotes ocurridos en Canadá y EstadosUnidos (64), sugiere que la dosis infectante sea bastante baja.

E. coli O157:H7 es un emergente de grande impacto sanitario, social, político yeconómico (83, 84) porque produce en el hombre un cuadro diarreico sanguinolentograve pudiendo llevar a la muerte (3, 43, 72) porque la comunidad científica aun notiene las respuestas definitivas respecto de su naturaleza, comportamiento y causasde su emergencia como patógeno humano (76) y porque su presencia en la carne nose evidencia por alteraciones organolépticas aparentes, imposibilitando la inmediatatoma de medidas sanitarias adecuadas (84, 85).

Considerando que el diagnóstico clínico de la enfermedad puede ser dificultado por lafalta de familiaridad de los médicos con la enfermedad emergente (77) y considerando que la E.coli O157:H7 no puede ser detectada por los métodostradicionalmente usados para aislamiento de patógenos entéricos (47), se hacenecesario evaluar su prevalencia en los alimentos vendidos en la vía pública.

Teniendo en cuenta la posibilidad de contaminación cruzada durante la preparación delos alimentos en la vía pública, y el bajo número de células que se necesitan paraproducir la enfermedad, 10 células o menos (86), todos los alimentos revisten interéspara la investigación.

Se reconoce que los microorganismos arriba citados no son los únicos indicadospara la evaluación higiénica de los alimentos ni tampoco los únicos que ocasionan lasETA. Por razones relacionadas con la capacidad analítica de los laboratoriosparticipantes, tampoco se incluyeron otros patógenos emergentes, a pesar de laimportancia de éstos en la actualidad.

3.8 Aspectos inmunológicos y epidemiológicos

El desarrollo de una enfermedad y el aparecimiento de sus síntomas clínicos en elhombre no son dependientes únicamente de la presencia de los patógenos en elorganismo ni de sus mecanismos patogénicos. Es necesario que ocurra lainteracción sinérgica de varios factores para que se manifieste el síndrome de laenfermedad. Estos factores pueden estar asociados a los agentes patógenos o a laspersonas, aisladamente o relacionarse a una comunidad que comparte una o mascaracterísticas predisponientes a la enfermedad como sean los grupos etareos,anormalidades fisiológicas como, por ejemplo, supresión o comprometimientotemporario de los mecanismos de inmunidad (3, 87, 88, 89).

El hombre sano cuenta con varios mecanismos de protección contra agresiones delmedio ambiente. Dos de eses mecanismos juegan un rol fundamental en laprotección de la salud: las barreras no específicas, como la acidez estomacal, las

secreciones químicas de la membrana mucosa del intestino y de otros órganos delcuerpo humano, juegan un papel fundamental para impedir o dificultar que el agenteinvasor (microorganismo) llegue, aún viable, al sitio en lo cual desempeñará susfunciones patogénicas; por otro lado, el organismo también cuenta con barrerasespecíficas, como las que actúan selectivamente sobre agentes patógenos y sustoxinas, tratando de neutralizar su acción nociva. Las barreras específicas entran enfuncionamiento cuando los agentes invasores logran sobrepasar las barreras noespecíficas y alcanzan sitios internos del organismo. Esas barreras se constituyen enla respuesta del sistema inmunológico, con la producción de anticuerpos y/oinmunoglobulinas, como respuesta al estímulo de un antígeno específico (87).

La dinámica de interacción de los agentes invasores con el organismo de losindividuos, permite consideraciones de orden epidemiológica (87, 88, 89). Laepidemiologia valora factores como la naturaleza, el comportamiento, la diseminacióny otros aspectos de una enfermedad, incluyendo las formas para el control de ladiseminación de los agentes patogénicos, y las condiciones de inmunización ydefensa de los individuos y de la comunidad expuestos al agente (88, 89).

La mayoría de los microorganismos seleccionados para el presente estudio sonampliamente diseminados en el medio ambiente, en los alimentos y en la población detodos los países de la Región. Sin embargo, la exposición a eses agentes no es igualen todas la regiones, en razón de las distintas acciones de salud pública que se tomancada una de ellas, lo que puede incluir inmunizacion a través de vacunación, medidasde prevención y control de diseminación de patógenos, acciones para mejorar lacalidad de vida a través de medidas de saneamiento ambiental, mejores condicionesde nutrición, entre otras. Esas acciones de salud pública son factores importantes enla determinación del grado de exposición de la población de diferentes locales oregiones (3, 87, 88, 89).

La exposición diaria y constante a los agentes patógenos causadores de ETA es, sinduda, un factor de riesgo epidemiológico. De otra parte, la convivencia permanentecon sintomatología leve de ETA, como sean las diarreas leves, puede llevar a unaconceptuación de condición de normalidad, considerándose, por ejemplo, que ladiarrea solo es síntoma de enfermedad, se acompañada de otros síntomas quedificulten las actividades diarias. Además, la inmunidad que se adquiere naturalmentepor el contacto constante con pequeñas dosis del agente infeccioso o toxigénico,puede influenciar los datos sobre riesgos de ocurrencia de ETA, porque los estadosendémicos tienden a producir un Aequilibrio@ en la población y, también porque larespuesta a una encuesta como la que se realizó en el presente estudio, puede noreflejar la real condición del individuo, que considera diarrea y/o vómitos con criteriosmenos rígidos que los de un diagnostico clínico, ya que eses síntomas, por comunes,pueden considerarse condición normal (87, 88, 89).

Otros índices, como la tasa de mortalidad infantil pueden, por otro lado, indicar conmayor seguridad los riesgos reales a que se exponen los consumidores de alimentos

callejeros. De manera resumida, se puede afirmar que en situaciones de endemiaocurre una Aselección natural@ de los individuos más resistentes durante la primerainfancia. La ocurrencia de diarrea infantil refleja, además de la diseminación depatógenos entéricos, la posible resistencia adquirida por la población adulta. Laincidencia de ETA entre turistas y visitantes de otras áreas en donde las accionesbásicas de salud son más efectivas, es otro ejemplo de la existencia del riesgo deenfermarse a través del consumo de alimentos callejeros, y de la ocurrencia de laenfermedad no asociada con un estado de equilibrio endémico. Hasta el 50% de losvisitantes se enferman después de consumir alimentos en donde la diseminación deagentes patógenos por esta vía es expresiva (3, 87, 89). La diarrea de los viajeros esmundialmente reconocida como enfermedad asociada al consumo de alimentos (89).

4. OBJETIVOS

El objetivo principal del presente estudio fue la investigación y cuantificación delnúmero de células viables del V. cholerae en los alimentos de mayor consumo en lasciudades mencionadas, habida cuenta la epidemia que ha afectado a la Región ytambién los microorganismos de mayor prevalencia en la mayoría de las regiones delmundo (S. aureus, B. cereus, C. perfringens, Salmonella).

Además, se buscó identificar entre los alimentos comercializados en la vía pública,los que con mayor frecuencia se presentan contaminados con números iguales omayores de dosis infectantes para cada organismo, a fin de determinar el riesgo decontraer una ETA como consecuencia de su consumo.

Teniendo en cuenta la gran importancia que se viene concediendo a la enfermedadcausada por la E. coli O157:H7, la búsqueda de este microorganismo también hasido incluida. Esa decisión tuvo la ventaja de permitir la implantación de lametodología analítica en los laboratorios involucrados en el estudio y la capacitaciónde los analistas en la identificación de ese microorganismo emergente.

Se intentó también obtener información sobre las características higiénicas de lospuntos de comercialización de alimentos y las condiciones socio-económicas de laspersonas que participan en la elaboración y comercialización, por la importancia quetienen estos aspectos para un análisis conjunto de la calidad de los alimentos enrelación a los manipuladores.

Asimismo, se recogió información sobre las características socio-económicas de losconsumidores de alimentos callejeros y sus hábitos de consumo.

5. MATERIAL Y METODOS

5.1 Etapa preparatoria

Antes de iniciarse la recolección de muestras y las entrevistas con losvendedores y consumidores de alimentos en la vía pública, todos loslaboratorios participantes en el estudio fueron visitados por expertos de laOrganización Panamericana de la Salud (OPS) en microbiología de alimentospara fines de evaluación de sus instalaciones, equipo y capacidad técnica delos analistas. Además, a fin de colaborar con las autoridades nacionales desalud, y buscando disminuir al mínimo las interferencias externas en losresultados, la OPS suministró todos los reactivos, medios de cultivo yvidriería utilizados. De esa manera, es posible garantizar que todos loslaboratorios trabajaron con materiales procedentes del mismo proveedor,misma marca y mismo lote de fabricación.

Al final de su visita de evaluación a los laboratorios, los expertos dejaroncultivos estándar de los microorganismos a investigar durante el estudio, paraidentificación por los analistas. El resultado de ese ejercicio fué evaluado porel laboratorio de referencia y en conjunto con el resultado de la evaluación Ainsitu@, ha orientado los expertos en la programación de dos talleres decapacitación que se realizaron en las instalaciones del Laboratorio Nacionalde Salud Pública, en la ciudad de México y en el laboratorio del InstitutoNacional de Nutrición, Alimentación y Control de Calidad de Alimentos enLima-Perú. Los talleres contaron con la asistencia de por lo menos unanalista de cada laboratorio participante y, durante su desarrollo fueronrevisados todos los métodos analíticos y otros puntos pendientes de mayordiscusión, además de haberse buscado familiarizar a los analistas con unprograma de garantía de calidad analítica desarrollado especialmente para elestudio (Anexo 5).

5.2 Plan de muestreo

Se estableció como meta en cada una de las ocho ciudades seleccionadasrecoger 300 muestras representativas de la venta ambulante de alimentos.

El número de muestras se estableció tomando como base el modeloestadístico de probabilidades conocido como distribución binomial (90, 91). Este modelo es apropiado para el caso en que la población que nos interesaestá integrada por un número muy grande de individuos. Así, pues, para teneruna probabilidad del 95% de detectar microorganismos, cuando estos estánpresentes en 1% de los alimentos muestreados, basta con investigar 299muestras.

Las muestras de los alimentos fueron recolectadas por personal previamentecapacitado, para lo cual se utilizó una ficha con información sobre la muestra,el vendedor/manipulador y el puesto de venta del alimento (Anexo 2). En cadaciudad se seleccionaron al azar 10 áreas de recolección de muestras, con

ayuda de una tabla de números aleatorios (92) y, en cada área se buscórecolectar 30 muestras, dándose prioridad a los alimentos de mayor riesgo detransmitir ETA, teniendo en cuenta el volumen comercializado, el número deconsumidores atendidos en una jornada de trabajo y las condicioneshigiénicas de preparación. Siempre que fue posible, las muestras dealimentos se recolectaron en las horas de mayor actividad.

Habida cuenta que la venta de alimentos en las vías públicas en laslocalidades seleccionadas se caracteriza por el expendio de comidas listaspara el consumo, la gran mayoría de estas están compuestas por variosingredientes, por lo cual, para efectos de la clasificación por tipo de alimento,se tomó en cuenta el ingrediente de mayor riesgo en su composición, sindesconocimiento del riesgo potencial de los demás.

En forma simultanea con la recolección de muestras, se propuso entrevistar300 consumidores, entre los que atendían a los puestos de ventaseleccionados, para lo cual se utilizó una ficha de entrevista apropiada (Anexo3). Con esta parte del estudio se buscó conocer algunas característicasdemográficas y socio-económicas de esos consumidores y estimar lacantidad de personas expuestas al riesgo de enfermar por el consumo de esetipo de alimentos.

5.3 Metodología de análisis estadístico de los datos

Los datos obtenidos se ingresaron a una base de datos utilizando elprograma Epi Info versión 6.02 (93). El análisis estadístico se realizóutilizando el paquete estadístico SAS (Statistical Applications Software)versión 6.04 (94).

5.3.1 Análisis exploratorio y descriptivo

Inicialmente se realizó un análisis descriptivo de los resultados decada uno de los componentes de la encuesta: la encuesta avendedores/manipuladores, el análisis microbiológico y la encuesta aconsumidores. Se elaboraron cuadros y gráficos a fin de describir ladistribución de las variables en cada una de las ciudades. Seutilizaron pruebas de ji cuadrado (χ2, para proporciones) y análisis devarianza (para medias) a fin de determinar si las diferencias entre lasciudades eran estadísticamente significativas. La descripción de losresultados del análisis microbiológico también se realizó estratificadapor tipo de alimento. A fin de controlar potenciales factores deconfusión, se estimaron proporciones ajustadas por el método directoutilizando la población combinada de las ocho ciudades comoestándar.

5.3.2 Variables asociadas a la presencia de síntomas gastrointestinalesentre los consumidores

A fin de explorar asociaciones entre la contaminación bacteriana enlos alimentos muestreados y la existencia de síntomasgastrointestinales entre los consumidores, se elaboraron gráficosrelacionando ambas variables en las ocho ciudades. Además, seinvestigó la relación entre características del consumo de alimentos enla vía pública y la ocurrencia de síntomas gastrointestinales en losconsumidores. Para ello se estimaron las razones de posibilidades(odds ratios) de tener síntomas gastrointestinales asociados adistintas variables. Estas razones de posibilidades se ajustaronmediante regresión logística respecto a posibles variables deconfusión.

5.3.3 Relación entre características de los vendedores y de los puestosde venta y la contaminación bacteriana

Se estimaron razones de posibilidades (odds ratios) de contaminaciónbacteriana por distintos microorganismos asociadas a diversascaracterísticas de los vendedores y de los puestos. A fin de eliminar elposible efecto de confusión de ciudad, las razones de posibilidadesse ajustaron por ciudades mediante regresión logística.

5.4 Procedimientos generales en el laboratorio

La metodología analítica ha sido uniforme en todos los laboratoriosparticipantes, de acuerdo con los procedimientos descritos más adelante (5.5).

Las muestras identificadas en los laboratorios participantes comosospechosas, fueron remitidas para fines de confirmación y pruebascomplementarías, al Instituto Adolfo Lutz (IAL), de la Secretaría de Salud delEstado de São Paulo - Brasil, seleccionado como laboratorio de referenciapara el presente estudio, teniendo en cuenta su condición de CentroColaborador Conjunto FAO/OMS para el Monitoreo de la Contaminación delos Alimentos. Hay que registrarse el hecho de que las muestras de lasciudades de México, DF y Culiacán, también ubicada en México no se hanenviado al IAL debido a que el Laboratorio Nacional de Salud Pública deMéxico es parte de un programa de garantía de calidad con los EstadosUnidos de América y Canadá.

Además de prestar los servicios de referencia para el estudio, el IALsuministró a todos los laboratorios participantes, cultivos estándar yantisueros polivalentes.

La cantidad mínima de muestra que se ha recogido ha sido de 100 g o 100ml. Para alimentos mixtos, todos sus componentes integraron la muestra enla proporción aproximada original del alimento ofrecido a la venta.

Se han utilizado instrumentos estériles solamente en los casos en que elvendedor no disponía de sus propios instrumentos. Siempre que fue posible,se buscó reproducir exactamente las condiciones reales y habituales dedistribución del producto en el punto de venta (24, 95).

En seguida, las muestras se acondicionaron en recipientes del propiovendedor utilizados en su punto de venta, ya que quizás el recipiente utilizadotambién pudiera ser una fuente de contaminación. Las muestras han sidoentonces acondicionadas e identificadas debidamente (95). En los casos enque el vendedor no disponía de recipiente para servir o acondicionar losalimentos, se utilizaron bolsas plásticas de primer uso o recipientes estériles.

El transporte de las muestras al laboratorio se realizó respetando lascondiciones usuales de conservación del alimento, de la forma más semejanteposible. En el caso de transporte rápido (máximo de una hora), el alimento seacondicionó en embalaje isotérmico sin incluir hielo, teniendo cuidado de nomezclar alimentos calientes con alimentos fríos en el mismo embalajeisotérmico. En casos de que el tiempo de transporte fue superior a una hora,se utilizaron embalajes isotérmicos específicos para cada grupo de alimentos.

Las muestras se identificaron individualmente, mediante una etiqueta o medioanálogo, unida o pegada al embalaje.

Después de recibidas en el laboratorio, las muestras fueron mantenidas enrefrigeración hasta el momento del análisis, en general por un período detiempo no superior a una hora.

Todo el material utilizado se identificó debidamente, incluida la fecha deiniciación del análisis. Los analistas recibieron instrucciones claras paraasegurar siempre la perfecta homogeneización de las muestras y de lasdiluciones (24).

Además, se recomendó a los analistas seleccionar diluciones que ofrecieron,en medios sólidos, recuentos entre:

S. aureus: 5 y 150 coloniasB. cereus: 5 y 50 coloniasC. perfringens: 5 y 50 colonias

Para los fines del presente estudio, se consideró como riesgo la presencia delos microorganismos siguientes, en los números indicados:

V. cholerae: $103/gS. aureus: $102/gB. cereus: $103/gC. perfringens: $103/gSalmonella: presencia en 25 gE. coli O157:H7: presencia en 25 g

Para evaluar la calidad higiénica de los alimentos, se ha utilizado comoindicador la presencia de organismos coliformes de origen fecal en unaconcentración de 3 o más coliformes por g o ml de alimento.

5.5 Metodología analítica

Los métodos analíticos microbiológicos, de confirmación bioquímica,serológicos y de verificación de la toxigenicidad de los cultivos aislados de losalimentos estudiados se han basado en las publicaciones de la AsociaciónAmericana de Salud Pública (24), Administración de Medicamentos yAlimentos de los Estados Unidos de América (96), Laboratorio Nacional deReferencia Animal de Brasil (55), Sociedad Americana de Microbiología (97),Microbiología Clínica y Patogénica (98) y Patógenos Transmitidos por losAlimentos (3).

La metodología utilizada en todos los laboratorios participantes fueestandarizada según se describe enseguida. Los procedimientos deevaluación y garantía de la calidad analítica, también estandarizados yadoptados por todos los laboratorios involucrados, se encuentran descritosen el Anexo 5.

El método analítico utilizado para la detección de V. cholerae visaba detectarnúmeros mayores que 103 células/25 g de alimento. Para eso, se incubó dosseries de dilución (10-3 a 10-5) a 35EC y la otra a 42EC durante 6 a 8 h. Después de la incubación, se transfirió la superficie de éstos a placas de agarde TCBS y a otros tubos que contenían 10 ml de APA. Se incubó las placasde agar de TCBS a 35EC durante 24 a 30 h y los tubos de APA a las mismastemperaturas de origen durante 18 h; luego, se transfirió la superficie de losmismos a placas de agar de TCBS, incubando a 35EC durante 24 a 30 h.

A partir de las placas de agar de TCBS, se aisló en T1N1 de 3 a 5 coloniassacarosa -positivas (o negativas) planas, de 2 a 3 mm de diámetro y seincubó a 35EC durante 18 a 24 h.

Los cultivos que se mostraron puros en T1N1 fueron sometidos a la pruebade oxidasa. Los cultivos oxidasa-positivos se repicó a agar nutritivo en planoinclinado, y se incubó durante 18 a 24 h a 35EC. En seguida se sometió estos

cultivos a la prueba de antisuero polivalente.

Para el recuento de S. aureus se sembró sobre la superficie seca de agar deBaird Parker 0,1 ml de cada dilución seleccionada y se incubó las placasinvertidas a 35EC durante 30 a 48 h. Se contó todas las colonias típicas yatípicas (grisáceas o negras brillantes sin halo o solo con uno de los halos),seleccionandose 5 colonias típicas y 5 colonias atípicas que se sembró entubos que contenían 5 ml de caldo de BHI, los que se incubó durante unanoche a 35EC. A partir del caldo de BHI, se preparó un frotis en coloración deGram para verificar la presencia de cocos Gram-positivos y se realizó laspruebas de investigación de la presencia de coagulasa y la fermentaciónaerobica de la maltosa. Los cultivos identificados como S. aureus (coagulasa y fermentación aerobica de la maltosa positivos) se repicó a agarnutritivo.

El recuento de B. cereus se hizo con la utilización del agar cereus. Se incubólas placas invertidas a 30EC durante 18 a 24 h. Se seleccionó de 5 a 7colonias típicas, repicandoselos a tubos con agar nutritivo en plano inclinado. Se incubó los tubos a 30EC durante 18 a 24 h. En seguida se preparó unfrotis el cual se coloreó con el método de coloración de esporos, verificandola presencia de bastoncillos cortos con extremidades rectas y la presencia deesporas centrales o paracentrales.

A partir de los cultivos puros en agar nutritivo, se realizó las pruebas deverificación de ß-hemolisina en agar de sangre de ovino, de motilidad yreducción de nitrato y de licuefacción de la gelatina. Los cultivos que secomportaron como B. cereus se repicó a agar nutritivo.

Para el recuento de C. perfringens, partiéndose de la dilución inicial en aguapeptonada al 0,1%, se efectuó diluciones decimales en serie y se sembró enagar de SPS (en profundidad 1 ml de las diluciones seleccionadas). Despuésde solidificado y colocado sobre base de 5 ml o más del mismo medio seincubó las placas invertidas, en anaerobiosis, durante 18 a 24 h a 46EC.

Se repicó de 5 a 7 colonias sospechosas a tubos que contenían medio detioglicolato y se incubó durante 4 h al baño maría a 46EC o durante una nochea 35EC. Después de la incubación, se preparó un frotis a fin de verificar lapresencia de bastoncillos Gram-positivos de extremidades rectas. Partiendode cultivos puros en medio de tioglicolato, se realizó las pruebas de motilidadde nitrato, lactosa-gelatina y prueba de fermentación tempestuosa(storm-test). Los cultivos que se comportaron como C. perfringens semantuvieron en agar nutritivo.

La investigación de Salmonella se realizó a partir de la homogeneización de25 g de la muestra con 225 ml de agua peptonada amortiguada (buffer) al 1%e incubación a 35EC durante una noche. El cultivo previamente enriquecidose transfirió a tubos que contenían el caldo de Rappaport Vassiliadis paraenriquecimiento selectivo y se incubó a 42EC durante una noche. Elaislamiento se realizó sobre una superficie seca de agar SS y de agar verdebrillante, a la que se haya añadido 1 ml de la solución de novobiocina al 4%,por litro del medio, después de incubar a 35EC durante una noche.

Se aisló las colonias sospechosas en agar nutritivo en plano inclinado, lascuales se repicó en tubos con caldo de urea y se incubó durante una noche a35EC. A partir del agar nutritivo, se repicó los cultivos urea-negativos a agarde TSI y LIA incubandoselos a 35EC durante 24 h. Los cultivos que secomportaron como Salmonella se mantuvieron en agar nutritivo.

La verificación del NMP de organismos coliformes de origen fecal se hizo apartir de la siembra de 3 series de 3 tubos con 1 ml de las diluciones de 10-1 a10-3 o de 10-2 a 10-4, según el tipo de alimento, en caldo de EC con tubos deDurhan invertidos, los cuales se incubó durante 3 h a 35EC y después duranteuna noche al baño maría a 45,5EC.

Partiendo de tubos positivos para la producción de gas en el caldo de EC, sesembró tubos con caldo de triptona para la verificación de la producción deindol a 45EC durante 18 a 24 h. Para llegar al resultado final se consultó lastablas de NMP (Anexo 7).

La presencia de E. coli O157:H7 se investigó a partir de la homogeneizaciónde 25 g de la muestra con 225 ml de agua peptonada amortiguada al 1% que,después de una incubación a 35oC durante 6 h, se repicó para la superficie deagar de Mac Conkey Sorbitol, incubandose otra vez a 35oC durante 24 h.

Se aisló de 3 a 5 colonias sorbitol negativas y las cuales se repicó a tuboscon caldo de EC, con caldo urea y a dos tubos con 10 ml de agar demotilidad, añadiéndose a uno de ellos una gota de antisuero H7. Los tubosde caldo de EC se incubó al baño maría a 45,5EC, y los tubos con caldo ureay con agar de motilidad a 35EC durante 24 h.

Los cultivos que presentaron motilidad positiva en el agar de motilidad ynegativa en el agar de motilidad al que se ha añadido antisuero H7, reacciónnegativa en el caldo urea y crecimiento negativo en el caldo EC a 45,5EC, seconsideró presuntamente como E. coli O157:H7 y se repicó a agar nutritivo.

5.6 Confirmación de los resultados

Los cultivos puros obtenidos de las muestras que se revelaron, durante el

proceso analítico, como sospechosas de contener uno o más de losmicroorganismos objeto del presente estudio se transplantaron en agarnutritivo y se enviaron al IAL para identificación complementaría yaveriguación de toxigenicidad. Las pruebas realizadas en el laboratorio dereferencia fueron las siguientes:

C Vibrio cholerae: pruebas complementarías de confirmación (7).

C Staphylococcus aureus: identificación de las toxinas tipo A, B, C y Dpor RPLA (Reverse Passive Latex Aglutination) (14).

C Bacillus cereus: identificación de las toxinas diarréica y emética porRPLA (3).

C Clostridium perfringens: identificación de la toxina tipo A (3, 35, 36).

C Salmonella: identificación serologica (57).

C Escherichia coli: identificación de cepas patogénicas y de E. coliO157:H7 (58, 99).

5.7 Estimación del número de consumidores expuestos al riesgo de enfermar

A fin de poder estimarse el número de consumidores expuestos al riesgo deenfermarse a través del consumo de alimentos en la vía pública, se verificócada ficha de recolección de las muestras que presentaron contaminación enniveles iguales o superiores al establecido en 5.4. Teniendo en cuenta queuna porción de alimento contenía alrededor de 300 g(ml), se tomó lainformación sobre el volumen en gramos (mililitros) del alimento vendido en eldía de la recolección de la muestra (Anexo 2, 1.3) y se dividió por 300. Así,se llegó al número de consumidores que, en el día de la recolección de lamuestra, estuvieron potencialmente expuestos a adquirir ETA a través delalimento contaminado.

Si bien se reconoce que hay muchas variables que hacen con que la floramicrobiana de los alimentos callejeros presente cambios periódicos,incluyendo la temperatura de preparación y/o de mantenimiento, latemperatura ambiente, las condiciones higiénicas del(los) manipulador(es),etc., se ha supuesto que esas condiciones son similares durante todo el año. Además, se consideró que los puestos de venta funcionan por lo menos 5días por semana durante las 52 semanas del año.

Así, las estimaciones del número de consumidores expuestos a enfermar sebasan en las siguientes suposiciones:

C que las condiciones de preparación y expendio son constantes a lolargo del tiempo;

C que los puestos funcionan 5 d/semana durante las 52 semanas delaño;

C que la muestra analizada es representativa de todo el alimentomuestreado;

C que cada consumidor consume una porción de 300 g(ml).

Se utilizó, para cada microorganismo, en cada una de las 8 ciudades, lafórmula siguiente:

Consumidores expuestos al riesgo de enfermarse = (3 personas queconsumieron el alimento contaminado) 260*

* 260 = días estimados de funcionamiento durante el año.

Esto ha permitido estimar el riesgo a que los consumidores de las ciudadesestudiadas estuvieron expuestos a enfermarse por S. aureus, B. cereus, C.perfringens o Salmonella, a través del consumo de alimentos expendidos enla vía pública.

6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Los resultados de este estudio se presentan en varios cuadros (1 - 19) y figuras (1 -28) que aparecen en el Anexo 1. En total se encuestaron 2342vendedores/manipuladores y 2134 consumidores y se analizaron 2433 muestras dealimentos.

6.1 Análisis exploratorio y descriptivo

6.1.1 Encuesta a vendedores/manipuladores

El Cuadro 1 y las Figuras 1 - 5 presentan la información referente acaracterísticas de los vendedores ambulantes en las ocho ciudadesestudiadas. En cinco de las ciudades (La Paz, Santafé de Bogotá,Quito, Lima y Ciudad de Guatemala) se observó que el expendio dealimentos en la vía publica es un oficio con alta participación del sexofemenino. Así, en La Paz casi el 90% de los vendedores fueronmujeres, mientras que en Quito y Lima, este porcentaje superó el 80%. Eso reafirma observaciones anteriores (1, 2) acerca de laimportancia de la venta callejera de alimentos como actividad que, enel caso de la mujer, es una alternativa para contribuir en el ingresofamiliar, trasladando a la calle un oficio que ha venido desempeñandotradicionalmente en el hogar y contribuyendo a superar el deterioro delnivel del ingreso familiar, a consecuencia de la caída real de los

salarios en la región, observada en los últimos 10 años (100). Hayque destacar la situación aparentemente inversa que se ha observadoen Santo Domingo, Ciudad de México y Culiacán. En esas ciudadeslos vendedores resultaron ser en su mayoría del sexo masculino. EnCuliacán más de 80% de los vendedores eran hombres.

En general, no se observaron grandes diferencias en la distribuciónpor edad de los vendedores ambulantes en las ocho ciudades. Entodas ellas la mayoría de los vendedores tenían entre 26 y 60 años deedad. Dentro de este grupo etáreo, en siete de las ocho ciudadeshubo mayor porcentaje de vendedores en el grupo de 26 a 40 añosque en el grupo de 41 a 60 años. La única excepción se dio en laciudad de Lima, donde casi el 50% de los vendedores tenían más de40 años. La información obtenida permite a su vez constatar que, enpor lo menos tres de las ciudades (Santo Domingo, Ciudad de Méxicoy Culiacán), la actividad de venta de alimentos en las calles esdesempeñada por hombres en edad productiva máxima, fenómenostodos estos que revelan la importancia de la actividad en la economíainformal de los países.

En cuando a nivel educacional, ingresos y cursos de capacitación, seobserva que en todas las ciudades, más del 50% de los vendedoresde alimentos callejeros tienen por lo menos educación secundaria, loque habla en general de una escolaridad con potencial para conocer oasimilar los hábitos correctos de manipulación de alimentos.

De otra parte, si bien se han identificado vendedores con instrucciónuniversitaria en todas las ciudades encuestadas, la situación enCuliacán merece un comentario a parte ya que en esa ciudad más del27% de ellos manifestaron tener ese nivel educativo. Eso podríaindicar que las personas en esa condición, no cuentan en esa ciudadcon mejores alternativas de trabajo, sobre todo cuando la informaciónindica que los ingresos mensuales de más del 75% de los vendedoreses de menos de 3 salarios mínimos, situación que reafirma otra de lasbondades atribuida a la venta callejera de alimentos cual es la decontribuir para atenuar la desocupación en las ciudades (2).

En lo que se refiere a ingresos provenientes de la actividad de venderalimentos en la calle, la información obtenida indica dos grupos deciudades en situación diferente. Así, mientras en Santafé de Bogotá,Lima, Ciudad de México y Culiacán, el ingreso mensual de la granmayoría (>75%) de los vendedores no alcanza a los 3 salariosmínimos, en La Paz, Quito, Santo Domingo y Ciudad de Guatemala lamayoría de los vendedores tienen un ingreso de por lo menos 4salarios mínimos. En Ciudad de Guatemala, el 42% de losvendedores refirieron recibir más de 10 salarios mínimos.

En casi todas las ciudades, con excepción de Ciudad de Guatemala yCuliacán, más del 50% de los vendedores nunca recibieron cursos decapacitación relacionados con el manejo higiénico de alimentos. Sibien estos porcentajes pueden considerarse una coberturainsuficiente, conviene hacer notar que las actividades de los diversosproyectos de cooperación en este campo, desarrollados por agenciascomo FAO, OPS/OMS y otras que han dedicado considerablesrecursos humanos y financieros, quizás no han sido proseguidas conefecto multiplicador por los países, además que la frecuente rotaciónde oficio entre el comerciante informal, puede determinar que seaimposible mantener una cobertura alta con actividades tradicionalesde capacitación.

Es posible que la situación de Culiacán, en donde más del 54% de losvendedores declararon poseer capacitación, esté relacionada con elelevado grado de instrucción universitaria (>27%) o el énfasis que enocasiones asignan las autoridades sanitarias a la capacitación enáreas de turismo.

Los Cuadros 2 y 3 y las Figuras 6 - 12 muestran características de lospuestos de venta por ciudad. La importancia de la venta callejera dealimentos como actividad familiar queda reflejada en los resultadoscontenidos en el Cuadro 2 y en la Figura 6, en los cuales se observaque vender alimentos en la calle es, por lo menos en las ciudadesobservadas, una actividad predominantemente familiar. En la mayoríade las 8 ciudades encuestadas, por lo menos el 65% de los puestosde venta son atendidos por una o dos personas (Figura 7).

Debido al potencial que tienen los alimentos callejeros de transmitirETA, es importante valorar el número de consumidores que sonatendidos en estos puestos en una jornada de trabajo (Figura 8). Lainformación obtenida muestra que mientras en La Paz, Lima, Ciudadde México y Culiacán la mayoría (>50%) de los puestos de ventaatienden entre 10 y 30 consumidores al día, en Santafé de Bogotá,Quito, Santo Domingo y Ciudad de Guatemala la mayoría de lospuestos (>60%) atiende a más de 30 consumidores por día. Tambiénse observa que la gran mayoría (>70%) de los puestos de ventafunciona entre 5 y 12 h por día (Figura 9). La situación en Santafé deBogotá y Santo Domingo merece registro especial, ya que en esasciudades, más del 14% de los puestos funcionan más de 12 h por día.

Las condiciones de saneamiento básico de los puestos, se resumenen el Cuadro 3 y en las Figuras 10 y 11, en los cuales los resultadosmuestran que en cinco de las ciudades (Santafé de Bogotá, Quito,Lima, Ciudad de Guatemala y Culiacán), por lo menos el 85% de los

puestos de venta de alimentos cuenta con acceso al agua, si bien estono significa que el agua provenga de una conexión a la red deacueducto, pues una gran proporción de los puestos de venta sonmóviles o cuentan con instalaciones precarias, ni tampoco que el aguaatienda a patrones aceptables de potabilidad. Sin embargo, máspreocupante es la situación verificada en La Paz y Ciudad de México,donde cerca del 30% de los puestos carece de acceso al agua o enSanto Domingo, donde casi el 85% de los puestos carece de esteinsumo indispensable. La Figura 10 muestra las fuentes de abasto deagua por ciudad.

Entre los vendedores que tienen acceso al agua, la gran mayoría deellos la aquella proveniente de la red publica o le agrega cloro en elpuesto. Esto quizás se pueda atribuir a la cooperación técnicadedicada por agencias que como la OPS y el Banco Interamericanode Desarrollo (BID) quienes a raíz de la epidemia del cólera en laRegión, han destinado importantes recursos técnicos y financierospara mejorar la calidad del agua y transferir tecnología con solucionessimples para la clorinación de pequeños volúmenes de agua, ademásde capacitar a la comunidad para la adecuada utilización de esterecurso.

Esto contrasta con lo observado en Ciudad de Guatemala donde, sibien la mayoría de los puestos cuenta con acceso al agua, más de untercio la utiliza sin ningún tipo de tratamiento, convirtiéndola en unpeligro potencial, considerando el importante rol de ese insumo en lavehiculización de ETA.

De otra parte, al observarse la información sobre las facilidades paraeliminación de aguas servidas, se verifica que en siete de las ochociudades menos del 40% de los locales cuentan con esos servicios. En algunas ciudades, como es el caso de Quito, Lima, SantoDomingo y Ciudad de Guatemala, el porcentaje llega a menos del20%, lo que sin duda, constituye en un gran riesgo de contaminacióndel ambiente, incluidos los alimentos que se expenden en los propioslocales.

El carácter móvil o la localización temporaria de muchos de lospuestos, determina que muy pocos de ellos cuenten con acceso aservicios sanitarios en las cercanías. El mayor porcentaje de puestoscon estos servicios se verificó en La Paz, llegando solo al 33%(Figura 11). La falta de ese servicio indispensable determina que enmuchos casos, vendedores y consumidores deban satisfacer susnecesidades fisiológicas en la vía publica, otro factor que contribuye acontaminar el ambiente en donde de prepara y expenden los alimentosy al menoscabo en la higiene de los manipuladores.

Con excepción de Lima y Santo Domingo, en las restantes ciudadesmás de dos tercios de los vendedores cuentan con facilidades pararecolectar y eliminar las basuras. En Lima, la situación se muestraespecialmente preocupante, si se tiene en cuenta que menos del 10%de los vendedores cuentan con ese requisito indispensable para elmantenimiento de la condiciones de salubridad del ambiente, en tantoque en Santo Domingo este porcentaje llegó al 29%.

Respecto al origen de las materias primas para la preparación de losalimentos, más del 75% de los vendedores de Santafé de Bogotá,Ciudad de México y Culiacán las adquieren de un mismo proveedor,situación bien distinta de la observada en La Paz y Ciudad deGuatemala donde las materias primas son suministradas por variosproveedores en más del 70% de los casos.

Por otro lado, en casi todas las ciudades, parece ser el propiovendedor quien prepara los alimentos a comercializarseposteriormente. La única ciudad en donde la adquisición de alimentospreparados por terceros llama la atención en términos de porcentajees Santafé de Bogotá, donde esa práctica alcanza el 35% de lospuestos.

Una proporción importante de los vendedores de La Paz, Quito yCuliacán, prepara los alimentos en el hogar. Simultáneamente, másdel 70% de los vendedores de La Paz, Lima, Santo Domingo, Ciudadde Guatemala y Ciudad de México, manifestaron preparar alimentosen el local de expendio. El comercio de alimentos en las calles pareceser una actividad diversificada, que tiene como característica la ventade alimentos tanto preparados en el hogar como otros que sepreparan en cocinas improvisadas en los locales de venta y finalmenteun tercer grupo de alimentos adquiridos de terceros ya listos paraconsumo.

En cinco ciudades (Santafé de Bogotá, Quito, Santo Domingo,Ciudad de México y Culiacán) más del 65% de los vendedores, informaron que cuentan con facilidades para recalentar o enfriar losalimentos. Este tipo de instalaciones puede servir tanto paradisminuir como para incrementar el riesgo de multiplicaciónmicrobiana en los alimentos, ya que más del 50% de los vendedoresno cuentan con cursos de capacitación en buenas practicas demanipulación de alimentos lo cual haría suponer que no conocen lastemperaturas criticas para el desarrollo microbiano.

La información respecto a la reutilización de los alimentos sobrantes(Figura 12) muestra que en la Ciudad de Guatemala y en Culiacán,

(donde el porcentaje de vendedores con curso de capacitaciónsobrepasa el 50%) menos del 35% de los vendedores aprovechan lossobrantes, en tanto que en todas las otras ciudades participantes másdel 55% de los vendedores refirieron reutilizar alimentos, porcentajeque resultó cercano al 85% en La Paz y Lima.

6.1.2 Resultados de los análisis microbiológicos

Si bien se reconoce que la dosis infectante de los microorganismosinvestigados son, en general, 1 a 2 log mayores (3, 6, 11, 33, 42) quela dosis considerada de riesgo en el presente estudio, las condicioneshigiénicas de los puestos de venta, la temperatura de mantenimientode los alimentos y el tiempo medio en que los mismos quedan enexposición en una jornada normal, han determinado la utilización denúmeros más bajos.

Los Cuadros 4 al 10 y las Figuras 13 y 14 presentan un resumen delas características de las muestras de alimentos analizadas, elporcentaje de muestras positivas por tipo de alimento, lacontaminación por los distintos microorganismos estudiados y lascaracterísticas de las muestras por microorganismo y por ciudadestudiada. Se recolectaron un total de 2433 muestras. En algunasciudades el número de muestras analizadas fue superior a las 300muestras planeadas.

Debido a las diferencias en el riesgo de contaminación microbiológicaque presentan los diferentes grupos de alimentos estudiados(cárnicos, frutas y verduras, granos y cereales, dulces, productoslácteos, jugos naturales, helados y pescados y mariscos), no sebuscaron todos los microorganismos en todos los tipos de alimentos. Este hecho, sumado a diferencias en la distribución proporcional dealimentos por ciudad, ha determinado que el número de muestras parala búsqueda de los diferentes microorganismos haya mostradovariaciones sustanciales entre unas ciudades y otras.

El Cuadro 4 muestra que si bien los alimentos que contenían carne ensu composición fueron mayoría en seis de las ocho ciudades, suparticipación porcentual fue destacada en Santafé de Bogotá (>50%). En algunas ciudades también se destacaron otros tipos de alimentosentre los más muestreados, como por ejemplo los lácteos en La Paz,los granos y cereales en Lima y Quito, los pescados y mariscos enQuito, Lima y Culiacán y las frutas, verduras y jugos naturales en LaPaz, Ciudad de México y Culiacán. Eso muestra la variedad dealimentos que se expenden en las calles de la Región, y explica laaparente disparidad entre el número de muestras que se analizó paracada uno de los microorganismos encuestados.

6.1.2.1 Vibrio cholerae

Teniendo en cuenta la epidemia de cólera que ha afectó a lamayoría de los países de la Región a partir de 1991, yconsiderando hallazgos anteriores (101), se buscó V. choleraeen todas las muestras en condición de análisis, con excepciónde las muestras recolectadas en la ciudad de Santo Domingo,ya que la República Dominicana se mantiene libre de laenfermedad. En total, se analizaron 2089 muestras, sin haberdemostrado en ninguna de ellas la presencia delmicroorganismo en cantidades >103 UFC/g de alimento(Cuadro 4).

6.1.2.2 Staphylococcus aureus

La observación de la información sobre la contaminación delos alimentos callejeros por S. aureus, indica que estemicroorganismo ofrece un riesgo porcentualmente mayor quelos demás involucrados en el estudio. Así, entre las 1630muestras analizadas, se verificó que este microorganismoestuvo presente, en dosis de por lo menos 103 UFC/g, en másdel 25% de los alimentos comercializados en Ciudad deGuatemala y en 16% de los alimentos vendidos en La Paz,decreciendo hasta valores cercanos a los 7% en Quito y Lima,5,5% en Santafé de Bogotá y poco más del 2% en las demásciudades (Cuadro 4). Con relación a los tipos de alimentosanalizados, se encontró el S. aureus en aproximadamente20% en los dulces, 10% en granos y cereales, productoslácteos y pescados y derivados, y alrededor de 5% en losproductos cárnicos (Cuadro 5). Merece especial mención elhecho de que no se buscó S. aureus en muestras de frutas yverduras, tomando en consideración que esos alimentos noofrecen riesgo potencial de producir ETA por esemicroorganismo. Como se puede observar en el Cuadro 6,las diferencias por ciudad no se modificaron sustancialmenteluego de ajustar por tipo de alimento.

6.1.2.3 Bacillus cereus

El B. cereus se investigó en 1631 muestras de los alimentoscallejeros a base de carnes, granos y cereales, dulces yproductos lácteos de las 8 ciudades. En Culiacán, alrededordel 32% de las muestras estaban contaminadas con esemicroorganismo. La contaminación estuvo alrededor del 8%en Lima y Guatemala, entre 4 y 5% en Ciudad de México y

Santafé de Bogotá y cerca del 2% en las demás ciudades(Cuadro 4). Es de destacar que la mayor cantidad demuestras positivas se observó en los productos a base decarnes (15%). También merece mención el hecho de que ensu mayoría, se trataban de platos compuestos en los cualeslos cereales hacían parte de su composición. Además, seencontraron muestras positivas en los granos y cereales(4,4%), dulces (3,6%) y productos lácteos (2,6%) (Cuadro 5). Como puede observarse en el Cuadro 6, las diferencias porciudad no se modificaron sustancialmente luego de ajustar portipo de alimento.

6.1.2.4 Clostridium perfringens

La búsqueda de C. perfringens se hizo sobre 805 muestras dealimentos callejeros que contenían carne en su composición. La observación de la información presentada en el Cuadro 4nos indica que la contaminación por ese microorganismo estápresente en las muestras de todas las ciudades en porcentajesque oscilaron entre el 3,6% en Lima, hasta el 9,3% en La Paz,situándose alrededor del 4% en las demás ciudades. Estosporcentajes no se modificaron sustancialmente al ajustar portipo de alimentos (Cuadro 6). En La Paz hubo que modificarla metodología analítica adoptada en los demás laboratorios,en consecuencia de limitaciones en el equipo de incubación.Así, la etapa de incubación en condiciones de anaerobiosis serealizó a 35 - 37oC por 48 h.

6.1.2.5 Salmonella

La reconocida capacidad de las salmonelas para contaminardiversos tipos de alimentos, ha sido el factor determinante dela búsqueda de ese microorganismo en la totalidad (2388) delas muestras recolectadas y que se presentaron encondiciones de análisis. La información que se presenta enlos cuadros 4 y 5 permite observar que la mayor ocurrencia deSalmonella se encontró en los alimentos comercializados enlas calles de Culiacán (3,7%). También contenían elmicroorganismo alimentos de La Paz y Ciudad de Guatemala(1,3%), Santafé de Bogotá y Lima (0,7%) y Ciudad de México(0,3%), mientras en Quito y Santo Domingo ninguna muestraanalizada reveló estar contaminada por este microorganismo. El análisis de la contaminación desde el punto de vista de lostipos de alimentos, se verifica que son los alimentos a basede carne los que presentan el mayor riesgo (1,7%) decontener Salmonella, seguidos de las frutas y verduras

(1,5%), los pescados y mariscos (1,0%) y los jugos naturales(0,2%) (Cuadro 5). Como se observa en el Cuadro 6, lasdiferencias por ciudad no se modificaron sustancialmente alajustar por tipo de alimento.

6.1.2.6 Organismos coliformes fecales

Varios autores (6, 58, 60, 61) recomiendan la búsqueda deesos microorganismos en los alimentos, como indicación desu contaminación directa o indirecta por heces humanas o deotros animales de sangre caliente. Su hallazgo en losalimentos indica que otros patógenos entéricos, comoSalmonella, Shigella y otros (incluyendo cepas patogénicasde E. coli), pueden estar presentes, mismo que no se hayanidentificado en la muestra.

El Cuadro 7 y Figura 15 muestran que la contaminación deorigen fecal de los alimentos en las ciudades estudiadas varióentre el 9,4% en Santo Domingo y el 56,7% en Culiacán. Encuanto e la contaminación por tipo de alimento (Cuadro 8), losporcentajes más altos de contaminación se encontraron en lospescados y mariscos (47,4%), productos cárnicos (39,4%) ygranos y cereales (35,3%).

Es importante destacar que incluso luego de ajustar por tipode alimentos, un porcentaje considerable de los alimentosestaban contaminados por coliformes de origen fecal,sugiriendo la posibilidad de contaminación por otrosmicroorganismos, incluyendo los patógenos. Además, estoindica que los alimentos son manipulados y/o mantenidos encondiciones favorables a la supervivencia y desarrollo de estaflora indeseable. Así, los datos ajustados muestran que el53,8% de los alimentos en Culiacán, 49,8% en Lima, 33,2% enCiudad de México, 27,9% en La Paz, 24,5% en Quito, 22,6%en Ciudad de Guatemala, 15,4% en Santafé de Bogotá y13,9% en Santo Domingo, son potencialmente riesgosos.

Esta es una información muy importante, desde el punto devista de salud pública, teniendo en cuenta el origen de estegrupo bacteriano indicador. La relación de la E. coli nopatogénica con los demás patógenos de transmisión fecal-oraltiene que ver con la presencia de esos patógenos en lapoblación humana y animal y la contaminación de materiasprimas, además de las condiciones de manipulación yconservación de los alimentos en las calles, entre otras.

6.1.2.7 Escherichia coli O157:H7

Si bien se reconoce que los mayores riesgos de ETA por elconsumo de alimentos en la calle se concentran en laenfermedad causada por microorganismos como S. aureus,C. perfringens, B. cereus y Salmonella, la gran importanciaque viene adquiriendo la E. coli O157:H7 en los paísesdesarrollados, despertó nuestro interés por investigar supresencia en los alimentos expendidos en vías públicas. Estodeterminó la búsqueda de ese microorganismo emergente en2389 muestras de alimentos pertenecientes a los 8 gruposarriba citados, en todas las ciudades estudiadas. Solo unamuestra, perteneciente a una fruta comercializada en la víapublica de la Ciudad de Guatemala (papaya pelada), dio comoresultado la presencia de ese microorganismo.

La presencia de E. coli O157:H7 en un alimento de ventacallejera sugiere que el mismo esté diseminado de manerasignificativa en el medio ambiente. Por eso, y teniendo aun enconsideración la gravedad de la enfermedad producida poreste patógeno, es que se considera este único caso comomuy importante.

6.1.3 Encuesta a consumidores

La información para conocer características demográficas ysocioeconómicas de los consumidores, está basada en lasentrevistas a cerca de 300 consumidores en la mayoría de lasciudades. En la Ciudad de Guatemala sin embargo, solo pudoencuestarse a 239 y en la Ciudad de México a 273, en tanto que en LaPaz, los resultados están basados en alrededor de 120 encuestasaplicadas.

El Cuadro 11 y las Figuras 16 - 20 muestran algunas característicasdemográficas y socioeconómicas de los consumidores encuestados. Puede observarse que, si bien la distribución de los consumidores porsexo, varía de ciudad en ciudad, en todas ellas predominan loshombres entre las personas que consumen alimentos en la vía pública,siendo más notoria su participación en ciudades como Lima (tan soloun 19.5% de mujeres), Santo Domingo y Santafé de Bogotá, en lascuales más de un 70% de los consumidores son del sexo masculino. A su vez, se observa que un alto porcentaje de los consumidores seencuentran en edades económicamente activas; así en todas lasciudades entre el 40 y el 50% de los consumidores tiene entre 26 y 40

años, porcentaje que es incluso mayor en Lima, donde cerca del 80%de los consumidores pertenece a este grupo etáreo, datos quesugieren que la venta callejera puede ser una fuente importante dealimentos para la población económicamente activa.

El perfil ocupacional de los consumidores nos muestra que quienescon mayor frecuencia hacen uso de las comidas en la vía publica sonobreros y oficinistas. Entre los encuestados, la proporción de estosdos grupos de población es cercana a las tres cuartas partes en lamayoría de las ciudades y llega al 78% en Ciudad de Guatemala, 77%en Quito, 73% en Ciudad de México y 71% en Santafé de Bogotá; delos dos grupos, el de obreros reviste especial importancia comoconsumidor: en Santafé de Bogotá, Quito, Lima, Santo Domingo yCiudad de Guatemala, más del 50% de los entrevistados son obrerosy en las ciudades restantes constituyen en todos los casos más del30% de la muestra. Los profesionales tienen una participaciónrelativamente importante como consumidores en Quito (22%), Ciudadde México (18%) y Santo Domingo (16%).

Resulta manifiesto que son las personas de menores ingresos las quehacen mayor utilización de las ventas callejeras; así en Culiacán, elporcentaje de consumidores con ingresos de menos de 3 salariosmínimos llega a un 96%, en Lima al 95%, en Santafé de Bogotá al79%, en Ciudad de México al 71%. Solo se registró un porcentajerelativamente alto de consumidores con ingresos superiores a 3salarios mínimos en La Paz y Ciudad de Guatemala.

Los resultados acerca del nivel educativo de los consumidores,indican un alto porcentaje de consumidores (cerca del 80% en lamayoría de las ciudades) con estudios primarios y secundarios,mientras que la proporción de personas con formación universitariatiene una participación destacada tan solo en Santafé de Bogotá(20%), Ciudad de México (25%) y Culiacán (40%), ciudad esta últimade gran importancia turística lo cual podría explicar en parte elconsumo de alimentos por un porcentaje relativamente alto depersonas con ese nivel de educación.

Por su parte, solo Ciudad de Guatemala registra un importanteporcentaje de analfabetos ( 22%) entre los consumidores, situaciónque posiblemente tenga repercusión en los hábitos y actitudes de losencuestados frente al consumo de alimentos y a su percepción de losconceptos relacionados con la higiene de los mismos. Hay que teneren cuenta que Guatemala es un de los países de la región con índicesmás altos de analfabetismo en su población (100).

El Cuadro 12 y las Figuras 21 - 24 muestran algunas características

del consumo de alimentos en la vía publica. En general, la mayoría delos encuestados refirió que consume alimentos en la vía publica una odos veces por día. La única excepción fue Santafé de Bogotá, dondeel 50% refirió consumirlos más de tres veces por día.

En relación al sitio de consumo del alimento, se encontró que lamayoría de encuestados consume la comida en el local de venta,siendo la única excepción la Ciudad de Guatemala, donde solo el 55%refirió consumir en el puesto de venta. Excepto en el caso de Lima,entre el 15 y el 30% de los encuestados refirió que lleva comida alhogar. En Lima, solo el 1,5% refirió llevar comida al hogar. Elnúmero de personas que consumen esta comida en el hogar fue muyvariable de ciudad en ciudad. Así, en Ciudad de México, casi el 70%de los encuestados que llevan comidas callejeras al hogar refieren suconsumo por una persona, en tanto que en Culiacán, más del 25%manifestaron que la comida era consumida por más de tres personas.

Junto a los resultados presentados para vendedores, estos resultadossugieren que tanto entre consumidores como vendedores existepotencial para recibir cursos de capacitación y/o información sobremanipulación higiénica de alimentos.

Las cifras obtenidas con estas variables, son un indicador de lacontribución de la venta de alimentos en la vía publica a la seguridadalimentaria de grupos poblacionales que en razón de sus actividades yestilo de vida acuden a este tipo de comercio durante su jornadadiaria, y lo hacen también por habito y para satisfacer su gusto pordeterminados tipos de comida vendida en la calle.

El porcentaje de encuestados que refirió diarrea en los últimos cincodías varió de ciudad en ciudad, desde un valor máximo de 9,7% enCiudad de México, hasta un mínimo de 1,1% en Lima. El porcentajecon antecedentes de vómitos en los últimos cinco días osciló entre el0,6 % (en Ciudad de Guatemala) y el 5,2 % (en Santafé de Bogotá)(Cuadro 13A). Como puede observarse en el cuadro siguiente, lospatrones observados no se modificaron sustancialmente luego deajustar las tasas por edad, sexo, ingreso y escolaridad de losconsumidores (Cuadro 13B). El resultado de la observación desíntomas gastrointestinales en las ocho ciudades se muestran en laFigura 16.

6.2 Variables asociadas a la ocurrencia de síntomas gastrointestinales entrelos consumidores

6.2.1 Relación entre ocurrencia de diarrea y vómitos entre losconsumidores y tasa de contaminación de los alimentos

muestreados

Debido a que se carece de información específica sobre la contaminación de los alimentos consumidos por cada consumidorencuestado, la investigación de la relación entre contaminación dealimentos y síntomas gastrointestinales debió limitarse a investigarasociaciones ecológicas entre contaminación y la ocurrencia desíntomas en cada una de las ciudades. Como muestran las Figuras25 - 28, no se observaron asociaciones entre la tasa decontaminación y la ocurrencia de síntomas para ninguno de losmicroorganismos investigados. Asimismo, diversos factorespsicológicos y culturales pueden haber reducido la validez de lainformación sobre síntomas gastrointestinales obtenida en lasencuestas a consumidores.

Además, es importante considerar que la encuesta se realizó entreconsumidores asiduos, lo que también lleva a suponer que los mismoshayan desarrollado algún factor de protección contra las patogeniasque pueden causar los microorganismos estudiados. La literaturacientífica registra varias investigaciones (102 - 106) en donde se hacomprobado el poder inmunogénico de algunos microorganismoscomo E. coli enterotoxigenico, Salmonella y Shigella flexneri, entreotros. Esto también puede relacionarse con el hecho de que losturistas que consumen alimentos en la calle sean siempre masafectados por síntomas grastrointestinales que la población local. Finalmente, hay que considerarse que la frecuencia de aislamiento delos microorganismos en los alimentos estudiados, indica la existenciade una condición endémica, con las connotaciones señaladasanteriormente en 3.8.

6.2.2 Relación entre características del consumo de alimentoscallejeros y síntomas gastrointestinales

Los Cuadros 14 y 15 muestran la razón de posibilidades (odds ratio)de haber tenido diarrea o de haber tenido vómitos según la frecuenciade consumo de alimentos callejeros y el sitio de consumo.

No se observó ninguna relación entre las posibilidades (odds) de tenerdiarrea y la frecuencia de consumo de alimentos en la vía pública(Cuadro 14). Una vez ajustado por ingreso y educación, el riesgo depadecer diarrea se encontró ligeramente elevado en quienes dijeronhaber consumido los alimentos en el sitio de venta en comparacióncon quienes dijeron no hacerlo; este incremento no fueestadísticamente significativo (los intervalos de confianza del 95%sobre la razón de posibilidades (odds ratio) incluyeron el valor 1.0).

Las posibilidades (odds) de haber padecido vómitos en los últimos 5días aumentaron a medida que aumentó la frecuencia del consumo dealimentos en la vía pública, aunque los intervalos de confianza del95% para la razón de posibilidades siempre incluyeron al valor 1.0(Cuadro 15) y la tendencia de incremento en la ocurrencia de vómitosal incrementarse la frecuencia de consumo no fue estadísticamentesignificativa. Estas asociaciones persistieron luego de ajustar poringreso y educación. No se observó ninguna relación entre haberpadecido vómitos y el sitio de consumo de los alimentos.

6.3 Relación entre características de los vendedores y de los puestos y lacontaminación bacteriana

Los Cuadros 16-19 muestran razones de posibilidades (odds ratios) decontaminación por distintos microorganismos luego de ajustar por ciudad. LaCiudad de Guatemala se excluyó de estos análisis ya que no fue posibleaparear los resultados de los análisis microbiológicos en las muestras dealimentos con las encuestas a vendedores. No se observaron asociacionesclaras entre el sexo o la edad de los vendedores y las posibilidades (odds) decontaminación. Tampoco hubo un patrón claro en cuanto a la relación entre laeducación y el ingreso de los vendedores y las posibilidades decontaminación. Para S. aureus, B. cereus y coliformes de origen fecal, lasposibilidades de contaminación fueron menores en los vendedores de menoringreso y educación, pero estas diferencias fueron estadísticamentesignificativas en muy pocos casos (en la gran mayoría, los intervalos deconfianza del 95% incluyeron el valor 1.0). Por el contrario, la contaminaciónpor C. perfringens pareció estar aumentada en los vendedores de menoresingreso y educación, pero las diferencias en ningún caso fueronestadísticamente significativas (P <0.05). No hubo asociaciones claras entre

las posibilidades de contaminación y la asistencia a cursos de manipulaciónde alimentos por parte de los vendedores. En este sentido, es importanteevaluar el contenido de los cursos recibidos y la aplicación de las medidashigiénicas por parte de los vendedores. También es posible que el riesgo detransmisión de ETA a través del consumo de esos alimentos solamentepresentará disminución importante cuando la educación de losvendedores/manipuladores se complemente con programas apropiados deinformación a los consumidores.

En general tampoco hubo asociaciones claras entre el número de personasque trabajan en el local, el número de personas que se atienden por día, lashoras que atienden por día, o el ser una actividad familiar y las posibilidadesde contaminación. Las únicas excepciones fueron la contaminación por C.perfringens, que se encontró significativamente aumentada el locales que norefirieron ser una actividad familiar (P <0.05) y la contaminación porcoliformes de origen fecal, que aumentó significativamente a medida queaumentó el número de empleados en el local y el número de comensales.

El uso de agua sin tratar estuvo asociado a incrementos en las posibilidades(odds) de contaminación de los alimentos para todos los gérmenes, aunqueestos incrementos no fueron estadísticamente significativos. El uso de aguaclorada estuvo incluso asociado a incrementos estadísticamente significativosen las posibilidades de contaminación por S. aureus. La escasa cantidad depuestos sin acceso a agua hace difícil la interpretación de las razones deposibilidades correspondientes a esta categoría. No hubo asociacionesclaras entre el riesgo de contaminación y la presencia de sistemas deeliminación de aguas o basuras o la existencia de letrinas en la proximidad selos puestos. Tampoco hubo asociaciones claras entre las posibilidades decontaminación y el sitio de preparación de alimentos, la presencia deinstalaciones para calentar o enfriarlos, o el aprovechamiento de alimentossobrantes. El adquirir los alimentos de más de un proveedor tampoco serelacionó claramente con las posibilidades (odds) de contaminación.

6.4 Evaluación de las muestras positivas y del riesgo de enfermarse

Además del análisis microbiológico de los alimentos, se evaluaronindividualmente todas las fichas de recolección de las muestras de alimentosque presentaron dosis infectante de S. aureus, B. cereus y/o C. perfringens, opresencia de Salmonella o E. coli O157:H7 (Anexo 2). En la evaluación seconsideraron su composición, temperatura en el momento de recolección dela muestra, condiciones en que se lo mantenía en el puesto de venta yvolumen expendido en una jornada de trabajo. También se revisó lainformación referente al vendedor y al puesto de venta como horas defuncionamiento, aspectos higiénicos del puesto, número promedio deconsumidores atendidos, etc. Toda esa información complementaría se

recolectó de las fichas individuales de recolección de muestras, y es la basede muchos de los comentarios que se hacen a continuación.

6.4.1 Vibrio cholerae

Si bien los resultados relativos a la búsqueda de dosis infectante deV. cholerae son coincidentes con el descenso de la curva epidémicadel cólera en las ciudades encuestadas, eso no se debe de interpretarcomo ausencia de riesgo, ya que en otras oportunidades (101) seaisló el microorganismo de varios tipos de alimento callejero.

Los programas desarrollados por las agencias de cooperacióntécnica, asociados a programas nacionales de educación y elfortalecimiento de la vigilancia epidemiológica por cierto contribuyerona la reducción del riesgo presentado por los alimentos callejeros en latransmisión del cólera. Sin embargo, hay que tener presente que lascondiciones en que se manipulan y comercializan esos alimentos en lavía publica, en donde la contaminación cruzada es una amenazapermanente, el substrato nutritivo ofrecido por los alimentos mismos yla temperatura ambiente en las ciudades estudiadas, son todos elloselementos muy favorables a la contaminación de los alimentos por elV. cholerae y su rápida multiplicación, pudiendo alcanzar la dosisinfectante en muy poco tiempo.

6.4.2 Staphylococcus aureus

Las muestras positivas para S. aureus halladas en La Paz pertenecíanmayormente a los alimentos clasificados como pescados y mariscos,dulces y productos lácteos. La mayor concentración de muestraspositivas en los dos últimos tipos de alimentos confirma lainformación de que los dulces, especialmente los que contienencrema, y los alimentos a base de leche, ofrecen substrato deexcelente calidad para el desarrollo del S. aureus, además deconstituir en un indicador importante sobre la manipulación y/o elorigen de la leche utilizada en la preparación de cremas y productoslácteos destinados al expendio en las calles. La contaminaciónobservada en los pescados puede estar asociada al exceso demanipuleo durante la preparación de eses platillos. Las muestraspositivas sugieren que el número de manipuladores de alimentoscallejeros que son portadores del microorganismo puede ser alto yque o bien la temperatura de cocción de esos alimentos no essuficiente para inactivar el S. aureus o la recontaminación posterior ala cocción es muy alta. Esta última hipótesis parece ser másprobable, por lo menos en el caso de un platillo de pescado frito conmaíz y papas en donde se ha verificado, además de la existencia de

S. aureus en cantidades suficientes para causar la intoxinación, lapresencia de Salmonella y un conteo elevado de organismoscoliformes fecales. Teniendo en consideración el número promediode consumidores que acudían a esos puestos, se estima en 700/día lacantidad de personas en riesgo de adquirir ETA por S. aureus, en esaciudad.

La situación observada en Santafé de Bogotá, en donde la mayoríade las 13 muestras positivas provenían de alimentos a base de lecheo carne, puede indicar la utilización de leche no pasteurizada para laelaboración de los alimentos lácteos destinados al expendio en la víapública. Esta es una situación que ocurre en muchas ciudades de laRegión, y que puede ser responsable de un número considerable deETA causadas por el S. aureus, ya que no es poco frecuente que laleche se obtenga de animales enfermos (mastitis) y así contengan elmicroorganismo. Es de destacar que muchas de las muestraspositivas provenían de alimentos que se han preparado en el hogardel vendedor o se adquirieron listos de proveedores. Esto sugiereque el tiempo, además de temperaturas adecuadas, es importantepara el desarrollo del microorganismo en el alimento y la consecuenteproducción de toxinas. Con relación a las toxinas, hay que registrarque el IAL ha identificado en las muestras positivas las toxinas A, C yD. Se estima en 520/día el número de consumidores expuestos alriesgo de adquirir ETA a través de la ingestión de alimentoscontaminados por S. aureus.

De las 16 muestras positivas en Quito, casi todas pertenecían a unalimento conocido como Aencebollado@, que es un platillo a base depescado, cebolla y condimentos. Casi siempre los vendedores lopreparan en su hogar o lo adquieren de un proveedor, ya listo para elconsumo, y lo mantienen a temperaturas alrededor de 42 al 45oC, enel local del expendio. En general, esas muestras provenían depuestos que se clasificaron como Asucios@. Los dueños de lospuestos declararon que alrededor de 50 personas al día acudían paraconsumir esos alimentos. Se estima en 800/día, el número deconsumidores expuestos al riesgo de enfermarse a través delconsumo de esos productos.

En Lima, donde la gran mayoría de los vendedores aprovecha losalimentos sobrantes del día en su próxima jornada de trabajo, laocurrencia de S. aureus también ha sido importante. Además, lajornada diaria es de casi 8 h, en promedio, lo que vale decir que losalimentos se mantienen expuestos al ambiente (situación constatadaen la mayoría de los puestos), por tiempo suficiente para que ocurra eldesarrollo microbiano hasta niveles infectantes. Teniendo en

consideración la información obtenida sobre el número deconsumidores que acudían a los puestos en donde se constatómuestras contaminadas por ese microorganismo, se estima alrededorde 700 personas/día estén expuestas al riesgo de enfermarse porconsumir alimentos callejeros contaminados con toxina estafilocócica.

Si bien en Santo Domingo solamente 3 muestras contenían dosisinfectantes de S. aureus, el hecho de que todas ellas provenían dealimentos que son, en general, sometidos a altas temperaturas depreparación (pollo frito, pescado frito y carne de cerdo frita) seconstituye en fuerte indicación de recontaminación, lo que significaque los manipuladores carecen de buenos hábitos higiénicos y queesos alimentos se manipulan de manera descuidada y que sonmantenidos en condiciones inadecuadas de conservación. Laausencia de otro tipo de contaminación en esas muestras es otroindicador de contaminación posterior al proceso térmico. Teniendoen cuenta que los vendedores de esos alimentos han declarado serviresos alimentos a cerca de 90 consumidores, se estima que por lomenos ese número de personas, pueden enfermarse cada día, através del consumo de esos alimentos.

La Ciudad de Guatemala ha sido el lugar que presentó el mayorporcentaje de muestras positivas para S. aureus. Teniendo en cuentaque en es ciudad más del 50% de los vendedores han sidocapacitados en buenas practicas de manipulación de alimentos, setiene un indicativo de que la capacitación del vendedor no essuficiente para producir cambios en la higiene de los alimentoscallejeros, si no se complementa esta acción con informaciónadecuada a los consumidores, a fin de permitir la identificación de losvendedores capacitados, dándose preferencia a los productosexpendidos por ellos. Entre los alimentos contaminados se puedeobservar productos crudos o cocinados, vegetales, cárnicos ylácteos, o sea, todos los tipos de alimentos. Eso es más unaindicación que este tipo de contaminación está estrechamenterelacionado a la manipulación deficiente de los alimentos. Unacaracterística de Ciudad de Guatemala es el gran número depersonas que acuden a las ventas callejeras de alimentos. Con baseen el número de consumidores que se sirvieron de los alimentos quepresentaron positividad para S. aureus, se estima que alrededor de1550 consumidores se exponen, todos los días, al riesgo de consumiralimentos callejeros contaminados, desarrollando una ETA por esacausa.

En Ciudad de México, la situación se presentó de manera semejante aSanto Domingo, con pocas muestras contaminadas con la dosis

infectante del S. aureus. Casi todas ellas fueron de tacos con carne,y una fue de ostillones. Los alimentos correspondientes se manteníana temperaturas alrededor de los 25oC. Teniendo en cuenta que losvendedores declararon servir esos alimentos a alrededor de 40consumidores al día, se estima que por lo menos 120 personasestuvieron expuestas al riesgo de enfermarse por S. aureus en esaciudad.

El pequeño número de muestras positivas para S. aureus en losalimentos callejeros de Culiacán parece indicar una influencia positivadel nivel de educación de los vendedores (más de 27% de ellos tienennivel universitario), en especial si se tiene en cuenta que lacontaminación por ese microorganismo es, en general, proveniente,de la recontaminación decurrente de manipulación inadecuada. Sinembargo, si se considera que esa es una ciudad en donde el turismoes una importante fuente de ingresos, no se puede dejar de considerarque las muestras positivas se pueden traducir en un riesgo de quealrededor de 250 personas estén expuestas a contraer unaintoxinación por toxina estafilocócica, todos los días.

6.4.3 Bacillus cereus

Teniendo en cuenta el número de muestras positivas en La Paz(solamente 3 muestras), se puede estimar que cerca de 100personas/día se exponen al riesgo de enfermarse a través delconsumo de alimentos callejeros contaminados por B. cereus.

Las muestras de alimentos de Santafé de Bogotá que presentaronniveles $103 UFC/g, pertenecían a los productos cárnicos, granos ycereales o productos lácteos. Sin embargo, en todos los casos setrataban de alimentos que requieren un alto nivel de manipuleo. Así,los platillos Alechona@, Achorizo de arepa@ y Aarepa de mazorca@,además de populares pertenecen a ese grupo. En el momento delmuestreo, se observó que la temperatura de esos alimentos estabaentre 24 y 28oC. Según la información de los vendedores, la cantidadde estos alimentos vendidos en una jornada de trabajo es suficientepara alimentar a cerca de 300 consumidores, estimándose que ese esel número de personas expuestas al riesgo de contraer ETA por laingestión de alimentos contaminados por dosis infectante de B.cereus.

Si bien en Quito solo 3 muestras estuvieron contaminadas con B.cereus en niveles capases de desencadenar ETA, la cantidad de losalimentos correspondientes expendidos en una jornada de trabajo essuficiente para atender a unos 300 consumidores. Los alimentos

contaminados se mantenían a temperatura tibia (43 - 48oC) que losvendedores consideraron Acaliente@.

En Lima, los alimentos de los cuales se recolectaron las muestraspositivas se mantenían en general a temperatura ambiente, lo cual escrítico para el buen desarrollo del B. cereus. Esas temperaturas sonapropiadas para la germinación de las esporas de esemicroorganismo con el posterior desarrollo y producción de sustoxinas. El IAL ha demostrado la producción de toxina diarréica porlos microorganismos aislados en esa ciudad. Considerando que elalimento contaminado por B. cereus se ha servido a cerca de 400consumidores, se considera que ese es el número de personas enriesgo diario de enfermarse.

La única muestra de Santo Domingo que presentó la presencia delmicroorganismo, en los niveles considerados como capases deproducir ETA, pertenecía a un helado preparado con leche y zumo defruta. Teniendo en cuenta que la temperatura de mantenimiento deese alimento (0oC en el momento de la recolección) no es apropiadaal desarrollo microbiano, ni a la producción de toxinas, se presumeque la contaminación viene desde la preparación, en donde lascondiciones higiénicas deben de ser precarias. En ese caso, hay queconsiderar que el vendedor adquirió el helado de un proveedor y por lotanto, la contaminación debe de haber ocurrido en esta etapa. Si seconsidera solamente las personas que consumieron el helado de esevendedor, se puede estimar que por lo menos 50 consumidores hanestado expuestos al riesgo de adquirir ETA por B. cereus a través delconsumo de alimentos en la vía pública de Santo Domingo.

En Ciudad de Guatemala, si bien entre las muestras positivas seencontraron una clasificada como Adulce@, otra como alimentoAcárnico@ y otra como Agranos y cereales@, todas conteníancereales en su composición. Los alimentos en cuestión se manteníana temperaturas que variaban entre los 20oC y los 37 oC. Merecedestacar el hecho que todos los vendedores involucrados recibieroncursos de capacitación, y sus puestos de venta tenían una aparienciaAlimpia@. Se estima que más de 150 personas pueden consumir esosalimentos durante una jornada de funcionamiento de los puestos.

En la Ciudad de México, en donde se encontraron 2 muestraspositivas para B. cereus, las muestras positivas también provenían dealimentos que contenían cereales en su composición. Además depresentar una dosis bastante elevada de B. cereus ($106 UFC/g) losAtacos@ también presentaron conteo elevado de organismoscoliformes fecales, lo que es un fuerte indicativo de que eses

alimentos se elaboraron en condiciones precarias de higiene. Si bienlos puestos de venta se consideraron Alimpios@ por el encuestador,se sabe que parte de este alimento (las tortillas) se elaboran, engeneral en otras partes, en donde las condiciones higiénicas delambiente y del manipulador son bastante precarias. A esto hay queagregar el tiempo transcurrido entre la preparación de la masa deharina de maíz y la preparación y cocción de los tacos. Este tiempoparece ser suficiente para que el microorganismo, cuando presente,se desarrolle al punto de alcanzar niveles que pueden significar riesgoal consumidor. Además, la temperatura y el tiempo de cocciónparecen ser insuficientes para destruir los microorganismos. Por elcontrario, las temperaturas de mantenimiento y cocción parecenfavorecer el desarrollo de la toxina diarréica, producida por el B.cereus durante la fase de desarrollo exponencial y de la toxinaemética, que el microorganismo secreta al esporularse. Si bien elnúmero de consumidores en riesgo directo de enfermarse a través delconsumo de tacos provenientes de los puestos que presentaronmuestras contaminadas se estima en cerca de 200/día, hay queconsiderar que ese número debe multiplicarse muchas veces, si setiene en cuenta la popularidad de este alimento en la venta callejera enla Ciudad de México.

En Culiacán más de 33% de las muestras en donde se buscó B.cereus, revelaron cantidades suficientes por gramo de alimento paraprovocar ETA. Todas las muestras positivas fueron de Atacos@ condistintos tipos de relleno. Si se estima que en cada uno de los puntosde venta se sirven cerca de 50 consumidores por día (numero muyconservador en una ciudad turística), se puede estimar en 2350 elnúmero de personas expuestas a contraer intoxinación alimentaria através de la ingestión de Atacos@ contaminados por B. cereus.

6.4.4 Clostridium perfringens

De las 9 muestras positivas en La Paz más del 70% se mantenían entemperatura ambiente (18oC - 20oC) en los puestos de venta. Teniendo en cuenta que 85% de los vendedores aprovechanalimentos sobrantes y el volumen comercializado en los puestos deorigen de las muestras positivas, se estima que entre 250 y 300consumidores de alimentos están en riesgo de adquirir ETA por C.perfringens en esa ciudad, cada día.

En Santafé de Bogotá, se observó que los alimentos de dondeprovenían las muestras que fueron positivas para el C. perfringenseran de alimentos que se preparan en el hogar, o que se adquieren deproveedores listos para consumirse. Estos productos se mantienen a

temperatura ambiente ("18oC) y sufren un breve recalentamiento,nunca superior a los 50 oC, antes del consumo. Este es unprocedimiento que favorece la multiplicación del C. perfringens. Teniendo en cuenta el volumen de alimento expendido, se estima quepor lo menos 150 personas se exponen, todos los días, al riesgo decontraer ETA producida por C. perfringens, en esa ciudad.

Entre las muestras positivas encontradas en Quito, todaspertenecientes a cepa productora de enterotoxina del tipo A, lacantidad de células de C. perfringens llegó a sobrepasar los 105/g. Engeneral, los alimentos se prepararon en el hogar del vendedor, y semantenían a temperatura de 32 a 48oC, en el momento de larecolección de la muestra o a temperatura ambiente ("18oC). El únicocaso de alimento que se preparaba en el local del expendio,correspondió a la muestra con el número más bajo demicroorganismos. Todas las muestras positivas provenían depuestos considerados Alimpios@. Se estima que alrededor de 350consumidores estuvieron expuestos al riesgo de contraer una ETA enesa ciudad, por día.

En Lima las 4 muestras que estuvieron contaminadas con dosisinfectante del C. perfringens provenían de puestos consideradosAsucios@, lo que se ve confirmado por el alto número de organismoscoliformes fecales presentes en las mismas muestras. Todos losalimentos de los cuales se recogieron las muestras positivas, semantenían a temperatura ambiente o ligeramente tibia (25 al 40oC),bastante apropiada para la multiplicación de microorganismos. Teniendo en cuenta el número de consumidores que concurren a esospuestos y que más del 83% de los vendedores aprovechan losalimentos sobrantes, están dadas todas las condiciones paraestimarse que alrededor de 100 consumidores se exponen al riesgode adquirir ETA debido al C. perfringens, cada día.

En Santo Domingo, el alimento que presentó niveles infectantes deese microorganismo se mantenía a una temperatura máxima de 31oC,según fue verificado en el momento de la recolección. Se verificó quemuchos consumidores acudían al local de expendio en donde seidentificó el C. perfringens. Por eso, se estima en 60 el número deconsumidores en riesgo de adquirir ETA por C. perfringens en SantoDomingo.

La situación verificada en Ciudad de Guatemala no difiere mucho delas anteriores. Todos los alimentos contaminados se mantenían atemperaturas que variaban de 20oC a 37oC y varios de ellospresentaron multicontaminación. Cabe registrar que Ciudad de

Guatemala es una de las ciudades, entre las participantes de eseestudio, con mayor número de vendedores con curso de manipulaciónde alimentos. Teniendo en cuenta el número promedio deconsumidores que atienden a los puestos que presentaron muestrasde alimentos contaminadas con C. perfringens, se estima quealrededor de 250 consumidores estuvieron en riesgo de contraer ETApor ese microorganismo, por día.

En la Ciudad de México, los alimentos contaminados con esemicroorganismo se mantenían, en general a temperaturas de 24 a28oC. Sin embargo, hay que destacar el caso de un alimento, queestaba a 90oC en el momento de la recolección de la muestra. Teniendo en cuenta que esa es una temperatura que sobrepasa latemperatura de inactivación de las células vegetativas, se estima quelos esporos de C. perfringens presentes en ese alimento resistieron latemperatura y se desarrollaron posteriormente. Se estima quealrededor de 150 consumidores corren el riesgo de enfermarse através de la ingestión de alimentos contaminados por C. perfringens,por día.

En Culiacán se observó que todas las muestras contaminadasprovinieron de un mismo tipo de producto (tacos) con relleno a basede carnes. Esta es una característica aún más interesante, si se tieneen cuenta que en esa ciudad los mismos alimentos tambiénpresentaron contaminación bastante elevada por B. cereus y porSalmonella. La temperatura de mantenimiento del relleno para lostacos estuvo, en general, en el rango de 44 a 47oC, ideal para eldesarrollo de microorganismos patógenos como el C. perfringens, E.coli, algunos serovares de Salmonella, etc. En esa ciudad, se estimaen cerca de 350/día, el número de consumidores expuestos al riesgode presentar ETA por esa causa.

6.4.5 Salmonella

En La Paz, de las 4 muestras contaminadas por Salmonella, e fueronde verduras frescas. Eso tiene importancia, en la medida que se sabeque la utilización de aguas negras para el riego de plantaciones es unapractica común en muchos países de la Región. Así, el hallazgo deSalmonella puede ser un indicador de contaminación de esasverduras por heces. Teniendo en cuenta el numero de personas queconsumieron el alimento contaminado en el día de recolección de lasmuestras, se estima que alrededor de 90 consumidores/día estuvieronexpuestos al riesgo de contraer ETA a través de alimentosexpendidos en la calle de La Paz.

De las 2 muestras positivas para Salmonella en Santafé de Bogotá,una se clasificó como Salmonella Infantis y se aisló del alimentoconocido como Arellena@. Este es un tipo se alimento a base decarne que requiere manipulación intensa durante su preparación y quese mantenía en el puesto de venta a temperatura cercana a los 32oC. La otra muestra positiva se identificó como Salmonella Sandiego y seaisló de un Aemparedado de jamón y queso@ que se mantenía a14oC. Si se considera que la cantidad de esos alimentos expendidosen una jornada de funcionamiento de esos puestos es suficiente paraalimentar a unos 100 personas, se estima que por lo menos igualnúmero de consumidores están en riesgo de adquirir salmonelosis através de la ingestión de alimentos callejeros en esa ciudad.

En Lima se encontraron 2 muestras positivas para Salmonella(Salmonella Albani y Salmonella Typhimurium 05+). Las dosmuestras fueron de Acebiche@, alimento típico compuesto de trozosde pescado crudo al cual se adiciona jugo de limón, cebolla y otrostemperos. Es de suponer que el pH de este alimento es siempreinferior a 4,0, que es el valor por debajo del cual se destruye elmicroorganismo. La presencia de Salmonella en ese alimento degran consumo en Lima, sugiere que el pH no es lo suficientementebajo como para garantizar su inocuidad. Considerándose que losvendedores de cada un de los puestos deben haber servido elalimento a 60 consumidores, se estima en 120 el número de personasen riesgo de adquirir ETA, por día.

En Ciudad de Guatemala fué posible confirmar la presencia deSalmonella en 4 muestras. Las cepas se identificaron comoSalmonella Paratyphi B, un serovar que está altamente adaptado alhombre. Los alimentos contaminados pertenecían al grupo de lasfrutas y vegetales (3 muestras) y jugos naturales (1 muestra). Esopuede significar que ese serovar de la Salmonella circula en elambiente de venta de alimentos en esa ciudad y que es probable queel número de portadores de ese microorganismo sea elevado y/o quese utilicen aguas negras para irrigación de los cultivos. Teniendo encuenta la cantidad de alimento expendida durante un día defuncionamiento del puesto, se estima que por lo menos 240consumidores/día pueden enfermarse a través de su consumo.

En la Ciudad de México, el vendedor del alimento que presentócontaminación por Salmonella, declaró que en general mantiene susAtacos@ a temperatura ambiente hasta el momento de la venta,cuando el mismo se calienta. El proceso de Acalentamiento@ delproducto que se tomó como muestra fue suficiente para llevar latemperatura a los 25oC. Si bien el puesto del cual se recolectó la

muestra positiva atendía alrededor de 30 consumidores por día, hayque considerar la gran importancia de los Atacos@ en la alimentacióncallejera en esa ciudad. Así, se considera, en una estimaciónconservadora, que por lo menos 10 veces más consumidores estánexpuestos, todos los días, al riesgo de enfermarse por esta causa, através de los alimentos que se expenden en la calle.

Todas las muestras positivas en Culiacán (11) fueron de Atacos@. Ese tipo de alimento, quizás el más común y apreciado en las callesde esa ciudad, está compuesto por tres ingredientes básicos: tortillade maíz, relleno a base de carne, pollo o menudencias y salsa deverduras. Teniendo en consideración que la tortilla no parece ofrecerambiente apropiado para el desarrollo de ese microorganismo, que elrelleno siempre es cocinado por largo tiempo y, por lo tanto, elbinomio temperatura/tiempo asegura la inactivación demicroorganismos que estuviesen presentes en los ingredientes, restandos hipótesis para justificar una contaminación tan importante comoesa: (1) que uno o más de los componentes de la salsa (lechuga,cilantro, ají, etc.) provenga de cultivos irrigados con aguas negras, o(2) que los manipuladores de esos alimentos sean portadores deSalmonella y que estén contaminando los alimentos a través deprocedimientos inadecuados en la manipulación. Considerándose queel alimento contaminado se ofreció al consumo de por lo menos 660personas en el día de recolección de las muestras, se estima que esesea el número de consumidores expuestos a adquirir ETA por esacausa.

6.4.6 Escherichia coli O157:H7

La única muestra que se logró confirmar para ese microorganismo entodo el estudio, ha sido una muestra de papaya pelada y picada,proveniente de la venta de alimento en las calles de la Ciudad deGuatemala.

La capacidad de la E. coli O157:H7 sobrevivir en pH ácido ha sidocomprobada por diversos autores (79, 80, 81). Teniendo en cuentaque la papaya madura presenta un pH de alrededor de 5,4, se puedeafirmar que este alimento ofrece condiciones adecuadas almantenimiento y hasta para la multiplicación del microorganismo. Losmismos autores informan que la E. coli puede desarrollarse a bajastemperaturas (4 a 5oC). Otros autores (107) verificaron que lamultiplicación de la E. coli O157:H7 ha sido inhibida en ensaladas dezanahorias. Sin embargo, lo mismo no ha ocurrido en relación aensaladas de lechuga o de pepino, cuando eran mantenidas atemperaturas entre 12oC y 21 oC. La capacidad de supervivencia y

desarrollo presentada por la E. coli O157:H7 en papaya, se hacomprobado en estudios desarrollados en laboratorio por DMTSchuch y MA Bechtel (Laboratorio de Referencia Animal-PortoAlegre, RS - Brasil, comunicación personal, 12 de abril de 1996). Estos investigadores contaminaron trozos de papaya con 25 UFC deE. coli O157:H7/g y se los mantuvieron a 30oC. Los conteosrealizados después de 1,5 h, 3,5 h y 24 h revelaron que las células quese inoculó inicialmente pasaron respectivamente a 101 UFC/g, 314UFC/g y 1,5 x 107/g. Esa observación indica que la papaya ofrececondiciones favorables a la supervivencia y multiplicación delmicroorganismo.

La contaminación de ese alimento se ha dado, muy probablemente,por manipulación inadecuada, a través de contacto directo o indirectocon carne bovina contaminada o con heces de ganado vacuno. Valedestacar que las autoridades sanitarias de los Estados Unidos deAmérica (76) recomiendan el lavado cuidadoso de frutas y vegetalesantes de su apertura para consumo, con utilización de esponja vegetalbajo el agua corriente, como medida para evitar la contaminación dela parte interna de esos alimentos.

En el caso específico de la muestra que se encontró positiva enCiudad de Guatemala, se observó que la cantidad comercializada enuna jornada de trabajo es suficiente para alimentar de 30 a 50consumidores. Esto permite estimar que por lo menos 30consumidores estuvieron expuestos al riesgo de adquirir laenfermedad conocida como HUS. Si bien esta ha sido la únicamuestra positiva para E. coli O157:H7, ese hallazgo se constituye enuna prueba, probablemente la primera conocida, del papel que losalimentos callejeros pueden jugar en la transmisión de ETA debidas amicroorganismos emergentes.

Además, si se tiene en cuenta la gran cantidad de cultivos (alrededorde 200) enviados IAL para confirmación y aún considerándose que loslaboratorios participantes enviaron para confirmación solamente unode los 5 cultivos aislados a partir del agar de MacConkey-Sorbitol, sepuede sospechar que algunas otras, entre las colonias que no fueronseleccionadas para confirmación, pueden haber sido también E. coliO157:H7.

6.4.7 Estimación del riesgo anual en cada ciudad

Tomándose las estimaciones de riesgo diario, hechas en cada una delas 8 ciudades estudiadas, para cada microorganismo, se ha llegado alos valores que se presenta en la tabla siguiente:

6. Resultados y Discusión6. Resultados y Discusión

Número anual de consumidores expuestos al riesgo de adquirir ETA por S. aureus,B. cereus, C. perfringens y Salmonella, debido a la ingestión de alimentos vendidos en

la vía pública*

S. aureus B. cereus C. perfring. Salmonella Total

La Paz 182,000 26,000 78,000 23,400 309,400

Bogotá 135 200 78,000 39,000 26,000 278,200

Quito 208,000 78,000 91,000 --- 377,000

Lima 182,000 104,000 26,000 31,200 343,200

Sto.Domingo 23,400 13,000 15,600 --- 52,000

Guatemala 403,000 39,000 65,000 62,400 569,400

México 31,200 52,000 39,000 7,800 130,000

Culiacán 65,000 611,000 91,000 171,600 938,600

Total 1,229,800 1,001,000 444,600 275,600 2,997,800

* En algunos casos, los valores pueden estar sobreestimados, en razón de la multicontaminación dealgunas muestras y de la resistencia presentada por algunos individuos a patógenos específicos.

7. CONCLUSIONES

Los resultados del análisis microbiológico permiten concluir que es evidente el riesgode los alimentos callejeros de estar contaminados con los patógenos transmitidos poralimentos, no obstante que la prevalencia de dosis infectantes en los diferentesgrupos de alimentos y para los microorganismos investigados son aparentementebajas.

Así mismo, es palpable la deficiencia que presenta el expendio de ese tipo decomidas en lo que refiere a infraestructura sanitaria de los puestos de venta, loshábitos higiénicos de los manipuladores y las actitudes de los consumidores frente aestos aspectos, que llevan a pensar en un riesgo real mucho mayor del estimado eneste estudio.

En efecto, el hecho de expresarse como positividad solo la existencia de dosisinfectantes, no se excluye la presencia de patógenos transmitidos por alimentos en lasmuestras, que si bien no pudieran alcanzar dosis infectantes en el momento de larecolección de las muestras, lo pueden hacer en el curso de su posteriormantenimiento en condiciones de temperatura y tiempo que según revela este mismoestudio, son adecuadas para la supervivencia y proliferación de microorganismos, locual puede reforzar el potencial de los alimentos callejeros para transmitirenfermedades.

Un hecho que llama la atención es la influencia que puede tener en la calidad sanitariade los productos así expendidos, la variada gama de posibilidades en cuanto aadquisición de materias primas y lugar de procesamiento de los alimentos. Enparticular es visible el porcentaje apreciable de vendedores que preparan losalimentos en sus mismos hogares, frente al escaso porcentaje de quienes loadquieren listo de un proveedor, lo cual plantea dificultades para el control por partede los organismos responsables por la dispersión que es de suponer en los lugaresde preparación y revela una situación de poco conocimiento sobre las condiciones deprocesamiento y formulación de productos, lo cual sugiere la necesidad de asignarprioridades en este sentido en los programas de control de este tipo de alimentos.

Los indicadores de tipo social y económico que resultan del presente estudio,confirman que la venta callejera de alimentos es mantenida por una dinámica de ofertay demanda donde los protagonistas muestran notable identidad en su perfil socio-cultural, lo cual sugiere la necesidad de profundizar en el conocimiento principalmentedel consumidor y dirigir hacia este los mayores esfuerzos para cambiar su actitud y supercepción frente al significado de la inocuidad de las comidas que consume y que seprofundice también en el estudio y divulgación de las ETA, especialmente lascausadas por patógenos emergentes, que pueden tener una importancia aún noevaluada en los alimentos vendidos en las calles.

Finalmente, al observar el cuadro que se presenta en 6.47, se puede verificar que seha estimado en casi 3 millones, el número anual de personas que se exponen alriesgo de adquirir ETA a través del consumo de alimentos en las vías públicas de lasocho ciudades estudiadas. Si se considera que los mencionados núcleos urbanostienen una población total estimada en 20 millones de habitantes (100), se concluyeque cerca del 15% de esas personas se encuentra en riesgo de enfermarse, lo quehace con que esos alimentos se constituyan en un grave problema de salud pública,mereciendo atención inmediata de las autoridades de salud de cada una de esasciudades.

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ANEXOS

Anexo 2

FICHA DE RECOLECCIÓN DE MUESTRAS

1. Identificación de la muestra Ficha no

1.1. Alimento recolectado_______________ Fecha / /

1.2. Temperatura en el momento de recolección ( oC) Hora_________

1.3. Volumen vendido por día______kg

2. Identificación del vendedor/manipulador

2.1. Edad________ 2.2. Sexo________

2.3. Nivel educacional

Analfabeto ( ) Primaria ( )Secundaria ( ) Universitaria ( )

2.4. ¿Ha recibido algún curso de manipulación de alimentos?

Si ( ) No ( )

2.5. Nivel de ingresos en salarios mínimos del país

< 1 ( )1 a 3 ( )3 a 5 ( )5 a 10 ( )> 10 ( )

3. Identificación del local de venta

3.1. Numero de personas que trabajan en el local

1 ( ) 2 ( ) 3 ( ) 4 o más ( )

3.2. ¿Se trata de una actividad familiar?

Si ( ) No ( )

3.3. Numero promedio de personas que comen en el local, por día

< 10 ( ) 10 - 20 ( ) 20 - 30 ( )30 - 50 ( ) más de 50 ( )

3.4. Características del local

3.4.1. Abastecimiento de aguaRed pública ( )Agua clorinada ( )Agua sin tratar ( )Sin agua ( )

3.4.2. Disposición de aguas servidas

Si ( ) No ( )

3.4.3. Disposición de basura

Si ( ) No ( )

3.4.4. Disponibilidad de letrina

Si ( ) No ( )

3.4.5. Aspecto general (limpieza y aseo)

Limpio ( )Sucio ( )

3.5. Condiciones operacionales

3.5.1. ¿Se adquiere las materias primas siempre del mismo proveedor?Si ( ) No ( )

3.5.2. ¿Se prepara el alimento en la casa del vendedor? Si ( ) No ( )

3.5.3. ¿Se compra el alimento listo de un proveedor? Si ( ) No ( )

3.5.4. ¿Se prepara el alimento el local de venta? Si ( ) No ( )

3.5.5. ¿Hay facilidades para recalentar o enfriar los alimentos en el local deventa? Si ( ) No ( )

3.5.6. Numero de horas de funcionamiento por día ________horas

3.5.7. ¿Se aprovechan los alimentos sobrantes? Si ( ) No ( )

Anexo 3

FICHA DE ENTREVISTA PARA CONSUMIDORES DE ALIMENTOS CALLEJEROS

Ficha no Fecha / /

Edad:_________ Sexo:__________

Ocupación: Obrero ( ) Oficinista ( ) Profesional ( ) Estudiante ( ) Hogar ( ) Comerciante ( )

Nivel de Educación: Analfabeto ( ) Primaria ( )Secundaria ( ) Universitaria ( )

Ingresos Mensuales (en salarios mínimos del país):< 1 ( )1 a 3 ( )3 a 5 ( )5 a 10 ( )> 10 ( )

1. ¿Cuantas veces en el día consume alimentos en la calle?

1 ( ) 2 ( ) 3 ( ) más de 3 ( )

1.1. ¿Come Ud. en el local de venta?

Si ( ) No ( )

1.2. ¿Se lleva Ud. la comida a casa?

Si ( ) No ( )

1.2.1. ¿Cuantas personas consumen este alimento en la casa?

1 ( ) 2 ( ) 3 ( ) más de 3 ( )

2. ¿Ha tenido Ud. diarrea en los últimos cinco días?(considerar diarrea como evacuación de heces liquidas 3 o mas veces en 24 horas)

Si ( ) No ( )3. ¿Ha tenido Ud. vómito en los últimos cinco días?

Si ( ) No ( )

4. Si la respuesta es positiva para 2 y/o 3 ¿qué hizo Ud.?

4.1. Se esperó que pasaran naturalmente ( )

4.2. Tomó medicamento por cuenta propia ( )

4.3. Buscó atención médica ( )

5. Si la respuesta es positiva para 2 y/o 3 )Ha tenido que faltar al trabajo (escuela)?

Si ( ) No ( )

Anexo 4

RESULTADO DE ANÁLISIS

Laboratorio_______________________________________________________________Numero__________Ciudad___________________________________________________________________Fecha___________Alimento______________________________________________________Fecha y hora de recepción en el laboratorio: Fecha_______Hora_________Responsable de la toma en la calle_________________________________Fecha de conclusión del análisis:___________

Observaciones sobre la muestra:_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

RESULTADOS

Vibrio cholerae /g o ml ____________________________

No de UFC de Staphylococcus aureus /g o ml ____________________________

No de UFC de Bacillus cereus /g o ml ____________________________

No de UFC de Clostridium perfringens /g o ml ____________________________

Búsqueda de Escherichia coli O157:H7 /25 g o 25 ml ___________________

Búsqueda de Salmonella spp /25 g o 25 ml ____________________________

NMP de coliformes fecales /g o ml ____________________________

OBSERVACIONES

1. Control de la calidad de los medios de cultivo__________________________

2. Determinación de la temperatura del equipo térmico_____________________3. Metodología utilizada (considerando el determinado en el protocolo del estudio)

3.1. Sin modificaciones ( )3.2. Con modificaciones ( ) (especificar en el verso)3.3. Otra metodología ( ) (especificar en el verso)

Anexo 5

Programa de Garantía de Calidad Analítica

El producto de cualquier laboratorio analítico es el resultado del análisis (1). Para que

realmente cumplan su finalidad de auxiliar en la decisión sobre el destino o la calidad sanitariade un producto o alimento, los resultados analíticos deben estar garantizados por unprograma amplio de Garantía de Calidad (2).

El conjunto de técnicas operacionales planeadas y adoptadas para monitorear todaslas fases críticas del proceso de obtención del producto y la adopción de procedimientos queprocuren la eliminación de causas de rendimientos no satisfactorios es conocido comoControl de Calidad (3).

La garantía de calidad requiere una evaluación continua y sistemática de los factoresque pueden afectar el programa de control de calidad previamente establecido (4).

Según algunos autores (5), la calidad analítica es determinada por procedimientos y

actitudes adoptados por todas las personas envueltas en la cadena de obtención delresultado, en todas las etapas en el laboratorio, lo que cubre desde los responsables por lacolecta, remesa y transporte de muestras, hasta la elaboración final del resultado del análisis.

La base principal de la calidad es el conocimiento (3). Para la implantación de un

programa de evaluación y garantía de calidad analítica es necesario que las personas esténsuficientemente entrenadas y capacitadas en sus áreas técnicas específicas (4) y

consecuentemente, con base de conocimiento necesaria y discernimiento para que puedandetectar fallas en el proceso o cuando un mal rendimiento es obtenido y decidir sobreacciones a ser adoptadas (1, 4).

Los beneficios obtenidos por la implantación del programa de garantía de calidadson innúmeros y comprenden:

C La credibilidad que se da a la información generada por el laboratorio (6);

C La mejoría en el desempeño del laboratorio como un todo; el establecimiento de

procedimientos uniformes realizados por diferentes personas, haciendo losresultados comparables en el mismo laboratorio (7);

C La garantía de que todo el equipo, medios, reactivos y otros materiales ofrecen una

respuesta adecuada para cada caso (5, 8, 9, 10);

C El aseguramiento de que las lecturas realizadas durante el proceso analítico son

correctas y confiables (4, 8);

C El aseguramiento de la eliminación del riesgo sanitario por el control en la eliminación

de materiales contaminados y de procedimientos de bioseguridad (11, 12);

C El aseguramiento del uso de equipo de seguridad apropiado y la adopción de

medidas para la protección de las personas y del ambiente de trabajo (5);

C El aseguramiento del uso de buenas técnicas analíticas y de laboratorio, con la

consecuente disminución de improvisaciones (4, 6);

C Prevención de la contaminación cruzada de la muestra en análisis (5) y protección del

personal contra infecciones adquiridas y del ambiente contra contaminación (12);

C Disminución de la escala de variación de los resultados obtenidos dentro de los

laboratorios y entre uno y otro (7, 13);

C Generación de información sobre la aptitud de cada especialista participante en los

análisis a fin de permitir verificarse las necesidades de capacitación (4, 5, 7, 8, 13);

C Determinación de la uniformidad de los procedimientos de control analítico realizados

por diferentes personas en el mismo laboratorio o en otro, con el fin de que losresultados obtenidos en los diversos laboratorios sean comparables (7);

C Reconocimiento de errores, cuando ocurren, permitiendo la toma de decisión basada

en hechos y datos concretos (8), la inmediata corrección de fallas impidiendo que la

información incorrecta salga del laboratorio (5);

C Prevención en origen, de los problemas, evitandose que el mismo problema vuelva a

ocurrir por la misma causa (3);

C Desarrollo de mejores desempeños en esquemas de control intra e interlaboratorio

(13) y suministro de información sobre el desempeño de cada miembro envuelto enlos análisis, permitiendo el diagnóstico de la situación (4).

1. Etapas

Un programa de garantía de calidad analítica exige los pasos siguientes :

C Determinar y formalizar los objetivos y exigencias que especifiquen la precisión

requerida, incluso la selección de procedimientos de manipulación de muestras ymetodologías cuya utilización se prevé (2, 5, 7);

C Seleccionar personal idóneo para realizar el trabajo de microbiología con el fin de

mantener el nivel de calidad deseable (2, 6, 8), y actividades permanentes de

capacitación y motivación del personal (17);

C Suministrar el equipo y las instalaciones necesarios para ejecutar las tareas (2, 5);

C Establecer métodos de vigilancia y mantenimiento de registros y protocolos para

verificar la precisión y coherencia del trabajo del laboratorio (5, 7);

C Establecer procedimientos para la adopción de medidas correctivas cuando se

determine que la calidad es inaceptable (7, 14).

2. Control de calidad intralaboratorial

2.1 Ambiente

El ambiente de trabajo debe estar exento de polvo, en lo posible. Lalocalización del equipo se debe optimizar en función del flujo de trabajo. Losbancos y mesas de trabajo se deben limpiar y desinfectar por lo menos dosveces al día. El piso del sector de microbiología no debe barrerse nunca, sinomás bien limpiarse con un paño humedecido en una solución desinfectante/detergente, usando dos baldes para tener siempre uno con solucióndesinfectante/detergente limpia y otro con agua y solución desinfectante paraenjuagar el paño.

Las dependencias del sector de microbiología de los alimentos se deben

limpiar, como mínimo, una vez al día. Cuando se derrame materialcontaminante, hay que cubrir el área con solución desinfectante (compuestosyodados, cloro, formol al 4% u otro desinfectante probado y aprobado en lostestes de verificación de eficiencia) y esperar por lo menos 30 min. Luego sedebe hacer la limpieza normal, utilizandose guantes de protección.

Es preciso hacer un control semanal del ambiente, exponiendo placas conagar no selectivo durante 15 min (15), por lo menos en dos puntos diferentes

próximos al lugar de manipulación microbiológica o en dos puntos (al frente yatrás) del equipo de flujo laminar, cuando se utilice. Incubar a 35oC por hasta96 h y registrar las lecturas (16). El Cuadro 1 presenta un resumen de las

medidas que se debe adoptar y el Cuadro 2 es un modelo de ficha pararegistro de los controles a realizarse.

2.2 Equipo

El equipo se debe mantener libre de polvo, a través de limpieza regular con unpaño remojado en solución desinfectante y manejarse de acuerdo con lasespecificaciones suministradas por el fabricante y se habrá de consultar elmanual correspondiente siempre que sea necesario (13). Se debe consultar

el Cuadro 3 para el control regular del equipo de uso más común.

Se deben mantener actualizados los registros ordinarios de control delequipo. Las lecturas diarias de la temperatura de las estufas bacteriológicas(hechas por la mañana y por la tarde) se deben registrar en forma de gráficossimilares al que aparece en el Cuadro 4. Los potenciómetros deben decalibrase por lo menos una vez al día con la utilización de solucionesestandardizada de pH 4,0 y 7,0 o 7,0 y 10,0. El electrodo debe mantenerseen solución 3M de KCl durante la noche y fines de semana. En los días defuncionamiento del laboratorio el electrodo debe mantenerse inmerso en unasolución 0,1M de KCl, acidificada al pH 4,0 con HCl. Los resultados de lacalibración se debe de registrar en formularios similares al que aparece en elCuadro 5. Por lo menos una vez por semana, se debe de comparar laslecturas de otro potenciómetro, tomando las medidas correctivas necesariassiempre que se note diferencia superior a 0,05 unidades.

2.3 Reactivos

Todos los reactivos deben llevar una etiqueta en la que se habrán de indicar elnombre de la prueba a la cual se destinan, la fecha de preparación, la fecha de

vencimiento del reactivo preparado, el nombre de la persona que lo preparó ylos cuidados especiales de manipulación y mantenimiento, cuando proceda(5).

Después de la preparación, hay que probar estos productos con medios ymicroorganismos apropiados para comprobar si su reactividad es correcta. Se deben mantener registros de la preparación y las pruebas de reactividad(9, 10) en una ficha similar a la que aparece en el Cuadro 6.

En el trabajo ordinario, se debe probar todo reactivo cada vez que se use,con cultivos de control positivos y negativos (9, 16) (Cuadro 7).

2.4 Cristalería

La cristalería se debe lavar con detergente y agua caliente. Cuando seanecesario (por ejemplo, cuando se le adhieren residuos de grasa), hay queremojarla en solución sulfocrómica (para ello se disuelven 100 g de K2Cr2O7

en 600 ml de agua destilada, se agregan 400 ml de concentrado comercial deH2SO4 y se lo mantiene enfriado mientras se agrega el ácido). Luego se lavanormalmente (16). Evitar el contacto con la piel, ojos y mucosas. Siempre

que se trabaje con eta solución, se debe de usar guantes y delatantesprotectores.

Cada quince días hay que determinar si han quedado residuos alcalinosagregando algunas gotas de azul de bromotimol en proporción de 0,04 g/l. Este indicador cambia el color de amarillo a azul verdoso en valores de pH de6,5 a 7,3 (2). Algunos autores (13) recomiendan el uso de una solución de

bromosulphtaleína (BSP) para ese control.

Después de lavar y secar la cristalería, se debe acondicionar debidamente yesterilizar a 170oC por 2 h (calor seco) (5).

La esterilidad de la cristalería debe examinarse rutinariamente (2), de acuerdo

con las indicaciones siguientes:

C Placas de Petri: viértase agar no selectivo en varias placas

recolectadas al azar. Déjese solidificar e incúbese en un medioaerobio o anaerobio o de ambas clases (30oC durante 72 h);

C Frascos o bolsas de recolección de muestras: agréguese caldo

nutritivo, tioglicolato o BHI. Enjuáguese e incúbese a 30oC por 72 h;

C Tubos, frascos de Erlenmeyer y otros: agréguese caldo BHI y

tioglicolato y obsérvese el crecimiento después de la incubación a30oC por 72 h;

C Pipetas: retírese el diluyente estéril con pipeta y siémbrese en caldo

BHI y tioglicolato y obsérvese la turbiedad después de la incubación a30oC durante 72 h.

Cuando se compruebe que el material no es estéril, hay que desecharlo ycorregir las fallas. Es preciso mantener registros de los resultados del controlde la cristalería y de las medidas correctivas tomadas para subsanar lasfallas.

Después del proceso de esterilización, la vidriería debe ser almacenada enlocal protegido del polvo y utilizada dentro de un máximo 3 semanas (13).

2.5 Medios de cultivo

El desempeño de los medios de cultivo depende de su composición, formade preparación, temperaturas sufridas, condiciones de manutención, pH final,etc. Se necesita una evaluación sistemática de los medios adquiridos enforma deshidratada o de los preparados en el laboratorio con ingredientesbásicos (16).

Los medios deshidratados, los reactivos y los ingredientes se deben guardaren un lugar fresco, donde estén protegidos de la luz y la humedad. Es precisomantenerlos refrigerados o en un frasco oscuro cuando así se indique en laetiqueta. Se necesita verificar la fecha de vencimiento (2). Hay que descartar

los medios y reactivos hidratados o que hayan cambiado de color.

Los colorantes deben guardarse en frascos oscuros o protegidos de la acciónde la luz con papel metálico u otro similar.

Para ajustar el pH de los medios de cultivo no se deben emplear nunca ácidosni bases flacos. Normalmente se usa HCl o NaOH en bajas concentraciones.

Los principales puntos críticos en la preparación de los medios de cultivo son

la pesada del material, la alteración de los medios deshidratados por causa dehidratación o exposición a la luz solar o la humedad, la destilación odeionización del agua (debe de ser reciente), la presencia de residuos dedetergente o de otras sustancias químicas o biológicas en la cristalería, lamezcla y disolución de los ingredientes, la observación estricta de lastemperaturas y tiempo de preparación y esterilización, la corrección adecuadadel pH y la correcta adición de suplementos.

Todos los medios de cultivo selectivos utilizados durante el trabajo ordinariodebe ir acompañada de un control positivo (microorganismo que se desearecuperar) y otro negativo (microorganismo que se desea inhibir total oparcialmente). Los medios no selectivos deben ir acompañados de un controlpositivo (9, 10).

Una porción (1 a 5% de lotes pequenos y por lo menos 10 unidades tomadasal azar de lotes grandes) de los medios preparados en el laboratorio debe sertestada en cuanto a la eficiencia de la esterilización a través de la incubación atemperaturas adecuadas por 48 h (13).

El Cuadro 8 indica el control positivo y negativo de los medios de cultivoselectivos para análisis de V. cholerae, S. aureus, B. cereus, C. perfringens,

Salmonella, E.coli O157:H7 y organismos coliformes fecales.

Se debe evaluar la calidad de los nuevas partidas de medios adquiridos por ellaboratorio, verificando su productividad y selectividad. Los mediospreparados con ingredientes básicos deben sufrir evaluación de la calidad encada preparación.

2.5.1 Medios sólidos

Algunos autores han desarrollado un método (18) que permite evaluar

la susceptibilidad de los medios sólidos selectivos y no selectivos a lacolonización por un microorganismo deseado y la resistencia a lacolonización por microorganismos indeseados, que se denominaMétodo Ecométrico y que está basado en los siguientesprocedimientos:

C Prepárense cultivos frescos de las cepas deseadas e

indeseadas, en fase estacionaria, en caldo BHI.

C Prepárense placas de Petri con el medio de ensayo. El medio

no debe tener menos de 4 mm de espesor. De la mismaforma, prepárense placas con el medio de referencia. Séquense en posición invertida en una estufa a 45oC porcerca de 30 min.

C Divídanse las placas en cuadrantes, según la Figura 1, y

márquense de una forma conveniente.

C Empleando los cultivos deseados e indeseados hechos en

caldo BHI y una asa calibrada de 1 µl, trazar sobre lasuperficie del medio 5 estrías paralelas en cada cuadrante yuna estría central, de forma progresiva, sin recargar ni torcerel asa. Hágase lo mismo con el medio de referencia.

C Incúbense las placas en posición invertida por el tiempo

necesario y a la temperatura apropiada para elmicroorganismo en cuestión.

2.5.1.1 Indice de crecimiento absoluto (ICA)

Se asigna un valor de 0,2 (precisión del método) acada estría. Ese valor se multiplica por el número deestrías en las cuales se observa crecimiento. Porejemplo, si hay crecimiento en las cinco estrías de unmismo cuadrante, el valor es 1 (uno); si se producecrecimiento completo en las cinco estrías de loscuatro cuadrantes y en la estría central (valor 1), elíndice de crecimiento absoluto (ICA) es igual a 5.

El ICA será igual al número del cuadrante cuandotodas las estrías de éste y de los cuadrantesanteriores muestren un crecimiento completo, mientrasno se observe crecimiento en ninguna estría delcuadrante siguiente.

Cuando aproximadamente la mitad de las estrías de

un cuadrante muestren crecimiento completo o casicompleto, el ICA será igual al número del cuadrantemenos 0,5. Para la realización de una evaluación masestricta, se debe de utilizar en esta etapa, cultivos enfase estacionaria diluídos a 1:10 o 1:100, con elmismo procedimiento que se describe anteriormente.

Calcúlese el ICA con la suma de los valoresobtenidos.

2.5.1.2 Indice de crecimiento relativo (ICR)

El ICR de una cepa es la comparación entre el ICA enun medio de estudio (ICAME) y el ICA en el medio dereferencia (ICAMR) o, ICR = ICAME/ICAMR.

2.5.1.3 Criterio de evaluación para el estudio

Los medios de cultivo sólidos se evalúan según suproductividad y selectividad:

C Se considera que un medio presenta una

productividad aceptable cuando el ICA detodas las cepas en un medio de cultivo noselectivo sea por lo menos igual a 3,5.

C Respecto a la selectividad, solo se debe

utilizar medios en los cuales el ICA de lascepas no deseadas en los medios selectivosno sea superior a 2. El ICA de las cepasdeseadas no debe ser inferior a 3.

2.5.2 Medios líquidos selectivos y no selectivos (19)

Este es un método general para evaluar el índice de crecimiento enmedios de cultivo líquidos selectivos y no selectivos.

Para el control de los medios selectivos puede ser convenienteagregar una muestra comparable al material objeto de análisis.

Distribúyanse 10 ml del caldo de referencia y del caldo a testar entubos con tapa de rosca. Esterilícense en autoclave según lasespecificaciones del fabricante.

Prepárense los cultivos de los microorganismos específicos para losmedios objeto de estudio, en fase estacionaria. En seguida,siémbrense los caldos, por duplicado, con 0,1 ml del cultivo de cadamicroorganismo objeto de estudio, que contengan aproximadamente105 unidades formadoras de colonias (UFC) por ml. Por lo general,este número se obtiene diluyendo el cultivo en fase estacionaria a1:10,000. Retírense 0,1 ml del caldo de análisis y colóquense en unaplaca de Petri con la superficie seca, que contenga agar no selectivo. Distribúyase con ayuda de un bastón tipo "hockey". Repítase elprocedimiento sobre otra placa de Petri sembrando 0,1 ml del caldode referencia. Incúbense los caldos y las placas de Petri encondiciones específicas para los medios y microorganismos objetode estudio. En diversos intervalos, retírese una parte de cada caldocon una pipeta o una micropipeta. En caso necesario, dilúyase ydistribúyase sobre las placas de Petri que contengan el mismo medioempleado en el punto anterior.

Es posible evaluar los resultados mediante observación directa oregistrar el recuento en función del tiempo en un gráfico.

Se debe analizar cada lote de caldo selectivo adquirido por ellaboratorio para verificar el número mínimo de células delmicroorganismo deseado que permite detectar. Para ello, se verificael desempeño del medio con una mezcla de cultivos deseados eindeseados.

2.5.2.1 Evaluación del desempeño del caldo selectivo con unamezcla de cultivos deseados e indeseados

Este método se desarrolló para controlar los mediosselectivos de enriquecimiento de Salmonella. Cuando

se utiliza con ese fin, se debe usar como cepadeseada una cepa standard de Salmonella

Typhimurium.

Prepárense las placas de Petri con agar de tripticase y

soya u otro agar no selectivo. Con un cultivo de lacepa deseada en fase estacionaria, prepárensediluciones decimales consecutivas (de 10-1 a 10-10) ensolución salina peptonada (NaCl 8,5 g, Peptona 1,0 g,agua destilada 1000,0 ml, pH: 7,0 a 7,2) o aguapeptonada al 0,1% . Al mismo tiempo, prepárensecultivos de las cepas patrón no deseadas, para el casode se estar testando medios selectivos paraSalmonella, Citrobacter freundii, Escherichia coli,

Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa y

Enterobacter aerogenes, en fase estacionaria y de

otros microorganismos interferentes.

Prepárese una mezcla que contenga 1 ml de cada unode los microorganismos no deseados y dilúyase a 10-1

en solución salina peptonada o agua peptonada al0,1%.

Dilúyase el microorganismo deseado de 10-1 a 10-10

en solución salina peptonada o agua peptonada al0,1%.

Estímese el número de UFC/ml del microorganismodeseado con un recuento en una superficie de agar detripticase y soya (u otro medio no selectivo). Enparalelo, el recuento se debe hacer también sobre unasuperficie de agar selectivo. Selecciónese la máximadilución de cada una de las preparadas que permitahacer el recuento (30 - 300 colonias). La comparaciónde los resultados obtenidos en el conteo en mediossólidos no selectivos y selectivos, ofrece informaciónsobre las perdidas que se puede esperar en relación alnumero de células recuperadas en medio selectivo,debido a la acción de factores impeditivos y/oselectivos sobre la cepa deseada.

Determínese la capacidad que tiene el caldo deenriquecimiento selectivo de recuperar pequeñosnúmeros del microorganismo deseado, sembrando 1ml de cada dilución de dicho microorganismo en 10 ml

de ese caldo. Incúbese a la temperatura óptima porun período de 18 a 24 h y aplíquese después enestrías sobre la superficie de agar de tripticase y soyau otro medio no selectivo y sobre la superficie de unmedio selectivo.

Obsérvense las placas y calcúlese el número demicroorganismos necesarios para activar el desarrolloen el caldo de enriquecimiento selectivo.

Para determinar la capacidad que tiene el caldo deenriquecimiento selectivo de recuperar pequeñosnúmeros del microorganismo deseado a partir de unamezcla de cepas, trasládese 1 ml de cada una de lasdiluciones del microorganismo deseado en soluciónsalina peptonada, en tubos separados, que contengan10 ml de caldo de enriquecimiento y 0,02 ml de ladilución a 10-1 de la mezcla de cepas indeseables.

Incúbese a la temperatura apropiada por un períodode 18 a 24 h y aplíquese luego en estrías sobre placasde agar selectivo. Después de la incubación,obsérvense las colonias de la cepa deseada,seleccionandose las colonias sospechosas paraconfirmación.

Para mas facil entendimiento las etapas descritasarriba se presentan en el Cuadro 9.

Regístrense los resultados, incluso la máxima diluciónque permita aislar el microorganismo deseado aparteo en conjunto con los indeseados.

2.5.2.2 Criterio de evaluación

Así como los medios sólidos, los medios líquidos de cultivodeben evaluarse según su productividad y selectividad:

C Productividad: el caldo de cultivo selectivo debe

permitir el desarrollo de un cultivo puro de la cepa

deseada con un inóculo de 20 células o menos. Alcolocar el microorganismo en placas de agar selectivoy no selectivo se puede manifestar cualquierinteracción de los medios líquidos con los sólidos.

C Selectividad: el desarrollo de las cepas deseadas en

los caldos de enriquecimiento que contienenmicroorganismos competidores (no deseables) sedebe detectar utilizando la máxima dilución quepermita el desarrollo del cultivo puro.

3. Evaluación de la calidad interlaboratorial (garantía de calidad)

Se debe de identificar los laboratorios y cada analista a través de códigos y en losinformes de evaluación del control entre laboratorios debe de constar solamenteestos códigos y no los nombres de las personas ni de los laboratorios.

Muestras ciegas de cultivos de uno o más microorganismos en un medio sólido,deben de ser analizadas y identificadas por todos los analistas.

También es importante la verificación de que todos los analistas pueden analizar unalimento que se contaminó anteriormente con diferentes cantidades de UFC/g de losdiversos microorganismos, y cuantificar el S. aureus, E. coli, C. perfringens, B.

cereus y organismos coliformes fecales, ademas de investigar la presencia de

Salmonella y V. cholerae 01, E. coli O157:H7.

Referencias Bibliográficas

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13. Weissfeld AS, Barlett RC.1991. Quality Management. In: Clinical and

Pathogenic Microbiology. Howard BJ, Keiser TF, Weissfeld AS and Tilton RC.

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15. American Public Health Association. Standard Methods for the Examination

of Dairy Products. Richardson GH. Ed. 15th ed. American Public Health

Association. Washington, DC. 1985.

16. República Federativa do Brasil, Ministério da Agricultura, do Abastecimento eda Reforma Agrária, Laboratório Nacional de Referencia Animal. Manual de

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17. Blumental TK. Management and Motivation in Quality Assurance: The HumanElement in Proficiency. In: Quality Assurance for Analytical Laboratories.Royal Society of Chemistry. Parkany M. Ed. Special publication No. 130.1994:56-59.

18. Mossel DAA, Bonants-Van Larrhoven TMG, Ligtenberg-Merkus AMT, WedlerMEB. Quality assurance of selective culture media for bacteria, moulds andyeasts: an attempt at standardisation on the international level. J Appl

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19. International Journal of Food Microbiology. Testing Methods for use inQuality Assurance of Culture Media, 1987; Appendix (I)5: 291-296.

Cuadro 1. Procedimientos de limpieza y control ambiental del laboratorio demicrobiología

LOCAL PROCEDIMIENTO FRECUENCIA

OBSERVACIONES

Bancos y Mesas detrabajo

Limpieza con pañohumedecido en solucióndesinfectante aprobada

Por lo menosdos veces aldía

Limpieza ydesinfecciónantes del início yal final de lajornada de trabajo

Pisos Limpiar con paño humedecidoen solución desinfectanteaprobada, utilizando dosbaldes

Al mínimo,una vez al día

Nunca barrer ellaboratorio demicrobiología

Cabinas de FlujoLaminar

Antes del inicio de los trabajosexponer placas con agarsangre o agar cerebrocorazón* y placas con agarbatata glicosado o agarSabouraud** en por lo menosdos puntos. Dejar por 15 min.Incubar a 35EC 96 h.

Semanal Mantenerregistros de laslecturas enformularioapropiado

Monitoreomicrobiológico delambiente cuando setrabaja en bancoscon mechero

Exponer placas con agarsangre o agar cerebrocorazón* y placas con agarbatata glicosado o agarSabouraud** en por lo menosdos puntos próximos al áreade trabajo. Dejar por 15 min.Incubar a 35EC hasta por 96 h.

Semanal Mantener registrode las lecturas enformularioapropiado

Areas contaminadasaccidentalmente porderramamiento decultivos

Cubrir el área inmediatamentecon solución desinfectanteaprobada. Dejar por 30 min.Usando guantes, limpiar conalgodón o papel absorbentedescartando en recipiente condesinfectante. Después lavar elárea normalmente

Siempre quesea necesario

Mantenerregistros de todoslos accidentes

* Después de 96 horas.** A 25oC por 5 días.

Cuadro 2.

Registros de los controles ambientales (cabinas de flujo laminar y bancos)

Fecha Medio Tiempo ResultadosMedidas

empleado exposición adoptadas

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Cuadro 3.Control de equipo

Equipo Procedimiento Frecuen. Lím. de tol. Observaciones

Baño maría Registro detemperatura

Diaria " 1 EC Limpieza semanal. Cambiar el agua

Bañomaría/colifecales

Registro detemperatura

Diaria " 0,2 EC Limpieza mensual. Cambiar el agua

Cabina de flujolaminar

Medir lavelocidad delaire

Trimestral

50 pies/min." 5 pies/min.

1) Cambiar olimpiar los filtroscada 3 meses.

2) Exponerdiariamente placasde agar sangredurante 10 minutos.

Incubar yobservar lapresencia decolonias. Si hubieramás de doscolonias, tomarmedidas correctivas.

3) Cada 15días limpiar laslámparasultravioletas conpaño suave yhúmedo.

Incubadoras Registro detemperatura

Mañana yTarde

Temperaturaapropiada

Utilizar termómetros de temperaturas máximay mí-nima. Anotar la temperatura al menosdos veces al día.

Hornos Registro detemperatura

Diaria

1) Limpiarlos

mensualmente

2) Utilizaresporas B. subtilisvar. niger paracontrol mensual.

Termómetros Verificación Anual

Balanza Verificacióncon pesopatrón

Diaria 0,00 Utilizar por lo menos 2 pesos patrones

Medidor de pH Calibración contampones

Diaria 0,05 unid. depH

1) Calibrardiariamente con dospatrones (pH 4,0 y7,0 o 7,0 y 10,0)

2) Compararsemanalmente conlecturas de patronesen otro medidor depH. Cuando ladiferencia fuere >0,05 unidades,solicitar la revisiónde los aparatos.

Jarra deanaerobiosis

Uso deindicador

Cadaciclo deuso

Reactivar el catalizador a 160EC, 2 horasdespués de 10 utilizaciones de las jarras.

Autoclave Control detemperatura

Control deeficienciabiológica

Cadaciclo deuso

Trimestral

1) Con cintaspara autoclaves, unavez al día

2) Por lomenos una vez en lasemana. Seposible, todos losdias.

3) Cambiar elagua y limpiar a cadauso.

1) Utilizaresporas de B.stearothermophilus.

Fuente: Manual de métodos de análise microbiológica para alimentos (16)

Cuadro 5.

Registro de calibración de potenciómetros

Fecha No del Tampón de Observacionesaparato calibración del pH

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Cuadro 6. Registros a efectuar durante la preparación y esterilización de medios de cultivo

Fecha Medio Marca/lote pH VolumenTiempo/Temperatura

preparado de operación deautoclave

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Cuadro 7.Evaluación y control de reactivos

PRUEBA REACTIVO CONTROL POSITIVO CONTROL NEGATIVO

Oxidasa Tetrametil-p-fenilenodiaminadihidrocloreto

V.cholerae P.aeruginosa

E.coli Salmonella

Coagulasa Plasma de conejo oxalatadoo con EDTA

S.aureus S.epidermidis S.capitis

Reduccion de Nitrato Alfanaftilamina + Ac.Sulfanilico

B.cereusE.coli

L.innocua

Producción de Indol Reactivo de Kovacs E.coli E.aerogenes

Cuadro 8.

Evaluación y control de medios de cultivo

MEDIO MICROORGANISMOS DECONTROL(C+) (C-)

RESULTADO ESPERADOCONTROL POSITIVO

RESULTADO ESPERADOCONTROL NEGATIVO

AGAR TCBS V. cholerae (C+)E. coli (C-)

Colonias amarillas, planas de 2 a 3 mm de diametro

Crecimiento inhibido concolonias translucidas

APA V. cholerae (C+)E. coli (C-)

Turbiedad con o sinpelícula en la superficie

Turbiedad

T1N1 V. cholerae (C+)S. aureus (C-)

Colonias lisas, translucidasde 1 a 3 mm de diámetro

Colonias emblanquecidas

BAIRD-PARKER S. aureus (C+)S. epidermidis (C-)

Colonias negras con halosde lecitinasa y lipolisis

Colonias negras o grisáceassin halo de lecitinasa ylipolisis

CALDO BHI S.aureusE. coli

Crecimiento

AGAR FERM.AEROBICAMALTOSA

S. aureus (C+)S. capitis (C-)

Colonias amarillas sobrefondo amarillo

Colonia blancas sobre fondopurpura

AGARB. cereus

B. cereus (C+)S. aureus (C-)

Colonias azul turquesa de"5mm rodeada por haloopaco

Crecimiento inhibido

MEDIO DEGELATINA

B. cereus (C+)P. aeruginosa (C+)S. aureus (C-)E. coli (C-)

Crecimiento conlicuefacción del medio

Crecimiento sin licuefaccióndel medio

MEDIOMOTILIDADNITRATO

B. cereus (C+ para motilidad y NO3)K. pneumoniae (C- para motilidad)L. innocua (C- paraNO3)

Motilidad: crecimiento portodo el medio.NO3: reacción positivacuando el reactivo denitrato (alfanaftilamina + ac.sulfanilico) es adicionado

Crecimiento apenas en lalinea de siembraNO3: reacción negativacuando el reactivo de nitrato(alfanaftilamina + ac.sulfanilico) es adicionado.

AGAR SPS C. perfringens (C+)E. coli (C-)

Colonias negras con o sinproducción de gas

Crecimiento inhibido

MEDIOTIOGLICOLATO

C. perfringens Crecimiento exuberante

MEDIO.LACTOSA-GELATINA

C. perfringens (C+)S. typhimurium (C-)

Licuefacción de la gelatinay fermentación de lalactosa

Sin licuefacción de la gelatinani fermentación de la lactosa

MEDIOLECHE CON

C. perfringens (C+) Coagulación de la lechecon abundante producción

HIERRO de gas

CALDORAPPAPORTVASSILIADIS

S. typhimurium (C+)E. coli (C-)

Buen crecimiento Crecimiento parcial ototalmente inhibido

AGAR VERDEBRILLANTE

S. typhimurium (C+)E. coli (C-)

Colonias rosadastranslucidas sobre mediorojo

Colonias amarillas

AGAR SS S. typhimurium (C+)E. coli (C-)

Colonias incoloras concentro negro

Colonias rosadas

CALDO UREA S. typhimurium (C+)P. mirabilis (C-)

Medio sin alteración decolor

Medio de coloración rosadafuerte

AGAR TSI S. typhimurium (C+)E. coli (C-)

Base ácido con gas y conH2S y bisel alcalino o sinalteración

Base y bisel ácidos con gassin H2S

AGAR LIA S. typhimurium (C+)E. coli (C-)

Base y bisel purpura conH2S

Base ácida y bisel purpura sinH2S

CALDO EC E. coli (C+)E. aerogenes (C-)

Crecimiento con formaciónde gas a 45EC

Crecimiento sin formación degas a 45EC

CALDOTRIPTONA

E. coli (C+)E. aerogenes (C-)

Aparecimiento de anillorojo en la superficie delcaldo después de laadición del reactivo deKovacs

Reacción negativa despuésde la adición del reactivo deKovacs

AGARMaCCONKEY -SORBITOL

E. coli O157:H7 (C+)E. coli (C-)

Colonias incoloras Colonias de color rosadointenso

Anexo 6Composición y método de preparación de los medios de cultivo

no disponibles en forma deshidratada

1. MEDIOS DE CULTIVO

1.1. Agua peptonada alcalina (APA)

Peptona 10,0 gNaCl 10,0 g

Disolver los ingredientes en un litro de agua destilada/desionizada y ajustar el pH a8,8 - 9,0 con NaOH. Distribuir porciones de 225 ml en frascos y, en tubos, porciones de10 ml. Esterilizar a 121EC durante 15 minutos.

1.2. Agua peptonada al 1% amortiguada (buffer)

Peptona de carne 10,0 gNaCl 5,0 gNaHPO4 9,0 gKH2PO4 5,0 g

Disolver los componentes en un litro de agua destilada/desionizada y ajustar el pH a 7,2" 0,2. Distribuir 225 ml en frascos Erlenmeyer y esterilizar a 121EC durante 15 minutos.

1.3. Agua peptonada al 0,1%

18 Peptona de carne 1,0 gAgua destilada/desionizada 1000,0 ml

Disolver la peptona en agua, ajustar el pH a 7,0 " 0,2. Distribuir 10 ml en tubos yesterilizar a 121EC durante 15 minutos.

1.4. T1N1

Triptona 10,0 gNaCl 10,0 gAgar-agar 20,0 g

Suspender los componentes en el agua, calentando hasta que la disolución estéconcluida. Ajustar el pH a 7,2 " 0,2. Distribuir porciones de 100 o 200 ml en frascosapropiados y esterilizar a 121EC durante 15 minutos.

1.5. Agar para fermentación aeróbica de la maltosa (AFM)

Proteosa de peptona 10,0 gExtracto de carne 1,0 gNaCl 5,0 gPúrpura de bromocresol 0,02 gAgar-agar 15,0 g

Contaminación Microbiana de los Alimentos Vendidos en la Vía Pública en Ciudades de AméricaContaminación Microbiana de los Alimentos Vendidos en la Vía Pública en Ciudades de AméricaLatinaLatina

Aditivo: Solución al 10% de maltosa esterilizada por filtración.

Suspender los componentes en un litro de agua destilada/desionizada y calentar hastaque quede concluida la disolución. Ajustar el pH a 6,8 " 0,2 y distribuir en 100 ml enfrascos. Esterilizar a 121EC durante 15 minutos. Antes de su uso, disolver el agar y dejaral baño María hasta que alcance la temperatura de 45 a 49EC. Después, añadir a cada100 ml del medio, 20 ml de la solución de maltosa estéril.

1.6. Agar motilidad nitrato

Peptona de carne 5,0 gKNO3 1,5 gExtracto de carne 3,0 gAgar-agar 3,0 g

Suspender los componentes en un litro de agua destilada/desionizada y calentar hastaque la disolución quede concluida. Ajustar el pH a 7,2 " 0,2 y distribuir en tubos. Esterilizar a 121EC durante 15 minutos.

1.7. Medio de leche con hierro (storm-test)

Leche en polvo 100,0 gSulfato ferroso 7.H2O 1,0 gAgua destilada/desionizada 1000,0 ml

Disolver la leche en polvo en 950 ml de agua destilada/desionizada. Por separado,disolver el sulfato ferroso en 50 ml de agua y mezclarlo lentamente con la leche. Trataren autoclave a 118EC durante 12 minutos. Preparar inmediatamente antes de utilizarlo.

1.8. Medio de lactosa-gelatina

Triptosa 15,0 gExtracto de levadura 10,0 gLactosa 10,0 gRojo fenol 0,05 gGelatina 120,0 gAgua destilada/desionizada 1000,0 ml

Suspender los componentes en el agua y calentar hasta que la disolución quedeconcluida. Ajustar el pH a 7,5 " 0,2 y distribuir 5 ml en tubos. Esterilizar a 121EC durante10 minutos.

2. REACTIVOS Y SOLUCIONES

Contaminación Microbiana de los Alimentos Vendidos en la Vía Pública en Ciudades de AméricaContaminación Microbiana de los Alimentos Vendidos en la Vía Pública en Ciudades de AméricaLatinaLatina

2.1. Solución de telurito de potasio al 3,5%

Telurito de potasio 3,5 gAgua destilada qsp 100,0 ml

2.2. Sulfato de polimixina B, solución al 1%

Sulfato de polimixina B 0,1 gAgua destilada qsp 100,0 ml

2.3. Ácido acético 5 N

Ácido acético glacial 28,75 mlAgua destilada 71,25 ml

2.4. Alfanaftilamina, solución al 0,5%

Alfanaftilamina 0,5 gÁcido acético 5 N qsp 100,0 ml

2.5. Ácido sulfanílico, solución al 0,8%

Ácido sulfanílico 0,8 gÁcido acético 5 N qsp 100,0 ml

2.6. Ácido clorhídrico 1 N

Ácido clorhídrico humeante 36,5 mlAgua destilada qsp 1000,0 ml

2.7. Novobiocina, solución al 4%

Novobiocina 4,0 gAgua destilada qsp 100,0 ml

2.8. Reactivo de Kovacs (Indol)

Para-dimetilamino-benzaldehído 5,0 gAlcohol amílico 75,0 mlÁcido clorhídrico concentrado 25,0 ml

Disolver 5,0 g de p-dimetilamino-benzaldehído en 75 ml de alcohol amílico. Calentar a60EC durante 5 minutos. Añadir 25 ml de HCl (33-35%). Debe aparecer un color rojo. Dejar reposar hasta que el color cambie a amarillo (6-7 horas). Mantener el reactivo enun frasco oscuro, bajo refrigeración.

2.9. Reactivo para oxidasa

Contaminación Microbiana de los Alimentos Vendidos en la Vía Pública en Ciudades de AméricaContaminación Microbiana de los Alimentos Vendidos en la Vía Pública en Ciudades de AméricaLatinaLatina

Tetrametil-p-fenilenodiaminadihidrocloruro 50,0 mgAgua destilada 5,0 ml

Disolver el polvo en agua destilada. Almacenar durante un máximo de una semana a4EC, en un frasco oscuro.

2.10. Alcohol yodado

Solución A

Yoduro de potasio 2,5 gYodo metálico 6,0 gAgua destilada 10,0 mlAlcohol 96E qsp 100,0 ml

Diluir el yoduro de potasio en agua. Añadir el yodo metálico y, por último, el alcohol 96E.

Solución B (alcohol 70E)

Alcohol 96E 729,0 mlAgua destilada 271,0 ml

Preparación final:

Solución A 20,0 mlSolución B 980,0 ml

Contaminación Microbiana de los Alimentos Vendidos en la Vía Pública en Ciudades de AméricaContaminación Microbiana de los Alimentos Vendidos en la Vía Pública en Ciudades de AméricaLatinaLatina

Anexo 7

Determinación del número más probable (NMP)

James T. Peeler y Foster D. McClure

Existen diversos métodos para calcular el número de bacterias en una muestradeterminada. Los tres que se usan con mayor frecuencia son el recuento microscópico directo,el recuento en placa de agar y la determinación del número más probable (NMP). En el recuentomicroscópico directo se toman en cuenta los microorganismos viables y los no viables, mientrasque en el recuento en placa de agar y en la determinación del NMP solo se consideran losviables.

La primera estimación precisa del número de bacterias viables fue dada a conocer porMcCrady (14). En una de las primeras aplicaciones de esta técnica (4) se comparó el número debacterias observadas mediante el empleo de medios de cultivo sólidos y líquidos y el cálculo deBacillus coli en el agua (13). Halvorson y Ziegler (10-12) publicaron una serie de artículos sobrelos fundamentos estadísticos del NMP en bacteriología. Eisenhart y Wilson (9) y Cochran (5) hanpublicado una revisión general de dichos fundamentos. Woodward (18) recomendó que debíalimitarse el uso de las tablas de NMP. Actualmente, dos libros sobre métodos de la AsociaciónEstadounidense de Salud Pública (APHA) (1, 2) emplean tablas abreviadas de NMP preparadaspor deMan (6-8).

El NMP es una estimación de la densidad de los micoorganismos viables en unamuestra. Para hacer este cálculo, la muestra debe diluirse de tal manera que una muestra másdiluida dé por resultado un número menor de tubos positivos, lo cual se manifiesta por lapresencia de gas o de multiplicación microbiana. Para obtener el NMP, se aplica a los resultadosla teoría de la probabilidad, de conformidad con los siguientes supuestos. 1) La muestracontiene una distribución al azar de las bacterias. Ello significa que la probabilidad de encontrarun microorganismo en una parte de la muestra es la misma que la de encontrar unmicroorganismo en cualquier otra parte. 2) Las bacterias existen como entidades, no comogrupos o conglomerados, y no se repelen entre sí. 3) El microorganismo o microorganismospresentes en la muestra se multiplicarán en el medio de cultivo al ser incubado este. 4) Existencondiciones apropiadas para la multiplicación; en otras palabras, se proporciona el medio decultivo adecuado y se mantiene la temperatura de incubación correcta. El número de dilucionesque se preparan debe basarse en la población prevista en la muestra. Los resultados másfidedignos se obtienen cuando todos los tubos de la dilución más baja son positivos (es decir,presentan multiplicación microbiana) y todos los tubos de la dilución más alta son negativos (osea, no presentan multiplicación microbiana). Si se prevé un elevado recuento microbiano, lamezcla habrá de diluirse hasta el punto en que pueda obtenerse el NMP. Las diluciones de diezveces son las más sencillas de efectuar, y el inóculo frecuentemente se usa en series de NMP de3, 5 o 10 tubos; es posible calcular el NMP con otro tipo de diluciones. Los límites de confianzadel NMP se estrechan a medida que aumenta el número de tubos inoculados para cada dilución. En el caso de poblaciones de elevada densidad, el NMP no es tan preciso como el recuentodirecto en placa y un valor de NMP calculado representa una estimación de la densidad de la

población, no un recuento directo de los microorganismos vivos. El NMP resulta de particularutilidad para las concentraciones reducidas de microorganismos (#10/g), especialmente enleche, agua y alimentos en los que los pequeños pedazos de alimento pueden confundir elrecuento exacto de colonias. La elección adecuada de los medios de cultivo puede proporcionarresultados preliminares de algunas características bioquímicas, y el empleo de mediosselectivos puede ofrecer estimaciones de una población mixta.

A. Tablas de NMP y límites de confianza del 95%

Las tablas 1 a 3 presentan los cálculos de deMan (6-8) de los valores estadísticamente probablesdel NMP y los correspondientes límites de confianza del 95% para pruebas con 3, 5 y 10 tubos. Las combinaciones que no figuran en las tablas tienen muy pocas probabilidades de presentarse.Si los resultados no corresponden con los de la tabla, hay que repetir la prueba con la muestraoriginal. Si esto último no es posible, el NMP puede obtenerse (combinaciones de 3 y 5 tubos)de las tablas 4 y 5 (3); también puede utilizarse una ecuación de la sección B para obtener unaaproximación de combinaciones del NMP. Puede programarse una computadora personal paracalcular el NMP y los límites de confianza (15).

Los intervalos de confianza del 95% se interpretan del modo siguiente. Si el analista supone queel número verdadero de microorganismos se encuentra entre los límites, entonces su suposiciónresultará correcta 95% de las veces. Los NMP tabulados representan un intervalo, no un valorabsoluto.

Cuando se preparan más de tres diluciones de una muestra, el NMP debe determinarse a partirúnicamente de tres diluciones consecutivas (cuando se usan las tablas 1 a 3). En primer lugar,para todas las diluciones en las que todos los tubos resultaron positivos, seleccione la diluciónmás alta (que contiene el menor volumen de la muestra) y luego utilice las dos diluciones másaltas que le siguen (volúmenes más pequeños) (A y B de las tablas 6 y 7). Cuando ninguna de lasdiluciones sometidas a prueba da todos los tubos positivos, seleccione (si es posible) las tresprimeras diluciones consecutivas (volúmenes de muestra) cuya dilución de en medio haya dado alresultado positivo (C de las tablas 6 y 7). El ejemplo D ilustra el cálculo del NMP cuando seproduce un resultado positivo en una dilución más alta (volumen de muestra más pequeño) quelas tres seleccionadas. En este caso, aumente el número de tubos positivos en la máximadilución, sin pasar de 3 o 5. Cuando todos los tubos sean positivos, exprese el NMP como mayorque la dilución multiplicado por el NMP que resulta de la combinación 3-3-2 o 5-5-4, segúncorresponda (ejemplo E). Lea de manera semejante los valores para 10 tubos de la tabla 3.

A menudo es necesario calcular el NMP a partir de volúmenes de la muestra inicial distintos de losenumerados en los cuadros 1 a 5. Si el mayor volumen de muestra usado para la referencia de latabla es 0,01 g, multiplique por 10 el índice que aparece en la tabla. De esta manera, losresultados de una determinación del NMP en cinco tubos en los que son positivas tres porcionesde 0,01 g, dos porciones de 0,001 g y una porción de 0,0001 g (3-2-1) corresponden al valor 17en la tabla 2, lo que multiplicado por 10 arroja 170 como el NMP/g verdadero para la muestra. Demodo análogo, si la porción mayor usada para la referencia de la tabla es 1 g en vez de 0,1g,divídase por 10 el NMP obtenido de la tabla. Así, el resultado de una determinación del NMP entres tubos para Salmonella que indica como positivas tres porciones de 1 g y una de 0,1 g, y enla que no es positiva ninguna de las porciones de 0,01 g (3-1-0), corresponde al número 43 en latabla 1, que dividido por 10 arroja 4,3 como NMP/g presunto de la muestra.

Un método alternativo para calcular el NMP/g se sirve de la siguiente fórmula (14):

[(NMP/g obtenido de la tabla)] - 100) x factor de dilución del tubo de en medio = NMP/g.

Para obtener el NMP/100 g, multiplíquese por 100.

B. NMP aproximado y límites de confianza del 95%

A causa de la complejidad que entraña calcular efectivamente los NMP y los límites de confianza,para determinar el NMP a menudo se emplean las tablas publicadas. Generalmente, dichastablas se limitan a 3, 5 o 10 tubos por dilución. Incluso con el diseño ordinario, los datosirregulares o un accidente de laboratorio pueden ocasionar la pérdida de uno o varios resultadosde una dilución. En este último caso, una serie de dilución de 5, 4, 4 tubos podría arrojar unacombinación positiva de 5-2-0.

Thomas (17) ha publicado una fórmula sencilla que no requiere repetición. Los NMP aproximadosque se obtienen mediante esta quizá no se correspondan exactamente con los obtenidos segúnla teoría; aun así, las desviaciones suelen ser pequeñas (puede ocurrir que las aproximaciones nosean admisibles para fines reglamentarios). La fórmula no se limita al número de tubos ydiluciones empleados y puede aplicarse a todo tipo de pruebas. La aproximación se obtienemediante la siguiente ecuación:

MPN/g = P/(N T)1/2

donde P es el número de tubos positivos, N es la cantidad total de la muestra (g) en todos lostubos negativos y T es la cantidad total de muestra (g) en todos los tubos.

Por ejemplo, considérese la serie de dilución al doble que aparece en seguida:

Muestra (g) No. de tubos No. de tubos positivos

8 5 54 5 42 5 21 5 00,5 5 10,25 5 0

El número de tubos positivos es P = (5 + 4 + 2 + 1) = 12; N = [(8 x 0) + (4 + 1) + (2 x 3) + (1 x 5) +(0,5 x 4) + (0,25 x 5)] = 18,25; y T = 5 (8 + 4 + 2 + 1 + 0,5 + 0,25) = 78,75.

NMP/g = 12/[(18,25) (78,75)]1/2 = 0,32/g o 32/100 g

Las estimaciones de los límites de confianza del 95% (5) pueden obtenerse de los antilogaritmosde base 10 de la siguiente ecuación:

log (NMP/g) " 1,08 [(log a) /n)]1/2

en la que a es la razón de dilución y n es el número de tubos por dilución. Esta expresión da por

sentado que la razón de dilución es distinta de 1 a 10 (por ej., 1 a 2). Para una razón de 1 a 10, lacantidad " debe ser (1,16) (n)1/2 para lograr la mejor estimación. Si el número de tubos pordilución (ni) es desigual (por ej., por un accidente de laboratorio en una dilución), en la ecuaciónanterior n se sustituye por la media armónica (nH) del número de tubos por dilución (ni) para ladilución k. La media armónica se define como nH = k/3(1/ni) y k es el número de diluciones. Porejemplo, supóngase que tres diluciones dieron como resultado un ni de 5, 4, 4; en este caso, nH =3/ [(1/5) + (1/4) + (1/4)]1/2 = 3/0,70 = 4,3.

Para el anterior ejemplo con n = 5, los límites de confianza del 95% aproximados se obtienen delmodo siguiente:

log 0,32 " (1,08) [(log 2)/5]1/2 = -0,495 " 0,265

de este modo, el límite inferior es el antilog (-0,76) = 0,17/g o 17/100 g, y el límite superior es elantilog (-0,23) = 0,59 ó 59/100 g. Por comparación, si se emplean las tablas de deMan (7), elNMP sería 0,31/g con límites de confianza de 0,16/g y 0,57/g.

Referencias Bibliográficas

1. American Public Health Association. Standard Methods for the Examination of DairyProducts. 15th ed. APHA. Washington, DC. 1985.

2. American Public Health Association. Standard Methods for the Examination of Waterand Wastewater. 17th ed. APHA. Washington, DC. 1989.

3. Association of Official Analytical Chemists. Official Methods of Analysis. 15th ed. AOAC,Arlington, VA. 1990.

4. Butterfield CT. Comparison of the enumeration of bacteria by means of solid and liquidmedia. Public Health Rep. 1933;48:1292-1297.

5. Cochran WG. Estimation of bacterial densities by means of the "Most Probable Number".Biometrics 1950;6:105-116.

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7. deMan JC. MPN tables for more than one test. Eur J Appl Microbiol. 1977;4:307-316.

8. deMan JC. MPN tables, corrected. Eur J Appl Biotechnol. 1983;17:301-305.

9. Eisenhart C and Wilson PW. Statistical methods and control in bacteriology. BacteriolRev. 1943;7:57-137.

10. Halvorson, H.O., and N.R. Ziegler. Application of statistics to problems in bacteriology. JBacteriol. 1933;25:101-121.

11. Halvorson, H.O., and N.R. Ziegler. Application of statistics to problems in bacteriology. JBacteriol. 1933;26:331-339.

12. Halvorson, H.O., and N.R. Ziegler. Application of statistics to problems in bacteriology. JBacteriol. 1933;26:559-567.

13. Hoskins, J.K. 1933. The most probable number of B. coli in water analysis. J Am WaterWorks Assoc. 25:867-879.

14. McCrady, M.H. 1915. The numerical interpretation of fermentation-tube results. J InfectDis. 17:183-212.

15. Parnow, R.J. 1972. Computer program estimates of bacterial densities by means of themost probable numbers. Food Technol. 26(7):56-62.

16. Silliker, J.H., D.A. Gabis, and A. May. 1979. ICMSF methods studies. XI.Collaborative/comparative studies on determination of coliforms using the most probable

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17. Thomas, H.A. 1942. Bacterial densities from fermentation tube tests. J Am Water WorksAssoc. 34:572-576.

18. Woodward, R.L. 1957. How probable is the most probable number? J Am Water WorksAssoc. 49:1060-1068.

Tabla 1.Selección de NMP y estimaciones de los límites de confianza del 95% (7) para tubos de fermentación con

tres tubos con porciones de 0,1, 0,01 y 0,001 g (ml)a

ÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄNo. de tubos positivos Límites de confianza del 95%

ÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄ ÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄ0,1 0,01 0,001 NMP/g (ml)b Inferior SuperiorÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄ 0 0 0 <3 - - 0 1 0 3+ <1 17 1 0 0 4 <1 21 1 0 1 7+ 2 27 1 1 0 7 2 28 1 2 0 11+ 4 35 2 0 0 9 2 38 2 0 1 14+ 5 48 2 1 0 15 5 50 2 2 0 21 8 60 3 0 0 23 9 130 3 0 1 39 10 180 3 1 0 43 10 210 3 1 1 75 20 280 3 2 0 93 30 380 3 2 1 150 50 500 3 2 2 210+ 80 640 3 3 0 240 90 1400 3 3 1 460 100 2400 3 3 2 1100 300 4800 3 3 3 >1100 - -ÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄ

a Los resultados normales (los obtenidos en el 95% de las pruebas) no van seguidos de un signo de más(+). Los resultados menos probables (los obtenidos en solo 4% de las pruebas) van seguidos por un signode más (+). Las combinaciones de tubos positivos que no aparecen en esta tabla se presentan en menosde 1% de las pruebas, y su aparición frecuente indica que las técnicas son deficientes o que no se estáncumpliendo los supuestos fundamentales para la estimación del NMP. Las estimaciones del NMP paracombinaciones que no figuran aquí pueden obtenerse mediante las fórmulas de Thomas (15) o porextrapolación a la siguiente combinación más alta de las mostradas aquí; por ejemplo, un resultado de 2-0-2 tendría un NMP de aproximadamente 20, que es el NMP para un resultado de 2-1-1, más probable.

b Todos los valores de esta columna se multiplican por 100 para notificar NMP/100 g (ml).

Tabla 2.Selección de NMP y estimaciones de los límites de confianza del 95% (7) para pruebas en tubos de

fermentación con 5 tubos con porcionesde 0,1, 0,01 y 0,001 g (ml)a

ÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄNo. de tubos positivos Límites de confianza del 95%

ÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄ ÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄ0,1 0,01 0,001 NMP/g (ml)b Inferior SuperiorÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄ 0 0 0 <2 - - 0 0 1 2+ <1 10 0 1 0 2 <1 10 1 0 0 2 <1 11 1 0 1 4+ 1 15 1 1 0 4 1 15 1 2 0 6+ 2 18 2 0 0 4 1 17 2 0 1 7+ 2 20 2 1 0 7 2 21 2 1 1 9+ 3 25 2 2 0 9 3 25 3 0 0 8 3 24 3 0 1 11 4 29 3 1 0 11 4 30 3 1 1 14+ 6 35 3 2 0 14 6 35 3 2 1 17+ 7 40 3 3 0 17+ 7 41 4 0 0 13 5 38 4 0 1 17 7 45 4 1 0 17 7 46 4 1 1 21 9 55 4 2 0 22 9 56 4 2 1 26+ 12 65 4 3 0 27 12 67 4 3 1 33+ 15 77 4 4 0 34+ 16 80 5 0 0 23 9 68 5 0 1 31 13 110 5 1 0 33 14 120 5 1 1 46 20 150 5 1 2 63+ 22 180 5 2 0 49 21 170ÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄ

Tabla 2. (Continuación)

ÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄNo. de tubos positivos Límites de confianza del 95%ÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄ ÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄ0,1 0,01 0,001 NMP/g (ml)b Inferior SuperiorÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄ 5 2 1 70 30 210 5 2 2 90+ 40 250 5 3 0 79 30 250 5 3 1 110 40 300 5 3 2 140 60 360 5 4 0 130 50 390 5 4 1 170 70 480 5 4 2 220 100 580 5 4 3 280+ 120 690 5 4 4 350+ 160 820 5 5 0 240 100 940 5 5 1 350 100 1300 5 5 2 540 220 2000 5 5 3 920 300 2900 5 5 4 1600 600 5300 5 5 5 >1600 - -ÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄa Los resultados normales (los obtenidos en el 95% de las pruebas) no van seguidos de un signo de más

(+). Los resultados menos probables (los obtenidos en solo 4% de las pruebas) van seguidos por un signode más (+). Los resultados que no aparecen en esta tabla se presentan en menos de 1% de las pruebas,y su aparición frecuente indica que las técnicas son deficientes o que no se están cumpliendo lossupuestos fundamentales para la estimación del NMP. Las estimaciones del NMP para combinacionesque no figuran aquí pueden obtenerse mediante las fórmulas de Thomas (15) o por extrapolación a lasiguiente combinación más alta de las mostradas aquí; por ejemplo, un resultado de 4-0-2 tendría un NMPde aproximadamente 21, que es el NMP para un resultado de 4-1-1, más probable.

b Todos los valores de esta columna se multiplican por 100 para notificar NMP/100 g (ml).

Tabla 3.Selección de NMP y estimaciones de los límites de confianza del 95% (7) para pruebas de tubos de

fermentación con 10 tubos con porciones de 0,1, 0,01 y 0,001 g (ml)a

ÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄNo. de tubos positivos Límites de confianza de 95%ÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄ ÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄ--0,1 0,01 0,001 NMP/g (ml)b Inferior SuperiorÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄ 0 0 0 <1 - - 0 0 1 1+ <1 5 0 1 0 1 <1 5 0 2 0 2+ <1 7 1 0 0 1 <1 5 1 0 1 2+ <1 7 1 1 0 2 <1 7 1 2 0 3+ 1 8 2 0 0 2 <1 7 2 0 1 3+ 1 9 2 1 0 3 1 9 2 1 1 4+ 1 10 2 2 0 4 2 10 2 3 0 5+ 2 12 3 0 0 3 1 9 3 0 1 4 2 11 3 1 0 4 2 11 3 1 1 5+ 2 13 3 2 0 5 2 13 3 2 1 6+ 3 14 3 3 0 6+ 3 14 4 0 0 4 2 12 4 0 1 6 2 13 4 1 0 6 2 14 4 1 1 7 3 15 4 2 0 7 3 15 4 2 1 8 4 17 4 3 0 8 4 17 4 4 0 9+ 5 19 5 0 0 6 2 15 5 0 1 7 3 16 5 1 0 7 3 17 5 1 1 9 4 18 5 2 0 9 4 18 5 2 1 10+ 5 20 5 3 0 10 5 20 5 3 1 11+ 6 22 5 4 0 11+ 6 22 6 0 0 8 3 18 6 0 1 9 4 20 6 1 0 9 4 20 6 1 1 11 5 22

Tabla 3.(Continuación)ÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄNo. de tubos positivos Límites de confianza de 95%ÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄ ÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄ0,1 0,01 0,001 NMP/g (ml)b Inferior SuperiorÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄ 6 2 0 11 5 22 6 2 1 12 6 24 6 3 0 12 6 25 6 3 1 14+ 7 27 6 4 0 14+ 7 27 6 5 0 15+ 8 29 7 0 0 10 5 22 7 0 1 12 6 24 7 0 2 13+ 7 27 7 1 0 12 6 25 7 1 1 13 7 27 7 1 2 15+ 8 30 7 2 0 13 7 27 7 2 1 15 8 30 7 2 2 17+ 9 32 7 3 0 15 8 30 7 3 1 17 9 33 7 4 0 17 9 33 7 4 1 19+ 10 36 7 5 0 19+ 10 36 8 0 0 13 6 28 8 0 1 15 7 31 8 0 2 17+ 8 34 8 1 0 15 7 31 8 1 1 17 9 34 8 1 2 19+ 10 36 8 2 0 17 9 35 8 2 1 19 10 38 8 2 2 21+ 12 42 8 3 0 19 10 39 8 3 1 21 12 42 8 3 2 24+ 13 46 8 4 0 22 12 43 8 4 1 24 13 46 8 5 0 24 13 47 8 5 1 27+ 15 51 8 6 0 27+ 15 52 9 0 0 17 8 37 9 0 1 19 10 41 9 0 2 22+ 11 46 9 1 0 19 10 42 9 1 1 22 11 47ÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄ

Tabla 3. (Continuación)ÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄNo. de tubos positivos Límites de confianza de 95%ÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄ------------ ÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄ0,1 0,01 0,001 NMP/g (ml)b Inferior SuperiorÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄ 9 1 2 25+ 13 52 9 2 0 22 12 47 9 2 1 25 13 53 9 2 2 28+ 18 58 9 3 0 25 13 54 9 3 1 29 15 60 9 3 2 32+ 18 66 9 4 0 29 16 61 9 4 1 33 18 67 9 4 2 37+ 20 74 9 5 0 33 18 69 9 5 1 37 20 76 9 5 2 42+ 23 83 9 6 0 38 21 77 9 6 1 43+ 24 85 9 7 0 44+ 24 8710 0 0 23 12 5810 0 1 27 14 6710 0 2 31+ 16 7710 1 0 27 14 6910 1 1 32 17 7910 1 2 38 20 9210 2 0 33 17 8310 2 1 39 20 9610 2 2 50 20 11010 2 3 50+ 30 12010 3 0 40 20 10010 3 1 50 20 12010 3 2 60+ 30 13010 3 3 70+ 30 15010 4 0 50 30 12010 4 1 60 30 14010 4 2 70 30 16010 4 3 80+ 40 17010 5 0 60 30 15010 5 1 70 70 17010 5 2 90 40 19010 5 3 100 50 21010 6 0 80 40 18010 6 1 90 50 20010 6 2 110 50 23010 6 3 120 60 25010 6 4 140+ 70 270

Tabla 3. (Continuación)

ÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄNo. de tubos positivos Límites de confianza de 95%

ÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄ ÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄ0,1 0,01 0,001 NMP/g (ml)b Inferior SuperiorÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄ10 7 0 100 50 22010 7 1 120 60 25010 7 2 140 70 28010 7 3 150 80 31010 7 4 170+ 90 34010 8 0 130 60 28010 8 1 150 80 32010 8 2 170 90 36010 8 3 200 100 40010 8 4 220 120 44010 8 5 250+ 140 48010 9 0 170 90 38010 9 1 200 100 43010 9 2 230 120 49010 9 3 260 140 56010 9 4 300 160 64010 9 5 350 180 72010 9 6 400+ 210 82010 10 0 240 120 61010 10 1 290 150 75010 10 2 350 170 91010 10 3 400 200 110010 10 4 500 300 140010 10 5 700 300 170010 10 6 900 400 210010 10 7 1120 600 270010 10 8 1160 800 370010 10 9 2300 1100 600010 10 10 >2300 - -ÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄ

a Los resultados normales (los obtenidos en el 95% de las pruebas) no van seguidos de un signo de más(+). Los resultados menos probables (los obtenidos en solo 4% de las pruebas) van seguidos por unsigno de más (+). Las combinaciones de tubos positivos que no aparecen en esta tabla se presentan enmenos de 1% de las pruebas, y su aparición frecuente indica que las técnicas son deficientes o que no seestán cumpliendo los supuestos fundamentales para la estimación del NMP. Las estimaciones del NMPpara combinaciones que no figuran aquí pueden obtenerse mediante las fórmulas de Thomas (15) o porextrapolación a la siguiente combinación más alta de las mostradas; por ejemplo, un resultado de 7-0-3tendría un NMP de aproximadamente 15, que es el NMP para un resultado de 7-2-1, más probable.

b Todos los valores de esta columna se multiplican por 100 para notificar NMP/100 g (ml).

Tabla 4.Números más probables (NMP) por 1 g de muestra, utilizando tres tubos con sendas porciones de 0,1,

0,01 y 0,001 g

ÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄ Tubos positivos Tubos positivosÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄ ----------------------------------------------------------------------ÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄ0,1 0,01 0,001 NMP 0,1 0,01 0,001 NMPÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄ 0 0 0 <3 2 0 0 9,1 0 0 1 3 2 0 1 14 0 0 2 6 2 0 2 20 0 0 3 9 2 0 3 26 0 1 0 3 2 1 0 15 0 1 1 6,1 2 1 1 20 0 1 2 9,2 2 1 2 27 0 1 3 12 2 1 3 34 0 2 0 6,2 2 2 0 21 0 2 1 9,3 2 2 1 28 0 2 2 12 2 2 2 35 0 2 3 16 2 2 3 42 0 3 0 9,4 2 3 0 29 0 3 1 13 2 3 1 36 0 3 2 16 2 3 2 44 0 3 3 19 2 3 3 53 1 0 0 3,6 3 0 0 23 1 0 1 7,2 3 0 1 39 1 0 2 11 3 0 2 64 1 0 3 15 3 0 3 95 1 1 0 7,3 3 1 0 43 1 1 1 11 3 1 1 75 1 1 2 15 3 1 2 120 1 1 3 19 3 1 3 160 1 2 0 11 3 2 0 93 1 2 1 15 3 2 1 150 1 2 2 20 3 2 2 210 1 2 3 24 3 2 3 290 1 3 0 16 3 3 0 240 1 3 1 20 3 3 1 460 1 3 2 24 3 3 2 1100 1 3 3 29 3 3 3 >1100ÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄ

Tabla 5.Números más probables por 100 ml de muestra, planteando 5 porciones en 3 diluciones en serie

geométrica

ÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄNúmero de tubos positivos Número de tubos positivos Número de tubos positivosÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄ---------ÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄ--------------------------ÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄ10 ml 1 ml 0,1ml NMP 10 ml 1 ml0,1ml NMP 10 ml 1 ml 0,1ml NMPÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄ-ÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄ 0 0 0 - 2 0 0 4,5 4 0 0 13 0 0 1 1,8 2 0 1 6,8 4 0 1 17 0 0 2 3,6 2 0 2 9,1 4 0 2 21 0 0 3 5,4 2 0 3 12 4 0 3 25 0 0 4 7,2 2 0 4 14 4 0 4 30 0 0 5 9 2 0 5 16 4 0 5 36 0 1 0 1,8 2 1 0 6,8 4 1 0 17 0 1 1 3,6 2 1 1 9,2 4 1 1 21 0 1 2 5,5 2 1 2 12 4 1 2 26 0 1 3 7,3 2 1 3 14 4 1 3 31 0 1 4 9,1 2 1 4 17 4 1 4 36 0 1 5 11 2 1 5 19 4 1 5 42 0 2 0 3,7 2 2 0 9,3 4 2 0 22 0 2 1 5,5 2 2 1 12 4 2 1 26 0 2 2 7,4 2 2 2 14 4 2 2 31 0 2 3 9,2 2 2 3 17 4 2 3 38 0 2 4 11 2 2 4 19 4 2 4 44 0 2 5 13 2 2 5 22 4 2 5 50 0 3 0 5,6 2 3 0 12 4 3 0 27 0 3 1 7,4 2 3 1 14 4 3 1 33 0 3 2 9,3 2 3 2 17 4 3 2 39 0 3 3 11 2 3 3 19 4 3 3 45 0 3 4 13 2 3 4 22 4 3 4 52 0 3 5 15 2 3 5 25 4 3 5 59 0 4 0 7,5 2 4 0 15 4 4 0 34 0 4 1 9,4 2 4 1 17 4 4 1 40 0 4 2 11 2 4 2 20 4 4 2 47 0 4 3 13 2 4 3 23 4 4 3 54 0 4 4 15 2 4 4 25 4 4 4 62 0 4 5 17 2 4 5 28 4 4 5 69 0 5 0 9,4 2 5 0 17 4 5 0 41 0 5 1 11 2 5 1 20 4 5 1 48 0 5 2 13 2 5 2 23 4 5 2 56 0 5 3 15 2 5 3 26 4 5 3 64 0 5 4 17 2 5 4 29 4 5 4 72 0 5 5 19 2 5 5 32 4 5 5 81ÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄ

Tabla 5. (Continuación)

ÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄNúmero de tubos positivos Número de tubos positivos Número de tubos positivosÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄ ÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄ ÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄ10 ml 1 ml 0,1ml NMP 10 ml 1 ml0,1ml NMP 10 ml 1 ml 0,1ml NMPÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄ 1 0 0 2 3 0 0 7,8 5 0 0 23 1 0 1 4 3 0 1 11 5 0 1 31 1 0 2 6 3 0 2 13 5 0 2 43 1 0 3 8 3 0 3 16 5 0 3 58 1 0 4 10 3 0 4 20 5 0 4 76 1 0 5 12 3 0 5 23 5 0 5 95 1 1 0 4 3 1 0 11 5 1 0 33 1 1 1 6,1 3 1 1 14 5 1 1 46 1 1 2 8,1 3 1 2 17 5 1 2 64 1 1 3 10 3 1 3 20 5 1 3 84 1 1 4 12 3 1 4 23 5 1 4 110 1 1 5 14 3 1 5 27 5 1 5 130 1 2 0 6,1 3 2 0 14 5 2 0 49 1 2 1 8,2 3 2 1 17 5 2 1 70 1 2 2 10 3 2 2 20 5 2 2 95 1 2 3 12 3 2 3 24 5 2 3 120 1 2 4 15 3 2 4 27 5 2 4 150 1 2 5 17 3 2 5 31 5 2 5 180 1 3 0 8,3 3 3 0 17 5 3 0 79 1 3 1 10 3 3 1 21 5 3 1 110 1 3 2 13 3 3 2 24 5 3 2 140 1 3 3 15 3 3 3 28 5 3 3 180 1 3 4 17 3 3 4 31 5 3 4 210 1 3 5 19 3 3 5 35 5 3 5 250 1 4 0 11 3 4 0 21 5 4 0 130 1 4 1 13 3 4 1 24 5 4 1 170 1 4 2 15 3 4 2 28 5 4 2 220 1 4 3 17 3 4 3 32 5 4 3 280 1 4 4 19 3 4 4 36 5 4 4 350 1 4 5 22 3 4 5 40 5 4 5 430 1 5 0 13 3 5 0 25 5 5 0 240 1 5 1 15 3 5 1 29 5 5 1 350 1 5 2 17 3 5 2 32 5 5 2 540 1 5 3 19 3 5 3 37 5 5 3 920 1 5 4 22 3 5 4 41 5 5 4 1600 1 5 5 24 3 5 5 45 5 5 5 -ÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄ

Tabla 6.

Ejemplos de determinación de estimaciones del NMP: serie de tres tubos con 1 g (ml) de muestra cadauno

ÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄCantidad de muestra (g o ml)a Valores

ÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄ positivos NPM estimadoEjemplo 0,1 0,01 0,001 0,0001 0,00001notificados /g o mlbÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄ A 3/3 3/3 2/3 0/3 0/3 3-2-0 930

B 3/3 3/3 3/3 2/3 0/3 3-2-0 9300

C 0/3 0/3 1/3 0/3 0/3 0-1-0 30

D 3/3 3/3 2/3 2/3 1/3 3-2-2 2100

E 3/3 3/3 3/3 3/3 3/3 3-3-3 >110000

ÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄa Numerador/denominador = número de tubos positivos/número de tubos inoculados.

b Los valores de esta columna pueden multiplicarse por 100 para notificar NMP/100 g o ml.

Tabla 7.

Ejemplos de determinación de estimaciones del NMP: serie de cinco tubos con 1 g (ml) de muestra cadauno

ÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄCantidad de muestra (g o ml)a ValoresÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄ positivos NPM estimado

Ejemplo 0,1 0,01 0,001 0,0001 0,00001notificados /g o mlbÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄ

A 5/5 5/5 2/5 0/5 0/5 5-2-0 490

B 5/5 5/5 5/5 2/5 0/5 5-2-0 4900

C 0/5 0/5 1/5 0/5 0/5 0-1-0 20

D 5/5 5/5 3/5 2/5 1/5 5-3-2 1400

E 5/5 5/5 5/5 5/5 5/5 5-5-5 > 160000

ÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄa Numerador/denominador = número de tubos positivos/número de tubos inoculados.b Los valores de esta columna pueden multiplicarse por 100 para notificar NMP/100 g o ml.

Anexo 7

Determinación del número mas probable (NMP)1

James T. Peeler y Foster D. McClure

Existen diversos métodos para calcular el número de bacterias en una muestradeterminada. Los tres que se usan con mayor frecuencia son el recuento microscópicodirecto, el recuento en placa de agar y la determinación del número más probable (NMP). En el recuento microscópico directo se toman en cuenta los microorganismos viables ylos no viables, mientras que en el recuento en placa de agar y en la determinación delNMP solo se consideran los viables.

La primera estimación precisa del número de bacterias viables fue dada aconocer por McCrady (14). En una de las primeras aplicaciones de esta técnica (4) secomparó el número de bacterias observadas mediante el empleo de medios de cultivosólidos y líquidos y el cálculo de Bacillus coli en el agua (13). Halvorson y Ziegler (10-12)publicaron una serie de artículos sobre los fundamentos estadísticos del NMP enbacteriología. Eisenhart y Wilson (9) y Cochran (5) han publicado una revisión generalde dichos fundamentos. Woodward (18) recomendó que debía limitarse el uso de lastablas de NMP. Actualmente, dos libros sobre métodos de la AsociaciónEstadounidense de Salud Pública (APHA) (1, 2) emplean tablas abreviadas de NMPpreparadas por deMan (6-8).

El NMP es una estimación de la densidad de los micoorganismos viables en unamuestra. Para hacer este cálculo, la muestra debe diluirse de tal manera que unamuestra más diluida dé por resultado un número menor de tubos positivos, lo cual semanifiesta por la presencia de gas o de multiplicación microbiana. Para obtener el NMP,se aplica a los resultados la teoría de la probabilidad, de conformidad con los siguientessupuestos. 1) La muestra contiene una distribución al azar de las bacterias. Ellosignifica que la probabilidad de encontrar un microorganismo en una parte de la muestraes la misma que la de encontrar un microorganismo en cualquier otra parte. 2) Lasbacterias existen como entidades, no como grupos o conglomerados, y no se repelenentre sí. 3) El microorganismo o microorganismos presentes en la muestra semultiplicarán en el medio de cultivo al ser incubado este. 4) Existen condicionesapropiadas para la multiplicación; en otras palabras, se proporciona el medio de cultivoadecuado y se mantiene la temperatura de incubación correcta. El número de dilucionesque se preparan debe basarse en la población prevista en la muestra. Los resultadosmás fidedignos se obtienen cuando todos los tubos de la dilución más baja son

1 Association of Official Analytical Chemists. FDA Bacteriological Analytical Manual, 7th ed. AOAC, Arlington,

VA. 1992.

positivos (es decir, presentan multiplicación microbiana) y todos los tubos de la diluciónmás alta son negativos (o sea, no presentan multiplicación microbiana). Si se prevé unelevado recuento microbiano, la mezcla habrá de diluirse hasta el punto en que puedaobtenerse el NMP. Las diluciones de diez veces son las más sencillas de efectuar, y elinóculo frecuentemente se usa en series de NMP de 3, 5 o 10 tubos; es posible calcularel NMP con otro tipo de diluciones. Los límites de confianza del NMP se estrechan amedida que aumenta el número de tubos inoculados para cada dilución. En el caso depoblaciones de elevada densidad, el NMP no es tan preciso como el recuento directo enplaca y un valor de NMP calculado representa una estimación de la densidad de lapoblación, no un recuento directo de los microorganismos vivos. El NMP resulta departicular utilidad para las concentraciones reducidas de microorganismos (#10/g),especialmente en leche, agua y alimentos en los que los pequeños pedazos de alimentopueden confundir el recuento exacto de colonias. La elección adecuada de los mediosde cultivo puede proporcionar resultados preliminares de algunas característicasbioquímicas, y el empleo de medios selectivos puede ofrecer estimaciones de unapoblación mixta.

A. Tablas de NMP y límites de confianza del 95%

Las tablas 1 a 3 presentan los cálculos de deMan (6-8) de los valoresestadísticamente probables del NMP y los correspondientes límites de confianza del95% para pruebas con 3, 5 y 10 tubos. Las combinaciones que no figuran en lastablas tienen muy pocas probabilidades de presentarse. Si los resultados nocorresponden con los de la tabla, hay que repetir la prueba con la muestra original. Siesto último no es posible, el NMP puede obtenerse (combinaciones de 3 y 5 tubos)de las tablas 4 y 5 (3); también puede utilizarse una ecuación de la sección B paraobtener una aproximación de combinaciones del NMP. Puede programarse unacomputadora personal para calcular el NMP y los límites de confianza (15).

Los intervalos de confianza del 95% se interpretan del modo siguiente. Si el analistasupone que el número verdadero de microorganismos se encuentra entre los límites,entonces su suposición resultará correcta 95% de las veces. Los NMP tabuladosrepresentan un intervalo, no un valor absoluto.

Cuando se preparan más de tres diluciones de una muestra, el NMP debedeterminarse a partir únicamente de tres diluciones consecutivas (cuando se usan lastablas 1 a 3). En primer lugar, para todas las diluciones en las que todos los tubosresultaron positivos, seleccione la dilución más alta (que contiene el menor volumende la muestra) y luego utilice las dos diluciones más altas que le siguen (volúmenesmás pequeños) (A y B de las tablas 6 y 7). Cuando ninguna de las dilucionessometidas a prueba da todos los tubos positivos, seleccione (si es posible) las tresprimeras diluciones consecutivas (volúmenes de muestra) cuya dilución de en mediohaya dado al resultado positivo (C de las tablas 6 y 7). El ejemplo D ilustra el cálculo

del NMP cuando se produce un resultado positivo en una dilución más alta (volumende muestra más pequeño) que las tres seleccionadas. En este caso, aumente elnúmero de tubos positivos en la máxima dilución, sin pasar de 3 o 5. Cuando todoslos tubos sean positivos, exprese el NMP como mayor que la dilución multiplicado porel NMP que resulta de la combinación 3-3-2 o 5-5-4, según corresponda (ejemplo E). Lea de manera semejante los valores para 10 tubos de la tabla 3.

A menudo es necesario calcular el NMP a partir de volúmenes de la muestra inicialdistintos de los enumerados en los cuadros 1 a 5. Si el mayor volumen de muestrausado para la referencia de la tabla es 0,01 g, multiplique por 10 el índice que apareceen la tabla. De esta manera, los resultados de una determinación del NMP en cincotubos en los que son positivas tres porciones de 0,01 g, dos porciones de 0,001 g yuna porción de 0,0001 g (3-2-1) corresponden al valor 17 en la tabla 2, lo quemultiplicado por 10 arroja 170 como el NMP/g verdadero para la muestra. De modoanálogo, si la porción mayor usada para la referencia de la tabla es 1 g en vez de0,1g, divídase por 10 el NMP obtenido de la tabla. Así, el resultado de unadeterminación del NMP en tres tubos para Salmonella que indica como positivas tresporciones de 1 g y una de 0,1 g, y en la que no es positiva ninguna de las porcionesde 0,01 g (3-1-0), corresponde al número 43 en la tabla 1, que dividido por 10 arroja4,3 como NMP/g presunto de la muestra.

Un método alternativo para calcular el NMP/g se sirve de la siguiente fórmula (14):

[(NMP/g obtenido de la tabla)] - 100) x factor de dilución del tubo de en medio =NMP/g.

Para obtener el NMP/100 g, multiplíquese por 100.

B. NMP aproximado y límites de confianza del 95%

A causa de la complejidad que entraña calcular efectivamente los NMP y los límitesde confianza, para determinar el NMP a menudo se emplean las tablas publicadas. Generalmente, dichas tablas se limitan a 3, 5 o 10 tubos por dilución. Incluso con eldiseño ordinario, los datos irregulares o un accidente de laboratorio pueden ocasionarla pérdida de uno o varios resultados de una dilución. En este último caso, una seriede dilución de 5, 4, 4 tubos podría arrojar una combinación positiva de 5-2-0.

Thomas (17) ha publicado una fórmula sencilla que no requiere repetición. Los NMPaproximados que se obtienen mediante esta quizá no se correspondan exactamentecon los obtenidos según la teoría; aun así, las desviaciones suelen ser pequeñas(puede ocurrir que las aproximaciones no sean admisibles para fines reglamentarios). La fórmula no se limita al número de tubos y diluciones empleados y puede aplicarsea todo tipo de pruebas. La aproximación se obtiene mediante la siguiente ecuación:

MPN/g = P/(N T)1/2

donde P es el número de tubos positivos, N es la cantidad total de la muestra (g) entodos los tubos negativos y T es la cantidad total de muestra (g) en todos los tubos.

Por ejemplo, considérese la serie de dilución al doble que aparece en seguida:

Muestra (g) No. de tubos No. de tubos positivos

8 5 54 5 42 5 21 5 00,5 5 10,25 5 0

El número de tubos positivos es P = (5 + 4 + 2 + 1) = 12; N = [(8 x 0) + (4 + 1) + (2 x3) + (1 x 5) + (0,5 x 4) + (0,25 x 5)] = 18,25; y T = 5 (8 + 4 + 2 + 1 + 0,5 + 0,25) =78,75.

NMP/g = 12/[(18,25) (78,75)]1/2 = 0,32/g o 32/100 g

Las estimaciones de los límites de confianza del 95% (5) pueden obtenerse de losantilogaritmos de base 10 de la siguiente ecuación:

log (NMP/g) " 1,08 [(log a) /n)]1/2

en la que a es la razón de dilución y n es el número de tubos por dilución. Estaexpresión da por sentado que la razón de dilución es distinta de 1 a 10 (por ej., 1 a 2). Para una razón de 1 a 10, la cantidad " debe ser (1,16) (n)1/2 para lograr la mejorestimación. Si el número de tubos por dilución (ni) es desigual (por ej., por unaccidente de laboratorio en una dilución), en la ecuación anterior n se sustituye por lamedia armónica (nH) del número de tubos por dilución (ni) para la dilución k. La mediaarmónica se define como nH = k/3(1/ni) y k es el número de diluciones. Por ejemplo,supóngase que tres diluciones dieron como resultado un ni de 5, 4, 4; en este caso, n4

= 3/ [(1/5) + (1/4) + (1/4)]1/2 = 3/0,70 = 4,3.

Para el anterior ejemplo con n = 5, los límites de confianza del 95% aproximados seobtienen del modo siguiente:

log 0,32 " (1,08) [(log 2)/5]1/2 = -0,495 " 0,265

de este modo, el límite inferior es el antilog (-0,76) = 0,17/g o 17/100 g, y el límitesuperior es el antilog (-0,23) = 0,59 ó 59/100 g. Por comparación, si se emplean lastablas de deMan (7), el NMP sería 0,31/g con límites de confianza de 0,16/g y 0,57/g.

Referencias Bibliográficas

1. American Public Health Association. Standard Methods for the Examination ofDairy Products. 15th ed. APHA. Washington, DC. 1985.

2. American Public Health Association. Standard Methods for the Examination ofWater and Wastewater. 17th ed. APHA. Washington, DC. 1989.

3. Association of Official Analytical Chemists. Official Methods of Analysis. 15thed. AOAC, Arlington, VA. 1990.

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5. Cochran WG. Estimation of bacterial densities by means of the "MostProbable Number". Biometrics 1950;6:105-116.

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7. deMan JC. MPN tables for more than one test. Eur J Appl Microbiol.1977;4:307-316.

8. deMan JC. MPN tables, corrected. Eur J Appl Biotechnol. 1983;17:301-305.

9. Eisenhart C and Wilson PW. Statistical methods and control in bacteriology.Bacteriol Rev. 1943;7:57-137.

10. Halvorson, H.O., and N.R. Ziegler. Application of statistics to problems inbacteriology. J Bacteriol. 1933;25:101-121.

11. Halvorson, H.O., and N.R. Ziegler. Application of statistics to problems inbacteriology. J Bacteriol. 1933;26:331-339.

12. Halvorson, H.O., and N.R. Ziegler. Application of statistics to problems inbacteriology. J Bacteriol. 1933;26:559-567.

13. Hoskins, J.K. 1933. The most probable number of B. coli in water analysis. JAm Water Works Assoc. 25:867-879.

14. McCrady, M.H. 1915. The numerical interpretation of fermentation-tuberesults. J Infect Dis. 17:183-212.

15. Parnow, R.J. 1972. Computer program estimates of bacterial densities bymeans of the most probable numbers. Food Technol. 26(7):56-62.

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17. Thomas, H.A. 1942. Bacterial densities from fermentation tube tests. J AmWater Works Assoc. 34:572-576.

18. Woodward, R.L. 1957. How probable is the most probable number? J AmWater Works Assoc. 49:1060-1068.

Tabla 1.Selección de NMP y estimaciones de los límites de confianza del 95% (7) para tubos de fermentación con

tres tubos con porciones de 0,1, 0,01 y 0,001 g (ml)a

No. de tubos positivos Límites de confianza del 95%

0,1 0,01 0,001 NMP/g(ml)b Inferior Superior

001111222233333333333

010012001200112223333

000100010001010120123

<33+

47+

711+

914+

15212339437593

150210+

240460

1100>1100

-<1<1

22425589

10102030508090

100300

-

-172127283538485060

130180210280380500640

140024004800

-

a Los resultados normales (los obtenidos en el 95% de las pruebas) no van seguidos de un signo de más(+). Los resultados menos probables (los obtenidos en solo 4% de las pruebas) van seguidos por unsigno de más (+). Las combinaciones de tubos positivos que no aparecen en esta tabla se presentan enmenos de 1% de las pruebas, y su aparición frecuente indica que las técnicas son deficientes o que nose están cumpliendo los supuestos fundamentales para la estimación del NMP. Las estimaciones delNMP para combinaciones que no figuran aquí pueden obtenerse mediante las fórmulas de Thomas (15)o por extrapolación a la siguiente combinación más alta de las mostradas aquí; por ejemplo, un resultadode 2-0-2 tendría un NMP de aproximadamente 20, que es el NMP para un resultado de 2-1-1, másprobable.

b Todos los valores de esta columna se multiplican por 100 para notificar NMP/100 g (ml).

Tabla 2.Selección de NMP y estimaciones de los límites de confianza del 95% (7) para pruebas en tubos de

fermentación con 5 tubos con porcionesde 0,1, 0,01 y 0,001 g (ml)a

No. de tubos positivos Límites de confianza del 95%

0,1 0,01 0,001 NMP/g(ml)b Inferior Superior

0001111222223333333444444444555555

0010012001120011223001122334001112

0100100010100101010010101010010120

<22+

22

4+

46+

47+

79+

98

1111

14+

1417+

17+

1317172122

26+

2733+

34+

23313346

63+

49

-<1<1<1

11212233344667757799

121215169

1314202221

-10101115151817202125252429303535404138454655566567778068

110120150180170

Tabla 2. (Continuación)

No. de tubos positivos Límites de confianza del 95%

0,1 0,01 0,001 NMP/g(ml)b Inferior Superior

5555555555555555

2233344444555555

1201201234012345

7090+

79110140130170220

280+

350+

240350540920

1600<1600

30403040605070

100120160100100220300600

-

210250250300360390480580690820940

1300200029005300

-

a Los resultados normales (los obtenidos en el 95% de las pruebas) no van seguidos de un signo de más(+). Los resultados menos probables (los obtenidos en solo 4% de las pruebas) van seguidos por unsigno de más (+). Los resultados que no aparecen en esta tabla se presentan en menos de 1% de laspruebas, y su aparición frecuente indica que las técnicas son deficientes o que no se están cumpliendolos supuestos fundamentales para la estimación del NMP. Las estimaciones del NMP paracombinaciones que no figuran aquí pueden obtenerse mediante las fórmulas de Thomas (15) o porextrapolación a la siguiente combinación más alta de las mostradas aquí; por ejemplo, un resultado de 4-0-2 tendría un NMP de aproximadamente 21, que es el NMP para un resultado de 4-1-1, más probable.

b Todos los valores de esta columna se multiplican por 100 para notificar NMP/100 g (ml).

Tabla 3.

Selección de NMP y estimaciones de los límites de confianza del 95% (7) para pruebasde tubos de fermentación con 10 tubos con porciones de 0,1, 0,01 y 0,001 g (ml)a

No. de tubos positivos Límites de confianza del 95%

0,1 0,01 0,001 NMP/g(ml)b Inferior Superior

000011112222223333333444444445555555556666

001200120011230011223001122340011223340011

010001000101000101010010101000101010100101

<11+

12+

12+

23+

23+

34+

45+

344

5+

56+

6+

4667788

0+

67799

10+

1011+

11+

899

11

-<1<1<1<1<1<1

1<1

111221222233222334452334455663445

-5575778799

1010129

111113131414121314151517171915161718182020222218202022

Tabla 3.

(Continuación)

No. de tubos positivos Límites de confianza del 95%

0,1 0,01 0,001 NMP/g(ml)b Inferior Superior

666666777777777777778888888888888888899999

223345000111222334450001112223334455600011

010100012012012010100120120120120101001201

111212

14+

14+

15+

1012

13+

1213

15+

1315

17+

151717

19+

19+

1315

17+

1517

19+

1719

21+

1921

24+

222424

27+

27+

1719

22+

1922

566778567678789899

101067879

109

101210121312131315158

10111011

222425272729222427252730273032303333363628313431343635384239424643464751523741464247

Tabla 3. (Continuación)

No. de tubos positivos Límites de confianza del 95%

0,1 0,01 0,001 NMP/g(ml)b Inferior Superior

9999999999999999101010101010101010101010101010101010101010101010101010

1222333444555667000111222233334444555566666

2012012012012010012012012301230123012301234

25+

222528+

252932+

293337+

333742+

3843+

44+

232731+

27323833395050+

405060+

70+

50607080+

6070901008090110120140+

13121318131518161820182023212424121416141720172020302020303030303040307040504050506070

524753585460666167746976837785875867776979928396

110120100120130150120140160170150170190210180200230250270

Tabla 3. (Continuación)

No. de tubos positivos Límites de confianza del 95%

0,1 0,01 0,001 NMP/g(ml)b Inferior Superior

1010101010101010101010101010101010101010101010101010101010

7777788888899999991010101010101010101010

012340123450123456012345678910

100120140150170+

130150170200220250+

170200230260300350400+

2402903504005007009001120116023002300

5060708090608090

10012014090

100120140160180210120150170200300300400600800

1100-

220250280310340280320360400440480380430490560640720820610750910

1100140017002100270037006000

-

a Los resultados normales (los obtenidos en el 95% de las pruebas) no van seguidos deun signo de más (+). Los resultados menos probables (los obtenidos en solo 4% delas pruebas) van seguidos por un signo de más (+). las combinaciones de tubospositivos que no aparecen en esta tabla se presntan en menos de 1% de las pruebas,y su aparición frecuente indica que las técnicas son deficientes o que no se estáncumpliendo los supuestos fundamentales para la estimación del NMP. Lasestimaciones del NMP para combinaciones que no figuran aquí pueden obtenersemediante las fórmulas de Thomas (15) o por extrapolación a la siguiente combinaciónmás alta de las mostradas; por ejemplo, un resultado de 7-0-3 tendría un NMP deaproximadamente 15, que es el NMP para un resultado de 7-2-1, más probable.

b Todos los valores de esta columna se multiplican por 100 para notificar NMP/100 g(ml).

Tabla 4.

Números más probables (NMP) por 1 g de muestra, utilizando tres tubos consendas porciones de 0,1, 0,001 y 0,001g

No. de tubos positivos No. de tubos positivos

0,1 0,01 0,001 NMP 0,1 0,01 0,001 NMP

00000000000000001111111111111111

000011112222333300001111222223333

01230123012301230123012301230123

<33693

6,19,2126,29,312169,41316193,67,211157,31115191115202416202429

22222222222222223333333333333333

00001111222233330000111122223333

01230123012301230123012301230123

9,1142026152027342128354229364453233964954375

12016093

150210290240460

1100>1100

Tabla 5

Numeros más probables por 100 ml de muestra, planteando 5 porcionesen diluciones en serie geométrica

Número de tubos positivos Número de tubos positivos Número de tubos positivos

10 ml 1 ml 0,1ml NMP 10 ml 1 ml 0,1ml NMP 10 ml 1ml 0,1ml NMP

000000000000000000000000000000000000

000000111111222222333333444444555555

012345012345012345012345012345012345

-1,83,65,47,29,01,83,65,57,39,1

11,03,75,57,49,2

11,013,05,67,49,3

11,013,015,07,59,4

11,013,015,017,09,4

11,013,015,017,019,0

222222222222222222222222222222222222

000000111111222222333333444444555555

012345012345012345012345012345012345

4,56,89,1

12,014,016,06,89,2

12,014,017,019,09,3

12,014,017,019,022,012,014,017,019,022,025,015,017,020,023,025,028,017,020,023,026,029,032,0

444444444444444444444444444444444444

000000111111222222333333444444555555

012345012345012345012345012345012345

13,017,021,025,030,036,017,021,026,031,036,042,022,026,031,038,044,050,027,033,039,045,052,059,034,040,047,054,062,069,041,048,056,064,072,081,0

Tabla 5 (Continuación)

Número de tubos positivos Número de tubos positivos Número de tubos positivos

10 ml 1 ml 0,1ml NMP 10 ml 1 ml 0,1ml NMP 10 ml 1ml 0,1ml NMP

111111111111111111111111111111111111

000000111111222222333333444444555555

012345012345012345012345012345012345

2,04,06,08,0

10,012,04,06,18,1

10,012,014,06,18,2

10,012,015,017,08,3

10,013,015,017,019,011,013,015,017,019,022,013,015,017,019,022,024,0

333333333333333333333333333333333333

000000111111222222333333444444555555

012345012345012345012345012345012345

7,811,013,016,020,023,011,014,017,020,023,027,014,017,020,024,027,031,017,021,024,028,031,035,021,024,028,032,036,040,025,029,032,037,041,045,0

555555555555555555555555555555555555

000000111111222222333333444444455555

012345012345012345012345012345012345

23314358769533466484

110130497095

12015018079

110140180210250130170220280350430240350540920

1600-

Tabla 6.Ejemplos de determinación de estimaciones del NMP: serie de tres tubos con 1 g (ml) de muestra

cada uno

Cantidad de muestra (g o ml)a Valorespositivos

notificados

NPM estimado/go mlb

Ejemplo 0,1 0,01 0,001 0,0001 0,00001

A 3/3 3/3 2/3 0/3 0/3 3-2-0 930

B 3/3 3/3 3/3 2/3 0/3 3-2-0 9300

C 0/3 0/3 1/3 0/3 0/3 0-1-0 30

D 3/3 3/3 2/3 2/3 1/3 3-2-2 2100

E 3/3 3/3 3/3 3/3 3/3 3-3-3 >110000

a Numerador/denominador = número de tubos positivos/número de tubos inoculados

b Los valores de esta columna pueden multiplicarse por 100 para notificar NMP/100 g o ml.

Tabla 7

Ejemplos de determinación de estimaciones del NMP: serie de cinco tubos con 1 g (ml) demuestra cada uno

Cantidad de muestra (g o ml)a Valorespositivos

notificados

NPM estimado/go mlb

Ejemplo 0,1 0,01 0,001 0,0001 0,00001

A 5/5 5/5 2/5 0/5 0/5 5-2-0 490

B 5/5 5/5 5/5 2/5 0/5 5-2-0 4900

C 0/5 0/5 1/5 0/5 0/5 0-1-0 20

D 5/5 5/5 3/5 2/5 1/5 5-3-2 1400

E 5/5 5/5 5/5 5/5 5/5 5-5-5 >160000

a Numerador/denominador = número de tubos positivos/número de tubos inoculados

b Los valores de esta columna pueden multiplicarse por 100 para notificar NMP/100 g o mla. BRASIL. LABORATÓRIO NACIONAL DE REFERENCIA ANIMAL/MINISTÉRIO DAAGRICULTURA DO ABASTECIMENTO E DA REFORMA AGRARIA. 1992. Manual de Métodos de AnaliseMicrobiológica para Alimentos. Brasília, DF.

Association of Official Analytical Chemists. FDA Bacteriological Analytical Manual, 7th ed. AOAC,Arlington, VA. 1992.