CROMATOGRAFIAHistórico

M. TSWEET (1903): Separación de diferentespigmentos vegetales en columnas rellenadas con

adsorventes sólidos y solventes variados.

éter depetróleo

CaCO

3

mistura depigmentos

pigmentosseparados

Cromatografia =kroma [color] + graph [escribir]

(griego)

CROMATOGRAFIAModalidades y Clasificación

FM = Líquido

FM = Gas

CromatografiaLíquida

CromatografiaGasosa (CG)

En CG a FEpuede ser:

Sólida

Líquida

CromatografiaGas-Sólido (CGS)

CromatografiaGas-Líquido (CGL)

Cromatógrafo Gaseoso

1

2

3

4

6

5

1 - Reservorio de Gas y Controles de Vapor / Presión.2 - Injetor (Vaporizador) de Amostra.3 - Columna Cromatográfica.4 - Detector.5 – Amplificador de Señal.6 - Registro de Señal (Registrador con Computadora).

Observación: en rojo: temperatura controlada

INSTRUMENTACIÓNGas de Arraste

Fase Móvil en CG: NO interacciona con la mues-tra - apenas se desliza a través de la columna.

Siendo usualmente referida como GAS DE GAS DE ARRASTEARRASTE

Requisitos:

INERTE No debe reaccionar con la muestra, fase estacionaria o superfícies del instrumento.

PURO Debe ser exento de impurezas que puedan degradar la fase estacionaria.

Impurezas típicas en gases y sus efectos:

oxida / hidroliza algunas FE

incompatibles con el DCEH2O, O2

hidrocarbonetos ruído sin señal del DIC

INSTRUMENTACIÓNGas de Arraste

Requisitos:

COSTO Gases de altísima pureza pueden ser muy caros.

COMPATIBILIDAD CON EL DETECTOR Cada detector demanda um gas de arraste específico

para mejor funcionamiento.

Selección de Gases de Arraste en Función del Detector:

He , H2DCT

DIC N2 , H2

DCE N2 (SS), Ar + 5% CH4

CO

ST

O

PUREZA

AB

CA = 99,995 % (4.5)

B = 99,999 % (5.0)

C = 99,9999 % (6.0)

INSTRUMENTACIÓNAlimentación del Gas de Arraste

Componentes necesarios en la linea de gas:

controladores de vapor / presión de gas

dispositivos para purificación de gas (“traps”)

1

2

34

5

6

1 - Cilindro de Gas2 - Regulador de Presión Primario

3 - “Traps” para eliminar impurezas del gas4 - Regulador de Presión Secundario

5 - Regulador de Vapor (Controlador Diferencial de Flujo)6 - Medidor de Vapor (Rotametro)

Nota: Tubos y Conecciones: Acero Inox o Cobre

INSTRUMENTACIÓNInyector “en-columna” Convencional

1

2

3

4

1 - Septo (silicona)2 - Alimentación de gas de arraste3 - Bloque metálico caliente4 - Punta de columna cromatográfica

INSTRUMENTACIÓNInyección “en-columna” de líquidos

1 2 3

1 - Punta de aguja de microjeringa introducida al inicio de la coluna.

2 – La muestra inyectada y vaporizada instantaneamente al inicio de la columna.

3 - “Plug” de vapor de mustra forzado para gas de arraste a fluir por la columna.

INSTRUMENTACIÓNParametros de Inyección

TEMPERATURA DE INYECTOR Debe ser sufi-cientemente elevada para que la muestra se vaporice imediatamente, sin descomposición

Regla Gral: Tinj = 50oC encima de la temperatura de ebulición del componente

menos volátil

VOLUMEN INYECTADO Depende del tipo de columna y del estado físico de la muestra

Columna empaq.

muestrasGasosas

muestrasLíquidas

= 3,2 mm (1/4”)0,1 ml ... 50 mL0,2 L ... 20 L

capilar = 0,25 mm 0,001 ml ... 0,1 mL0,01 L ... 3 L

Sólidos: convencionalmente se disuelve en un solvente adecuado y se inyecta la solución

INSTRUMENTACIÓNMicrojeringas para Inyección

LÍQUIDOS Capacidades típicas: 1 L, 5 L e 10 L

êmbolo

cuerpo (pirex)

aguja (inox 316)

Microjeringa de 10 L:

Microjeringa de 1 L (sección ampliada):

cuerpo

guia

embolo

aguja

INSTRUMENTACIÓNColmunas: Definiciones Básicas

EMPAQUETADA = 3 a 6 mm

L = 0,5 m a 5 mRelleada con sólido pul-verizado (FE sólida o FE líquida depositada sobre las partículas de relleno)

CAPILAR = 0,1 a 0,5 mmL = 5 m a 100 m

Paredes internas recubier-tas con un film fino

(fracción de m) de FE líquido o sólido

INSTRUMENTACIÓNTemperatura de la Columna

TE

MP

ER

AT

UR

A D

E L

A

CO

LU

MN

A

CONTROL CONFIABLE DE LA TEMPERATURA DE LA COLUMNA ES ESENCIAL PARA OBTENER BUENA

SEPARACIÓN EN CG

INSTRUMENTAÇÃOForno da Coluna

Características Desejáveis de um Forno:

FÁCIL ACESSO À COLUNA A operação de troca de coluna pode ser frequente.

AQUECIMENTO E ESFRIAMENTO RÁPIDO Importante tanto em análises de rotina e durante o desenvolvimento de metodologias analíticas novas.

TEMPERATURA ESTÁVEL E REPRODUTÍVEL

A temperatura deve ser mantida com exatidão e precisão de ± 0,1°C.

Em cromatógrafos modernos (depois de 1980),o controle de temperatura do forno é totalmente

operado por microprocessadores.

INSTRUMENTAÇÃOProgramação Linear de Temperatura

Misturas complexas (constituintes com volatilidades muito diferentes)

separadas ISOTERMICAMENTE:

TCOL BAIXA:

- Componentes mais voláteis são separados

- Componentes menos volá-teis demoram a eluir, saindo

como picos mal definidos

TCOL ALTA:

- Componentes mais volá-teis não são separados

- Componentes menos volá-teis eluem mais rapidamente

INSTRUMENTAÇÃOProgramação Linear de Temperatura

A temperatura do forno pode ser variada linearmente durante a separação:

Consegue-se boa separação dos

componentes da amostra em menor

tempo

TEMPO

TE

MP

ER

AT

UR

A

tINI tFIM

TINI

TFIM

R

Parâmetros de uma programação de temperatura:

TINI Temperatura Inicial

TFIM Temperatura Final

tINI Tempo Isotérmico Inicial

tFIM Tempo Final do Programa

R Velocidade de Aquecimento

INSTRUMENTAÇÃOProgramação Linear de Temperatura

Possíveis problemas associados à PLT:

VARIAÇÕES DE VAZÃO DO GÁS DE ARRASTE A viscosidade de um gás aumenta com a temperatura.

viscosidade vazão

DERIVA (“DRIFT”) NA LINHA DE BASE Devido ao aumento de volatilização de FE líquida

INSTRUMENTAÇÃODetectores

Dispositivos que examinam continuamente o material eluido, gerando sinal quando da pas-

sagem de substâncias que não o gás de arraste

Gráfico Sinal x Tempo = CROMATOGRAMAIdealmente: cada substância separada aparece

como um PICO no cromatograma.

INSTRUMENTAÇÃODetectores

Mais Importantes:

DETECTOR POR CAPTURA DE ELÉTRONS

(DCE OU ECD) Supressão de corrente causada pela absorção de elétrons por eluatos altamente eletrofílicos.

DETECTOR POR CONDUTIVIDADE TÉRMICA

(DCT OU TCD) Variação da condutividade térmica do gás de arraste.

DETECTOR POR IONIZAÇÃO EM CHAMA (DIC

OU FID) Íons gerados durante a queima dos eluatos em uma chama de H2 + ar.

REGISTRODE

SINAL

ANALÓGICORegistradores XY

DIGITALIntegradores

Computadores

FASES ESTACIONÁRIASConceitos Gerais

LÍQUIDOS Depositados sobre a superfície de: só-lidos porosos inertes (colunas empacotadas) ou de tubos finos de materiais inertes (colunas capilares)

FElíquida

SUPORTESólido inerte

poroso

Tubo capilar de material inerte

SÓLIDOS Colunas recheadas com material finamente granulado (empacotadas) ou depositado

sobre a superfície interna do tubo (capilar)

Para minimizar a perda de FE líquida por volatilização, normalmente ela é:

Entrecruzada: as cadeias poliméricas são quimicamente

ligadas entre si

Quimicamente ligadas: as cadeias poliméricas

são “presas” ao suporte por ligações químicas

FASES ESTACIONÁRIASCaracterísticas de uma FE ideal

SELETIVA Deve interagir diferencialmente com os componentes da amostra.

Regra geral: a FE deve ter características tanto quanto possível próximas das dos solutos a serem

separados (polar, apolar, aromático ...)

FE Seletiva: separação

adequada dos constituintes da

amostra

FE pouco Seletiva: má resolução

mesmo com coluna de boa eficiência

FASES ESTACIONÁRIASCaracterísticas de uma FE ideal

AMPLA FAIXA DE TEMPERATURAS DE USO Maior flexibilidade na otimização da separação.

BOA ESTABILIDADE QUÍMICA E TÉRMICA Maior durabilidade da coluna, não reage com componentes da amostra

POUCO VISCOSA Colunas mais eficientes (menor resistência à transferência do analito entre fases)

DISPONÍVEL EM ELEVADO GRAU DE PUREZA Colunas reprodutíveis; ausência de picos “fantasma” nos cromatogramas.

FASES ESTACIONÁRIASFE Sólidas: Adsorção

O fenômemo físico-químico responsável pela

interação analito + FE sólida é a ADSORÇÃO

A adsorção ocorre na interface entre o gás de arraste e a FE sólida

ADSORÇÃO

Sólidos com grandes áreas superficiais (partículas finas, poros)

Solutos polares

Sólidos com grande número de sítios ativos (hidroxilas, pares de eletrons...)

COLUNAS EMPACOTADASDefinições Básicas

Tubo de material inerte recheado com FE sólida gra-nulada ou FE líquida depositada sobre suporte sólido.

MATERIALDO

TUBO

ø = 3 mm a 6 mm

L = 0,5 m a 5 m

aço inox

vidro pirex

níquel

TEFLON

Granulometriado

recheio80 - 100 mesh 149 - 177 m

100 - 120 mesh 125 - 149 m

60 - 80 mesh 177 - 250 m

MESH dp

Eficiência maximizada com:

- Diminuição de dC

- Diminuição de dp

- Recheio regular

Limitados pela resistência à passagem de gás de arraste

COLUNAS EMPACOTADASFE Líquidas: Suporte

A FE líquida deve ser disposta sobre um

SUPORTE sólido

área superficial entre 0,5 e 10 m2.g-1

microporos regulares (~ 1 m)

NÃO interagir com a amostra

boa resistência mecânica

Uso quase universal: TERRA DIATOMÁCEA

Esqueletos fósseis

(SiO2 + óxidos

metálicos) de algas

microscópicas

ChromosorbAnachrom

Supelcoport...

secagem

calcinação

fusão com soda

lavagem com ácido

silanização

COLUNAS CAPILARESDiâmetro Interno

dC = Eficiência

0,10 mm 0,25 mm0,32 mm 0,53 mm

1 2 3

Valores comuns:

1Colunas de altíssima eficiência (amostras

complexas, “Fast GC”); capacidade volumétrica limitada de processamento de amostra

2Diâmetros mais comuns; capacidade

volumétrica limitada de amostra requer dispositivos especiais de injeção

3Colunas “megabore”: menor eficiência, mas maior capacidade de processamento permite

uso de injetores convencionais

COLUNAS CAPILARESColunas Capilares: Injeção

1

2

3

45

6

1 - Septo;2 - Entrada de gás de arraste;3 - “Liner” (misturador);4 - Coluna Capilar5 - Purga de gás de arraste;6 - Válvula de controle de purga.

Baixa capacidade de processamento de amostra (sub-microlitro)

Injeção direta com microseringa muito difícil !!!

Injetores com divisão (“splitters”) Sistema pneumático despreza fração da amostra injetada

- Menor sensibilidade (boa parte da amostra é desprezada)

- Divisão da amostra raramente é uniforme (fração purgada dos constituintes menos voláteis é sempre menor)

- Ajuste da razão de divisão é mais uma fonte de erros

COLUNAS CAPILARESLarge Volume Injection (LVI)

Combinando injetores com temperatura programada, vál-vulas controladas por microprocessador e pré-colunas pode ser feita injeção de grandes volumes (> 100 L) de amostra

1 Colunas e injetor frios;

válvula de purga aberta (solvente é

eliminado)

2 Colunas e injetor aquecidos; válvula de purga

fechada (constituintes de

interesse transferidos para coluna analítica)

COLUNAS CAPILARESColunas Multicapilares

“Feixes” paralelos de colunas capilares

com dC convencional

- Eficiência próxima à das colunas convencionais- Capacidade similar à das colunas empacotadas- Colunas mais curtas: análises mais rápidas

Separação de explosivos em coluna multicapilar (OV-17,

1000 capilares x 6 m)

1 - 2,6-DNT2 - 2,4-DNT3 - 2,4,6-TNT4 - 3,4,5-TNT5 - 2,3,4-TNT6 - RDX ?7 - tetryl

DETECTORESParâmetros Básicos de Desempenho

QUANTIDADE MÍNIMA DETECTÁVEL Massa de um analito que gera um pico com altura igual a três vezes o nível de ruído

SIN

AL

(S

)

RUÍDO (N)

= 3SN

RUÍDO Qualquer componente do sinal gerado pelo detector que não se origina da amostra

Fontesde

Ruído

Contaminantes nos gases

Impurezas acumuladas no detector

Aterramento elétrico deficiente

DETECTORESDetector por Ionização em Chama

PRINCÍPIO Formação de íons quando um composto é queimado em uma chama de hidrogênio e oxigênio

O efluente da coluna é misturado com H2 e O2 e

queimado. Como numa chama de H2 + O2 não

existem íons, ela não conduz corrente elétrica.

Quando um composto orgânico elui, ele também é

queimado. Como na sua queima são formados íons, a

chama passa a conduzir corrente elétrica

DETECTORESDetector por Ionização em Chama

COLETOR

FLAME TIP

BLOCO

AR

H2

COLUNA

O ar e o H2 difundem para o interior do coletor, onde se

misturam ao efluente da coluna e queimam:

Uma diferença de potencial elétrico é aplicada entre o flame

tip e o coletor - quando se formam íons na chama, flue uma

corrente elétrica:

DETECTORESDetector por Ionização em Chama

Química da Chama de Hidrogênio:

Incandescência

Reação

Quebra

Estrutura da chama

três regiões básicas

Região de quebra Mistura dos gases, pré-aquecimento, início da quebra das moléculas de H2, O2 e dos analitos.

Zona de reação Reações exotérmicas com produção e/ou consumo de radicais H, O, OH, HO2 (provenientes do H2), CH e C2 (proveniente do analito) e íons CHO+ (analito).

Zona de incandescência Emissão de luz por decaimento de espécies excitadas: OH (luz UV), CH e C2 (visível).

Queima de substâncias com ligações C-H

CH + O CHO+ + e-

1 íon formado a cada ~105 átomos de C queimados

Queima de H2

Formam-se apenas radicais !!!

ventajas de la cromatografía gaseosa

limitaciones de la cromatografía gaseosa

1.eficiente, permite alta resolución

1.la muestra debe ser volátil

1.requiere muestras pequeñas (ml)

1.no aplicable a muestras termolábiles

1.alta sensibilidad, detecta ppm y a menudo ppb

1.muestras “sucias” requieren de un clean-up

previo

1.cuantitativa (en ciertas condiciones)

1.se debe utilizar otro sistema de detección (ej. MS) para la confirmación

la identificación

1.alta velocidad de análisis1.es necesario algo de

entrenamiento y experiencia

1.buena exactitud

1.fácil de usar, bien conocida

BIBLIOGRAFIA

• http://mail.fq.edu.uy/~planta/pdf/FarmacognosiaPE80/GC.doc

• http://www.chemkeys.com/esp/md/mds_7/cgced_1/cgced_1.htm