CROMATOGRAFA DE INTERCAMBIO INICO La cromatografa de intercambio inico es un mtodo de separacin que permite la separacin de molculas basada en sus propiedades de carga elctrica. Se compone de dos fases, la fase estacionaria y la fase mvil. La fase estacionaria insoluble lleva en la superficie cargas electrostticas fijas La fase mvil suele ser una disolucin acuosa con cantidades moderadas de metanol u otro disolvente orgnico miscible con agua que contiene especies inicas en forma, generalmente de buffer. El principio bsico de la cromatografa de intercambio inico es que las molculas cargadas se adhieren a los intercambiadores de forma reversible de modo que dichas molculas pueden ser unidas o desunidas cambiando el ambiente inico. La separacin inica se realiza por lo general, en dos fases: en la primera las sustancias a separar se unen al intercambiador utilizando condiciones que originan una unin fuerte y estable; a continuacin, se eluye de la columna con tampones de diferentes pH o diferente fuerza inica, compitiendo los componentes del tampn con el material, por los sitios de unin. INTERCAMBIADORES INICOS Un intercambiador inico es, por lo general, un polmero que tiene grupos cargados unidos. Si un grupo est cargado negativamente, podr intercambiar iones positivos y ser un intercambiador de cationes o catinico. Un grupo tpico que se es el grupo sulfnico, SO3-. Si se une un H+ al grupo, se dice que el intercambiador se encuentra en forma cida, y puede por ejemplo intercambiar un H+ por un Na+ o dos H+ por un Ca2+. El grupo cido sulfnico es un intercambiador de cationes fuertemente acido. Otros grupos de utilizacin corriente son el carbonilo e hidroxilo fenlico, dos intercambiadores catinicos dbilmente cidos. Si el grupo cargado es positivo es un intercambiador de aniones o aninico fuertemente bsico. Los intercambiadores aninicos dbilmente bsicos ms corrientes son grupos aminos alifticos o aromticos. La matriz puede estar hecha de diferentes materiales. Los de uso ms corriente son el dextrano, la celulosa y copolmeros del estireno y divinilbenceno La eleccin entre intercambiadores fuertes o dbiles est basada en el efecto del pH sobre la carga y la estabilidad. Por ejemplo, si se va a cromatografiar una sustancia dbilmente cida que necesita pH muy altos o muy bajos para su ionizacion, se requiere un intercambiador fuerte debido que este funciona a pH extremos Los intercambiadores de celulosa han probado ser los mejores para la purificacin de molculas grandes como protenas y polinucletidos. PROCEDIMIENTO

1. Para realizar una cromatografa de intercambio inico son necesarios los siguientesmateriales: (1) Columna de vidrio, (2) Matriz de intercambio inico (Resina), (3) Eluyente, (4) Muestra a fraccionar y (5) Colectores La mayora de los experimentos basados en esta tcnica estn basados en 4 etapas

1. Equilibrio: El primer paso es el equilibrio de la fase estacionaria con las condiciones iniciales deseadas. Cuando el equilibrio se ha logrado, toda la fase estacionaria se encuentra asociada a iones complementarios (que pueden ser cloro o sodio). Por ejemplo, un intercambiador catinico sulfonado asociado a Na+ producto de la disociacin de NaOH. 2. Aplicacin y Lavado: El paso siguiente es aplicar la muestra la cual queremos filtrar a travs de la columna mediante un lavado especfico. Para ello es necesario aplicar un buffer con el mismo pH y fuerza inica que el buffer inicial para que todas las protenas cargadas se unan al intercambiador. Por ejemplo: A la forma sdica de la resina lavada se le aade una solucin cida (pH=3) de la mezcla de aminocidos; a dicho pH los aminocidos se encuentran en forma de cationes con carga neta positiva. Los aminocidos catinicos tienden a desplazar algunos de los iones ligados a las partculas de resina. A pH 3 los aminocidos ms bsicos se unirn a la resina de forma ms estrecha y los ms cidos o menos bsicos, se unirn menos. 3. Elusin: Las molculas captadas por el intercambiador son eludas debido a cambios en la composicin del buffer. Una manera comn es incrementando la fuerza inica con cloruro de sodio u otra sal comn. Los aminocidos sern eludos dependiendo de la carga neta que estos posean. A medida que se aumenta gradualmente el pH y la concentracin de NaCl del medio eluyente acuoso, los aminocidos descienden en la columna a velocidades diferentes y pueden recogerse en muchas pequeas fracciones. La disminucin del pH protonar a los grupos de los aminocidos por lo que su carga neta tender a ser positiva, al revs si se aumenta el pH. Si se aumenta la concentracin de sal, sus iones competirn mucho ms por la resina y se intercambiarn por los grupos de aminocidos. Las diversas fracciones pueden analizarse cuantitativamente mediante la reaccin con ninhidrina. Los aminocidos aninicos aparecen primero y los ms catinicos aparecen posteriormente (con un intercambiador catinico). 4. Regeneracin: Por ltimo, remover las partculas que an estn asociadas al intercambiador. Para ello se debe generar un cambio ms drstico en el pH y la concentracin salina. Ahora la fase estacionaria puede volver a ser utilizada. FACTORES QUE AFECTAN LA RETENCIN Tiempo de retencin (Tr): se describe como el tiempo que transcurre despus de la inyeccin de la muestra hasta que la mayor concentracin del analito alcanza el detector (cuando se ha separado todo el analito), es decir, el tiempo que un compuesto tarda en salir de la columna. En la cromatografa de intercambio inico la retencin est basada en la atraccin entre iones del soluto y la carga complementaria de la fase estacionaria pH: Los intercambiadores inicos se clasifican en cidos o bsicos, fuertes o dbiles. Las resinas cidas fuertes siguen ionizadas incluso en disoluciones muy cidas, en cambio las resinas cidas dbiles se protonan a un pH prximo a 4 y pierden su capacidad de intercambio catinico, reducindose as, el tiempo de retencin. Los grupos muy bsicos de amonio cuaternario siguen

siendo catinicos a cualquier valor de pH. Los bsicos dbiles de amonio terciario se desprotonan en disoluciones moderadamente bsicas y pierden entonces su capacidad, reducindose tambin el tiempo de retencin. Cargas: La fuerza de enlace de la muestra depende de la magnitud de la carga. La fuerza de retencin es mayor y, por consiguiente la de elusin es menor, mientras ms cargado se encuentre el compuesto, ya sea negativa (aniones) o positivamente (cationes). Los iones polivalentes se unen con mayor fuerza a la fase estacionaria que los monovalentes. Gradiente: Aumentando la concentracin de la fase mvil, los iones compiten cada vez ms favorablemente con la muestra por los sitios activos cargados de la fase estacionaria. Porosidad: El tamao del poro de la resina al que se une el compuesto mvil por intercambio inico influye directamente en la capacidad de unin. En membranas cuyo tamao de poro es pequeo (menor de 600) no hay espacio suficiente para unir el in dentro de dichos poros por lo que la cantidad de intercambiador por unidad de superficie es menor. Sin embargo, en membranas con tamao de poro mayor (mayor de 600) se puede unir el compuesto mvil dentro de dichos poros, con lo que se incrementa la cantidad de intercambiador por unidad de superficie. La porosidad busca una mayor superficie de intercambio. Supresor es de iones: La cromatografa inica tard en desarrollarse debido a la falta de un buen sistema de deteccin. La eleccin evidente es un detector conductimtrico. El problema es debido a la elevada concentracin inica necesaria para eluir a la mayora de los iones en un tiempo razonable. Ello hace que la conductibilidad de la propia fase mvil sea muy elevada haciendo muy difcil la deteccin de pequeas concentraciones de analito. Este problema se resolvi mediante un sistema supresor de conductibilidad colocado a la salida de la columna cromatogrfica. Los primeros supresores fueron columna de intercambio inico que convierten los iones del disolvente en especies moleculares poco ionizadas y por lo tanto poco conductoras. As, por ejemplo, cuando se separan cationes es frecuente emplear una disolucin de HCl como eluyente. La columna supresora es anionica y contiene iones OH-. Al paso de la fase mvil por la columna supresora los Cl- son intercambiados por iones OH-. De este modo se ha sustituido el HCl muy conductor por H2O poco conductora. En la separacin de iones es frecuente usar HCO3Na y CO3Na2 en la fase mvil. La columna supresora es en este caso catinica. De este modo el Na+ es sustituido por H+ formndose un electrolito dbil como H2CO3.