Control del Contaminación

Bacteriana en Plaquetas

Alfredo Mendrone Junior

Fundação Pro sangue Hemocentro de São Paulo

Caso Clínico

o DAP, 30 años, hombre, nascido em SP

o Portador de LH, programación de ATMO

o Plaquetas = 14.000/mm3 y Neutrófilos = < 500 Neutrófilos / mm3 = Transfusión de CP

o Durante la cuarta infusión de la unidade de CP = fiebre + temblores + escalafrios + hipotensión arterial

o Transfusión suspendida y iniciado antibiótico de amplio espectro (Meropenem + polimixina B + DVA)

Introdução

• O CP = Contaminación bacteriana

• La temperatura de almacenamiento de 20–24° C favorece el crecimiento de muchas especies de

micro flora humana y bacterias del microambiente

• O2 = intercambio de gas permitido por bolsa de plástico

• Uso de soluciones aditivas de plaquetas

• Klebsiella pneumoniae, Serratia marcescens ou Pseudomonas fluorescens = desde unas

pocas unidades formadoras de colonias (UFC) a 107 UFC/ml en solo 2 días.

• Tiempo de almacenamiento = 5 días

• En algunas situaciones puede extenderse para 7 días

Introdução

• USA - The 2015 National Blood Collection and Utilization Survey (Aféresis: 92%, ST: 8%).

• 2,4 millones de unidades de plaquetas distribuidas

• 2,0 millones son transfundidos

• Europa

• 2,8 millones de unidades de plaquetas distribuidas

• 2,2 millones son transfundidos

• Brasil (HEMOPROD 2016 – Ministério da Saúde)

• 900.000 transfusiones de concentrados de plaquetas

Transfusion. 2011;51(12):2573-2582. https://www.fda.gov/BiologicsBloodVaccines/SafetyAvailability/ReportaProblem/TransfusionDonationFatalities/default.htm. Transfusion. 2017;57(12):2969-2976; Blood. 2016;127(4):496-502. http://www.fda.gov/downloads/AdvisoryCommittees/CommitteesMeetingMaterials/BloodVaccinesandOtherBiologics/BloodProductsAdvisoryCommittee/UCM325690.pdf.

Introdução

• Estado clínico: reacción séptica leve, acompañada de fiebre y

temblores, hasta sepsis y muerte

• Condición clínica del paciente

• Patogenicidad de las bacterias

• Cantidad de bacterias infundidas

Introdução

• Criterios para el diagnóstico de la transmision transfusional de bacteria (AABB e

CDC):

• Manifestación de infección em las primeras 24 horas, con cultivo (+) em paciente y muestra de bolsa

• Sin diagnóstico y bajo notificación

• Las reacciones generalmente se clasifican como siendo RFNH

• La infección no relacionada con la transfusión

• Paciente que ya toma antibiótico = cultivo no positivo

• La bolsa generalmente es descartada y no esta disponible para cultivo

Introdução

• Se han implementado varias medidas para reducción del riesgo potencial

• Rechazo de donantes de alto-riesgo para bacteriemia asintomática

• Control y estandarización del procedimiento de desinfección de la piel

• Garantizar la conservación del sistema cerrado durante el procedimiento y almacenamiento

• Deviación de los dos primeros 20-40mL de sangre en donación

• Medida de prevención más eficiente

• Reducción significativa en la incidencia de contaminación do sangre total y CP*

• Inspección visual previa al lanzamiento

• El riesgo persiste a pesar de estas numerosas intervenciones

*Vox Sang. 2002 Jul; 83(1): 13–6. Transfusion. 2009 Oct; 49(10): 2152–7. Vox Sang. 2004 Apr; 86(3): 178–82.

Introdução

1. 2004: Standards AABB (5.1.5.1.) = prueba microbiológica en 100% de concentrados de plaquetas

• 50-70% de reducción de casos de sepsis por transfusión (Transfusion. 2017;57(5):1099-1103).

• Aumento del costo del componente sanguíneo; atraso en la liberación de estos productos

2. 2014 = La FDA ha publicado (21 CFR 606.145(a))

• Servicios de transfusión = debe garantizar que el riesgo de contaminación bacteriana de las plaquetas se controle

adecuadamente, utilizando dispositivos aprobados por la FDA o otro método aceptable para este propósito

3. 2016 = FDA

• Opción para usar IP y ampliar las opciones de prueba para la detección de bacterias, con la posibilidad de extender la

vida útil de la CP

Pruebas de detección bacteriana • Métodos disponibles

• Basada en cultura

• Métodos rápidos

• Clasificación:

• Primario o temprano (muestra recolectada dentro de las 36 h posteriores a la donación)

• Prueba de cultivo

• Secundaria o tardía (muestra recolectada después de 36 h da donaciones)

• Prueba adicional realizada cerca del tiempo de transfusión para la detección de bacteria no reveladas en la

prueba primaria

• Puede ser una prueba de cultivo o una prueba rápida

Metodología Device /dispositivo Sensibilidad

(CFU)

Métodos basados

en cultura

BactAlert BioMerieux 101

BactTec BD 101

eBDS Haemonetics 101

Dispositivos rápidos de

detección de Bacterias

(tardio ou point-release)

Verax Pan Genera

Detection

(PGD)

Método: Inmunoensayo

Detección de Lipopolisacarídos

y ácido lipoteico

103-104

Immunetics

BacTx

Método: Colorimétrico

Detección: peptideoglycano

103-104

Otros métodos rápidos

(tardio ou point-release)

Citometría de Flujo ?

Biologa Molecular ?

Riesgo Residual

• Riesgo residual / unidad transfundida (incluso con cultivo primario (-)

• 1 / 2.300

• Reacciones severas continúan ocurriendo

• 1/100.000 (vigilancia pasiva) a 1/10.000 (vigilancia activa)

• El 100% de las reacciones fatales están asociadas con la transfusión de CP no 4º o 5º día de stock

Transfusion. 2011;51(12):2573-2582. https://www.fda.gov/BiologicsBloodVaccines/SafetyAvailability/ReportaProblem/TransfusionDonationFatalities/default.htm. Transfusion. 2017;57(12):2969-2976; Blood. 2016;127(4):496-502. http://www.fda.gov/downloads/AdvisoryCommittees/CommitteesMeetingMaterials/BloodVaccinesandOtherBiologics/BloodProductsAdvisoryCommittee/UCM325690.pdf.

Posibles Estrategias

1. Cultivo primario = coleta de muestra dentro de las 24 h posteriores a la donación

2. Cultivo primario + prueba rápida dentro de las 24 h previas a la transfusión

3. Cultivo primario + una cultura secundaria en el día 3 o día 4 (para extender hasta el

día 7)

4. Cultivo secundario el día 3

5. Reducción del Patógeno

Screening 100% de la rutina

Inactivación de Patógenos

Screening parcial o solo CQ

Datos no disponibles.

Prueba de cultivo – colección de muestra

• 2 enfoques para el tiempo de recolección de muestras

• “early sampling” = definido como recolección de muestra dentro de las 36 h posteriores a la donación

• “late sampling” = cuando la recolección ocurre después de 36 h de donación

• Early sampling

• Ventaja = resultado de prueba microbiológica más rápido que favorece el stock de CP

• Desventaja = falsos negativos

• Baja concentración de plaquetas (< 1 UFC/mL ) al momento de la recolección de la muestra (primeras 24 h),

• Biofilm y formación de agregados celulares

• Solo se detectan entre el 20 y 40% de las plaquetas contaminadas*

*Transfusion. 2017 Sep; 57(9): 2174–81. Transfusion. 2007 Aug; 47(8): 1381–9 Vox Sang. 2008;95(1):13-19 .

Tiempo de cuarentena durante la detección

• Tiempo de positividad:

• CP inoculada con > 108 UFC/mL de K. pneumoniae o Escherichia coli = mínimo de 4 h para positivar.

• Inoculación con Staphylococcus aureus y Bacillus spp., carga > 106 UFC / mL = positividad después de al menos 4 h de incubación

• CP inóculos de baja carga de UFC, con varias bacterias de alta y baja patogenicidad:

• 24 h de incubación = positividad de 100%

• 18 h de incubación = 95% de detección

• < 12 h de incubación = 59% de detección de bacterias de baja patogenicidad y 100% de detección de bacterias de alta patogenicidad

• Conclusión:

• La liberación sin cuarentena es de grande riesgo y puede provocar una reacción transfusional severa

• Se requiere una cuarentena mas prolongada para asegurar la identificación de bacterias de crecimiento más lento e muestras de

bajo inóculo

Vollmer T, et al. Late sampling for automated culture to extend the platelet shelf life to 5 days in Germany. Transfusion. 2018 Jul; 58(7): 1654–64.

Volumen de muestra

• Volumen de muestra = factor importante en el índice de detección

• Volumen máximo de muestra para BacTec y BacT/ Alert = 10 mL por vial

• El limite de detección del método con este inóculo es de 0.1 UFC/ mL

• Volumen menor = sensibilidad más baja

• Se obtuvo un incremento del 57% en la positividad cuando si aumento de 4 mL para 8 mL*

• Actualmente: 7,5 mL – 10 mL

• Alternativa = volumen proporcional al volumen de la bolsa **

• Según el modelo de Poisson = el inóculo de 3,8% del volumen total de componentes sanguíneos puede conducir a un

aumento en la tasa de detección***, con un máximo de 10mL.

*Bruhn R, et al. Impact of increasing sample volume from 4 ml to 8 ml on bacterial detection rates in apheresis platelets: a meta-analysis. Vox Sang. 2015 Apr; 108(3): 318–20. **Kamel H, et al. Improved yield of minimal proportional sample volume platelet bacterial culture. Transfusion. 2017 Oct; 57(10): 2413–9. ***Tomasulo PA, Wagner SJ. Predicting improvement in detection of bacteria in apheresis platelets by maintaining constant component sampling proportion. Transfusion. 2013 Apr; 53(4): 835–42.

Detección anaerobica – ¿Vale la pena?

• Con la excepción de Clostridium = todas las bacterias que pueden causar reacciones graves después de la

transfusión se cultivan en condiciones aeróbicas.

• Algunos países (Irlanda, Portugal, Países Bajos) han adoptado 2 viales (aero e anaero) = Clostridium

perfringens y Propionibacterium no crecieron en condiciones aeróbicas

• Muchas bacterias patógenas son facultativas y crecen tanto en entornos aeróbico como anaeróbico,

incluidos S. aureus, E. coli, y Candida albicans

• Algunas bacterias , particularmente da la flora entérica, muestran un crecimiento más rápido en viales

aneroides que en condiciones aeróbicas

• Un aspecto negativo relacionado con el cultivo anaeróbica es la alta tasa de falsos positivos

Métodos Directos

• Métodos directos: detección de componentes bacterianos (lipopolissacarídeos o péptidos

glicanos) / citometría de flujo / biología molecular

• Cuando se aplican antes de la administración (point of release), pueden identificar las CP

contaminadas que han sido aprobadas por el método de cultivo

Métodos Directos

• Ventaja = tiempo hasta el resultado: métodos directos superan al método basado en la cultura

• Dependiendo del método los resultados se obtienen en unos minutos a unas pocas horas.

• Desventajas: baja sensibilidad (103-104 UFC) alto costo y dificultad logística

• La implementación de un método directo no da como resultado la eliminación completa de la sepsis relacionada

con la transfusión debido a la baja sensibilidad de estos métodos

• Teniendo en cuenta el potencial de replicación de patógenos en una CP, los resultados de los métodos directos

son válidos por no más de 24 horas.

Contaminación Bacteriana de componentes

Aféresis PLT liberada por BactAlert, con resultado de PGD previo a la transfusión

(n = 27.620)

PGD repetidamente

reactivo en 2 análisis

(n = 151)

Cultura Positiva

(n=9)* 1/3069

326 / 1.000.000

Cultura Negativa

(n=142)

PGD no reactivo

(n = 27.469)

Nueva cultura, incluso con PGD no reactivo

(n = 10.344)

Cultura Positiva

(n=2)**

Cultura Negativa

(n=10.342)

Jacobs et al. Transfusion 2011; 51: 2573-2582

**Ambas liberadas para transfusão: - 01 com sepsis pós transfusional: Streptococcus oralis 1,2 x 107 CFU/ml - 01 sem reação: CoNS 4 x 102 CFU/ml

* Todos Gram (+): • CoNS (6); Bacillus species (2); Enterococcus faecalis (1)

Resultados Falso-negativos

• La sepsis por contaminación bacteriana sigue ocurriendo incluso después de la introducción del

método de cultivo = resultado falso negativo del cultivo.

• Muestra inadecuada (volumen inadecuado o recolección temprana)

• Las especies de bacterianas que contaminan las plaquetas pueden formar biofilmes agregados que se

adhieren a superficies biológicas y no biológicas

• Crecimiento lento

• Inspección visual en el no momento de la liberación = formación de agregados, pérdida de remolino,

cambio de color

Abela MA, et al Bacterial contamination of platelet components not detected by BacT/ALERT®. Transfus Med. 2018 Feb; 28(1): 65–70. Greco C, et al. Staphylococcus epidermidis forms biofilms under simulated platelet storage conditions. Transfusion. 2007 Jul; 47(7): 1143–53. Fitzgerald JR, Foster TJ, Cox D. The interaction of bacterial pathogens with platelets. Nat Rev Microbiol. 2006 Jun; 4(6): 445–57.

• 13 meses de estudio = análisis de 23.044 Aféresis CP

• Día 1 = cultivo con 8 mL en medio aeróbico, en cuarentena + Día 3 = cultura con 5 mL en medio aeróbico, en cuarentena

• 5 casos positivos = Los 5 casos positivos fueron removidos del stock

• No hubo casos de sepsis en los 13 meses del estudio

• 12 meses anteriores (solo cultura del Día 1 ):

• 26.586 plaquetas analizadas = 4 posibles casos de sepsis y 3 confirmados (combinados = 1/3.798) con 1 caso fatal

• Conclusión = La implementación de una segundo cultivo en el día 3 detectó casos de CP con resultado falso negativo en el

primer cultivo

Cultivo primario con recolección tardia de muestra

• 16-20 mL de muestra (aero y anaero), recolectada 48-60 h después de la donación.

• La segunda prueba no se realiza.

• Inventario extendido hasta el día 7

• Canadá = 2015 – 2017 = 9.215 pools e 44.190 aféresis analizados.

• Detección = 1 / 2.543 (21/53.405).

• No se informaron reacciones sépticas durante el periodo ( datos históricos ~1/93,000)

• Inglaterra = 2011 – 2015 = 1.239.029 CP analizadas ( día 3)

• Verdadero positivo = ~1/3.075

• Falso positivo = ~1/521

• Cultura en el día 7 = detección 0/4.515

• Hube un caso de sepsis asociada con transfusión de agrupación de PC asociada con S. aureus.

Reducción de patógenos

• El screening bacteriano en CP utilizando sistemas de cultivo semiautomáticos esta limitado por:

• Resultados falsos negativos = transfusión de productos contaminados

• Resultados falsos positivos = descartar productos no contaminados

• Tecnologías de reducción de patógenos

• Intercept Blood System (Cerus Corp., Concord, CA, USA)

• Mirasol (Terumo BCT Inc., Lakewood, CO, USA)

• Theraflex (MacoPharma, Mouvaux, France) = se presentará a la CE en 2019.

• Mecanismo de acción: daño irreversible del DNA bacteriano previniendo la replicación de ácidos nucleicos.

Redución de Patógenos - Desafíos

• Hora de realizar la inactivación

• Las bacterias de rápido crecimiento pueden alcanzar una alta carga bacteriana en un corto período de

tiempo, excediendo la capacidad del Sistema IP

• Una sola bacteria restante después del tratamiento con IP puede ser suficiente para una reacción fatal

• Los componentes restantes de la parede celular pirógeno o las exotoxinas pueden representar un

riesgo para el receptor.

• Biofilme o formación de esporas pueden ser resistentes al método

• Concentrado de glóbulos rojos (co componente)

Caso Clínico

o DAP, 30 años, hombre, nascido em SP

o Portador de LH, programación de ATMO

o Plaquetas = 14.000/mm3 y Neutrófilos = < 500 Neutrófilos / mm3 = Transfusión de CP

o Durante la cuarta infusión de la unidade de CP = fiebre + temblores + escalafrios + hipotensión arterial

o Transfusión suspendida y iniciado antibiótico de amplio espectro (Meropenem + polimixina B + DVA)

Caso Clínico

o DAP, 30 años, sexo masculino, nacido en SP

o Operador de DH, sometido a terapia de rescate con programación ATMO.

o Plaquetas = 14.000/mm3 e Neutrófilos = < 500 Neutrófilos / mm3 : transfusión de CP

o Durante la cuarta infusión de la unidades de CPR = fiebre + temblores + hipotensión arterial

o Transfusión suspendida y antibiótico de amplio espectro (Meropenem + polimixina B + DVA)

o Evolución = Óbito dentro de las 36 horas posteriores a la transfusión

o Cultivo = paciente / concentrado de plaquetas/ concentrado de glóbulos rojos:

o Enterobacter aerogenes

Fundação Pro Sangue Hemocentro de SP

o Hasta Julio de 2014 =

o Todas las medidas ya se habían introducido en el examen, recolección, procesamiento y liberación.

o Pruebas microbiológicas solo para control de cualidad

o Agosto 2014 = Financiamiento para pruebas microbiológicas en CP 100% producido (AF + Pool de PRP)

o 2014-2016 = eBDS

o 2016-2019 = cultura en medio líquido (BACTEC)

o colección de muestra = 24 h después de la donación (8 mL)

o Aeróbica solo + cuarentena de 24 h

o Si (+): Prueba confirmatoria con identificación de patógenos + cultivo de co componentes

o Si (-): liberado para transfusión + inspección visual.

Resultados - FPS

Testados Positivos Incidência

Aférese 29.991 3 1/9.777

7.8 x maior Pools 48.523 39 1/1.244

Randomica 4.093 2 1/2.046

Total 82.607 44 1/1.877

Falsos Positivos 103 82.607 1 / 802

eBDS 38 42.942 1/1.130

BacTec 65 39.665 1/610 1,85 x maior

Resultados - FPS

ANO Concentrados de Glóbulos Rojos POSITIVOS

(co componentes)

2014 2

2015 2

2016 5

2017 5

2018 5

2019 2

TOTAL 21

21 / 39 = 54%

Resultados - FPS BACTÉRIA TEMPO DE POSITIVIDADE (HS) HEMOCOMPONENTE

Serratia marcescens (Gram negativo) 1,6 PCP Escherichia coli (Gram negativo) 2,3 PCP Escherichia coli (Gram negativo) 3,6 PCP Serratia marcescens (Gram negativo) 3,6 PCP Clostridium perfringens (Gram positivo) 3,6 PCP Staphylococcus aureus 3,6 CPAFL Klebesiela pneumoniae (Gram negativo) 3,6 PCP Serratia marcescens (Gram negativo) 3,6 PCP Serratia marcescens (Gram negativo) 3,7 PCP Staphylococcus epidermidis 3,7 PCP Staphylococcus hominis 3,8 CP Streptococcus agalatiae 4,08 PCP Serratia marcescens (Gram negativo) 4,3 PCP Enterobacter cloacae (Gram negativo) 4,7 PCP Staphylococcus aureus 5,3 PCP Staphylococcus epidermidis 7,5 CP Staphylococcus epidermidis 8,4 PCP Streptococcus agalactiae 8,5 CPAFL Staphylococcus epidermidis 8,6 PCP Staphylococcus epidermidis 8,8 PCP Streptococcus dysgalactiae 9,3 PCP Staphylococcus epidermidis 11,3 PCP Staphylococcus aureus 11,3 PCP Streptococcus gallolyticus (bovis) 11,4 PCP Staphylococcus epidermidis 11,5 PCP Staphylococcus epidermidis 12 PCP Staphylococcus epidermidis 12,0 PCP Enterococcus faecium (Gram negativo) 12,0 PCP Staphylococcus epidermidis 12,4 PCP Staphylococcus epidermidis 13,0 PCP Staphylococcus epidermidis 13,3 PCP Streptococcus equi 14,3 PCP Staphylococcus coagulase negativa 15,6 PCP Staphylococcus epidermidis 16,5 PCP Staphylococcus epidermidis 17,0 PCP Staphylococcus aureus 19,4 PCP Staphylococcus epidermidis 20,0 PCP Staphylococcus epidermidis 22,0 PCP Staphylococcus epidermidis 23,1 PCP Staphylococcus epidermidis 24,0 PCP Staphylococcus epidermidis 24,0 PCP Staphylococcus epidermidis 24,2 PCP Staphylococcus epidermidis 34,8 PCP Staphylococcus warneri 44,9 CPAFL

Gram (-) 10 23%

Gram (+) 34 77%

Total 44 100%

Tempo para positividade N %

12 hs 28 64%

18 hs 7 16% 80%

24 hs 6 14% 94%

> 24 hs 3 6%

Gram (+)

Gram (-)

12 hs 18 hs 24 hs > 24 hs

Conclusión

• La incidencia de sepsis asociada a transfusiones se subestima, no refleja el riesgo real

• La vigilancia activa revela un riesgo 10-40 x mayor que la vigilancia pasiva

• Prueba de cultivo con muestra recolectada antes de 36 hs de donación = Se detectara

20-40% dos CP contaminada

• El 100% de los casos de sepsis están relacionados con plaquetas de 4-5 días

Conclusión

• Ideal

• Cultivo primario + cultivo secundario

• Cultivo primario + prueba rápida realizada cerca de transfusión

• Inactivación de patógenos

• Costos

• Conveniencia, reforzada por resultados de vigilancia pasiva, que muestran que la

contaminación bacteriana es un riesgo remoto

Muchas Gracias!

alfredo.mendrone@prosangue.sp.gov.br