TESIS HPLC
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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTNOMA DE MXICO
FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES
ZARAGOZA
DESARROLLO DE UN MTODO ANALTICOPOR CROMATOGRAFA DE LQUIDOS DE
ALTA EFICIENCIA PARA LACUANTIFICACIN DE OMEPRAZOL EN UNA
FORMULACIN LIQUIDA
T E S I S
PARA OBTENER EL TTULO DE
QUMICO FARMACUTICO BILOGO
PRESENTA:
VIRIDIANA FLORES DE LA CRUZ
Dr. Vicente J. Hernndez Abad
DIRECTOR
M. en C. Elizabeth Gpe. Snchez Gonzlez
ASESOR
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2INDICE
1. Introduccin 42. Fundamentos 52.1Cromatografa. 52.2 CLAE o CLAR. 62.3 Tipos de CLAE 62.3.1 Cromatografa quiral.. 62.3.2 Cromatografa de Intercambio Inico.. 62.3.3 Cromatografa de afinidad. 62.3.4 Cromatografa de fase normal.. 72.3.5 Cromatografa de fase reversa. 72.3.5 Cromatografa de exclusin molecular 72.4 Partes esenciales de un cromatgrafo de lquidos de altaresolucin... 72.4.1 Reservorio 72.4.2 Bomba.. 82.4.3 Inyector. 82.4.4 Columna... 82.4.5 Detector 92.4.5.1 Detectores ms comunes.. 92.4.6 Registrador o Integrador 102.5 Fase mvil... 102.5.1 Compatibilidad del sistema... 102.5.2 Solubilidad de la muestra.. 102.5.3 Preparacin de la fase mvil. 102.6 Anlisis cuantitativo... 112.6.1 Determinaciones cuantitativas.. 112.6.1.1 Integrador computarizado.. 112.6.1.2 Normalizacin de rea 122.7 Validacin de mtodos analticos 142.7.1 Mtodo analtico. 142.7.2. Consideraciones al desarrollar un mtodo analtico 162.7.3 Validacin. 172.7.4 Parmetros analticos de validacin 172.7.4.1 Selectividad.. 172.7.4.2 Linealidad. 172.7.4.3 Precisin... 182.7.4.4 Exactitud... 182.7.4.5 Robustez... 182.8 Omeprazol.. 192.8.1 Espectroscopia UV. 202.8.2 Espectroscopia Infrarroja.. 202.8.3 Indicaciones teraputicas.. 212.8.4 Interacciones medicamentosas 223. Planteamiento del problema... 234. Objetivos 245. Hiptesis 25
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36. Diseo experimental 267. Diagrama de Flujo 298. Metodologa.. 308.1 Preparacin de la formulacin lquida de Omeprazol.. 308.2 Desarrollo del mtodo analtico... 318.2.1 Condiciones cromatogrficas... 318.2.2 Preparacin de la fase mvil. 318.3 Validacin del mtodo analtico... 328.3.1 Validacin del Sistema.. 328.3.2 Validacin del mtodo 339 Resultados y Anlisis de Resultados 369.1 Desarrollo del mtodo analtico .. 369.2 Validacin del Sistema.. 399.3 Validacin del Mtodo... 4110. Conclusiones.. 5311. Referencias..... 54
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41. INTRODUCCIN
En la actualidad se requiere el desarrollo de mtodos de anlisis apropiadosque cumplan con las normas de calidad, dichos mtodos deben cumplir conlos parmetros establecidos para su aceptacin y que a su vez cumplan con lasnormas regulatorias que exigen que los mtodos estn validados, es decir setiene que comprobar y certificar con evidencia conveniente documentada queun mtodo, sistema o proceso, cumple y se desarrolla tal y como estabaprevisto, dentro de los intervalos definidos.
En el presente trabajo se busca desarrollar un mtodo para la cuantificacin deOmeprazol en una formulacin lquida. La Cromatografa de Lquidos de AltaEficiencia en la actualidad es una de las tcnicas ms utilizadas en la IndustriaFarmacutica para la cuantificacin de componentes, ya que es una forma deevaluacin analtica que proporciona una alta selectividad, sensibilidad yprecisin.
Para garantizar la confiabilidad y funcionalidad del mtodo analtico que seemplea en el anlisis del principio activo se deben cumplir los parmetros devalidacin que incluyen la linealidad, precisin, repetibilidad reproducibilidad,exactitud, estabilidad de la muestra y robustez.
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52. FUNDAMENTOS
1.1 CROMATOGRAFA1
La cromatografa es un trmino general aplicado a una amplia gama detcnicas de separacin.
Existen diversas definiciones del fenmeno de la cromatografa, dentrode estas destacan las siguientes.
1. Es una tcnica mediante la cual los componentes en una muestrason acarreados por una fase gaseosa o lquida, y son resueltosmediante pasos de adsorcin-desorcin sobre la fase estacionaria.
2. Es un proceso de separacin en donde una mezcla es aplicada comouna zona inicialmente reducida a un adsorbente poroso estacionario,y los componentes experimentan una migracin diferencial por elflujo de una fase mvil, la cual puede ser un lquido o un gas.
3. Es un proceso de separacin que se lleva a cabo por una distribucinde sustancias entre una fase mvil y una estacionaria. Estassustancias pasan por el sistema cromatogrfico al ser distribuidasentre la fase mvil y la fase estacionaria. Como una consecuencia,las sustancias son eluidas en la columna por orden inverso a suscoeficientes de distribucin con respecto a la fase estacionaria.
4. La Unin Internacional para la Qumica Pura y Aplicada (1993) laclasific como un mtodo fsico de separacin, en que componentesal ser aislados estn distribuidos entre dos fases, una de las cualesest en estado estacionario y la otra en movimiento en una direccindefinida.
5. Keulemans ha definido la cromatografa como un proceso fsico deseparacin en la cual los componentes a separar se distribuyenentre dos fases una de las cuales constituye la fase estacionaria, degran rea superficial, y la otra es un fluido (fase mvil) que pasa atravs o a lo largo de la fase estacionaria.
Por lo tanto el proceso cromatogrfico involucra la distribucin de los analitospresentes en una mezcla a separar entre dos fases inmiscibles entre si. Una deellas es la fase estacionaria, la cual puede ser un slido o un lquido adsorbidoo enlazado covalentemente sobre un soporte poroso de gran rea superficial.La fase mvil es un fluido (gas, lquido o fluido supercrtico) que se usa comoportador de la mezcla.1, 2
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62.2 CROMATOGRAFA DE LIQUIDOS DE ALTA EFICIENCIA/RESOLUCIN(CLAE o CLAR)
La CLAE o CLAR (Cromatografa de Lquidos de Alta Resolucin) es unatcnica de separacin que se fundamenta en la interaccin de un soluto conuna fase estacionaria slida y una fase mvil lquida. La separacin se lleva acabo por reparto, adsorcin o procesos de intercambio inico, dependiendo deltipo de fase estacionaria usada. Esta tcnica tiene distintas ventajas sobre lacromatografa de gases para el anlisis de compuestos orgnicos. Loscompuestos al ser analizados son disueltos en un lquido orgnico, y la mayorparte de las separaciones se llevan a cabo a temperatura ambiente. Dado quela mayora de los frmacos son compuestos no voltiles o trmicamenteestables, pueden ser separados sin descomposicin o sin la necesidad desintetizar derivados voltiles.3, 4
El tiempo de elusin de un compuesto puede ser descrito por el factor decapacidad, k, que depende de la naturaleza qumica del analito, la composiciny la velocidad de flujo de la fase mvil, adems de la composicin y el rea dela superficie de la fase estacionaria. La longitud de la columna es determinantede la resolucin. Slo compuestos con diferentes factores de capacidadpueden ser separados por CLAR.
2.3. Tipos de CLAE
Los mtodos cromatogrficos comnmente utilizados pueden ser divididos en:
2.3.1. Cromatografa quiral.
La separacin de enantimeros puede hacerse sobre una fase estacionariaquiral, por formacin de diasteremeros va agentes derivativos o aditivos de lafase mvil que actan sobre la fase estacionaria. Cuando se usa como unmtodo de prueba de impurezas, la sensibilidad es mejorada si la impurezaenantiomrica eluye antes que el frmaco enantimero.4
2.3.2. Cromatografa de intercambio inico.
La separacin est basada en la carga de los grupos funcionales, intercambioaninico para una muestra con carga negativa o intercambio catinico para unamuestra con iones positivos. El gradiente de elusin por pH es comn.1
2.3.3. Cromatografa de afinidad.
La separacin est basada en la interaccin qumica especfica de las especiesdestino. La modalidad ms popular usa un amortiguador y una cantidad
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7adicionada de carga positiva a la muestra con separacin influenciada por pH,fuerza inica, temperatura, concentracin y tipo de disolvente orgnico.1La cromatografa de afinidad, comn para macromolculas, emplea un ligando
(molcula biolgicamente activa unida covalentemente a la matriz slida), lacual interacta con su antgeno (analito) homlogo como un complejoreversible que puede ser eludo por cambios en las condiciones delamortiguador. 1
2.3.4. Cromatografa de fase normal.
Es una tcnica cromatogrfica que usa solvente orgnico para la fase mvil yuna fase estacionaria polar. Aqu, los componentes menos polares eluyen msrpido que los componentes ms polares.4
2.3.5. Cromatografa de fase reversa.
La cromatografa de fase reversa, es una tcnica de fase ligada, la cual utilizaagua como el solvente base. La separacin est basada en la fuerza yselectividad del solvente, tambin puede ser afectada por la temperatura de lacolumna y el pH. En general, el componente ms polar eluye ms rpido quelos componentes menos polares.4
2.3.6. Cromatografa de exclusin molecular.
Tambin conocida como filtracin o per meacin en gel, la separacin estbasada en el tamao de las molculas o el volumen hidrodinmico de loscomponentes. Las molculas que son ms grandes que los poros del materialde empaque de la columna, eluyen primero, las molculas pequeas queentran en los poros eluyen al final y la velocidad de elucin de el resto dependede sus tamaos relativos.5
2.4 Partes esenciales de un cromatgrafo de lquidos de alta eficiencia
Las partes esenciales de un cromatgrafo de lquidos de alta resolucin son: elreservorio para fase mvil, la bomba, el inyector, la columna, el detector y elregistrador o integrador.1,4
2.4.1 Reservorio para la fase mvil
Es el recipiente que contiene la fase mvil, debe ser de composicin tal que nointeracte con sta, su forma y tipo puede variar desde un frasco comn hastaun sistema capaz de filtrar, termo regular y/o desgasificar el disolvente.4
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82.4.2 Bomba
Es el dispositivo capaz de proporcionar a la fase mvil el flujo o velocidadprecisa para introducirla al sistema y atraviesa la columna a presiones de hasta6000psi.1
Las bombas ms utilizadas son las de movimiento alternado o masreciprocantes que mantienen la velocidad constante de la fase mvil, consta deun pequeo pistn accionado por un motor que se mueve rpidamente haciadelante y hacia atrs en una cmara hidrulica, que puede variar de capacidaddesde 35 hasta 400L. No hay restricciones en el tamao del recipiente o en eltiempo de alimentacin.1
2.4.3 Inyector
Es el dispositivo que permite introducir la muestra en solucin al sistema, sininterrumpir el caudal de la fase mvil. El inyector debe ser fcil de operar, inerteal ataque qumico y capaz de soportar altas presiones, debe ser preciso encuanto a la cantidad de muestra que introduce al sistema, debe inyectar lamuestra en forma de paquete compacto con el propsito de obtener unamxima eficiencia en la separacin.
Existen dos diseos de inyectores: los de desplazamiento y los de aguja.Ambos pueden ser incorporados a un sistema de inyeccin manual oautomtico. Los inyectores de desplazamiento forzan la muestra hasta un looppero presentan baja reproducibilidad cuando estn parcialmente llenos. Enconsecuencia, es necesario cambiar fsicamente el loop para cambiar losvolmenes de inyeccin. Los inyectores de tipo aguja conducen la muestra atravs del loop. Este mecanismo puede operar con precisin con un loopparcialmente lleno y es, por lo tanto, ms verstil. Puede ser ms difcilmantener inyecciones reproducibles con un inyector de desplazamiento quecon uno de aguja. Bajo la mayora de las circunstancias, la reproducibilidad noes un problema.4
2.4.4 Columna
Es la parte ms importante del sistema cromatogrfico, pues en ella es dondese lleva a cabo la separacin. Las caractersticas de la columna, el material deempaque, as como las dimensiones dependern del tipo de separacin que sedesee o requiera. Las ms comunes para separaciones analticas usualmentetienen dimetros internos de 2 a 5 mm; las columnas de dimetro mayor sonusadas para cromatografa preparativa. Las columnas pueden ser calentadaspara dar separaciones ms eficientes, pero raramente son usadas atemperaturas mayores a 60C, debido a la degradacin potencial de la faseestacionaria o la volatilizacin de la fase mvil.1, 4
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92.4.5 Detector
La funcin del detector en CLAE es monitorear la fase mvil que emerge de lacolumna. La salida del detector es una seal elctrica que es proporcional aalgunas propiedades de la fase mvil y/o solutos.
Las caractersticas importantes que debe poseer un detector ideal son:
Sensibilidad alta y respuesta constante de la muestra. Responder a todos los solutos o tener especificidad constante. No ser afectado por cambios de temperatura y flujo de la fase mvil. Ser confiable, conveniente, fcil de usar y econmico. Respuesta rpida.
2.4.5.1 Detectores ms comunes1
a) Detector de ndice de refraccin
Mide las diferencias de los ndices de refraccin del disolvente puro y lasolucin de la muestra que sale de la columna.
b) Detector de absorcin UV/Visible
Son los detectores ms utilizados para un anlisis por CLAR, la fase mvilde la columna es pasada por una pequea celda de flujo en el rayo deradicacin de un fotmetro o espectrofotmetro UV/Visible, estos detectoresson selectivos, esto es nicamente detectan solutos que absorben laradiacin de un rango entre 190-800 nm.
c) Detector de Arreglo de fotodiodos ( DAD)
En este detector la radiacin policromtica despus de pasar por lamuestra, es dispersada por una rejilla fija y cae a un arreglo de fotodiodos,cada diodo mide una banda angosta de longitudes de onda en el espectro,de esta forma se tienen todos los puntos en el espectro.
d) Detector de fluorescencia
Es el ms sensible y posee alta selectividad de respuesta a compuestosfluorescentes y a sus derivados, al tener la capacidad de medir la energaemitida por los solutos excitados. El detector es tan selectivo que se utilizapara el anlisis de trazas.
2.4.6 Registrador o Integrador
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Es un sistema de registro de la respuesta del detector, que la transforma en uncromatograma que se integra para cuantificar la muestra.4
2.5. Fase mvil
En todas las formas de cromatografa, la calidad y manipulacin de la fasemvil es tan crtica como cualquier parte del sistema cromatogrfico. Existe unaserie de factores que deben tomarse en cuenta a fin de evitar problemasdurante la ejecucin de la tcnica.1, 4
2.5.1 Compatibilidad del sistema.
Es necesario considerar las necesidades del equipo de CLAE cuando seselecciona la fase mvil. Se recomienda que la mezcla de disolventes seamiscible con la usada previamente en el equipo, de lo contrario, es necesariousar un disolvente intermediario que sea miscible en la fase previa y en lanueva. Esto requerir purgar el sistema e introducir el nuevo disolvente, lo cualtomar alrededor de 30 minutos. Si las fases son miscibles, se necesitar de untiempo de enjuague, pero significativamente menor, de 5 a 15 minutos.1
2.5.2 Solubilidad de la muestra.
Cuando los componentes de la muestra son insolubles en la fase mvil puedeocurrir precipitacin, bloqueo de la jeringa o de la vlvula. Dependiendo del tipode muestra, puede actuar como un grano de arena y rayar el sistema. Estaspartculas pueden bloquear la cabeza de la columna, restringir el flujo de la fasemvil e incrementar la presin interna. La muestra debe ser soluble en la fasemvil, en el rango de concentracin de trabajo.1
2.5.3 Preparacin de la fase mvil.
La primera rutina que se debe llevar a cabo con la fase mvil es la filtracin desus constituyentes. Los solventes comerciales para CLAR pueden contenerpartculas. No obstante, stas no son visibles debido al ndice de refraccin deldisolvente, o bien, a su tamao. Tal contaminacin ocasiona varios problemasdebido a la acumulacin en la cabeza de la columna, como pueden ser:
- Cambios en la velocidad de elucin.- Cambios en el factor de capacidad.- Disminucin de la selectividad.- Picos fantasma.- Absorcin irreversible y disminucin de la vida de la columna.
Es posible que las partculas se queden en el sistema de bombeo dandolo yprovocando fluctuaciones en la velocidad de flujo. Este tipo de contaminacintambin invade las vlvulas afectando el tiempo de vida de ellas.4La forma ms fcil de evitar los problemas anteriores es filtrar el disolvente. Seutilizan comnmente filtros de steres de celulosa con tamao de poro de 0.22
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micras para medios acuosos, y de politetrafluoroetileno con 0.2 micras paramedios orgnicos.4
Una vez que estos han sido filtrados se recomienda realizar unadesgasificacin, esto para que nuestra fase mvil no lleve burbujas que puedantapar el inyector as como daar el detector al bajar la presin por elacumulamiento de gas.4
2.6 Anlisis cuantitativo
El uso de la cromatografa se ha extendido en todo el mundo, en las ltimascuatro dcadas, no solo por su capacidad de separar compuestos sino porquese puede realizar un anlisis cuantitativo de las especies proporcionadas.
En la cromatografa en columna, el anlisis cuantitativo se basa en lacomparacin de la altura, o del rea, del pico del analito con la de uno o mspatrones inyectados bajo las mismas condiciones cromatogrficas. El uso deuno u otro trmino depender de las caractersticas de la banda obtenida,aunque en la actualidad con el uso de sistemas de integracin de reacomputarizados, la precisin es muy alta para el clculo de rea, sin embargo,siempre es importante conocer otras herramientas a utilizar para calcular elrea de una banda y en qu momento es mejor usar altura en vez de rea.4
2.6.1 Determinaciones cuantitativas
2.6.1.1 Integrador computarizado5
Los sistemas de datos basados en computadoras en lnea permiten unaautomatizacin completa. Esto incluye la adquisicin y reduccin de datos enforma automtica y la impresin de los resultados analticos. La sealcromatogrfica, inicialmente analgica, se digitaliza por medio de unconvertidor digito-analgico. Con programas se puede entonces detectar lapresencia de picos, hacer correcciones por la desviacin de la lnea de base,calcular reas y tiempos de retencin, determinar la concentracin de loscomponentes utilizando factores de calibracin almacenados y generar uninforme completo del anlisis.
Las cuentas del rea del pico se acumulan cuando la seal abandona la lneabase. Este alejamiento de la lnea base usualmente se determina por medio dela medicin de la pendiente de la seal. El tiempo de retencin y las alturas dela seal en el mximo de cada pico se detectan con un programa almacenadoen la memoria. El final del pico de un componente se establece cuando la sealregresa a la lnea base.
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Durante cromatogramas isotrmicos los programas pueden aumentarautomticamente con el tiempo la sensibilidad a la pendiente, asegurando suhabilidad para detectar los picos agudos iniciales y los picos bajos y chatosms retardados con la misma precisin.
En el caso de picos fusionados es posible asignar el rea a cada componenteproyectando perpendicularmente el mnimo del valle a la lnea base corregida.
Algoritmos especiales distribuyen el rea de componente en el caso de picossobrepuestos. Tambin en el caso de picos sobre colas de otros picos esposible distribuir las reas de cada pico de forma coherente.
2.6.1.2 Normalizacin del rea.5
Cuando se sabe que el cromatograma representa la muestra completa, quetodos los componentes se han separado y que cada pico se ha resueltocompletamente; se puede utilizar la normalizacin de las reas para laevaluacin. Para utilizar este mtodo, se mide el rea bajo cada pico individual.Sumando todas estas reas de los picos se obtiene el rea total calculada.
El porcentaje en volumen de los componentes individuales se obtienemultiplicando el rea calculada individual por 100 y luego dividindola entre elrea total calculada.
El mtodo slo es vlido si el factor de respuesta de todos los componentes esel mismo, es decir iguales cantidades de distintos componentes dan la mismarea. En otro caso las reas deberan ser corregidas por un factor de respuestade cada componente.
a) Mtodo del patrn externo5
Cuando el volumen de la muestra es conocido con frecuencia se utiliza lacalibracin con estndares o patrones. Tiene la ventaja de que slo senecesita, medir las reas de los picos de inters. Es un requisito que cada vezse inyecte la misma cantidad de muestra. Los estndares necesarios debenanalizarse bajo las mismas condiciones de operacin que la muestra.
En la prctica, se preparan las soluciones estndar de(los) componentes deinters y se inyectan en el cromatgrafo. Para cada componente se obtiene lagrfica: rea del pico en funcin de cantidad de componente.Despus, para el clculo de una concentracin desconocida, se obtiene elcromatograma de la muestra problema y el rea de cada pico se utiliza con lagrfica anterior para obtener la cantidad.
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b) Mtodo del estndar Interno5
Este mtodo es conocido como calibracin relativa o indirecta, el mtodo delpatrn interno permite que varen las condiciones de operacin entre muestra ymuestra y no requiere de repetibilidad en las inyecciones. El patrn internodebe ser un compuesto que pueda resolverse completamente de los picosadyacentes, que no est presente en la muestra problema y que no produzcaningn efecto interferente.
Como en el caso anterior se preparan estndares que contienen loscomponentes de la muestra a analizar. A cada uno de ellos se aade unacantidad conocida del llamado patrn interno que obviamente no es uno de loscomponentes que se quiere analizar. Se obtienen los cromatogramas de cadaestndar y se obtiene la grfica: cociente entre el rea de componente y readel patrn interno frente a cociente entre cantidad de componente y cantidadde patrn interno.
Entonces se aade una cantidad conocida del patrn interno a la mezcladesconocida. Se obtiene el cromatograma, y con el cociente entre las reas delpico de componente a determinar y la de patrn interno en la muestra problemase obtiene (con la grfica anterior determinada con estndares) el cocienteentre cantidad de componente y cantidad de patrn interno. Como la cantidadde patrn interno aadida a la muestra problema es conocida puede calcularsela cantidad desconocida de componente. Cualquier variacin en el tamao dela muestra se evidenciar inmediatamente al comparar el rea del pico delpatrn interno en cromatogramas diferentes pero no afectar al resultado.
Fig. 1. Calibracin relativa
De la curva mostrada en la Fig. 1 se obtiene la ecuacin lneal y=mx, y de lasiguiente ecuacin se obtiene la masa de la muestra:
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La ventaja de este mtodo es que es independiente del volumen de inyeccinde muestra lo que es sumamente importante para aquellas tcnicascromatogrficas que utilizan un mtodo de introduccin de muestra noautomatizado como por ejemplo el uso de jeringas de inyeccin encromatografa gaseosa.
Requerimientos para un buen estndar interno: 6, 7
Debe ser resuelto de los otros picos. Debe eluir cercano al pico de inters. Debe usarse una concentracin similar al pico de inters. Debe ser de las mismas caractersticas estructurales.
2.7 Validacin de mtodo analtico6,8,9
2.7.1 Mtodo Analtico
El Mtodo analtico es aquel mtodo de investigacin que consiste en ladesmembracin de un todo, descomponindolo en sus partes o elementos paraobservar las causas, la naturaleza y los efectos. El anlisis es la observacin yexamen de un hecho en particular. Es necesario conocer la naturaleza delfenmeno y objeto que se estudia para comprender su esencia. Este mtodonos permite conocer ms del objeto de estudio, con lo cual se puede: explicar,hacer analogas, comprender mejor su comportamiento y establecer nuevasteoras.6, 8
En el cuadro 1 se muestra una clasificacin de los mtodos analticos masusuales.7
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Cuadro 1. Clasificacin de los mtodos analticos usuales
Clasificacin general Sub clasificacin Cantidad medida
GravimtricoMtodo indirecto Peso de compuestos
conteniendo especiesMtodo directo Prdida de peso debido avolatizacin de especies
VolumtricoMtodos de valoracin
Volumen de disolucin que esqumicamente equivalente a lasespecies deseadas
Anlisis de gases Volumen de una especiegaseosa producida o consumida
ptico
Espectroscopa de emisin Radiacin emitida por especiesEspectroscopa de absorcinincluyendo colorimetra
Radiacin absorbida por unaespecie
Polarimetra Rotacin de las especies por laluz polarizadaRefractometra ndice de refraccin dedisolucin de especiesTurbidimetra, nefelometra Dispersin de radiacin porespecies
Electroanaltico
Potenciometra Potencial de un electrodo enequilibrio con las especiesConductimetra Conductividad de una disolucinde las especiesCoolombimetra Cantidad de corrienteequivalente a las especies
PolarografaCorriente asociada con lareaccin en un electrodopolarizable
Varios
Mtodos de alta frecuencia Capacidad de una disolucin deespecies
Espectroscopa de masaRelacin de carga a masa deproductos de descomposicinde especies
Mtodos radioqumicos Decrecimiento radioqumico delas especiesMtodos de conductividad Conductividad trmica de lasespeciesValoraciones entlpicas Calor de reaccin de especies
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2.7.2 Consideraciones al desarrollar mtodos analticos
Antes de enfocar el papel de la instrumentacin en un mtodo analtico, elanalista debe considerar otras etapas importantes para la determinacin dentrode las cuales se encuentran las siguientes:
-La primera tarea es definir el problema analtico. Cuando es posible, lo anteriorse hace a travs de una interaccin directa con la(s) persona(s) que desea(n)el anlisis.6
-El analista debe determinar la naturaleza de la muestra, el uso final de losresultados analticos, las especies que deben analizarse y la informacinrequerida.6
-Las propiedades fsicas y qumicas nicas del analito, las propiedades de lamatriz de la muestra, la presencia de interferencias probables que eliminan elcurso de ciertas propiedades del analito como indicadores de medicin, formaen la que se presenta el analito en la muestra.7
-Una vez que el problema se ha definido, la siguiente tarea es seleccionarel(los) mtodo(s) apropiado(s). Algunos factores a considerar son lasposibilidades y limitaciones de la tcnica.6
- La siguiente rea a considerar es el muestreo. A menudo es el paso msimportante en todo el anlisis, ya que hay que considerar las medidas quedeben tomarse a fin de obtener las muestras requeridas para proporcionar lainformacin deseada, as como las medidas que deben tomarse a fin deobtener las muestras requeridas que proporcionen la informacin deseada.7
-El analista debe seleccionar el(los) mtodo(s) de estandarizacin msadecuado(s) para el anlisis de entre los siguientes: grficas (o curvas) decalibracin, adiciones estndares, estndares internos, estndares externos,materiales de referencia, muestras de prueba y diagramas de control.7
- Para evaluar la precisin y los resultados de los anlisis, el analista debe usarmtodos estadsticos, que garanticen que los resultados obtenidos sonconfiables.7
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2.7.3 Validacin
Existen numerosas definiciones de Validacin que expresan la misma ideaValidar es comprobar y certificar con evidencia conveniente documentada queun mtodo, sistema o proceso, cumple y se desarrolla tal y como estabaprevisto, dentro de intervalos definidos.8
De acuerdo a la Norma Oficial Mexicana NOM-059-SSA1-2006, en su apartado9.12 los mtodos analticos deben ser validados, se deben contar con mtodosvalidados para producto a granel, producto terminado y materia prima en casode no aparecer en cualquier farmacopea internacional ni en la FEUM.9
2.7.4 Parmetros Analticos de Validacin
Las caractersticas de desempeo del mtodo analtico se expresa en funcinde los siguientes parmetros analticos:
2.7.4.1 Selectividad
La selectividad es la capacidad del mtodo para evaluar nicamente el principioactivo integro de forma exacta y especifico, en presencia de los componentesque puedan esperar estar presentes, como por ejemplo: impurezas, productosde degradacin y componentes de la matriz.8, 10, 11
2.7.4.2 Linealidad
La linealidad de un mtodo analtico es su capacidad para demostrar que losresultados de la prueba son directamente proporcionales a la concentracin delanalito dentro de un rango dado. 8, 10, 11
2.7.4.3 Precisin
La precisin de un mtodo analtico, es el grado de concordancia de losresultaos de la prueba, cuando el mtodo se aplica repetidamente a mltiplestomas de muestra homognea. 8, 10, 11
La precisin puede ser medida, ya sea por el grado de reproducibilidad o derepetibilidad del mtodo analtico, bajo condiciones operativas normales. Eneste contexto definimos:
a) Reproducibilidad: Se refiere al uso del procedimiento analtico endiferentes laboratorios.
b) Precisin Intermedia. Expresa la variacin dentro de un mismolaboratorio, diferentes das, o con diferentes analistas o equipos.
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2.7.4.4 Exactitud
La exactitud de un mtodo analtico, es la proximidad entre los resultadosobtenidos por ese mtodo y el valor real. 8, 10, 11
2.7.4.5 Robustez
Es una medida de la capacidad del mtodo analtico para permanecer sinalteraciones por defecto de variaciones pequeas, pero deliberadas, en losparmetros del mtodo y provee indicaciones acerca de su confiabilidaddurante su utilizacin en condiciones normales. 8, 10, 11
En funcin de la aplicacin analtica de un mtodo el Cuadro 2 indica losparmetros de desempeo a estudiar.8
Cuadro 2. Parmetros de desempeo
*Puede ser requerido dependiendo de la naturaleza del mtodo
2.8 Omeprazol 11, 12, 13, 14,15, 16, 17
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Fig. 1 Estructura de Omeprazol
Nombre cientfico: 5-metoxi-2-[[(4-metoxi-3,5-dimetil-2-piridinil)-metil]sulfinil]-1H-benzoimidazol
Formula condensada: C17H19N3O3S1
Peso molecular: 345.42 g/mol1
Propiedades fsicas
Polvo blanco o casi blanco. Muestra polimorfismo. Muy poco soluble en agua;bastante soluble en etanol y metanol; soluble en cloruro de metileno. Sedisuelve en soluciones diluidas de hidrxidos alcalinos. Se debe conservar enenvases hermticos a una temperatura entre 2 y 8C. Proteger de la humedady de la luz.
Consiste en cristales blancos que se funden alrededor de 156C;
pKa : en piridina-N es de 4.0 y en imidazol-N es de 8.7.
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2.8.1 Espectroscopia UV
En solucin acuosa cida (0.2 M H2SO4): 303nm, en medio bsico: 276-305nm.12, 16
Fig. 2 Espectro UV de Omeprazol
2.8.2 Espectroscopia Infrarroja
Principales picos a la longitud de onda: 1628, 1205, 1015 cm1 (KBr disk). 12, 16
Fig.3 Espectro infrarrojo de Omeprazol
2.8.3 Indicaciones Teraputicas
Padecimientos que cursan con enfermedad cido-pptica como:
a) lcera
-
21
Lesin en forma de crter, circunscrita que afecta a piel o mucosas.Consecutiva a la necrosis que acompaa ciertos procesos inflamatorios,infecciosos o malignos.18
b) lcera pptica
Zona erosionada, claramente circunscrita en la membrana mucosa delestmago o del duodeno o en cualquier otra parte del sistema gastrointestinal,expuesta a la accin de los jugos gstricos ricos en cido y pepsina.18
c) lcera duodenal,
lcera del duodeno. El tipo ms comn de lcera pptica.19
d) lcera gstrica
Erosin circunscrita de la mucosa gstrica que atraviesa la muscolarismucosae, puede penetrar la capa muscular y perforar la pared del estmago.19
e) lcera pptica asociada con Helicobacter pylori.
Helicobacter pylori produce gastritis aguda, gastritis astral, lcera gstrica yduodenal, en nios y adultos, y se asocia con cncer gstrico. Tiene forma debastn curvo, con flagelos; es microaeroflico, catalasa y oxidasa positiva.Helicobacter pylori se localiza en el epitelio del estmago. Secreta ureasa, queproduce amonio y bicarbonato, con lo que neutraliza el pH cido; ademsproduce peptidasa, lipasa, fosforilasa A, lo que permite penetrar en la capaprotectora.17
f) Enfermedad por reflujo gastroesofgico (ERGE)
Desplazamiento retrgrado del contenido del estmago hacia el esfago. Eljugo gstrico es cido y por tanto produce dolor urente en el esfago. Losepisodios repetidos de reflujo pueden causar esofagitis, estenosis esofgicapptica o lcera esofgica.19
g) Dispepsia
Sensacin de molestia gstrica vaga que se siente despus de la ingesta.Combina sensaciones de plenitud, ardor meteorismo y nuseas.19
h) Sndrome de Zollinger-Ellison
Trastorno caracterizado por la aparicin de lceras ppticas graves, comohipersecrecin gstrica, elevacin de los niveles de gastrina en suero ypresencia de un gastrinoma pancretico o duodenal.19
-
22
i) Gastropata relacionada con el uso crnico de AINEs.17
2.8.5 Interacciones Medicamentosas
En la metabolizacin heptica del omeprazol, tambin desempea unimportante papel el sistema enzimtico del citocromo P-450, pudiendo existirinteracciones con sustancias que utilicen la misma va metablica. Hasta ahora,los estudios realizados demuestran una reduccin en el aclaramiento defrmacos, como diazepam, fenitona o R-warfarina. 13, 18
No se han descrito, sin embargo, interacciones con el propranolol, S-warfarinao teofilina. Se ha descrito la existencia de un pequeo porcentaje de individuosen que el metabolismo heptico del omeprazol est prolongado de formasustancial, probablemente como consecuencia de una alteracin hereditaria enla isoenzima del citocromo P-450 encargada de su metabolizacin.11, 18
En estos casos se triplica el tiempo de vida media plasmtica y se multiplicapor 10 la curva de concentracin plasmtica/tiempo. Sin embargo, si seemplean dosis habituales, aunque est disminuida la capacidad remanentepara metabolizar el omeprazol, es suficiente para impedir la acumulacin delfrmaco. Hace falta caracterizar completamente a esta poblacin, pero esprevisible anticipar que presentarn altos grados de hiposecrecin y,potencialmente, estarn ms expuestos a los riesgos de la hipoclorhidria. Todoello requerir mayor cuidado por parte del clnico, pero no implicanecesariamente una dosificacin ms reducida salvo en tratamientoprolongados con dosis altas, sobre todo en pacientes ancianos o coninsuficiencia heptica.11, 18
-
23
3. Planteamiento del Problema
La Cromatografa de Lquidos de Alta Eficiencia es una de las tcnicas msutilizadas dentro de los mtodos analticos debido a su alta selectividad,sensibilidad y precisin. Puesto que en el Laboratorio de InvestigacinFarmacutica no se cuenta con un mtodo analtico para la cuantificacin deOmeprazol en una formulacin lquida se pretende desarrollar y validar dichomtodo para ser utilizado en proyectos de docencia dentro de la carrera deQ.F.B.
-
24
4. Objetivos
Objetivo General
Desarrollar y Validar un mtodo analtico por CLAE para la cuantificacin deomeprazol en una formulacin lquida.
Objetivos Especficos
Disear un mtodo analtico para cuantificar omeprazol en unaformulacin lquida.
-
25
5. Hiptesis
El mtodo analtico desarrollado por CLAE permite cuantificar de maneraefectiva, confiable y sencilla el omeprazol en la formulacin lquida cumpliendolos parmetros de validacin. Dicho mtodo puede ser utilizado en proyectosde docencia dentro de la carrera de Q.F.B.
-
26
6. Diseo Experimental
En los cuadros 3, 4 y 5 se muestran los reactivos, materiales y equipoutilizados.
Cuadro 3. Lista de reactivos, marca y lote
REACTIVO MARCA LOTE PUREZA
Fosfato monobsico depotasio
J.T. Baker C13C00 99.4%
Fosfato dibsico depotasio
J.T. Baker B14C13 99.9%
Hidrxido de Sodio J.T. Baker B14C70 99.3%
cido fosfrico J.T. Baker G38806 88%
Metanol
grado HPLC
J. T. Baker J34C34
J10C29
H33C24
99.9%
Agua desionizada
grado HPLC --------------- ------------------ -----------------
Propilparabeno N.F. (Spectrum) LH0015 99-100.5%
Solucin buffer de fosfatopH 7
J. T. Baker G02C33 pH a 25C 7.01
Solucin buffer deBiftalato pH 4
J. T. Baker G03C11 pH a 25C 4.02
Solucin buffer de BoratopH 10
J. T. Baker E48C14 pH a 25C10.03
Omeprazol Helm de Mxico OME0040699 ----------
Sacarina Sdica Sehyex SS235897 99.3%
Carboximetilcelulosa Farmacia Paris ----------- -------------
Bicarbonato de Sodio HELM de MxicoSA
S109042 99.5%
Esencia de fresa cremosa Deiman 1361DO6259 99.7-100.3%
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27
Cuadro 4. Lista de material, capacidad y marca
MATERIAL CAPACIDAD MARCA
Bureta 25 mL Pyrex
Pipeta volumtrica 1,2,5,10 mL Pyrex, Kimax
Vaso de precipitado 50, 100, 250, 1000mL
Pyrex, Kimax
Matraz volumtrico 10, 25, 50, 100 mL Pyrex, Kimax
Reservorio 1 L Wheaton
Equipo de filtracin 1L Millipore
Viales paraautomuestreador
Varian 410
2 mL Varian
Columna C18
150 x 4.6 mm
5m
----------
Thermo SCIENTIFIC
Probeta 100, 500, 1000 mL Pyrex
Soporte Universal ---------- ----------
Pinzas para bureta ---------- ----------
Barra magntica ---------- ----------
Embudo de vidrio Chico P.K.Mxico
Vaso de aceroInoxidable
500, 1000 mL ----------
Esptula de aceroinoxidable
---------- ----------
-
28
Cuadro 5. Lista de equipo y marca
EQUIPO MARCA
Cromatgrafo conautomuestreador
Varian Prostar
Modelo 410
Detector UV( 305 nm)
Varian Prostar
Modelo 325
Des-ionizador Milli-Q Millipore Synthesis
Bomba ternaria de baja presin Varian Prostar
Modelo 240
Balanza analtica OHAUS Explorer Pro
Modelo EP214C
Sonicador VRW MoDec 75D
Potencimetro Conductronic
Microbalanza METTLER MT5
Parrilla de agitacin ycalentamiento
Thermolyne
Cimarec 2
Bomba de vacio GAST
-
29
7. Diagrama de flujo
Fabricacin de la formulacinextempornea (Suspensin)
Desarrollo del mtodoanaltico por CLAR
Evaluacin de lascondiciones
Cromatogrficas yparmetros
cromatograficos
Validacin del mtodoanaltico
LinealidadPrecisin: Repetibilidad,precisin intermedia
Exactitud
RobustezEstabilidad de la muestra
Mtodo
Sistema
CumpleRepetirprueba
No
Si
CumpleNo
Si
Repetirprueba
Fin
Inicio
Linealidad
PrecisinAdecuabilida
d
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30
8. Metodologa
8.1 Preparacin de la Formulacin lquida de Omeprazol20, 21, 22, 23
Se preparo a una concentracin de 2 mg/mL
Cuadro 6. Formulacin Lquida
Formafarmacutica
Excipientes Cantidad empleada%
Suspensin
omeprazol 0.2bicarbonato de sodio 8.4carboximetilcelulosa 1
Esencia de fresa cremosa 0.5sacarina sdica 0.2
Agua c.b.p. 100mLCantidad a preparar 500 mL
Modo de preparacin 20
Equipo e instrumentos:
Vasos de acero inoxidable de 500 mL Esptula de acero inoxidable Balanza analtica
Precauciones de operacin
Mantener la velocidad (manual) de agitacin, constante durante todo elproceso de fabricacin.
Procedimiento de fabricacin
Se surti 1 g del omeprazol y se agrego al vaso de acero inoxidable Se agreg al vaso de acero inoxidable 42g de bicarbonato de sodio y
se adicionaron 200mL de agua, se agito hasta solubilizar. Se aadi 1g de sacarina sdica y se mezclo. Una vez incorporados se agregaron 5 g de carboximetilcelulosa poco
a poco con agitacin constante hasta completa incorporacin. Una vez que se incorporo la carboximetilcelulosa ,se adiciono 1.5 mL de
esencia de fresa cremosa y se agito, se completo el volumen para500mL
Se envaso seguidamente, en frasco mbar, llenando solo hasta pocoms de la mitad.
-
31
8.2 Desarrollo del Mtodo Analtico
8.2.1 Condiciones cromatogrficas
De acuerdo a la bibliografa consultada 3,5, 24,25 para el desarrollo del mtodoanaltico se probaron las siguientes condiciones:
- Equipo: Cromatgrafo Varian Prostar con automuestreador Modelo 410- Columna : Thermo Scientific C 18- Sistema : Isocrtico- Longitud de onda: 305 nm- Temperatura: ambiente- Flujo: 1mL/ min- Volumen de inyeccin: 50 L- Fase mvil tres proporciones diferentes: (50:50); (45:55) y (60:40)Buffer de fosfatos pH 7 0.01 M: Metanol- Tiempo de corrida: 10 min.
Se preparo una solucin de omeprazol y propilparabeno a una concentracinde 40 g/mL utilizando fase mvil para solubilizar.
8.2.2 Preparacin de la fase mvil 3,5,24,25
Buffer de fosfatos pH 7 0.01 M
Se peso en un matraz volumtrico de 1L 3.7553g de fosfato monobsico depotasio y 3.8690g de fosfato dibsico de potasio, se ajusto pH con cidofosfrico llevando a volumen con agua.
FASE MOVIL
Se utilizo una mezcla desgasificada y filtrada de:
Buffer de fosfatos pH 7: metanol HPLC con las siguientes proporciones:(50:50), (45:55), (60:40).
Para garantizar que el mtodo es selectivo para los analitos (omeprazol yestndar interno) y que no existan problemas como ruido en la lnea base,cambios en la fase mvil o se puedan encimar los tiempos de retencin, ascomo una mala resolucin de los cromatogramas, primero se corrieron porseparado las muestras y finalmente se probaron juntos los analitos.
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32
8.3 Validacin del mtodo analtico
8.3.1 Validacin del Sistema
a) Linealidad y Precisin del Sistema 8, 11
Se evaluaron 3 curvas con 5 niveles de concentracin partiendo de unasolucin stock
Preparacin de la solucin stock
Se pesaron 20 mg de omeprazol se transfiri a un matraz volumtrico de 100mL y se aforo con fase mvil. Obteniendo una concentracin final de 200 g/mL
Obtencin de las concentraciones:
Preparacin del estndar interno
Se utilizo como estndar interno propilparabeno, se pesaron 4 mg depropilparabeno el cual se transfiri a un matraz volumtrico de 10 mL llevandoal aforo con metanol HPLC, se tomo una alcuota de 1 mL de esta solucin yse transfiri a un matraz de 10 mL se aforo con fase mvil, esta solucin tuvouna concentracin de 40 g/mL.
Se adiciono el estndar interno a las soluciones de omeprazol en una cantidadde 2 mL antes de realizar el aforo.
Se inyectaron las soluciones preparadas en el mismo da, en las condicionessealadas en la metodologa especificada en el desarrollo del mtodo analtico.
Una vez obtenidos los cromatogramas, se calcul la respuesta para cada unode ellos, la cual se obtuvo con el rea bajo la curva del frmaco entre el reabajo la curva del estndar interno.
Solucin stock
200g/mL 44 g/mL
42 g/mL40g/mL38 g/mL
36 g/mL(1.8mL/10mL)
(1.9mL/10mL)(2.0mL/10mL)
(2.1mL/10mL)
(2.2mL/10mL)
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33
Se llev a cabo la correlacin de la respuesta vs. la concentracin del analito yse obtuvo el coeficiente de variacin, pendiente y ordenada al origen de lacurva.
Los criterios de aceptacin que se tomaron fueron una r2 0.98, y unCoeficiente de variacin en cada nivel de concentracin menor o igual a 2%.Con los resultados obtenidos se determino si todo el sistema analticofuncionaba correctamente.
b) Adecuabilidad8,11
Se inyecto por quintuplicado una solucin de la muestra al 100%.
Se calculo el Coeficiente de Variacin el cual debe ser menor o igual al 2% delanalito y se procedi a reportar el Factor de capacidad K>2, la Resolucin(R)>2 y nmero de platos tericos (N)>2000
8.3.2 Validacin del mtodo8, 11
a) Intervalo de trabajo
El intervalo de trabajo que se estableci fue en funcin de la especificacinmarcada en farmacopea 9 ed. 2008, la cual indica que es de 90-110%. Elintervalo se constituyo por cinco niveles, con puntos intermedio en comn.
Las concentraciones establecidas fueron: 36, 38, 40,42 y 44 g/mL
Obtencin de las concentraciones:
42 g/mL40g/mL38 g/mL
Suspensin
2000g/mL36 g/mL 44 g/mL
(1.8mL/10mL)
(1.9 mL/10mL)(2.0mL/10mL)
(2.1mL/10mL)
(2.2mL/10mL)
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34
b) Linealidad
Se prepararon cinco niveles de concentracin por cuadruplicado, preparadaspor pesadas independientes a las concentraciones establecidas en el rango.
Se determino el valor de la pendiente, ordenada al origen, coeficiente deregresin lineal el cual no debe ser mayor o igual a 0.98 y el coeficiente devariacin que debe ser menor al 2%.
c) Precisin
1. Repetibilidad
Se determino el coeficiente de variacin, el cual debe ser menor al 2%, de 6determinaciones al 100% de la concentracin de ensayo.
2. Precisin intermedia
Se analiz por triplicado una muestra homognea en dos das diferentescumpliendo el siguiente formato.
Cuadro 7. Precisin Intermedia
ANALISTA 1 ANALISTA 2
DA 1
DA 2
Se calcul el contenido de cada muestra reportando el coeficiente de variacintotal.
-
35
d) Exactitud
Se determino l % de recobro y el coeficiente de variacin en una muestrarealizada por sextuplicado.
e) Estabilidad de la muestra
Se determinaron tres condiciones de almacenamiento
a) Temperatura ambiente 25 C
b) Refrigeracin 5C
c) Luz (blanca)
Para que la muestra se considere estable en las diferentes condicionesevaluadas, los resultados obtenidos deben cumplir con una Fcal menor a Ftab.
f) Robustez
Para evaluar este parmetro se considero el cambio de lote del metanol gradoHPLC, as como el cambio de pH de la fase mvil.
Se prepararon soluciones correspondientes al 100% por triplicado para cadacambio considerado.
Se calculo la diferencia absoluta entre el promedio de cada condicininstrumental respecto a la condicin normal de operacin.
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36
9. Resultados y Anlisis de Resultados
9.1 Desarrollo del mtodo analtico
En este proyecto el objetivo fue Desarrollar y Validar un mtodo analtico porCLAE para la cuantificacin de omeprazol en una formulacin lquida, seplanteo un mtodo para el omeprazol, utilizando propilparabeno como estndarinterno, se emple como fase mvil una solucin buffer de fosfatos pH 7 0.01M y metanol en proporciones de (50:50), (55:45), (60:40), con una velocidadde flujo de 1mL/min a una longitud de onda de 305 nm con un volumen deinyeccin de 50 L. Las muestras se prepararon a una concentracin de40g/mL, se eligi una buffer de fosfatos debido a la solubilidad que poseenen agua lo cual no causara una obstruccin parcial en la columna y por endeno provocara una baja eficiencia en la misma as como no afectara su vidamedia, las sales de fosfatos tambin son indetectables casi invisibles en UV locual no causa interferencia con el analito de inters, y se observa en elsiguiente cromatograma.
Fig.5 Cromatograma de fase mvil buffer de fosfatos pH 7 0.01M: metanol
Los resultados que se obtuvieron inyectando juntos los analitos con lasproporciones de metanol- buffer de 50:50; 45:55 y 40:60 se presentan acontinuacin:
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37
Fig.6 Cromatograma de Omeprazol y propilparabeno, fase mvil buffer de fosfatospH 7 0.01 M: metanol en una proporcin de 60:40
Fig.7 Cromatograma de omeprazol y propilparabeno, fase mvil buffer de fosfatospH 7: metanol en una proporcin de 55:45
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38
Fig.8 Cromatograma de omeprazol y propilparabeno, fase mvil buffer de fosfatospH 7: metanol en una proporcin de 50:50
Se observa en el cromatograma de la Fig. 6 un solo pico que corresponde aldel omeprazol con un tiempo de retencin de 18.74 min. Un tiempo demasiadolargo ya que se programo un tiempo de corrida de 20 min como mximo, porello que no se encuentre el pico del estndar interno (propilparabeno), debidoa esto queda descartada esta proporcin de fase mvil ya que para los finesestablecidos es un tiempo excesivo de corrida esto tambin se debe a lapolaridad de la fase mvil ya que el metanol al tener una polaridad baja ysiendo este el que se encontraba en menor proporcin provoca que nuestrosanalitos se retengan, y den dichos tiempos por tal motivo se decidi subir laproporcin de metanol ( cromatograma Fig 7 ) se observa que el omeprazoltiene un tiempo de retencin de 9.21 min y el estndar interno (propilparabeno)un tiempo de 12.98 min los cuales no entran en el rango de 10 minutos decorrida propuestos, comparando estas dos proporciones se puede notar queentre mayor sea la proporcin de metanol la polaridad incrementaragradualmente dando tiempos de retencin menores debido a que se da unequilibrio entre la fase mvil y estacionaria, por lo tanto las muestras serntrasladadas por la fase estacionaria provocando que los analitos no seretengan demasiado en la columna, es as, que se decidi probar la proporcin50:50(cromatograma Fig 8) dando como resultado que el omeprazol saliera alos 6.55 min y el propilparabeno a los 8.43 min y a que solo se necesitabarecorrer un poco los picos para obtener un tiempo de 10 min. Finalmente fueesta proporcin la que fue factible para la validacin.
-
39
9.2 VALIDACIN DEL SISTEMA
a) Linealidad y Precisin del sistema
En la siguiente tabla se muestran los resultados de la linealidad y precisin delsistema.
Cuadro 8. Linealidad y Precisin del sistema
CRITERIO DEACEPTACIN
RESULTADO CUMPLE
Coeficiente dedeterminacin mayor o
igual a 0.98
0.99 SI
Coeficiente de variacinmenor o igual al 2%
1.72 % SI
Con los datos de linealidad se realizo una grafica de la linealidad del sistemarelacionando la concentracin contra la respuesta del equipo (rea bajo lacurva).
Fig. 9 Linealidad del Sistema
El cumplimiento de las pruebas realizadas, indican que la respuesta medida porel equipo (reas bajo la curva) para la cuantificacin de omeprazol son precisasy que a su vez existe una relacin lineal entre la concentracin de la muestra y
-
40
la respuesta medida por el equipo, esto nos garantizo que nuestro equipo seencuentra en buenas condiciones para su uso.
b) Adecuabilidad
Cuadro 9. Adecuabilidad del sistema
CRITERIO DEACEPTACIN
RESULTADO CUMPLE
Resolucin (R) > 2 3.18 SI
Factor de capacidad (K)> 2
2.65 SI
No. Platos tericos>2000 7324.47 SI
Cuadro 10. Resultados de la Adeucabilidad
El cumplimiento de las pruebas realizadas, indican que el sistema de medicinfunciona apropiadamente, independientemente de las condiciones ambientales.Garantizando que este se encuentra en buenas condiciones.
REA K NTP USP RESOLUCIN SELECTIVIDAD
57.4 2.69 7405.28 3.69 1.2557.2 2.65 7197.20 3.35 1.2257.4 2.63 7281.39 3.23 1.2257.4 2.64 7390.54 3.28 1.2357.3 2.64 7324.47 3.18 1.22
PROMEDIO 2.65 7324.47 3.18 1.22
n y DE MEDIA CV5 286.7 0.08944272 57.34 0.155986605
-
41
9.3 VALIDACIN DEL MTODO
Linealidad del Mtodo
Cuadro11. Linealidad del Mtodo
CRITERIO DEACEPTACIN
RESULTADO CUMPLE
Coeficiente dedeterminacin mayor o
igual a 0.98
0.98 SI
Coeficiente de variacinmenor o igual al 2%
1.55 % SI
Con los datos de linealidad se realizo una grafica de la linealidad del sistemarelacionando la concentracin contra la respuesta del equipo (rea bajo lacurva).
Fig. 10 Linealidad del Mtodo
a) Prueba de hiptesis para la ordenada al origen
-
42
Ho: b=0
Ha: b0
Estadgrafo de contraste t de student
r2 b m S2x Sy2 n
0.98 0.2686 0.0753 10 0.05806241 20 40
0.15870051
tcal= 0.581601161
Criterio de aceptacin
tcal ttabl.
=0.05 1-/2
ttabl.0.975,18=2.10092204
tcal ttabl.
-
43
0.581601161 2.10092204
Por consiguiente, se acepta Ho, comprobndose que la ordenada al origen esigual a cero, con un nivel de significancia de 0.05.
b) Prueba de hiptesis para la pendiente
Ho: m=0
Ha: m0
Estadgrafo de contraste t de student
r2 b m S2x S2y/x n
0.98 0.2686 0.0753 10 0.0251858 20
Criterio de aceptacin
tcal ttabl
6.537836745 2.10092204
Por consiguiente, se rechaza Ho, comprobndose que la pendiente es diferentea cero, con un nivel de significancia de 0.05.
-
44
c) Anlisis de varianza para la Regresin Lineal
Ho: El rea bajo la curva no depende de la concentracin
Ha: El rea bajo la curva depende de la concentracin
F.V. SC g.l. MC Fcal Ftabl(0.975,1,18)Regresin 1567788016 1 1567788016 726.861314 5.98Error 38824716.3 18 2156928.68
Criterio de aceptacin
Fcal Ftabl
=0.05
726.861314 5.98
Se rechaza Ho, por consiguiente el rea bajo la curva depende linealmente dela concentracin, con un nivel de significancia de 0.05.
En la linealidad del mtodo se puede observar que el coeficiente dedeterminacin que se obtuvo fue de 0.98 y el coeficiente de variacin de 1.55%esto nos indica que el mtodo es lineal teniendo una distribucin prcticamentehomognea.
Precisin del Mtodo
Repetibilidad
Cuadro 12. Repetibilidad del Mtodo
CRITERIO DEACEPTACIN
RESULTADO CUMPLE
Coeficiente de variacinmenor o igual al 2%
1.55 % SI
Dado que el parmetro de CV cumple el mtodo resulto ser muy preciso entrminos de repetibilidad.
-
45
Precisin intermedia
Cuadro 13. Precisin Intermedia
CRITERIO DEACEPTACIN
RESULTADO CUMPLE
Fcal Ftabl
F tabl: 7.57
A: 3.01369896 7.57
D: 2.1844121 7.57
AD: 0.30887379 7.57
SI
ABC
A1 A24.39590255 4.39545202
D1 4.54375 4.404986154.44519016 4.38189845
4.44004462 4.40697674D2 4.50056625 4.44574944
4.52572075 4.50931677
Prueba de hiptesis
a) Ho: no hay efecto del analista
Ha: si hay efecto del analista
b) Ho: no hay efecto del da
Ha: si hay efecto del da
c) Ho: no hay efecto del analista/da
Ha: si hay efecto del analista/da
-
46
Anlisis de Varianza
F.V g.l. SC MC Fcal F tablasA 1 0.00784358 0.007843584 3.01369896 7.57D 1 0.00568525 0.005685246 2.1844121
AD 1 0.00080389 0.000803888 0.30887379e 8 0.02082115 0.002602644
Criterio de aceptacin
Fcal Ftabl
Para:
Analista
3.01369896 7.57 Ho se acepta: no hay efecto del analista
Da
2.1844121 7.57 Ho se acepta: no hay efecto del da
Interaccin
0.30887379 7.57 Ho se acepta: no hay efecto del analista/da
Se cumple el criterio de aceptacin para la precisin intermedia. Lo cual indicaque el mtodo es preciso ya sea cambiando de analista y cambiando de da,bajo las mismas condiciones.
-
47
Exactitud
Cuadro 14. Exactitud del Mtodo
CRITERIO DEACEPTACIN
RESULTADO CUMPLE
% de Recobro de
98-102%
98.25-101.11 % SI
Se cumple el criterio de aceptacin indicando que el mtodo es exacto yaexiste la proximidad entre los resultados obtenidos por ese mtodo y el valorreal.
Estabilidad de la muestra
Cuadro 15. Estabilidad de la muestra
CRITERIO DEACEPTACIN
RESULTADO
REFRIGERACIN
5C
RESULTADO
LUZ
BLANCA
RESULTADO
T. AMBIENTE
25C
Fcal Ftabl
Ftabl 7.26
0.022 7.26 102.117.26 0.84 7.26
CUMPLE SI NO SI
Prueba de hiptesis
Ho: no existe diferencia significativa entre la muestra de anlisis y la condicinde almacenamiento
Ha: existe diferencia significativa entre la muestra de anlisis y la condicinde almacenamiento
a) Refrigeracin
-
48
Horas 0 6 24
ABC4.38189845 4.34082192 4.34495913
4.37305987 4.38189845 3.92680464
4.39545202 4.32987439 4.57380816
F.V g.l. SC MC F cal F tablTratamiento 2 0.01615031 0.00807516 0.2232366 7.26
Error 6 0.21703849 0.03617308Total 8 0.2331888
B) Luz blanca
Horas 0 6 24
ABC4.38189845 4.41514649 4.093766374.37305987 4.39269912 4.07676244.39545202 4.32987439 4.03962461
F.V g.l. SC MC F cal F tablTratamiento 2 0.19384711 0.09692356 102.113937 7.26
Error 6 0.00569502 0.00094917Total 8 0.19954214
c) Temperatura ambiente
Horas 0 6 24
ABC4.38189845 4.3455842 4.509316774.37305987 4.41514649 4.440044624.39545202 4.35365184 4.33389262
F.V g.l. SC MC F cal F tablTratamiento 2 0.00527367 0.00263683 0.84319738 7.26
Error 6 0.01876311 0.00312719Total 8 0.02403678
-
49
Criterio de aceptacin
Fcal Ftabl
Para:
Refrigeracin: 0.02232 7.26
Ho se acepta no existe diferencia significativa entre la muestra de anlisis y lacondicin de almacenamiento.
Luz blanca: 102.113937 7.26
Ho se rechaza, bajo las condiciones de estudio existe diferencia significativaentre la muestra de anlisis y la condicin de almacenamiento.
Temperatura ambiente: 0.84319738 7.26
Ho se acepta no existe diferencia significativa entre la muestra de anlisis y lacondicin de almacenamiento.
El tiempo que se dejaron las muestras fue de 0, 6 y 24, horas. Se eligieronesos tiempos debido a que el omeprazol es susceptible de degradacin-transformacin en medios de reaccin cida y neutra. La vida media dedegradacin del omeprazol en soluciones acuosas a valores de pH inferiores acuatro es menor de 10 minutos, a pH neutros la vida media es de 14 horas y apH mayores a este se mantiene estable22, de acuerdo con el resultado obtenidoel omeprazol result ser estable en la condicin de refrigeracin ( 5C) y atemperatura ambiente ya que cumple con los parmetros establecidos, sinembargo el resultado en luz blanca, no los cumple. Esto se debe a que elomeprazol al ser sensible a la luz blanca sufri degradacin, pudindosecuantificar ya no omeprazol si no alguno de sus productos, sin embargo al serrefrigerado( 5C) nos garantiza que el omeprazol no cambiar en gran medidaal ser almacenado por mnimo 24 hrs. Por ello la muestra debe ser conservadaen refrigeracin ( 5C) y protegida de la luz, antes de su anlisis, y seranalizada en un plazo de no ms de 24 horas siempre y cuando tenga un pHneutro.
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50
Robustez
Cambio de lote en Metanol
Cuadro 16. Robustez en cambio de Lote en el metanol
CRITERIO DEACEPTACIN
RESULTADO CUMPLE
La diferencia absolutade la media aritmticade la condicin dada,
respecto a la media dela condicin normal nodebe ser mayor de 2%
1.95% SI
Cambio de pH en fase mvil
Cuadro 17. Robustez en cambio de pH en la fase mvil
CRITERIO DEACEPTACIN
RESULTADO CUMPLE
La diferencia absolutade la media aritmticade la condicin dada,
respecto a la media dela condicin normal nodebe ser mayor de 2%
5.98% NO
De acuerdo a los resultados obtenidos en la robustez se determino que uncambio de lote en el metanol al preparar la fase mvil no afecta nuestrosresultados sin embargo, se debe ser cuidadoso con la pureza del metanol eneste caso siempre se debe utilizar un grado HPLC para asegurar que no se veaafectado el mtodo as como el equipo utilizado, en su lugar un cambio de pHsi afecta el mtodo utilizado esto se debe a que el pH en especial juega unpapel importante ya que una modificacin pequea en el pH puede ocasionarque los tiempos de retencin no sean constantes y esto puede originar uncambio en la eficiencia y resolucin de los picos obtenidos como se muestra enlos siguientes cromatogramas:
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Fig.11 Cromatograma de omeprazol y propilparabeno, fase mvil buffer de fosfatospH 7.08: metanol en una proporcin de 50:50
Fig.12 Cromatograma de omeprazol y propilparabeno, fase mvil buffer de fosfatospH 7.1: metanol en una proporcin de 50:50
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Cuadro 18. RESUMEN DE RESULTADOSVA
LID
AC
IN
DEL
SIS
TEM
APARAMETRO CRITERIO DE
ACEPTACINRESULTADO CUMPLE
LINEALIDAD r2 0.98 0.99 SI
PRECISIN C.V. 2% 1.72 SI
VALI
DA
CI
N D
EL M
ETO
DO
LINEALIDAD r2 0.98 0.98 SI
C.V. 2% 1.55 SI
PRECISIN C.V. 2% 1.55 SI
REPETIBILIDAD C.V. 2% 1.55% SI
PRECISININTERMEDIA
Fcal Ftabl
F tabl: 7.57 Fcal Ftabl
A: 3.01 7.57
D: 2.18 7.57
AD: 0.30 7.57
SI
EXACTITUD % Recobro98-102%
96.25-101.11% SI
ESTABILIDAD DELA MUESTRA
Fcal Ftabl
Ftabl 7.26
Refrigeracin5C 0.02 7.26 SI
Luz blanca 102.117.26 NO
T. ambiente25C 0.847.26 SI
ROBUSTEZ
La diferenciaabsoluta de lamediaaritmtica de lacondicindada, respectoa la media dela condicinnormal no debeser mayor de2%
Cambio delote
1.95% SI
Cambio depH
5.96% NO
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10. CONCLUSIONES
-Se logr desarrollar el mtodo analtico por CLAE para la cuantificacin deOmeprazol en una formulacin liquida.
-El mtodo analtico propuesto cumpli con los parmetros de validacindemostrando que dicho mtodo es confiable, especifico y capaz de cuantificarel activo de esta forma el proyecto puede ser utilizado en prcticas de docenciadentro de la carrera de Q.F.B.
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54
11. Referencias
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Portadandice1. Introduccin2. Fundamentos3. Planteamiento del Problema4. Objetivos5. Hiptesis6. Diseo Experimental7. Diagrama de Flujo8. Metodologa9. Resultados y Anlisis de Resultados10. Conclusiones11. Referencias