Conteo de Plancton

7/15/2019 Conteo de Plancton

1/16

Reduca (Biologa). Serie Microbiologa. 5 (5): 110-125, 2012.ISSN: 1989-3620

110

Aspectos ecolgicos y metodolgicos del muestreo,identificacin y cuantificacin

de cianobacterias y microalgas eucariotas

Julio Ricardo Moreno. Cesar Dante Medina. Virginia Helena Albarracn.

Facultad de Ciencias Naturales e IML. Universidad Nacional de Tucumn. Miguel Lillo 205-4000.San Miguel de Tucumn. Argentina.

Laboratorio de Investigaciones Microbiolgicas de Lagunas Andinas LIMLA. Planta Piloto de ProcesosIndustriales Microbiolgicos PROIMI-CONICET. Av. Belgrano y Pje. Caseros 4000.

San Miguel de Tucumn. [email protected] [email protected] [email protected]

Resumen: mediante el muestreo de un cuerpo de agua, empleando red de plancton,obtendremos muestras de cianobacterias y microalgas eucariotas. Una vez realizada laidentificacin taxonmica, se realizarn anlisis cualitativos y cuantitativos de los mismospara determinar la riqueza y abundancia de especies presentes. Finalmente, con parte delas muestras colectadas, extraeremos y cuantificaremos los pigmentos fotosintticos paracomparar los resultados obtenidos con los del anlisis cuantitativo.

Palabras clave: Muestreo. Identificacin. Cuantificacin. Plancton. Fitoplancton.

Cianobacterias. Microalgas. Clorophytas. Euglenophytas. Dinophytas. Bacillariophytas.Riqueza. Abundancia. Biomasa. Clorofila. Carotenoides.

INTRODUCCIN

Las algas son un grupo polifiltico de organismos fottrofos oxignicos,auxotrficos o facultativamente hetertrofos, restringidos a ambientes hmedos por laausencia de mecanismos de proteccin contra la desecacin. Algunos autores incluyen

dentro de esta denominacin tanto a organismos procariotas como eucariotas. Altratarse de un grupo sumamente heterogneo es difcil resaltar caractersticas generalesdel grupo, por lo cual lo ms objetivo es realizar estudios especficos para cada grupo.

MUESTREO

Las microalgas constituyen un grupo muy amplio y heterogneo, por lo tanto lametodologa de muestreo es diversa, debiendo ser especfica para cada objetivo

planteado. As, el tipo de muestreo empleado se realiza de acuerdo al tipo de comunidadde microalgas que se quiera estudiar (Alvear et al, 1995). Por ejemplo, si el objetivo de la
mailto:[email protected]:[email protected]:[email protected]:[email protected]


2/16


111

investigacin es describir las especies presentes en el agua superficial de un lago, es decir,la comunidad planctnica, se utilizarn redes de plancton seleccionando las estaciones demuestreo de acuerdo a la morfometra del cuerpo de agua. Esta recoleccin de muestrasse realizar en el mismo lugar que la toma de muestras fsico-qumicas u otras muestras

biolgicas. Adems, si el tipo de estudio es cualitativo, el muestreo se efectuar sin teneren cuenta el volumen de agua. Por lo tanto, el microbilogo utiliza tcnicas que permitenobtener una muestra representativa del ambiente (Tabla 1).

Tipo deAmbiente

N demuestras/Tipo

Tipo deComunidad

Procedimiento

Ambienteslenticos.

Cualitativa:Muestra discretade superficie o adeterminada

profundidad.

Microplancton

(>20 m).

Toma de muestra discreta a 30 cm pordebajo de la superficie y filtrarla con lared de plancton.Fijar las muestra para conservarlas.Sin fijar para la observacin de celular

vivas y determinacin deconcentracin de pigmentosfotosintticos.

Nanoplancton (2-

20 m).

Picoplancton (0,2-2

m).

Cuantitativa:Muestra a unaprofundidaddiscreta.

Toma de muestra integral del cuerpode agua con una botella esterilizada ycon volumen conocido.Fijar las muestras con formaldehido al4%Conservarlas al resguardo de la luz.

Tabla 1. Parmetros de muestreo.

Es comn encontrar componentes del fitobentos al hacer colecta de muestras delplancton. Esto ocurre debido a que existe cierto equilibrio dinmico entre la reginplanctnica respecto de la bentnica y viceversa y diferentes grupos de algas puedenocupar ambas regiones indistintamente en periodos variables a lo largo de su ciclo devida. En la figura 1, se muestra esta interaccin dinmica esquematizada en un ambientehipottico, donde inicialmente debemos diferencian dos zonas principales, la reginplanctnica y la regin bentnica. En A se observan las algas epfitas (e), formasfilamentosas y unicelulares, presentes sobre algas macrfitas (m). Las algas filamentosaspueden desprenderse para formar masas de plancton en el techo de la columna de agua,

que posteriormente mediante procesos reproductivos pueden fragmentarse y parte de ladescendencia retomar una ubicacin bentnica mientras el resto continua integrando elplancton. En B, algas bentnicas, se separan del sustrato. Esto puede darse posiblementepor accin de las corrientes de agua que debilitan el anclaje al sustrato o simplementepuede tratarse de clulas especializadas de resistencia o colonias que presentanmecanismos de flotacin y se incorporan a la zona planctnica. En C algas tpicamenteunicelulares presentes dentro de un biofilm, originado por medio de su matrizmucilaginosa donde se pueden incorporar otros microorganismos, se liberan y puedentrasladarse con ayuda de las corrientes de agua y al retornar a un sustrato iniciar laformacin de un nuevo biofilm o pasar a formar parte del plancton. Finalmente en D se

observa que el crecimiento prolongado de algas filamentosas puede formar una densa


3/16


112

capa denominada perifiton. Las algas filamentosas estn tpicamente ligadas a superficiesslidas como rocas, y se propagan vegetativamente por fragmentacin de sus talos.

Figura 1. Interaccin dinmica plancton-bentos en un ambiente hipottico.

IDENTIFICACIN

Para la identificacin de las microalgas se utiliza un microscopio ptico y una guade identificacin e iconografas que nos guiarn en las caractersticas observables. Noobstante, es imprescindible la gua de un profesional con experiencia para una buenadeterminacin taxonmica.

De acuerdo a cada grupo taxonmico para una correcta determinacin es necesarioprocesar a las muestras previamente fijadas. Por ejemplo, como la clasificacin de lasdiatomeas se basa en la estructura de sus frstulos es necesario hacer una limpieza de lamateria orgnica (el procedimiento a realizar se explica en las Actividades). Existentcnicas de tincin que ayudan a determinar la presencia de sustancias caractersticas decada grupo taxonmico. Por ejemplo, se puede determinar presencia de almidnintraplastidial (sustancia de reserva caracterstica de las algas verdes), y la determinacinde ncleo por tincin con carmn actico no solo sirve para diferenciar en primerainstancia algas eucariotas de las procariotas, sino tambin presencia de clulasmultinucleadas (carcter de valor taxonmico).


4/16


113

CUANTIFICACIN

El anlisis cuantitativo del fitoplancton consiste en realizar un inventario de los

taxones y un recuento de los individuos presentes de cada taxn. La estrategia para elrecuento depender de los objetivos a conseguir, y especialmente del nivel taxonmicoes decir, especie o gnero. Se recomienda realizar previamente un anlisis cualitativo dela muestra, antes de iniciar el recuento para confeccionar una lista de los taxonespresentes y una visin general de la densidad de microalgas. Existen dos estrategiasalternativas para el recuento:

Recuento de un numero de campos pticos del microscopio seleccionados al azar. Recuento de toda la cmara o cubeta de sedimentacin (Figura 2).

Figura 2. Cmaras de sedimentacin de Utermhl.

El recuento de microalgas nos proporciona un dato representativo de la estructurade la comunidad fitoplanctonica, es decir: la concentracin de clulas expresada enindividuos por mililitros (Clulas / mL). Tambin nos permite graficar la proporcin de

cada taxn en el total de la comunidad (Figura 3).

En base al recuento podemos aplicar un ndice para calcular la biodiversidad; porejemplo el ndice de Shannon-Weaver (D):

S

i

ii ppD1

2 )(log

Donde:D: ndice de diversidad de Shannon.S: Nmero de especies en la muestra.pi: abundancia relativa de ith taxa en la muestra.


5/16


114

Figura 3. Ejemplo de abundancias relativas de Cianobacterias y Microalgas, y su variacin estacionaria.

Tomado de Goncalves et al2011.

ASPECTOS ECOLOGICOS

El gran inters y motivo por lo que las microalgas son intensamente objeto deinvestigacin es que son los principales productores primarios. La produccin primariadepende del proceso fotosinttico llevado a cabo por los organismos auttrofos que enlos ecosistemas acuticos incluye al fitoplancton, fitobentos y macroalgas.

ASPECTOS METODOLOGICOS

Tcnicas de medicin de la produccin fitoplanctnica

Existen varias tcnicas para medir la produccin primaria fitoplanctnica. Lamayora de las tcnicas para medir el proceso fotosinttico tales como la produccin decarbohidratos o la liberacin de oxigeno se enumeran a continuacin.

Incorporacin de radiocarbono. Produccin de oxigeno. Carbono 13. Estimacin desde sensores remotos. Fluorescencia natural a 683 nm. Medicin de pulso de fluorescencia.

OBJETIVOS

Realizar un muestreo cualitativo de microalgas a partir de un cuerpo de aguamediante red de plancton.


6/16


115

Realizar un muestreo cuantitativo para el conteo de algas previa sedimentacin. Observacin e identificacin de microalgas a partir de muestras vivas o fijadas

con tinciones simples que permitan diferenciar algunas estructuras especiales

(por ejemplo: vainas, ncleos, plastos).

Realizacin de limpieza de frstulos de diatomeas, para la diferenciacin deestructuras de importancia taxonmica.

Calculo de la diversidad aplicando el ndice de Shannon-Weaver. Aislamiento de pigmentos fotosintticos y cuantificacin de biomasa

fitoplanctnica a partir de cultivos puros y muestras de cuerpos de agua dulce.

ACTIVIDADES

Muestreo

Elaborar una planilla de muestreo indicando los datos necesarios a registrar.Considere el sitio de muestreo y mtodo a elegir dependiendo de los objetivos y tenga encuenta que debe ubicarse cerca del sitio de muestreo fisicoqumico.

Identificacin

Aplicar las claves e iconografas para la identificacin. Emplee coloraciones para diferenciar entre los grupos taxonmicos. (Azul de

metileno para diferenciar vaina y capsula de carcter mucilaginoso encianobacterias. Lugol para determinar presencia de clorofila intraplastidial enClorophytas. Para determinar la presencia de ncleo o diferenciar clulas oartculos multinucleados seguir el protocolo de tincin con Carmn Actico).

Lavado de frstulo para la clasificacin de las Diatomeas (Fig. 4). Las Diatomeas(Bacillariophyceae) son microalgas caracterizadas, entre otras cosas, por lapresencia de una pared celular formada por un frstulo silceo bivalvo unido porfibras de exopolisacridos. En la identificacin taxonmica se emplea comoprincipal carcter la morfologa, ornamentaciones y dems detalles presentes enel frstulo. Para poder diferenciar correctamente dichas estructuras es necesariolimpiar el frstulo para observar con mayor claridad cada detalle, por lo cual se

elimina el sedimento asociado y el contenido orgnico de las clulas. Para realizarel lavado de pared silcea algal deben seguir las siguientes indicaciones adaptadasdel trabajo de Ohtsuka, T, et al2006:


7/16


116

Figura 4. Representacin esquemtica del lavado de frstulo.

Tomar 2 g de la muestra y colocarla en un tupo de ensayos preferentemente contapa hermtica (Fig. 4 A).

Suspender la muestra en 1 ml de HCl 1N y homogeneizar (Fig. 4 B).

Exponer el tubo de ensayos al calor del mechero por 30 segundos, y dejar enfriar10 segundos - repetir 5 veces (Fig. 4 C).

Dejar sedimentar 10 minutos y eliminar cuidadosamente el HCl (Fig. 4 D). Enjuagar al menos 3 veces con agua destilada (Fig. 4 E). Aadir 5 ml de perxido de hidrgeno al 20% y exponer al calor del mechero por

30 segundos, y dejar enfriar 10 segundos - repetir 5 veces (Fig. 4 F).

Dejar sedimentar 5 minutos y eliminar cuidadosamente el perxido de hidrgeno.(Fig. 4 G).

Enjuagar con agua destilada repetidamente. (Figu. 4 H). Observar al MO a unamagnificacin de 40x y luego a 100x.

Cuantificacin

Para el conteo de organismos es necesario corroborar la distribucin al azar de lasclulas independientemente del mtodo a utilizar. En general se puede contar un nmero

mnimo de clulas en un rea de la cmara que puede ser variable o bien contar clulasen un rea fija (por ejemplo, la mitad de la cmara, o un nmero constante de transectas


8/16


117

o campos). En cualquier caso es necesario ser consistente para el conjunto de muestrasque se van a contar.

A continuacin se enumeran las distintas formas de conteo para muestras con alta

densidad:

Enjuagar con agua destilada repetidamente. (Fig. 4 H). Observar al MO a unamagnificacin de 40x y luego a 100x.

En una alcuota de muestra observada en porta-objetos convencional (sincmaras).

Utilizando cmaras que contienen un volumen conocido siendo las msapropiadas para fitoplancton: a) Palmer-Maloney, b) Sedgwick-Rafter, c)

Neubauer (Fig. 5) y d) Petroff-Hauser. Para esta prctica emplearemos cmaras deNeubauer y Sedgwick-Rafter.

Figura 5. Esquema de la cmara de recuento celular de Neubauer.

Para muestras con baja densidad los mtodos son:

Filtracin. Centrifugacin. Sedimentacin.

Cuantificacin con cmara de Neubauer

La cmara de Neubauer puede tener una o dos cuadriculas, en nuestro recuento(Fig. 6) emplearemos una cmara de una sola cuadrcula (cuadrcula simple).


9/16


118

Figura 6. Procedimiento de cuantificacin de fitoplancton con cmara de Neubauer de cuadrcula simple.

Los pasos a seguir para la cuantificacin de la muestra natural o del cultivo puroalgal son los siguientes:

Colocar el cubre objetos sobre la cuadricula de la cmara de Neubauer (Fig. 6 A). Llenar la cmara de Neubauer colocando la punta de la pipeta en la ranuraubicada entre el cubre objetos y la superficie de la cuadricula (Fig. 6 B); dejar

reposar la muestra 2 minutos.

Observar al Microscopio ptico a una magnificacin de 40X y apreciar el rayadode lneas brillantes que marcan el cuadrante central y los cuatro cuadrantesexteriores (Fig. 6 C). Cada clula algal se diferenciar como un punto color verdeoscuro sobre el fondo amarillo. Se debe contar cada punto en cada uno de loscinco cuadrantes, luego sumar el resultado para obtener el nmero de clulas pormL.


10/16


119

En algunos casos la densidad de clulas es tan alta que se requieren de mtodosde dilucin para realizar el recuento por este mtodo, en este caso, luego desumar el resultado obtenido, se debe multiplicar por el factor de dilucin(ejemplo: si a una muestra de 100 ml la diluimos 5 en 100, el factor de dilucin

ser de 20).

Cuantificacin con cmara de Sedgwick-Rafter

La cmara de conteo Sedgwick- Rafter cuenta las clulas en una celda de conteoestndar, diseada para contar plancton en un microscopio compuesto o en unmicroscopio invertido. Consiste en un marco de cermica rectangular de una capacidadvolumtrica de 1 ml. Posee un grabado de 1000 cuadrados y est cubierto por uncubreobjetos espeso. Procedimiento (Fig. 7):

Extraer una muestra de la suspensin de microalgas empleando una pipetagraduada. Llenar lentamente la cmara de Sedwick-Rafter, girando la parteposterior del cubreobjetos (Fig. 7 A).

Dejar reposar cinco minutos para permitir que las clulas se depositen en el fondode la cmara y examinar a una magnificacin inicial de 20X y luego 40X con unmicroscopio ptico convencional.

Antes de iniciar el recuento, observar detenidamente toda la extensin de lacmara para identificar las principales especies presentes en la muestra.

Compruebe que los organismos se dispersan al azar a travs del rea de conteo yno se encuentran restringidos a una regin en particular.

Al Iniciar el recuento, seleccione una cuadrcula al azar y cuente todas las clulasindividuales dentro de la plaza; slo considere en el conteo aquellos organismoscercanos o superpuestos a las caras A y B-B-D de la plaza, excluyendo a los que seencuentran en contacto con las caras B-C y C-D (Fig. 7 B).

Las cuadrculas adicionales a contar deben ser seleccionadas sobre una baseobjetiva, sin cualquier sesgo hacia los contenidos. Para ello, se corren cinco

lugares hacia la derecha desde la plaza 1 (plaza inicial) y se contina el conteo enla nueva plaza (plaza 2). Repita el proceso como se indica en la figura 7C.

Como alternativa, en lugar de un intervalo fijo de cinco cuadrantes, se puedeutilizar nmeros aleatorios para determinar el espaciamiento entre loscuadrantes. McAlice et al1971 demostr que en un recuento de 30 cuadrantes sepuede, determinar entre el 90 y el 95% de las especies presentes en una muestra.


11/16


120

Figura 7. Procedimiento de cuantificacin de fitoplancton con cmara de Sedwick-Rafter.

Para el clculo de la poblacin (T) entre las especies cuantificadas en la cmara deSedwick-Rafter utilizamos la frmula T= 1000.(C)/10.(N), donde C es el nmero deorganismos cuantificados en N (nmero de plazas). T se expresa como el nmerode organismos (clulas o colonias) presentes en 1 mL de la muestra. En el caso delas algas filamentosas y los agregados celulares se tendrn en cuentaconsideraciones particulares en el momento del recuento siguiendo la gua deldocente.

Calculo de biodiversidad

En base a los datos de la Tabla 2 calcular la biodiversidad D.


12/16


121

EspeciesN de Individuosde cada especie

Proporcin decada especie

Logaritmo naturalde la proporcin

de c/especiePi x log2 (pi)

Anabaena sp. 50

Microcoleus sp. 80

Microcystis sp. 30

Chrooccocus sp. 50

Eudorina sp. 20

Scenedesmus sp. 10

Cosmarium sp. 20

Ceratium sp. 25

Euglena sp. 30

Phacus sp. 10

Aulacoseira sp. 20

Cyclotella sp. 25

Cocconeis sp. 30

Navicula sp. 50

Pinnularia sp. 30

Nitzchia sp. 25

Gomphonema sp. 20

Total: D=

Tabla 2. Clculo de diversidad a partir del ndice de Shannon (D).

Aislamiento de pigmentos fotosintticos

Para aislar los pigmentos fotosintticos de las comunidades algales seleccionadasemplearemos metanol como solvente. Luego con los resultados obtenidoscuantificaremos la biomasa fitoplanctnica. Procedimiento:

Filtrar 200 ml de agua o cultivo puro utilizando los filtros de 0.5 m. Colocar el filtro en un tubo falcn de 15 ml y agregar 5ml de metanol al 100%.

Tapar el tubo con papel aluminio y colocar a -20C, durante 1 h.

Centrifugar las muestras a 1.288 g, se reservan los sobrenadantes. Leer los espectros de absorcin de las distintas muestras entre 250 y 750 nm en

un espectrofotmetro.

Medir fluorescencia de la clorofila en un fluormetro y antes y despus deacidificar la muestra con HCl 1N.


13/16


122

Calcular la concentracin de clorofila mediante la siguiente frmula y estimar labiomasa fitoplanctnica en la muestra: Ca (g.l

-1 )= Fs .(r/r-1) x(Rb-Ra)x (Volsolvente/Vol de muestra), donde:

Ca Concentracin de clorofila expresada en g.l-1. Fs ( Factor de respuesta para la sensibilidad del equipo)= Cs/Rs. Cs: Concentracin de clorofila estndar utilizada para calibrar el equipo. Rs: Fluorescencia del blanco. r = Fluorescencia de la solucin estndar pura de clorofila antes de acidificar. Fluorescencia de la solucin de clorofila pura despus de acidificar. Rb: Fluorescencia de la muestra sin acidificar. Ra: Fluorescencia de la muestra acidificada. Vol Solvente: ml de metanol en los que se hizo la extraccin. Vol de muestra: ml de cultivo filtrados para hacer la extraccin.

Determinacin diferencial de biomasa por HPLC

Para analizar los componentes de la comunidad fitoplanctnica a partir de labiomasa total (Fig. 8), los pigmentos fotosintticos de las comunidades algalesseleccionadas deben separarse y cuantificarse para establecer la biomasa de cada especiepresente. Este diagnostico puede lograrse mediante HPLC con el posterior anlisis de losdatos mediante una matriz de factorizacin, para lo cual se emplea el programaCHEMTAX (Fig. 9).

Figura 8. Diferenciacin de la biomasa total.


14/16


123

Figura 9. Esquema del diagnostico por HPLC empleando el programa CHEMTAX que permite evaluar lacomposicin de algas de una muestra, basado en la diferenciacin de pigmentos determinantes de cada

grupo de algas. Adaptado de Paerl et al2005.


15/16


124

BIBLIOGRAFA

Alvear, K. & Romo, H. 1995. Manual de Mtodos Ficolgicos. Universidad de Concepcin.

Chile. 579pp.

Goncalves, R.J., Villafae, V.E., Medina, C.D., Barbieri, E.S. & Helbling, W.E. 2011. Planktondynamics and photosynthesis responses in aeutrophic lake on Patagonia(Argentina): influence of grazer abundance and UVR. Lat. Am. J. Aquat. Res., 39(1):117-130.

McAlice, B.J., 1971. Phytoplankton sampling with the Sedgwick-Rafter cell.Limnology andOceanography. 16: 19-28.

Ohtsuka, T., Kudoh, S., Imura, S. & Ohtani, O. 2006. Diatoms composing benthic microbialmats in freshwater lakes of Skarvsnes ice-free area, East Antarctica. PolarBioscience, 20: 113-130.

Paerl, H.W., Dyble, J. & Pinckney, J.L. 2005. Using microalgal indicators to assess humanand climateinduced ecological change in estuaries. In Bortone, S.A. Ed EstuarineIndicators. Boca Raton, Fl, CRC Press. 145-174pp.

BIBLIOGRAFA DE CONSULTA

Bourrelly, P. 1972. Les Algues deau douce. Initiation a la systmatique. Les algues vertes.I Ed. N. Boube & Cie. Paris. 572p.

Bourrelly, P. 1981. Les Algues deau douce. Initiation a la systmatique. Les algues jauneset brunes. Chrysophyces, Phophyces, Xanthophyces et Diatomes. II Ed. N.Boube & Cie. Paris. 517p.

Bourrelly, P. 1985. Les Algues deau douce. Initiation a la systmatique. Les algues bleues

et rouges. Les Euglniens, Peridiniens et Cryptomonadines. Ed. N. Boube & Cie.Paris. 606p.

Bellinger, E.G. & Sigee, D.C. 2010. Freshwater Algae: Identification and use asbioindicators. NJ. Wiley-Blackwell.

Canter Lund, H. & Lund J.W.G. 1995. Freshwater Algae, their microscopic world explored.Bioprees Ltd., The Orchard, Clanage Road Bristol. 306pp.

Cox, E.J., 1996. Identification of Freshwater Diatoms from Live Material. 1st Edn.,Chapman and Hall, London, 158p.


16/16


125

Graham, L.E. & Wilcox, L.W. 2000. Algae. Prentice Hall, Upper Saddle River, New York.640p.

Helbling, E.W., Faras, M.E., Fernndez Zenoff, M. & Villafae, V.E. 2006. In Situ responses

of phytoplaankton from the subtropical lake La Angostura (Tucumn, Argentina) inrelation to solar ultraviolet radiation exposure and mixing conditions.Hydrobiologa, 559: 123-134.

Helbling, E.W., Prez, D.E., Medina, C.D., Laguna, M.G. & Villafae, E.V. 2010.Phytoplankton distribution and photosynthesis dynamics in the Chubut Riverestuary (Patagonia, Argentina) throughout tidal cycles. Limnology andOceonography, 55: 55-65.

Round, F.E., Crawford, R.M. & Mann, D.G. 1990. The Diatoms: Biology and Morphology of

the genera. Cambridge University Press, Cambridge. 758p.

Van den Hoeck, C. 1978. Einfhrung in die Phycologie. Verlag Sttutgart. 481pp.

Van den Hoeck, C., Mann, D.G. & Jahns., H.M. 1998. Algae: An introduction to Phycology.Cambridge University Press, Cambridge. 627pp.

Recibido: 15 julio 2012.Aceptado: 9 octubre 2012.

Conteo de Plancton

Documents

Transcript of Conteo de Plancton