Control biológico de los patógenos Fusarium circinatum … · un periodo de tiempo mas largo para...
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1 Control biológico de los patógenos Fusarium circinatum y Sphaeropsis sapinea mediante la utilización de especies fúngicas antagonistas Euskal Herriko Unibertsitatea Universidad del País Vasco eman ta zabal zazu
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Control biológico de los patógenos Fusarium circinatum y Sphaeropsis sapinea
mediante la utilización de especies fúngicas antagonistas
Euskal Herriko Unibertsitatea
Universidad
del País Vasco
eman ta zabal zazu
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Equipo participante:
Miren K. Duñabeitia Aurrekoetxea1
Eugenia Iturritxa2
Carmen Gonzalez Murua1
Unai Ortega Lasuen1
Joseba Sanchez Zabala1
Kepa Txarterina Urkiri3
Juan Majada Guijo4
1 Departamento de Biología Vegetal y Ecología. Facultad de Ciencia y Tecnología.
UPV/EHU. Apdo. 644. 48080-Bilbao.
2 NEIKER-Tecnalia. Granja Modelo Arkaute, NI Km 355. Apdo. 46. 01080 Vitoria.
3 BASALAN, Diputación Foral de Bizkaia. Avda. Madariaga 1-1ª Plta, Dpto. 9. 40014-
Bilbao.
4 SERIDA. Estación Experimental “La Mata”, Sección Forestal. Apdo. 13. 33820
Grado, Asturias.
Fdo.: M.K. Duñabeitia Aurrekoetxea
3
INTRODUCCION
Fusarium circinatum y Sphaeropsis sapinea son dos especies patógenas
causantes de la enfermedad del chancro resinoso que afecta principalmente a
las coníferas del género Pinus, siendo Pinus radiata una de las especies más
sensibles. En la lucha por la erradicación o control de dichas especies, la
utilización de técnicas de control biológico como alternativa a los productos
químicos puede ser una herramienta de gran interés. El biocontrol actualmente
ya ocupa un lugar importante dentro de las prácticas de manejo de
enfermedades de las plantas causadas por los patógenos fúngicos del suelo,
principalmente de los géneros Rhizoctonia, Sclerotium, Pythium, Phytophthora
y Fusarium entre otros.
En esta línea de investigación el primer paso que hay que dar es el de la
selección de potenciales bioantagonistas que puedan ser utilizados como
controladores biológicos, para lo cual es necesario realizar ensayos in vitro que
orienten respecto a su capacidad antagónica y permitan que posteriormente
puedan ser formulados y utilizados en pruebas de campo.
Las especies del género Trichoderma poseen buenas posibilidades en
este sentido como hiperparásitos competitivos que producen metabolitos
antifúngicos y enzimas hidrolíticas a los que se les atribuyen los cambios
estructurales a nivel celular, tales como vacuolación, granulación,
desintegración del citoplasma y lisis celular. Asimismo, el empleo de especies
ectomicorrícicas puede ser también una herramienta importante ya que se han
descrito diferentes mecanismos de protección mediante los que estos
organismos son capáces de hacer frente a los agentes patógenos, entre los
cuales se encuentra el de la antibiosis.
Objetivo
Estudiar in vitro el posible efecto antagonista que puedan tener
diferentes especies fúngicas frente a los patógenos Sphaeropsis sapinea y
Fusarium circinatum, con el fin de seleccionar candidatos para su utilización en
el control biológico de la enfermedad del chancro resinoso.
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MATERIAL Y METODOS
Los agentes patógenos se han aislado de rodales de Pinus radiata del
País Vasco y se han identificado, en el caso de la cepa de Sphaeropsis
sapinea como M1/100107, morfotipo A, VCG H y, en el caso de la cepa de
Fusarium circinatum como M3/070505, tipo de apareamiento MAT1-2, VCG.
En el caso de Trichoderma se ha testado una cepa salvaje aislada de
una plantación de Pinus radiata e identificada como Trichoderma harzianum
T31/281004 y la cepa comercial distribuida por Agromed bajo la denominación
de Tricofag R16 Agromed .
Diferentes muestreos por rodales de coníferas de Bizkaia y otras
provincias limítrofes permitieron la recolección de carpóforos de macromicetos
en buen estado de conservación, que fueron trasladados al laboratorio para
intentar aislarlos en cultivo puro.
Para el aislamiento en cultivo puro, las especies fúngicas recolectadas
en campo se sembraron en placa Petri sobre medio de cultivo MMN sólido
(Fig.1). Los aislamientos considerados positivos pasaron a formar parte de la
colección de cultivos puros, manteniéndose viables mediante resiembras
periódicas a medio fresco.
No todas las especies recogidas y sembradas en cultivo puro dieron
resultados positivos. Además, algunas de las especies que si se han aislado
con éxito, presentan tasas de crecimiento bajas, lo que hace que se necesite
un periodo de tiempo mas largo para poder realizar test de antagonismo in
vitro. Por todo ello, de entre todas las especies de la colección de cultivos
puros, se seleccionaron las 5 siguientes:
5
Especie Rodal de Procedencia
Lactarius quieticolor Pinus radiata, Leioa (Bizkaia)
Rhizopogon luteolus Pinus radiata, Zalla (Bizkaia)
Suillus luteus Pinus sylvestris, Guardo (Palencia)
Scleroderma polyrhizum Pseudotsuga menziesii, Amorebieta (Bizkaia)
Xerocomus badius Pinus radiata, Zalla (Bizkaia)
R. luteolusS. polyrhizum
L. quieticolor
X. badius
S. luteus
R. luteolusR. luteolusS. polyrhizumS. polyrhizum
L. quieticolorL. quieticolor
X. badiusX. badius
S. luteusS. luteus
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Figura 1. Cepas de Rhizopogon luteolus y Suillus luteus aislados en cultivo puro crecidos durante 18 días en medio MMN.
La evaluación se ha realizado mediante emparejamientos dobles del tipo
cepa ectomicorrícica-patógeno y Trichoderma-patógeno, así como
emparejamientos triples cepa ectomicorrícica-Trichoderma-patógeno, con el fin
de analizar posibles sinergias entre los hongos ectomicorrícicos y las diferentes
cepas de Trichodermas hacia los patógenos.
Especie patógena
Especie micorrícica
18 días en oscuridad 23ºC
Trichoderma
3 días en oscuridad 23 ºC
Hongo micorrícico-Patógeno-Trichoderma
Hongo micorrícico-Patógeno
Trichoderma-Patógeno
Hongo micorrícico-Trichoderma
Análisis de Área y Biomasa
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Las tasas de crecimiento de cada una de las especies fúngicas
implicadas en los ensayos es muy diferente, siendo las especies
ectomicorrícicas las que mas lento crecen. Por ello, en la placa Petri se sembró
inicialmente la especie ectomicorrícica, que se dejó crecer durante 18 días en
la cámara de incubación a 23 ºC en oscuridad. Transcurrido este tiempo se
sembró el hongo patógeno, de forma que ambos micelios quedaban
enfrentados y separados entre si unos dos centímetros.
En el caso de Trichoderma, debido a que su tasa de crecimiento es muy
elevada, la siembra se realizó de forma simultanea, enfrentando los micelios de
esta especie con los de Sphaeropsis o Fusarium.
Asimismo, cuando se trataba de emparejamientos triples, a los 18 días
de iniciar el cultivo con el hongo ectomicorrícico se realizaba también de forma
simultanea la siembra de Trichoderma y del patogeno.
Una vez enfretados de dos en dos, o de tres entres, se dejaron crecer
durante 3 días en la cámara de incubación a 23ºC y en oscuridad.
En todos los casos, se dejó una tanda de placas en las que cada una de
las especies ensayadas (micorrícicas, de Trichoderma y patógenas) creció
sola, considerando este tratamiento como el Control, con el cual comparar
todas las combinaciones ensayadas.
La evaluación de la respuesta de las diferentes especies se ha realizado
en base al crecimiento que presenta cada uno de ellas. Para ello se ha
determinado, en primer lugar, y en cada una de las placas, el área ocupada por
el micelio. Posteriormente se ha calculado la biomasa desarrollada mediante la
extracción de la colonia de la placa y el secado en estufa a 80 ºC durante 48
horas.
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RESULTADOS Y DISCUSION
La presencia de Trichoderma o de la especie ectomicorríca produce un
descenso significativo del crecimiento de Sphaeropsis sapinea, tanto en área
como en biomasa, variando el grado de inhibición en función de la especie
testada (Fig. 2).
En presencia de L. quieticolor se observa la menor disminución (45%),
aumentando a mas de un 60% en presencia de R. luteolus y S. polyrhizum. La
presencia de Trichoderma reduce el crecimiento del patógeno entre un 70 y
un 80%, siendo un 10% más efectiva la cepa salvaje. S. luteus y X. badius son
dos especies a destacar por ser las que mayor efecto inhibitorio han producido
en el crecimiento de S. sapinea, con una disminución superior al 80% en área
y al 90% en biomasa.
Figura 2. Efecto de la presencia de L. quieticolor (Lq), R. luteolus (Rl), S. luteus (Sl), S. polyrhizum (Sp), X. badius (Xb), Trichoderma cepa salvaje (TN) y cepa comercial (TC) en el área y la biomasa de Sphaeropsis sapinea, expresado como porcentaje de disminución, con respecto al control.
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Figura 3. Crecimiento de la cepa de Sphaeropsis sapinea en medio MMN, sola (Control), en presencia de Trichoderma, tanto comercial como salvaje, y en presencia de las cinco cepas ectomicorrícicas testadas.
Control
L. quieticolor R. luteolus
S. luteus X. badius
S. polyrhizum
Trichoderma comercial (TC) y salvaje (TN)
Sphaeropsis sapinea
Control
L. quieticolor R. luteolus
S. luteus X. badius
S. polyrhizum
Trichoderma comercial (TC) y salvaje (TN)
L. quieticolor R. luteolus
S. luteus X. badius
S. polyrhizumL. quieticolor R. luteolus
S. luteus X. badius
S. polyrhizum
Trichoderma comercial (TC) y salvaje (TN)
Sphaeropsis sapinea
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La presencia combinada de Trichoderma y una especie ectomicorrícica
produce un significativo descenso del crecimiento del patógeno (Fig. 4), siendo
mas patente este incremento del efecto antagónico en el caso de L. quieticolor
(con un 40 a 50% y 70 a 80% en area y biomasa, respectivamente) y de R.
luteolus (60% y 80%-90% en área y biomasa), especies que son las que
menos afectan al patógeno cuando no se testan de forma combinada.
Destacan las combinaciones con las especies S. polyrhizum, S. luteus y
X. badius, con descensos superiores al 90% tanto en área como en volumen,
inhibición que llega a ser casi total en el caso de Suillus y Xerocomus.
Figura 4. Efecto de la presencia de L. quieticolor (Lq), R. luteolus (Rl), S. luteus (Sl), S. polyrhizum (Sp.) y X. badius (Xb) en el crecimiento de Sphaeropsis sapinea, comparado con el efecto de la presencia combinada de esa especie y la cepa comercial (TC) o salvaje de Trichoderma (TN).
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Figura 5. Efecto de la presencia combinada de Trichoderma y una especie ectomicorrícica en el crecimiento de la cepa de Sphaeropsis sapinea.
L. quieticolor R. luteolus
S. polyrhizum
X. badiusS. luteus
L. quieticolor R. luteolus
S. polyrhizum
X. badiusS. luteus
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Con respecto a Fusarium circinatum, la presencia de Trichoderma o de
la especie ectomicorríca produce un efecto negativo en su crecimiento, si bien
se observa una gran variabilidad en el grado de inhibición producido en función
de la especie testada (Fig. 6). Trichoderma afecta igual al área y a la biomasa
de Fusarium, aunque difieren en su efectividad, observándose un descenso
del 50% con la cepa salvaje frente a un 25% con la comercial.
Las cepas ectomicorrícicas afectan a la biomasa en mayor medida que
al área. L. quieticolor y R. luteolus son las especies que menos afectan al
patógeno, poco más de un 10% en área y 40% en biomasa. Con S.
polyrhizum la inhibición aumenta a un 40% en área y 65% en biomasa. S.
luteus y X. badius muestran los resultados más prometedores, al disminuir en
un 70% el área y en casi el 90% la biomasa producida por Fusarium.
Figura 6. Efecto de la presencia de L. quieticolor (Lq), R. luteolus (Rl), S. luteus (Sl), S. polyrhizum (Sp), X. badius (Xb), Trichoderma cepa salvaje (TN) y cepa comercial (TC) en el área y la biomasa de Fusarium circinatum, expresado como porcentaje de disminución, con respecto al control.
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Biomasa
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Figura 7. Crecimiento de la cepa de Fusarium circinatum en medio MMN, sola (Control), en presencia de Trichoderma, tanto comercial como salvaje, y en presencia de las cinco cepas ectomicorrícicas testadas.
Control
L. quieticolor R. luteolus
S. luteus X. badius
S. polyrhizum
Trichoderma comercial (TC) y salvaje (TN)
Fusarium circinatum
Control
L. quieticolor R. luteolus
S. luteus X. badius
S. polyrhizum
Trichoderma comercial (TC) y salvaje (TN)
Fusarium circinatum
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La combinación de Trichoderma con una especie ectomicorrícica
produce un incremento significativo del grado de inhibición del patógeno (Fig.
8), siendo más patente este incremento del efecto antagónico en el caso de L.
quieticolor (40-50% y 70-80% en área y biomasa) y de R. luteolus (60% y 80%-
90% en área y biomasa), especies que son las que menos afectan al
patógeno cuando no se testan de forma combinada.
Figura 8. Efecto de la presencia de L.quieticolor (Lq), R. luteolus (Rl), S. luteus (Sl), S. polyrhizum (Sp) y X. badius (Xb) en el crecimiento de Fusarium circinatum, comparado con el efecto de la presencia combinada de esa especie y la cepa comercial (TC) ó salvaje de Trichoderma (TN).
Micorrícico Micorricico + TC Micorricico + TN
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Destacan las combinaciones con las especies S. polyrhizum, S. luteus y
X. badius, con descensos superiores al 90% tanto en área como en biomasa,
inhibición que llega a ser casi total en el caso de Suillus y Xerocomus.
Figura 9. Efecto de la presencia combinada de Trichoderma y una especie ectomicorrícica en el crecimiento de la cepa de Fusarium circinatum.
L. quieticolor R. luteolus
S. polyrhizum
X. badiusS. luteus
L. quieticolor R. luteolus
S. polyrhizum
X. badiusS. luteus
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La presencia de la cepa ectomicorrícica produce un efecto antagónico
en Trichoderma que ralentiza su crecimiento, siendo la cepa comercial más
sensible que la salvaje (Fig. 10). La disminución en biomasa (50 a 90%) es
significativamente mayor que la observada en el área miceliar (20 a 40%).
El efecto inhibitorio más claro se produce con S. luteus, S. polyrhizum y
X. badius. Aunque el área sólo se ve afectada un 30-40%, la biomasa
desciende en un 80-90%.
Figura 10. Efecto de L. quieticolor (Lq), R. luteolus (Rl), S. luteus (Sl), S. polyrhizum (Sp) y X. badius (Xb), en el crecimiento de las cepas salvaje (TN) y comercial (TC) de Trichoderma.
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Las especies fúngicas ectomicorrícicas presentan un crecimiento muy
lento respecto a las cepas de Trichoderma y los dos patógenos, capaces de
desarrollar un denso micelio que ocupa completamente la superficie de la
placa. Algunos autores consideran que la necesidad de dejar crecer las cepas
ectomicorrícicas de 14 a 21 días antes de enfrentarlas con las cepas
patógenas esta muy relacionada con el efecto antagonista observado, al
producirse una disminución de la disponibilidad de nutrientes en el medio de
cultivo, que causa una reducción en el crecimiento del patógeno (Martin-Pinto
et al., 2006).
Las especies testadas no parecen confirmar esta hipótesis ya que la
tasa de crecimiento y el diámetro alcanzado por las cepas ectomicorrícicas
durante 18 días muestra diferencias entre especies que no se correlacionan
con las diferencias observadas en el grado de inhibición del desarrollo del
patógeno (Fig. 11).
Figura 11. Relación entre el diámetro de la cepa ectomicorrícica en el momento de la siembra del patógeno y el porcentaje de inhibición del crecimiento de S. sapinea y F. circinatum en área (claro) y biomasa (oscuro), transcurridos tres días.
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Los cambios observados en el color de la colonia en el caso de Suillus,
Scleroderma y Xerocomus ,en presencia del patógeno parecen sugerir que es
la producción de compuestos fenólicos la causa, al menos en parte, de la
inhibición en algunos casos prácticamente total, del crecimiento tanto de
Sphaeropsis sapinea como de Fusarium circinatum.
Figura 12. Cambios en el color del medio de cultivo, así como en el margen de la colonia de la cepa ectomicorrícica, observados en Scleroderma polyrhizum y Suillus luteus cuando crece en presencia de Trichoderma o del patógeno.
S. luteus
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S. polyrhizum
TC S. polyrhizum
Fusarium
S. luteus
TC
Fusarium
S. luteus
TC
Fusarium
S. polyrhizum
TC
S. polyrhizum
TC S. polyrhizum
Fusarium
S. polyrhizum
Fusarium
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La capacidad antagonista de Trichoderma es altamente variable.
Mihuta-Grimm y Rowe (1986) demostraron que de 255 aislamientos obtenidos
de diferentes lugares, sólo el 15% de los mismos fueron efectivos en el control
de Rhizoctonia, y llegaron a la conclusión, al igual que Arcia (1995), de que las
cepas aisladas del lugar de aplicación son más efectivas que las traídas de
otras zonas.
Es probable que la capacidad antagonista de Trichoderma dependa de
la especificidad de la cepa aislada y que los aislamientos, como sugieren.
Acevedo y Arcia (1988) sean más eficientes para el control de un patógeno que
para otro. Por ello, es importante medir esa especificidad, y, en caso de tener
situaciones de este tipo, sería interesante evaluar la efectividad de mezclas de
cepas antagonistas, a fin de controlar la acción de las poblaciones patogénicas.
20
CONCLUSIONES
Actualmente las medidas utilizadas para el control de las enfermedades
del suelo son el uso de productos químicos y prácticas culturales; sin embargo,
el control por medio de estas prácticas se ve restringido por razones
económicas y ecológicas.
Las posibilidades de sustituir o disminuir el uso de productos químicos en el
control de enfermedades producidas por hongos del suelo abre una ventana a
la investigación de técnicas alternativas como el control biológico.
•Todas las especies fúngicas testadas in vitro presentan capacidad antagonista
para las cepas de Sphaeropsis sapinea y Fusarium circinatum causantes de
graves daños en los rodales de Pinus radiata de la CAPV.
•Las dos cepas de Trichoderma inhiben el crecimiento de Fusarium circinatum
y de Sphaeropsis sapinea, mostrándose más efectiva la cepa salvaje que la
comercial, lo que indica la idoneidad de localizar y seleccionar cepas
adaptadas a las zona de aplicación.
•Suillus luteus y Xerocomus badius son capaces de inhibir in vitro, de forma
casi total el crecimiento tanto de Sphaeropsis sapinea como de Fusarium
circinatum, lo que las sitúa como buenos candidatos para el control biológico de
la enfermedad del chancro resinoso.
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BIBLIOGRAFIA
Acevedo, R.; Arcia, A. 1988. Control de Sclerotium cepivorum por Trichoderma en
macetas. (Resumen). Fitopatol. Venez. 1(1):34.
Arcia, A. M. 1995. Uso de Antagonistas en el Control de Fitopatógenos del Suelo. En:
Curso sobre Control Microbial de Insectos Plagas y Enfermedades en Cultivos.
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Sphaeropsis sapinea, pathogenic fungus of Pinus radiata. European Journal of
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Mihuta-Grimm, L. and Rowe, C. 1986. Trichoderma spp. as biocontrol agents of
Rhizoctonia damping-off of radish in organic soil and comparison of four delivery
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