CROMATOGRAFIA DE REPARTO

La cromatografía de reparto ha llegado a ser el tipo de cromatografía más

utilizado de las cuatro modalidades de cromatografía de líquidos. En el pasado

la mayoria de a las aplicaciones se han referido a compuestos polares, no

iónicos, de baja a moderada masa molecular (habitualmente < 3000). Sin

embargo, recientemente se han desarrollado algunos metodos( derivitalización

y formación de pares iónicos) que han extendido las separaciones de reparto a

los compuestos iónicos.

La cromatografía de reparto se puede subdividir en cromatografía liquido-

liquido y cromatografía de fase unida químicamente.la diferencia entre estas

tecnicas radica en la forma que se retiene la fase estacionaria sobre las

particula soporte del relleno. En liquido-liquido, la fase estacionaria líquida se

retiene sobre la superficie del soporte por adsorción física. En fase unida

químicamente, la fase estacionaria se une quimicamente a la superficie del

soporte.En la actualidad los métodos de fase unida químicamente son los que

predominan debido a las desventaja de los sistemas líquido-líquido.una de

esas desventajas es la perdida de la fae estacionaria por disolución en fase

movil, lo que hace necesario un peiódico recubrimiento de las particulas del

soporte. Por otra parte el problema de la solubilidad, de la fase estacionaria

impide el uso de los rellenos de la fase líquida en la elución con gradiente.

La cromatografía de reparto es hoy en día el método más utilizado. La

cromatografía de reparto se divide en “fase normal”, y “fase reversa”, cuyas

principales diferencias radican en las distintas polaridades de sus fases

estacionarias y móviles.

COLUMNAS PARA LA CROMATOGRAFÍA DE FASE UNIDA QUIMICAMENTE

Los soportes para casi todos los rellenos de fases unidas químicamente se

separan con sílice rígida o composiciones constituidas básicamente por sílice.

Estos sólidos están formados por partículas mecánicamente resistentes,

porosos y uniformes, con diámetros de 3.5 o 10 µm. La superficie de la sílice

totalmente hidrolizada (hidrolizada por calentamiento con HCl 0.1m durante uno

o dos días) está constituida por grupos silanol químicamente reactivos. Es

decir:

Las superficies de sílice características contienen cerca de 8µmol/m2 de

grupos OH.

Los recubrientos de fase unida químicamente más utilizados son los siloxanos,

que se forman por reacción de la superficie hidrolizada con un

organoclorosilano. Por ejemplo:

Donde R es un grupo alquilo o un grupo alquilo sustituido.

El recubrimiento de la superficie por sililación se limita a 4µmol/m2 o menos a

causa de los efectos esféricos. Los grupos SiOH que no han reaccionado,

desafortunadamente proporcionan una polaridad indeseable a la superficie, lo

que origina picos cromatograficos con cola en especial con los solutos básicos.

Para reducir este efecto, los rellenos de siloxano muchas veces desactivan por

un proceso de bloqueo mediante reacción de clorotrimetilsilano, el cual, debido

a su peuqño tamaño, puede unirse químicamente a muchos de los grupos

silanol que no habían reaccionado.

CROMATOGRAFÍA EN FASE NORMAL

Inicialmente, la cromatografía de líquidos utilizaba fases estacionarias de

elevada polaridad tales como el agua o el trietilenglicol soportadas sobre

paraticulas de sílice o alúmina; y como fase móvil se emplea un disolvente

relativamente apolar con el hexano o el iso-propileter. Por razones históricas, a

este tipo de cromatografía se le conoce ahora como cromatografía de fase

normal.

En esta cromatografía a diferencia de en fase reversa, la fase estacionaria es

polar y la móvil apolar. Las fases estacionarias se obtienen haciendo

reaccionar químicamente los centros silanoles activos de la sílice con un

trialquilclorosilano.

La retención también (como la de fase reversa) tiene lugar en esa especie de

capa líquida depositada químicamente, como consecuencia de la distinta

solubilidad relativa en la fase estacionaria (polar) y la fase móvil (apolar).

Donde el analito menos polar será el primero que se eluye y el más polar el

último en eluir.

Se deduce que los analitos A, B, C tardan más tiempo en eluirse si se usa una

fase móvil poco polar. Es decir, cuanto más polar sea el analito, más tardará en

eluir.

CROMATOGRAFÍA EN FASE INVERSA

En la cromatografía de fase inversa su fase estacionaria en apolar (con

frecuencia un hidrocarburo), y la fase móvil polar (como el agua, el metanol o el

acetonitrilo). Las fases estacionarias han sido obtenidas haciendo reaccionar

químicamente los centros silanoles activos de la sílice con un

trialquilclorosilano.

La retención se produce en esta especie de capa líquida depositada

químicamente como consecuencia de la distinta solubilidad relativa entre la

fase estacionaria (apolar) y la fase móvil (polar).

Los compuestos más retenidos son los más apolares. La retención y

selectividad se controlan fundamentalmente con la composición de la fase

móvil. Para obtener una fase móvil de fuerza de elución óptima, se ensayan

mezclas de metanol, acetonitrilo o tetrahidrofurano en agua.

Las polaridades de los solutos son A> B > C

Actualmente, el 75% de los análisis con HPLC se realizan en fase inversa.

Permite un análisis directo de muestras acuosas y de compuestos solubles en

agua o en disolventes relativamente polares (metanol) y con peso molecular no

superior a 2000 o 3000 ua.

Si se compara con la de adsorción, su comportamiento cromatográfico es

excelente.

SELECCIÓN DE LA COLUMNA EN LAS ESPARACIONES POR

CROMATOGRAFIA DE REPARTO

Una cromatografía exitosa con fases móviles interactivas requiere un equilibrio

adecuado entre la fuerzas intermoleculares existentes entre los tres

participantes activos en el proceso de la separación ( el soluto, la fase móvil y

la fase estacionaria).

Estas fuerzas intermoleculares se describen cualitativamente en términos de

polaridad relativa. Las polaridades en orden creciente para varios grupos

funcionales del analito son: hidrocarburos<éteres<ésteres<cetonas

<aldehídos< amidas <aminas< alcoholes. El agua es más polar que cualquier

compuesto que contenga alguno de los anteriores grupos funcionales.

Al elegir una columna para una separación por cromatografía de reparto, la

polaridad de la fase estacionaria ha de ser bastante similar a la de los

amnalitos, y para la elución se utiliza entonces una fase móvil con una

polaridad considerablemente distinta.

SELECC IÓN DE LA FASE MOVIL EN LA CROMATOGRAFIA DE REPARTO

Propiedades de las fases móviles cromatografícas más comunes

APLICACIONES DE LA CROMATOGRAFÍA DE REPARTO

Como aplicaciones de la cromatografía de reparto en productos de

alimentación: edulcarantes artificiales, antioxidantes, aflatoxinas, aditivos en

bebidas refrescantes, colorantes, aminoácidos, proteínas, carbohidratos,

lípidos.

CROMATOGRAFIA DE ADSORCION

La cromatografía de adsorción, o líquido- sólido, es la forma clásica de

cromatografía de líquidos que introdujo Tswett por primera vez a principios del

siglo XX. Más recientemente, se ha adaptado para llegar a convertirse e un

método importante de HPLC.

Las unicas fases que se utilizan en HPLC líquido- solido son la sílice y la

alúmina, siendo la primera la que se prefiere para la mayoría, cuando no todas,

las aplicaciones debido a su mayor capacidad de carga y a su mayor diversidad

de presentaciones. Con pocas excepciones, las carateristicas de adsorción de

los dos adsorbentes son similares. Con ambas, el orden de los tiempos de

retencion es : olefinas< hidrocarburos aromáticos< haluros, sulfuros< éteres

<nitroderivados< ésteres ≈ aldehídos ≈ cetonas< alcoholes ≈ aminas< sulfonas

<sulfoxidos< amidas <ácidos carboxilicos.

SELECCIÓN DEL DISOLVENTE EN CROMATOGRAFIA DE ADSORCION

Afortunadamente en la cromatografía de adsorción, las modificaciones del

disolvente provocan una gran variación en la resolución y en el tiempo de

retención, y solo en raras ocasiones no se puede encontrar la fase movil

adecuada.

ELECCION DE LOS DISOLVENTES

El procedimiento para la elección del disolvente en cromatografía de adsorción

es esmejante al descrito para las separaciones de reparto. Es decir, se eligen

dos disolventes compatibles, uno de los cuales es demasido fuerte y el otro que

es demasiado debil.

APLICACIONES DE LA CROMATOGRAFIA DE ADSORCION

La figura 28-1 ilustra como la cromatografía de adsorción es la más adecuada

para compuestos no polares probablemente con masa moleculares inferiores a

5000. Los métodos de cromatografía de adsorción y los de reparto tienden a

ser complementarios, aunque en algún caso se superponen.

En general, la cromatografía líquido-sólido es más adecuada para muestras

que son solubles en disolventes no polares, y por tanto tienen una solubilidad

limitada en los disolventes acuosos que son los que utilizan en los

procedimientos de reparto en fase inversa. Como en cromatografía de reparto,

los compuestos que tienen distintos grupos funcionales por lo general se

pueden separar. Una característica particular de la cromatografía de adsorción,

que no es compartida con otros métodos, es su capacidad para diferenciar

compuestos isómeros.