Cortes con enzimas de restricción

Yudy Alvear CarvajalNatalia Carolina CastiblancoNéstor Julián Zarate Herrán

ENZIMAS DE RESTRICCIÓN

Las enzimas de restricción, tuvieron su primera aparición en 1950 principalmente en organismos bacteriófagos, estas enzimas adoptaron el nombre a partir del hecho de q que prevenían la invasión de ADN foráneo tal como el ADN viral, cortándolo, adicionalmente, las enzimas cortaban preferencialmente en sitios internos del ADN foraneo, por esta razón recibieron el nombre de endonucleasas.Se observó en experimentos de laboratorio, que ciertas cepas de bacterias eran capaces de restringir el crecimiento de virus crecidos previamente en estas cepas. Este efecto fue atribuido a enzimas de restricción.

El término endonucleasa de restricción fue adoptado por Cohen y Boyer y fue asignado a las enzimas que producían restricción.En los años sesenta Swewaert Linn y Wernwr Arber, fueron quienes descubrieron las endonucleasas de restricción en Escherichia coli.Lin y Arber esperaban que las enzimas que descubrieron pudieran cortar el ADN en sitios específicos y así producir Tajadas” de ADN, aunque no fue lo que observaron. Posteriormente, Hamilton Smith descubrió una enzima aislada de Haemoplitus influenzae aislada de la cepa R, que cortaba el ADN en un especifico. A esta enzima se le denominó Hind II.

• Las enzimas de restricción tiene como ventaja principal su habilidad al cortar cadenas de ADN de una manera reproducible en los mismos sitios.

• Las dos cadenas de ADN que cortan en forma de “escalera” denominados así por la forma que deja en las cadenas, que hace que los extremos puedan encontrar complementariedad entre si mismo o/y con otros extremos; por lo que se denominan extremos adhesivos. Propiedad que tiene numerosas aplicaciones en técnicas moleculares, como en la Clonación.

1. Cohen y Boyer aprovecharon los extremos adhesivos y empezaron a crear experimentos de clonación.

2. Implementación de 2 plásmidos que conferían resistencia a antibióticos.

3. Utilización de la endonucleasa EcoRI.

Acción de la DNA ligasa.

Formación de un plásmido que incluye

mas resistencia.

Reglas generales de nomenclatura en las enzimas

de restricción

Primera • E. de restricción y endonucleasa de

restricción son sinónimos; se abrevia Reasa- Enasa.

Segunda• Las metiltransferasas (metilasas), tienen

por abreviación MTasa.

Tercera • las tres primeras letras que

corresponden al nombre científico del microrganismo (en cursiva).

•  La cuarta letra a la cepa o estirpe si la hubiese 

Cuarta• En números romanos, se distingue la

presencia de más de una endonucleasa aislada de esa misma especie.

Quinta • El prefijo M, R o RM indica la función de

la enzima Ej. RM. Eco571.

Sexta

Cuando genes codificantes para REasas o MTasas están asociados en un solo

sistema R-M, deben ser referidos con el segundo carácter del prefijo y utilizar

numero arábicos.Ej los productos de dos genes M de HphI de un sistema R-M va a ser M1 HphI y M2

HphI

Septima Los isosquizomeros difieren de los

neoesquizomeros.

Tipos de enzimas de restricción

Tipo I Tipo II Tipo III

Tipo IV

Tipo I

Formado por Proteínas de

múltiples subunidades 2-R;

2M y 1S

Cuando actúan sobre sustratos

no metilados funcionan como

REasas

Cuando se encuentra un sustrato

hemimetilado, el complejo actua como

MTasa. Usa S-adenosilmetionina.

La localización de los sitios de escisión se da

por la colisión y dilatación de dos

complejos durante la translocación.

Endonucleasas de

restricción Tipo II

La nomenclatura que toman se

relaciona con la secuencia que

corta o la estructura que

tiene

Reconocen secuencias de

ADN especificas.

Necesitan Mg como cofactor.

Actuan de manera independiente de las

MTasasLa MTapas transfieren un grupo metil a partir

del S-adenosil-L-metionina.

Reconocen secuencias palindrómicas y realizar

cortan de manera

simétrica

Se encuentran las enzimas que

reconocen secuencias simétricas

Cortan sitios fijos simétricos en la molécula o adyacentes

Tipo IIP

5’ G A A T T C 3’ 3’ C T T A A G 5’

Se encuentran todas las

enzimas de tipo II que reconocen

secuencias asimetricas.

Tienen un gen codificante para una REasa y dos

MTasa

Tipo IIA

Enzimas tipo II B• Corte doble de la secuencia

de reconocimiento.• Ej:• BcgI ( 10/12)S.C ; (12/10)

Escisión

Enzimas tipo IIC • Enzimas hibridas con ambos dominios de

escisión, modificando una sola proteína.• Contienes las IIB,II G Y IIH.

Enzimas tipo IIE y IIT• Interacción con 2 copias de reconocimiento.• Regiones blanco ( escisión/ efecto alexitérico

( Mg++)• Ej: EcoRII• IIT: subunidades heterodimericas

Enzimas Tipo IIF y IIG• IIF: coordinada con 2 secuencias de

reconocimiento.• IIG: 1 solo poli péptido fusionado.( R-M)• AdoMet ( donador del grupo metilo)• Secuencias de reconocimiento variadas.

Enzimas Tipo IIH, IIM y IIS

• IIH: características similares a tipo I y bioquímicamente iguales a tipo II.

• IIM: Secuencias metiladas, Sitio fijo de corte • IIS: Sub categoria de IIA que corta al menos 1 de

las cadenas de DNA fuera de la S.R.

Nicking Enzimas• Reasas de corte incompleto (N 1 chain)• ej: Bpu10I ( inactivación de 1 de las

subunidades).• M5c-Mtasas ( mismatch de apareamiento erróneo

de G/T)

Proteínas de control• Genes adicionales• Codificación de enzimas que regulan la expresión

de Gen R.• Ej: Pvu II Y C.BamHI genes c(ACTIVADORES

TRANSCRIPCIONALES) - acumulación protegiendo REasa.

Endonucleasas Tipo III• Sistemas (Mod/res) SITIO DE reconocimiento• DUO + ATP• DNA no palíndromo y secuencias de forma

inversa,• Corte en secuencia especifica de una de las

copias de secuencia de reconocimiento.• M6A - Hemimetilacion.• EJ: EcoP 1I

Endonucleasas Tipo IV• Solo DNA modificado( metilado, hidroximetilado,

y glucosil/metilado)• EcoKMcrBC: • Reconocimiento de 2 dinucleotidos de la forma

RmC.• 30 bases lejos de reconocimiento

Enzimas Hipotéticas• Similitud o inferencia en secuencias especificas

en un plásmido o DNA bacteriano METILADO.

•P… comprobación P

Sistemas R/M : Formas Mínimas de Vida

• Mantenido en bacterias como defensa a infecciones como: DNA viral, plásmido etc.

• « HIPOTESIS DE DEFENSA CELULAR»

• Muerte celular si hay perdida de sistema o arreglos genómicos para supervivencia. «HIPOTESIS DEL GEN EGOISTA»

• Variación genómica Diagnostico de enfermedades genéticas con cambios en secuencia de DNA ( mutaciones, delecciones o inserciones) o Enf. Infecciosas.