CROMATOGRAFIA

CROMATOGRAFIA

Breve introduccin a la cromatografa:

La cromatografa es un mtodo muy utilizado en todas las ramas de la ciencia y que permite la separacin, identificacin y determinacin de los componentes qumicos en mezclas complejas. Ningn otro mtodo de separacin es tan potente y de aplicacin tan general como la cromatografa.

Definicin de HPLCLa Cromatografa lquida de alto rendimiento o High performance liquid chromatography (HPLC) es un tipo de cromatografa en columna utilizada frecuentemente en bioqumica y qumica analitica.El HPLC es una tcnica utilizada para separar los componentes de una mezcla basndose en diferentes tipos de interacciones qumicas entre las sustancias analizadas y la columna cromatogrfica.

CROMATOGRAFA LIQUIDA DE ALTO RENDIMIENTO (HPLC)

Fundamentos y principios bsicos

El analito se pasa a travs de una columna de la fase estacionaria bombeando la fase mvil liquida con alta presin. La muestra se introduce en pequeos volmenes a la corriente de la fase mvil y all se retarda por medio de interacciones qumicas con la fase estacionaria mientras atraviesa la columna.

El grado de retencin de los componentes de la muestra depende de la naturaleza del compuesto, de la composicin de la fase estacionaria y de la fase mvil.

Componentes bsicos en un equipo de HPLC

Bsicamente es un sistema compuesto de un reservorio de fase mvil, bomba, inyector, columna de separacin y detector.

SISTEMA SUMINISTRO DE LA FASE MVIL

Se trata de un reservorio o varios reservorios para los disolventes. Sirve para desgasificar y eliminar partculas en suspensin de los disolventes que interfieren formando burbujas en los sistemas de deteccin.

SISTEMA DE BOMBEO DE LA FASE MVIL La bomba tiene la funcin de proveer un flujo continuo del eluyente a travs del inyector, la columna y el detector. Los requisitos de una bomba para HPLC son:Rango de flujo: de 0.01 a 10 ml/minRango de presin: de 1 a 5000 psi.Deben estar construidas de materiales resistentes a la presin y a las agresiones qumicas.Fcil manejo y mantenimiento

Existen distintos tipos de bombas

De presin constante: son fciles de usar y con bajo mantenimiento, adems evitan los pulsos de presin. El problema es que requiere una vigilancia constante del flujo, puesto que las variaciones pueden producir fallos.De flujo constante: son capaces de mantener el flujo: existen varios tipos:Pistn recproco: un pistn expela lquido a travs de una vlvula anti-retorno.Pistn dual: Usando dos pistones, provee un fllujo constante y libre de pulsos.

INYECTORES

Son los encargados de introducir la muestra en la cabeza de la columna de forma reproducible y adecuada.

COLUMNA DE SEPARACION

Normalmente son de acero inoxidable de dimetro interno uniforme aunque en ocasiones se encuentran tubos de vidrio de paredes resistentes.

DETECTORES

En HPLC existen dos tipos bsicos de detectores:

Los basados en una propiedad de la disolucin: Que corresponden a una propiedad de la fase mvil, como el ndice de refraccin, la constante dielctrica, la densidad.

Los basados en una propiedad del soluto: Es decir, responden a alguna de las propiedades del soluto, como la absorbancia UV, fluorescencia, intensidad de difusin, que no son propias de la fase mvil.

TIPOS DE HPLCCromatografa de fase normalCromatografa de fase inversaCromatografa de exclusin por tamaoCromatografa de intercambio inicoCromatografa de bioafinidad

CROMATOGRAFIA DE FASE NORMAL Fue el primer tipo de HPLC, separaba analitos basndose en la polaridad. Este mtodo usa una fase estacionaria polar y una fase mvil no polar que se usa cuando el analito es polar. El analito polar es retenido por la fase estacionaria polar. La adsorcin aumenta con la polaridad del analito y la interaccin entre analito y fase estacionaria. Esto incrementa el tiempo de elucin. La fuerza de interaccin depende no solo de los grupos funcionales, sino tambin de factores estricos e ismeros estructurales

CROMATOGRAFA DE FASE INVERSA

Este tipo de HPLC es el ms comn. En esta tcnica se usa una fase estacionaria no polar y una fase mvil moderadamente polar.El principio bsico de este mtodo est basado en las interacciones del disolvente polar, el analito no polar y la fase estacionaria no polar. Las caractersticas del analito son importantes para sus propiedades de retencin. Las molculas muy grandes pueden causar que la interaccin no sea completa. El tiempo de retencin aumenta con el rea hidrofobicidad, que es inversamente proporcional al tamao del soluto. Los componentes ramificados eluyen ms rpido porque el rea total esta disminuida.Cromatografa de exclusin por tamao

Tambin conocida como cromatografa de gel permeante o cromatografa de gel filtrante. Separa las partculas en funcin del tamao.Es una cromatografa de baja resolucin y sirve para determinar estructuras terciarias y cuaternarias de protenas y es la tcnica comn para averiguar el peso molecular de polmeros sintticos y naturales.

Cromatografa de intercambio inico

La retencin est basada en la atraccin entre iones del soluto y la carga complementaria de la fase estacionaria. Si los iones del soluto y la fase estacionaria tienen la misma carga, son excluidos. Este tipo de cromatografa es ampliamente utilizado en purificacin de aguas.

Cromatografa de bioafinidad

Se basa en las propiedades de sustancias bio-activas para formar complejos estables, especficos y reversibles. La formacin de los complejos implica fuerzas moleculares como Van der Waals, electrosttica, dipolo-dipolo, hidrofbicas y puentes de hidrogeno. Una unin bioespecfica se forma por accin simultnea de estas fuerzas en los sitios de unin.

APLICACIONES AL ANLISIS DE ALIMENTOS

Conservantes antioxidantes: se usa el gradiente de HPLC con un detector colorimtrico para medir simultneamente los nueve antioxidantes ms comunes.

Anlisis de carbohidratos en bebidas: la adicin de mono y disacridos a bebidas y zumos sirve como propsito de enriquecer el sabor. Para determinar si la cantidad aadida es correcta se miden los azucares usando HPLC de intercambio inico con deteccin de pulso amperomtrico con detectores de refraccin o ultravioletas.Ismeros de carotenoides: el HPLC en combinacin con detectores calorimtricos permite el anlisis de los carotenoides dietticos en tejidos animales y vegetales.Flavonoides y fenoles: en el vino la medicin de estas sustancias permite la determinacin del color, la edad y las variedades de uva usadasAcidos lipoico y cido dihidrolipoico en suplementos alimenticios: aun en estudio pero su deteccin combinando HPLC con detectores colorimtricos es importante ya que estos dos compuestos parecen importantes como antioxidantes y reguladores del ciclo celular.

Medicin de nutrientes liposolubles en tabletas multivitamnicas: el uso del HPLC permite la deteccin de mltiples vitaminas en alimentos suplementarios para neonatos.Hidroxinonenal y otros aldehdos: se forman como resultado de peroxidacin de lpidos, durante la coccin o podredumbre. Se usa HPLC con detectores de fluorescencia para detectar estas sustancias que son citotxicas.

Surfactantes no inicos: la deteccin de estas sustancias es crucial puesto que estn altamente reguladas debido a problemas medioambientales, se usa HPLC combinado con dispersin de luz evaporativa.