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CROMATOGRAFÍA

Cromatografía es el término con el que se denomina a un conjunto de métodos analíticos utilizados para separar, identificar y cuantificar los componentes de una muestra. Mediante una cromatografía es posible separar analitos muy parecidos entre sí en cuanto a sus propiedades físico-químicas. Por ejemplo nos permite separar mezclas de aminoácidos; mezclas de proteínas; mezclas de ácidos grasos; pigmentos; pesticidas; etc.

¿Por qué cromatografía?

La primera vez que se utilizó el método fue para separar pigmentos vegetales a partir de un extracto de hojas y el resultado obtenido fue una serie de

bandas coloreadas (verdes y amarillas correspondientes a clorofilas y carotenoides) por lo que se denominó al método de separación CROMATOGRAFIA,

término que deriva del griego “chromatos” que significa color (1903, Tswett).

Para realizar una cromatografía se necesitan dos fases (fase estacionaria y fase móvil) y un soporte:

1- Fase estacionaria (FE): será un componente que estará contenido en un soporte adecuado y como su nombre lo indica permanecerá fija en un espacio determinado. Puede ser sólida o líquida. Según qué tipo de soporte que se utilice para contener a la fase estacionaria las cromatografías pueden ser planas o en columna.

2- Fase móvil (FM): será un compuesto químico, o una mezcla sencilla de compuestos químicos y como su nombre lo indica debe fluir (moverse) a través de la fase estacionaria. La fase móvil es la que arrastrará a la muestra obligándola a atravesar la fase estacionaria. Puede ser líquida o gaseosa dando lugar a las denominadas “Cromatografías Liquidas” y “Cromatografías Gaseosas” respectivamente.

Por lo tanto en toda cromatografía hay una fase estacionaria inmovilizada en un soporte y una fase móvil que arrastrará a la muestra a través de la fase estacionaria. Durante este proceso cada componente de la muestra se va a desplazar según sus propias características físico-químicas las que van a determinar que interaccione más con la fase estacionaria o que prefiera a la fase móvil. El concepto general será que aquellos analitos que prefieren a la fase estacionaria son más retenidos, es decir van quedando más atrasados, mientras que aquellos que prefieran a la fase móvil se desplazarán más rápido.

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I- Existen al menos tres maneras de clasificar a las cromatografías: 1- Clasificación de las cromatografías según el estado de agregación de las fases. 2- Clasificación de las cromatografías según el soporte que contiene a la fase estacionaria. 3- Según el mecanismo físicoquímico por el que se produce la separación de los analitos. 1- Clasificación de las cromatografías según el estado de agregación de las fases:

2- Clasificación de las cromatografías según el proceso fisicoquímico que se pone en juego para la separación de los analitos

Nombre Algunas características

Cromatografía de Adsorción FE sólida y FM líquido o gas Los analitos son adsorbidos por el sólido según su polaridad.

Cromatografía de Reparto FE líquido y FM líquido / gas Los analitos se reparten entre dos líquidos según su polaridad.

Cromatografía de intercambio iónico

FE resina (sólido) con grupos unidos covalentemente de carga opuesta al ión que intercambian. Hay resinas de intercambio catiónico (con grupos sulfónicos negativos) y resinas de intercambio aniónico (con grupos aminas cuaternarias positivas). FM líquido Se basa en la atracción entre cargas opuestas.

Cromatografía de Exclusión molecular

FE gel poroso. FM líquido / gas Separa los analitos por tamaños. Los poros del gel serán atravesados por las moléculas pequeñas pero no por las moléculas grandes. Las moléculas pequeñas tardarán másen atravesar la fase estacionaria.

Cromatografía de Afinidad FE especialmente diseñada para atrapar a un soluto en particular. Muy selectiva

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3- Clasificación de las cromatografías según el soporte que contiene a la fase estacionaria:

A continuación podemos observar los esquemas que representan un proceso cromatográfico, es decir la separación de los componentes de una muestra a través de la interacción de los mismos con cada una de las dos fases involucradas, cada banda de color representa a un analito separado:

Cromatografía plana: Cromatografía en columna: (En este caso la fase móvil asciende.) (En este caso la fase móvil desciende) 3.1- Generalidades de las CROMATOGRAFÍAS PLANAS:

De acuerdo al soporte utilizado hay dos tipos de cromatografías planas: cromatografía en papel y cromatografía en capa fina. En ambos casos el soporte puede ser a su vez la fase estacionaria, pero para ello se debe activar el papel o la “capa fina”, lo que quiere decir que se colocarán en una estufa para quitar la humedad ambiente. De lo contrario, la fase estacionaria será una fina película de líquido adsorbido en la superficie del papel o de la capa fina, en general agua (humedad ambiente).

Las cromatografías planas pueden realizarse en forma ascendente o descendente. En la forma ascendente la fase móvil arrastra a la muestra recorriendo la fase estacionaria desde abajo hacia arriba mientras que en la forma descendente el camino será desde arriba hacia abajo. En la cromatografía plana ascendente la fase móvil sube por capilaridad mientras que en la descendente la fase móvil se mueve principalmente por gravedad.

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El parámetro que se mide en una cromatografía plana se denomina relación de frentes, Rf, y representa la distancia que recorre un analito sobre la fase estacionaria respecto a la distancia que recorre la fase móvil en la cromatografía: Rf A = distancia recorrida por el analito A / distancia recorrida por la FM Este parámetro puede tomar valores entre 0 y 1. Cuanto más cercano a 0 es el valor de Rf significa que el analito tiene afinidad por la fase estacionaria (es muy retenido) mientras que cuanto más cercano a 1 sea el valor de Rf significa que el analito tiene más afinidad por la fase móvil, por lo tanto es poco retenido por la fase estacionaria.

En general las cromatografías planas necesitan las siguientes etapas (Figura 1): 1- Siembra de la muestra: consiste en colocar una pequeña cantidad de la muestra a analizar en uno de los extremos del soporte donde está contenida la fase estacionaria. 2- Desarrollo del cromatograma: la fase móvil recorre la fase estacionaria “empujando” a la muestra, cada analito se desplaza a una velocidad diferente. Esta etapa finaliza cuando la fase móvil llegue cerca del otro extremo del soporte. 3- Si los analitos tienen color (por ejemplo los pigmentos vegetales) se puede observar a simple vista la separación de los mismos sobre la fase estacionaria. Si los analitos no tienen color al finalizar el desarrollo no podremos ver la separación, es necesario realizar una etapa de REVELADO para poner en evidencia donde quedó cada analito separado. 4- Cálculo de Rf: realizar las medidas correspondientes para calcular los valores de Rf de cada analito.

Figura 1: El rectángulo representa la fase estacionaria retenida en un soporte plano. La línea trazada cerca del extremo inferior representa la línea de siembra. El círculo azul sin relleno representa la muestra sembrada (1). Es una cromatografía plana ascendente por lo tanto la FM subirá por capilaridad a través de la fase estacionaria durante el desarrollo hasta llegar cerca del extremo superior, a esto se le denomina “frente de la fase móvil” (2). Finalmente se realiza un revelado para observar los analitos separados (3). Se miden las distancias recorridas para obtener el Rf de cada analito. Las distancias se miden desde la línea de siembra hasta el lugar donde llegó cada analito y en el caso de la fase móvil desde la línea de siembra hasta el “frente” donde llegó la fase móvil.

Comentario a tener en cuenta: Muchas veces en las cromatografías

se suele denominar a la fase móvil como solvente, lo cual es cierto

siempre que la cromatografía use como fase móvil un líquido

menos polar que el agua. En esos casos se suele decir “frente del

solvente” en lugar de frente de fase móvil.

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Ejemplo de cálculo del parámetro Rf (relación de frentes):

¿Qué utilidad práctica puede tener una cromatografía plana y su parámetro Rf?

Rf como criterio de NO IDENTIDAD

El valor de Rf es un parámetro que nos permite asegurar la ausencia de un analito en una muestra, pero por si sólo no puede garantizar la presencia del analito. Esto se denomina criterio de NO IDENTIDAD y es una herramienta útil en los análisis para el control del uso de compuestos no permitidos. Ejemplos de aplicación de este concepto: detectar la presencia de pesticidas en frutas y verduras; detectar la presencia de algún metal pesado en pinturas para maderas; detectar algún compuesto que revele adulteración de un producto. Uso del criterio de NO IDENTIDAD para controlar el uso de un pesticida no habilitado en un cultivo de lechuga: 1- Aplicar el criterio de NO IDENTIDAD implica conocer el valor de Rf del analito de interés, en este caso el pesticida no habilitado para lechuga. 2- Se realizan las cromatografías planas de un gran número de muestras: extractos de hojas de lechuga provenientes de la producción que se está controlando. 3- Se analizan los Rf obtenidos en cada muestra de lechuga. 4- Interpretación de resultados:

Si la muestra de lechuga no tiene un valor de Rf que sea igual al del pesticida prohibido podemos asegurar que NO TIENE el pesticida prohibido por lo tanto se acepta la lechuga.

Si alguna muestra de lechuga dio positivo para el pesticida ya que algún componente dio un valor de Rf igual al del pesticida la lechuga se descarta momentáneamente hasta que el resultado se confirme por otro método.

Frente de FM

Posición final

del analito

Punto de

siembra

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3.2- Generalidades de las CROMATOGRAFÍAS EN COLUMNA:

En las cromatografías en columna, se usa como soporte un tubo de vidrio que contiene en su interior una fase estacionaria sólida finamente molida (sacarosa, silicagel, alúmina, resinas activas) o bien un tubo de vidrio relleno con un sólido inerte finamente molido, lo que en conjunto actuará como soporte de una fase estacionaria líquida absorbida en ese sólido. También pueden utilizarse columnas capilares en las cromatografías que tienen FM gaseosa.

Las cromatografías en columna se suelen denominar según la naturaleza de la fase móvil: “Cromatografía líquida” y “Cromatografía gaseosa”. En las cromatografías en columna la fase móvil se desplaza sobre la fase estacionaria por acción de la gravedad y/o por aplicación de una presión para que sea posible la circulación del fluido por el interior de la columna de diámetro pequeño.

Las cromatografías en columna se realizan generalmente utilizando un equipo denominado CROMATÓGRAFO, el que permite obtener un registro de la cromatografía realizada que se denomina CROMATOGRAMA.

Las etapas necesarias para realizar una cromatografía en columna son (Figura 3): 1- Inyección de la muestra: es el equivalente a sembrar la muestra en la cromatografía plana, el lugar de inyección será en un extremo de la columna. 2- Desarrollo de la cromatografía: la fase móvil empuja a los analitos obligándolos a atravesar la fase estacionaria contenida en la columna. Durante este proceso los analitos se separan dentro de la columna. 3- Elución: en las cromatografías en columna es necesario que los analitos separados dentro de la columna lleguen a salir de la columna para poder detectarlos. Se hace circular fase móvil hasta que los analitos se recuperen a la salida de la columna.Por este motivo muchas veces se nombra a la fase móvil como “eluyente”.

Figura 3: Representación esquemática de las etapas de una cromatografía en columna. 1 representa la inyección de la muestra; 2 el desarrollo de la cromatografía y 3 representa la elución de analitos.

El parámetro que se mide en una cromatografía en columna es el tiempo de retención (tr) o el volumen de retención (Vr), ambos parámetros tienen la misma interpretación sólo que se miden en distintas unidades: Tiempo de retención: es el tiempo que transcurre desde que se inyectó la muestra hasta que el analito sale de la columna.

1 2 3 3

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Volumen de retención: es el volumen de FM que circuló por la columna desde que se inyectó la muestra hasta que el analito sale de la columna. Un analito con un bajo tiempo de retención (o volumen de retención) tendrá alta afinidad por la FM, interacciona poco con la fase estacionaria y por lo tanto sale pronto de la columna. Por el contrario, un analito que tiene alta afinidad por la FE será retenido mucho tiempo dentro de la columna y tardará en salir de la misma. Tiempo muerto de la columna: algunas veces en el cromatograma aparece el “tiempo muerto” (tm) o “volumen muerto” (Vm) de la columna que corresponde al primer pico del gráfico y aparece rápidamente (es un tiempo muy corto). Corresponde a un analito que no interacciona con la fase estacionaria y por lo tanto es una medida del tiempo (o volumen de FM) que se necesita para recorrer la columna desde que se inyectó la muestra. Si el cromatograma tiene un dato de tm, todos los tiempos de retención se corrigen respecto a él y se denominan tiempo de retención neto.

Volveremos a estudiar estos conceptos en la sección de la guía: ¿Qué parámetros podemos obtener de un cromatograma?

II- Componentes del CROMATÓGRAFO GASEOSO (Figura 4) (Cromatografía en columna)

En este caso la FM es gaseosa, por lo tanto el recipiente que contiene a la FM (eluyente) es una garrafa con su correspondiente regulador de presión. Antes de llegar a la columna habrá un regulador de flujo que permite controlar a qué velocidad se hará circular la FM a través de la columna. Dentro del horno que nos permite regular la temperatura de trabajo encontramos la columna donde está contenida la FE. En el extremo de la columna próximo al ingreso de la FM se encuentra el inyector, donde se va a colocar la muestra que se analizará. En el extremo opuesto de la columna, que corresponde a la salida de la columna, estará ubicado el detector. Finalmente y nuevamente fuera del horno encontramos el procesador y el registro del CROMATOGRAMA.

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III- Componentes del CROMATÓGRAFO LÍQUIDO (Figura 5) (Cromatografía en columna) En el reservorio de FM, que en este caso es un líquido, está conectada una bomba de alta presión que permite seleccionar con que presión se hará circular la FM líquida a través de la columna que contiene la fase estacionaria. Antes de la columna encontramos el inyector donde se colocará la muestra, luego la columna que contiene a la FE y luego de la columna el detector que permite obtener los datos necesarios para obtener finalmente el CROMATOGRAMA.

ESQUEMA BÁSICO PARA AMBOS CROMATÓGRAFOS

¿Dónde se produce la separación de analitos? IV- CROMATOGRAMA (Cromatografía en columna)

Es el gráfico donde se registran los analitos separados durante el proceso cromatográfico. Este registro se logra mediante un detector ubicado a la salida de la columna del cromatógrafo. El detector dará una señal base (línea de base) cuando por la salida de la columna circule la fase móvil. Cuando la fase móvil contenga un analito la señal

Reservorio de FM

Reservorio de FM Detector Inyector Columna (FE) Registro:

Cromatograma

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del detector se levantará dando lugar a un pico correspondiente al analito que está saliendo con la fase móvil (Figura 6).

Figura 6- Representación esquemática de un cromatograma en el que se obtuvieron tres analitos separados: a, B y C. En el eje Y se grafica la señal del detector y en el eje X se grafica el tiempo en minutos desde que se inyectó lamuestra hasta que sale el analito. En este esquema t1 t2 y t3 representan los minutos a los que salió cada analito (A, B y C respectivamente). En algunos cromatógrafos el cromatograma que se obtiene representa la señal del detector (en el eje Y) en función del volumen de fase móvil que circula desde la inyección de la muestra (en el eje X) en lugar del tiempo que transcurrió desde la inyección de la muestra.

Ejemplo de un cromatograma real obtenido en un cromatógrafo líquido de alta presión (HPLC) (figura 7)

Figura 7- En el eje Y se representa la señal del detector y en el eje X el tiempo en min. Corresponde a la separación de azúcares solubles a partir de un extracto etanólico de pulpa de un fruto.

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¿Qué parámetros podemos obtener en un cromatograma? 1- Tiempo de retención (tr): Es el tiempo que tarda en salir un analito de la columna, este valor se mide en minutos a partir de la inyección de la muestra. Un analito con un tr bajo es un analito que tiene baja afinidad por la fase estacionaria, es decir que es poco retenido en la fase estacionaria. Por el contrario, un tr alto será un analito que tiene gran afinidad por la fase estacionaria y por lo tanto es fuertemente retenido y tardará más tiempo en salir de la columna.

Si el cromatograma representa la señal del detector en función del volumen de fase móvil que circula el parámetro se denomina Volumen de retención (Vr) y se interpreta del mismo modo que el tiempo de retención.

Tiempo muerto (tM): tiempo que tarda en recorrer la columna la fase móvil desde que se inyectó lamuestra. Para determinar el tiempo muerto es necesario agregarle a la muestra un analito que a priori sabemos que no interactúa en absoluto con la fase estacionaria. No todos los cromatogramas tendrán este dato. En aquellos cromatogramas que tienen el valor de tM se calculan los tiempos de retención netos para cada analito restándole el tiempo muerto al valor del tiempo de retención (figura 8).

tR´ = tR - tM Figura 8- Tiempo muerto, de retención y de retención neto.

2- Área bajo el pico: es proporcional a la cantidad del analito al que corresponde ese pico. Podemos decir que cuanto mayor es el área bajo el pico, mayor la cantidad del analito que representa ese pico. Para poder cuantificar es necesario previamente realizar una calibración de la cromatografía (como ocurre con todos los métodos instrumentales) (Figura 9).

Figura 9- Cromatograma del mismo analito pero en cantidades diferentes. A mayor concentración en la solución, mayor el área del triángulo. Para calcular el área se aproxima el dibujo a un triángulo y se calcula el área del triángulo: (base x altura /2)

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3- Ancho en la base del pico (W): se mide en las unidades que se grafican en el eje X (minutos o mililitros) y es un parámetro que permite interpretar si la cromatografía es eficiente para separar prolijamente un analito. Si la cromatografía es eficiente significa que el analito queda concentrado en una porción estrecha de la fase estacionaria contenida en la columna (no existe efecto de “desparramo” dentro de la columna (Figura 10). Concretamente cuanto menor es el ancho de la base del pico más eficiente es la cromatografía (menor efecto desparramo).

Figura 10- Eficiencia de un pico en un cromatograma. Cuanto más finito (agudo) es el pico obtenido para un analito, más eficiente es la cromatografía para ese analito.

La Eficiencia de la cromatografía realizada se puede calcular para cada analito obtenido a partir de los datos del pico correspondiente: tiempo de retención y ancho de la base del pico. Asumiendo que los picos son simétricos alrededor del máximo, asumimos que la eficiencia se calcula con la siguiente fórmula:

Eficiencia = 16 (tr/W)2

4- Resolución de la cromatografía: es un parámetro que nos permite evaluar si los analitos fueron separados correctamente (están resueltos) o si hay desprolijidades en la separación, lo que significa que hay zonas a la salida de la columna donde dos analitos consecutivos salen mezclados. La resolución se calcula a partir de los datos del cromatograma para dos picos consecutivos. Corresponde a la diferencia entre los tiempos de retención divido el promedio del ancho de bases:

Rs = ( trB-trA ) (WA + WB) Rs debe ser ≥1,5 2

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Figura 11- Representación de tres cromatogramas para los analitos A y B. Los analitos se separaron bien en el gráfico inferior donde la resolución (Rs) dio por lo menos 1,5. En los otros dos casos las resoluciones dieron valores menores a 1,5 y como se observa en el dibujo los dos picos no están bien separados.

Una mala eficiencia termina complicando la resolución. Picos anchos aumentan las chances de obtener picos superpuestos (mala resolución). Cuanto más angostos son los picos (picos agudos) mayor la probabilidad de obtenerlos separados. FACTORES QUE AFECTAN LA EFICIENCIA DE UNA CROMATOGRAFIA Básicamente los cuatro factores que determinan la eficiencia de una cromatografía en columna son los siguientes: 1-Naturaleza de la fase estacionaria (calidad del empaquetamiento en caso de columnas rellenas y resistencia a la transferencia de materia que ofrece la FE). 2-Naturaleza de la fase móvil (resistencia a la transferencia de materia que ofrece la FM) 3-Velocidad a la que circula la fase móvil (para cada cromatografía diseñada existirá una velocidad óptima para la circulación de la FM). 4-Temperatura de trabajo (modifica la resistencia a la transferencia de materia de las fases involucradas y modifica el coeficiente de difusión de los analitos). En la práctica estos cuatro factores representan las características del método cromatográfico que podemos cambiar para lograr que los picos anchos de un cromatograma se transformen en picos angostos.

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ACTIVIDADES DE LABORATORIO

1- Cromatografía plana Separación de Fe+3, Ni+2, Cu2 por cromatografía de reparto en papel Se realizará una cromatografía para separar iones metálicos, utilizando un papel de filtro como soporte, una fina película de agua como FE y un”solvente” como FM. Composición de la FM: 17 ml de acetona- 1 ml de agua-2 ml de HCl (concentrado). La cromatografía de papel es un método de reparto o partición que utiliza como soporte de a fase estacionaria la celulosa de una hoja de papel de filtro especial (Whatman o Schleicher & Schull). Procedimiento: Etapas de la cromatografía plana

1- Siembra de la muestra: La muestra se disuelve en un solvente volátil (para que se seque fácilmente) con una concentración de por lo menos 10 mg/ml (10μg/μl). Se utiliza una tira de papel rectangular. Para efectuar la siembra de la muestra sobre el papel se traza con un lápiz la “línea de siembra” a aproimadamente 1cm del extremo de la tira de papel. Mediante una pipeta capilar (0,5 mm de diámetro) se deposita una pequeña gota tal que al extenderse sobre el papel sea de aproximadamente 2 a 3 mm de diámetro. Dejas secar la gota y repetir el procedimiento colocando una segunda gota en el mismo lugar. 2-Desarrollo del cromatograma: Una vez sembrada la muestra, la hoja de papel se coloca dentro de la cámara que está saturada con los vapores de la mezcla de solventes (Fase móvil) que se van a emplear para el desarrollo del cromatograma. Se deja en esas condiciones durante un período variable que se llama periodo de equilibrado, durante el cual el papel se satura sin entrar directamente en contacto con el solvente. Luego se sumerge el borde inferior del papel en el solvente contenido en el fondo de la cuba (cromatografía ascendente). El reparto o partición se lleva a cabo entre el agua (fase estacionaria) retenida por la celulosa del papel y el solvente empleado en el desarrollo del cromatograma (fase móvil). Es decir que a medida que el solvente se desplaza sobre el papel, se produce un reparto o distribución de los analitos de la muestra entre el solvente orgánico (FM) y el agua retenida (FE), lográndose así una separación de los componentes de una mezcla según sus respectivos coeficientes de reparto. Como consecuencia de esto, los componentes es moverán con distintas velocidades. Cuando el frente del solvente (FM) llega a una adecuada distancia del borde superior se retira el papel, se marca con lápiz el “frente del solvente (FM)” se seca y se revela. 3-Revelado del cromatograma: Una vez desarrollado el cromatograma, se rocía el papel seco con una solución alcohólica de dimetilglioxima, exponiendo luego el papel a los vapores de NH3 La aparición de una mancha de color rojo de Ni-dimetilglioxima indica la presencia de Ni+2. Luego se rocía el resto del papel con solución acuosa de ferrocianuro de potasio. La aparición de una mancha azul y de una mancha de color marrón revelan la presencia de Fe+3 (mancha azul de ferrocianuro férrico) y de Cu+2 (mancha marrón ferrocianuro cúprico) respectivamente. Se marcan con lápiz el centro de cada mancha (o la zona donde el color es más intenso). 4- Cálculo de los Rf correspondientes: Todas las distancias se miden desde la “línea de siembra”. Con los datos obtenidos en el papel (distancias medidas con una regla) se podrá calcular las relaciones de frente.

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solventeelporrecorridadistancia

muestralaporrecorridadistanciafR

La relación de frentes Rf se calcula para cada componente midiendo las distancias desde a línea de siembra hasta el centro de la mancha correspondiente a cada analito y desde la línea de siembra hasta el frente del solvente (FM). 5- Interpretación de los resultados

2- Cromatografía en columna Eliminación de la “Dureza de agua” por cromatografía de intercambio iónico

Cromatografía de intercambio iónico: En este tipo de cromatografía se utiliza como FE un sólido particular: una resina que presenta unidos covalentemente muchos grupos de carga opuesta a los iones que se van a intercambiar. Si es una resina de intercambio catiónico tendrá unidos covalentemente grupos negativos (sulfónicos: RSO3 -) mientras que si se trata de una resina de intercambio aniónico, tendrá unidos covalentemente grupos de carga positiva (aminas cuaternarias: NH3

+). La FM en este tipo de cromatografía es un líquido que llevará disueltos a los iones que queremos separar. Por lo tanto cuando la FM empuje a los iones a través de la FE, los analitos de carga opuesta a la fase estacionaria serán atraídos y retenidos por una fuerza electrostática. Reacción química que interpreta el funcionamiento de una resina de intercambio catiónico: R-SO3 H + Ca+2 (R-SO3)2 Ca + 2H+

La condición inicial de la resina será cuando está equilibrada con agua destilada, por lo tanto el grupo sulfónico estará unido a un protón (H+). Cuando intercambie el protón por los cationes calcio tendrá como consecuencia la acidificación el agua. Una vez que la resina se agota (todos los sitios ya fueron intercambiados) se pueden reciclar usando HCl para recuperar la condición inicial.

¿Cómo funcionaría una resina intercambiadora de aniones? ¿Qué pasaría con el agua entonces?¿Cómo la reciclaríamos?

Muchas sustancias sólidas, naturales o sintéticas, pueden emplearse como

intercambiadores de iones. Las arcillas (naturales) son componentes de los suelos que

actúan como intercambiadoras de iones por lo tanto tendrán influencia en la

“disponibilidad de iones”. Las resinas sintéticas de intercambio de iones son polímeros

de alto peso molecular que fueron producidas por primera vez en 1935 y desde entonces

han hallado gran aplicación en el laboratorio y la industria para ablandamiento de

aguas (eliminación de Ca+2 y Mg+2), desionización de aguas, purificación de

soluciones y separación de iones.

En el trabajo práctico se utilizará como soporte una columna de vidrio rellena con una resina de intercambio catiónico (cargada con grupos sulfónicos) la que va a retener fuertemente los iones Ca+2 y el Mg+2 cuando una muestra de agua circule a través de la misma.

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Soporte: Columna FE: resina de intercambio catiónico (sólida) FM: agua La retención de los iones dentro de la columna se pondrá en evidencia mediante el uso de Indicadores metalocrómicos los que permiten fácilmente revelar la presencia o ausencia de los iones Ca+2 y Mg+2.

Procedimiento en el trabajo práctico:

a) Se toman 10 ml de una muestra de agua sin tratar, se agregan 5 ml buffer pH 10 (mezcla de NH4Cl y NH4OH)) y se agrega una pizca de indicador negro de eriocromo. La coloración rojo vinoso indica la presencia de Ca+2 y Mg+2.

b) Se toma otra alícuota de la misma muestra, se hace pasar lentamente por la resina intercambiadora de cationes y se recoge la muestra a la salida de la columna en un vaso de precipitado. Se agregan 5 ml de buffer pH 10 y una pizca de negro de eriocromo. La aparición de una coloración azul indica la ausencia de los cationes Ca+2 y Mg+2, que fueron entonces retenidos por la resina dentro de la columna.

Cuestionario 1. ¿Qué entiende por cromatografía? 2. ¿Cómo puede clasificar los procesos cromatográficos según los ecanismos por los que

se separan los analitos? 3. ¿Cuáles son los componentes básicos de cualquier sistema cromatográfico? 4. ¿Cómo clasifica las técnicas cromatográficas según el estado de agregación de la fase

móvil? 5. ¿Cómo clasifica a las cromatografías según el soporte utilizado? 6. Defina y explique el parámetro que se utiliza en una cromatografía plana y en una

cromatografía en columna asociado a un analito. 7. ¿Cuáles son las partes constitutivas de un cromatógrafo gaseoso? ¿Cuál es el orden de

estos componentes? 8. ¿Qué tipo de columnas pueden utilizarse en la cromatografía gas-líquido? 9. ¿En el caso de las cromatografías en columna a que llamamos cromatograma? ¿Qué

parámetros puedo obtener en el mismo? 10. ¿Cómo se calcula la eficiencia de una cromatografía en base a los datos del

cromatograma? 11. ¿Cómo se calcula la resolución de una cromatografía? ¿Qué significado tiene este

parámetro? 12. ¿Cómo se puede mejorar experimentalmente la eficiencia de una cromatografía en

columna? 13. ¿Qué tipo de cromatografía puede utilizar para ablandar un agua? ¿Qué tipo de

sustancia utiliza como soporte? 14. ¿Cómo funcionan las resinas de intercambio iónico? 15. Una vez agotadas las resinas de intercambio, ¿cómo puede regenerarlas? 16. ¿En la cromatografía de papelque realizó en el trabajo práctico, cuál es fenómeno que

permite la separación? 17. En la cromatografía de papel ¿cuál es la fase estacionaria, la fase móvil y cuál es el

soporte que se emplea?

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18. Explique los procesos de sembrado, desarrollo y revelado del cromatograma en la cromatografía de papel.

19. ¿Qué es el Rf? ¿Para qué se utiliza? ¿Qué valores puede tomar? ¿Qué significan?

Problemas

1- El dibujo muestra los resultados obtenidos en una cromatografía

plana en la que se estudió la presencia de un pesticida (P) en la

cáscara de 3 duraznos (D1, D2 yD3). De acuerdo a los datos

obtenidos, ¿qué puede concluir sobre la posible contaminación de los

duraznos con el pesticida?

2- Los cromatogramas de los compuestos A y B que se muestran en la figura se obtuvieron

empleando dos columnas de la misma longitud y con el mismo caudal

a) ¿Cuál de las dos columnas es más eficiente para los analitos A y B? b) ¿Qué columna tiene mayor resolución?

3- El cromatograma de una mezcla de especies A, B, C y D proporcionó los siguientes datos:

Tiempo de retención en min Ancho de la base en min

No retinada 3,1 -

A 5,4 0,41

B 13,3 1,07

C 14,1 1,16

D 21,6 1,72

Calcular: el tiempo de retención neto, la eficiencia para cada analito y la resolución. A

partir de los resultados obtenidos para la resolución indique si los componentes han

sido separados satisfactoriamente.