INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLGICAS

QUMICO FARMACUTICO INDUSTRIAL

*MTODOS DE ANLISIS E INSTRUMENTACIN ANALTICA*

PROFESORA: MARA AURORA GASCA RODRGUEZ

VALIDACIN DE LA DETERMINACIN DE ALCOHOLEMIA POR CROMATOGRAFA DE GASES CON AUTOMUESTREADOR DE VOLTILES E IDENTIFICACIN DE ACETALDEHDO, ACETONA Y 2-PROPANOL

EQUIPO NO.2LPEZ HERNNDEZ ALEXA ISABELVZQUEZ MARTNEZ YAZMN MARIL

GRUPO: 6FM2

VALIDACIN DE LA DETERMINACIN DE ALCOHOLEMIA POR CROMATOGRAFA DE GASES CON AUTOMUESTREADOR DE VOLTILES E IDENTIFICACIN DE ACETALDEHDO, ACETONA Y 2-PROPANOL1.- INTRODUCCIN.La prevalencia del consumo de alcohol en la poblacin colombiana, es un factor de riesgo que incide negativamente en el orden pblico y privado, comnmente se encuentra presente en delitos como la violencia intrafamiliar, sexuales, hurtos, homicidios y en mayor nmero de casos en accidentes de trnsito. La determinacin de la cantidad de alcohol ingerida por una o varias personas involucradas en un proceso judicial por algn delito, es importante al momento de esclarecer el mismo. Entre los anlisis forenses utilizados internacionalmente para determinar alcohol en humanos, estn: La determinacin de etanol expirado (Alcohol sensor), prueba poco confiable a nivel cuantitativo La determinacin de etanol en sangre total (Alcoholemia) por Cromatografa de Gases. Que junto al examen clnico cuando se trata de personas vivas, pueden dar una aproximacin del estado de embriaguez del delincuente o la vctima al momento de ocurridos los hechos investigados. La alcoholemia indica el nivel de etanol contenido en sangre total, expresado en miligramos de etanol en 100 mililitros de sangre (mg Etanol/100mL de sangre o mg%). Desde el punto de vista analtico, en el anlisis toxicolgico se debe contar con mtodos analticos selectivos y sensitivos para la evaluacin cualitativa y cuantitativa de las sustancias toxicas que conduzcan a una correcta interpretacin forense, teniendo en cuenta que adems de esto una correcta interpretacin, se debe buscar resultados confiables obtenidos bajo rigurosos controles de calidad. La cromatografa de gases HS-GC/FID es la tcnica aceptada internacionalmente para el anlisis de alcoholemia. La metodologa consiste en someter una muestra de sangre a calentamiento controlado, tomar una muestra del vapor generado y hacer la determinacin en la columna cromatogrfica en un cromatgrafo de gases.Por otro lado, se entiende por validacin de un mtodo; como un proceso documentado mediante el cual se demuestra que un procedimiento analtico es idneo y apropiado para el propsito para el cual fue diseado. Tpicamente, los parmetros que se validan en un mtodo analtico son: exactitud, precisin, especificidad, selectividad, linealidad, lmite de deteccin y lmite de cuantificacin. Tambin, en el estudio de validacin se evala la idoneidad del sistema que para mtodos cromatogrficos incluyen: el factor de simetra, determinacin y estabilidad del tiempo de retencin de cada uno de los analitos, la resolucin, el factor de capacidad y el nmero de platos tericos. Estos 11 parmetros permiten determinar la capacidad que tiene el sistema cromatogrfico de arrojar resultados reproducibles cada vez que el mtodo sea aplicado. Se realiza un anlisis estadstico para la interpretacin de los datos obtenidos, en un estudio de validacin, la aplicacin de pruebas como anlisis de varianza (ANOVA), anlisis de regresin lineal, aplicacin t-student, desviacin estndar y coeficiente de variacin, son utilizadas para demostrar la validez del mtodo. La validacin de un mtodo analtico permite conocer la confiabilidad del mismo para su aplicacin rutinaria y es fiable cuando es capaz de conservar los parmetros que se han validado.2.-OBJETIVO GENERAL.Validar la Determinacin de alcoholemia por cromatografa de gases con automuestreador de voltiles e identificacin de acetaldehdo, acetona y 2- propanol en el Instituto Nacional de Medicina Legal y Ciencias Forenses de la ciudad de Pereira, Colombia.3.-METODOLOGA La metodologa se establece con base en el procedimiento estandarizado de trabajo (PET) de la Determinacin de Alcoholemia y metanol por cromatografa de gases con Automuestreador de voltiles e identificacin de acetaldehdo, acetona y 2-propanol, que se encuentra documentado en el Instituto Nacional de Medicina Legal y Ciencias Forenses de la ciudad de Pereira. 4.-MATERIALES Y MTODOS.4.1 MATERIALES Y REACTIVOS.REACTIVOS Etanol Estndar Certificado Primario de las siguientes concentraciones: 25%, 40%, 100%, 150%, 300% y 400%. Etanol Absoluto Grado Reactivo Analtico (R.A.) Metanol R.A. n-Propanol R.A. Isopropanol R.A. Acetona R.A. Acetaldehdo R.A. Cloruro de sodio R.A. Agua destilada y desionizada. EQUIPOS Cromatgrafo de gases con detector de ionizacin de llama (FID), (HP 6890) Automuestreador de voltiles Head Space Thermo Triplus. Sistema de manejo de informacin, estacin de datos cromatogrficos de canal simple Chem Station HP Columna capilar HP Blood Alcohol Anlisis 7.5 metros x 0.320 mm de dimetro interno. Sistema de suministro de gases calidad cromatogrfica: nitrgeno, aire e hidrgeno. Micropipeta de 100 L -1000 L, LABMATE Balanza analtica con divisin de escala 0.0001g MATERIAL DE LABORATORIO Viales de vidrio de 10 mL de capacidad de dimensiones compatibles con el Automuestreador de voltiles Head Space. Septas para viales de polipropileno de 20 mm de dimetro. Balones volumtricos de 50, 100 y 1000 mL Pipetas volumtricas de 3, 5 y 10 mL Puntas para micropipetas de capacidad para 100 y 1000uL Vasos de precipitado de 50 mL 5.-PREPARACIN DE LA MUESTRA. Cuando la muestra para anlisis de alcoholemia es sangre: Debe ser recogida en un tubo tapa gris que contiene fluoruro de sodio como conservante y oxalato de potasio como anticoagulante. Cuando se trata de humor vtreo se recolecta en un tubo de vidrio o de plstico. Colocar en un vial de 10 mL nuevo, 100 mg aproximadamente de cloruro de sodio R.A. Homogenizar la muestra de sangre total con agitacin manual suave. Trasvasar 1 mL de sangre aproximadamente a cada vial. Ubicar los viales en una gradilla sobre hielo seco. Dispensar 100 L de estndar interno (n- propanol) y luego 200 L de sangre total en un vial de 10 mL. Colocar el tapn de polipropileno verificando la hermeticidad manualmente. Cambiar la punta de micropipeta entre la medicin de cada muestra. Agitar vigorosamente la muestra utilizando un vrtex durante aproximadamente 5 segundos Almacenar bajo refrigeracin (Nevera 2 a 10C) hasta el momento de colocarlos en el carrusel del Head Space para el anlisis.6-.ANLISIS Y RESULTADOS. La evaluacin de los parmetros de calidad fue realizada utilizando dos matrices: Una matriz acuosa denominada sistema que se asemeja al humor vtreo, esto se hace debido a que es muy difcil la recoleccin de un volumen suficiente de ste para la preparacin de las soluciones de trabajo. Una matriz de sangre llamada mtodo, en ella se evala la respuesta del anlisis en una de las muestras biolgicas ms utilizadas para la elaboracin de dicha prueba. 6.1 REPETIBILIDAD PARA EL ESTNDAR INTERNO El estndar interno se utiliza en cromatografa de gases con el fin de poder efectuar una determinacin cuantitativa, ya que la cantidad de analito es proporcional a la intensidad del pico, para ello se realiza una curva de calibracin con estndares de concentracin conocida, cada muestra conteniendo el estndar, esta curva es una dependencia entre la relacin de concentraciones y la relacin de reas (Analito / estndar interno), el estndar garantiza una relacin constante de reas con los analitos presentes en la muestra. Por esto se hace necesario inicialmente evaluar la repetibilidad que presenta el estndar interno en cuanto a sus reas y en su tiempo de retencin. El estndar interno n-Propanol, fue preparado el 24 de Junio de 2010. En la tabla no.1 se observa que 21 das despus de su preparacin el estndar presenta una buena repetibilidad, ya que, su desviacin estndar relativa no supera el 5%. Tabla no.1 Datos de repetibilidad para el estndar interno a los 21 das de su preparacin.

7. VALIDACIN.IDONEIDAD DEL SISTEMA CROMATOGRAFICO La idoneidad se establece cuando la seal producida en la etapa de medicin puede ser atribuida nicamente al analito y no a la presencia de algo similar o la coincidencia. Se establecen entonces el tiempo de retencin del analito (tr), el coeficiente de capacidad (k), simetra, y resolucin (R). Estos parmetros se evalan usando el nivel 3 de la curva de calibracin secundaria el cual contiene la totalidad de los analitos estudiados. El cromatgrafo de gases fue operado en las condiciones que se describen en la Tabla no. 2.

Tabla no.2: Condiciones cromatogrficas para la validacin del mtodo.

IDONEIDAD DEL SISTEMA CROMATGRAFICO Y ESPECIFICAD Para determinar la idoneidad y especificidad del sistema cromatogrfico se realiz un anlisis de estadstica extendida sobre un cromatograma correspondiente al nivel 3 de la curva (mostrado en la figura 1), ya que en l se presentan todos los analitos de inters, los datos presentados en la Tabla no. 3 son un promedio de los valores reportados en el anexo 1 que son extrados directamente del equipo.

Tabla no.3 Parmetros cromatogrficos para los analitos estudiados.

En la Tabla no. 3, se puede observar que los tiempos de retencin para cada analito presentan coeficiente de variacin inferior a 0.035%. El factor de capacidad tiene un rango de aceptacin entre 2 y 10, rango que se cumple para todos los analitos excepto para el n-propanol aunque no se considera significativo, ya que excede muy poco el rango. Para todos los analitos se cumple que la simetra es menor de 1, lo que indica que no existen colas en los picos cromatogrficos. Se muestra que el nmero de platos tericos es significativamente alto, en pruebas anteriores con una columna desgastada se present el traslape de los picos de acetaldehdo y metanol, caracterstica que puede servir como un indicador de deterioro de la columna. En cuanto a la resolucin se sabe que lo ideal es que sea mayor de 2, criterio que aceptan todos los analitos, para el metanol no aplica la resolucin, ya que es el primer pico que se encuentra despus del tiempo muerto. Segn estos resultados se puede considerar que el sistema cromatogrfico es idneo y especifico.SELECTIVIDAD.Se realizaron corridas de cada analito por separado y de algunos solventes voltiles para verificar los tiempos de retencin y determinar posibles interferencias.Tabla no.4. Parmetros y criterios de selectividad.

Tabla no.5. Tiempos de retencin de los analitos de inters.

*Cada dato corresponde al promedio de tres mediciones.

Tabla no.6: Tiempos de retencin para los solventes estudiados.

De la tabla anterior se determina que no se present ninguna interferencia entre los analitos de inters y analitos voltiles como acetonitrilo, alcohol isoamlico, n-butanol, hexano, tolueno y acetato de etilo. Para garantizar que no se traslapaba el pico del acetonitrilo, que fue el nico solvente que mostr respuesta a un tiempo de retencin de 1.73 se realiz una sobreposicin del cromatograma de este solvente con un cromatograma del etanol, como se muestra en la Figura no. 2. (El pico azul corresponde al etanol y el rojo es el correspondiente al acetonitrilo.

8.-CONCLUSIONES. Se valid el mtodo a las condiciones indicadas del Head Space y Cromatgrafo de Gases con detector de ionizacin de llama HS/GC/FID HP 6890 con la columna capilar HP Blood Alcohol Anlisis 7.5 metros x 0.320 mm de dimetro interno. De manera isotrmica. En la Tabla no. 3, se puede observar que los tiempos de retencin para cada analito presentan coeficiente de variacin inferior a 0,035%. Para todos los analitos se cumple que la simetra es menor de 1, lo que indica que no existen colas en los picos cromatogrficos. Segn estos resultados se puede considerar que el sistema cromatogrfico es idneo y especifico. Se considera que el sistema cromatogrfico es selectivo.

REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS.HENAO BETANCUR L., VACA DUQUE E. 2010. VALIDACIN DE LA DETERMINACIN DE ALCOHOLEMIA Y METANOL POR CROMATOGRAFA DE GASES CON AUTOMUESTREADOR DE VOLTILES E IDENTIFICACIN DE ACETALDEHDO, ACETONA Y 2-PROPANOL. UNIVERSIDAD TECNOLGICA DE PEREIRA FACULTAD DE TECNOLOGA QUMICA INDUSTRIAL.PEREIRA, COLOMBIA.