HPLC TU S2 2014

ANÁLISIS INSTRUMENTAL I PROFESORA: SRA. ZULEMA MALDONADO RIQUELME

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CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN (High Performance Liquid Chromatography, HPLC)

Cromatografía. Según define la IUPAC, “La Cromatografía es un método, usado primariamente para la separación de los componentes de la muestra, en la cual los componentes se distribuyen en dos fases, una de la cuales es estacionaria, mientras que la otra se mueve. La fase estacionaria puede ser un sólido, un líquido retenido sobre un sólido o un gel. La fase estacionaria puede ser extendida como una capa o distribuída como una película, etc. La fase móvil puede ser líquida o gaseosa”. Sin embargo, esta definición presenta restricciones como, por ejemplo, ante el desarrollo en los años 60 de la SFC, en la que la fase móvil no es ni un gas ni un líquido, sino un fluído supercrítico. Cromatografía Líquida de Alta Eficiencia o Alta Resolución, HPLC. La sigla HPLC en un comienzo se debió a “High Pressure Liquid Chromatography”, que hubo que cambiar a “High Performance Liquid Chromatography” cuando los cromatografistas se dieron cuenta de que la presión sólo constituía una herramienta que forzaba a la fase móvil a atravesar la columna, sin constituir una variable del sistema. Tipos de Cromatografía Líquida La cromatografía líquida puede desarrollarse en diferentes sistemas, en función de la forma física de la fase estacionaria. En la cromatografía en capa fina y en la cromatografía sobre papel dicha fase se extiende en forma de capa (cromatografía plana), mientras en la cromatografía en columna se empaqueta en una “columna”, que es un tubo relativamente delgado. Existen muchas maneras de clasificar la cromatografía líquida en columna. Basándose en la naturaleza de la fase estacionaria y en los procesos de separación, pueden enumerarse los tipos: Cromatografía Líquido – Sólido (LSC) o de adsorción.

Cromatografía Líquido – Líquido (LLC) o de partición.

Cromatografía de Fase Ligada (BPC).

Cromatografía de Intercambio Iónico (IEC).

Cromatografía de Exclusión por Tamaño (SEC).

Cromatografía Líquido – Sólido (LSC) o de adsorción. La fase estacionaria es un adsorbente y la separación se basa en repetidas etapas de adsorción – desorción. Este método emplea una fase estacionaria polar, sílicagel, y una fase móvil no polar, por ejemplo hexano. Cromatografía Líquido – Liquido (LLC) o de partición. Las moléculas de soluto se distribuyen entre dos líquidos: uno es la fase móvil, y el otro la fase estacionaria, que se encuentra homogéneamente dispersa en un soporte sólido, finamente dividido.


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Cromatografía de Fase Ligada (BPC). La LLC tuvo varios inconvenientes, derivados del tipo de fijación de la fase estacionaria al soporte (meramente mecánica), por lo que, la LLC ha sido casi totalmente desplazada. En la BPC se reemplazó el tipo de unión de la fase estacionaria a su soporte, haciéndola perdurable por medio de una unión química covalente. Así, el 90% de las separaciones cromatográficas modernas se efectúa sobre material químicamente modificado, el cual permite optar, según el reactivo empleado para su fabricación, entre materiales altamente hidrofóbicos o altamente hidrofílicos, con un amplio rango de polaridad y de selectividad: octadecilo, octilo, hexilo, butilo, etilo, ciano, diol, fenilo, amino, nitro, amonio cuaternario, etc. Cromatografía de Intercambio Iónico (IEC). En ella se emplean rellenos en los cuales la partícula está constituída por un polímero unido a un grupo funcional aniónico o catiónico (típicamente sulfónico para el intercambio de cationes, amonio cuaternario para el intercambio de aniones). La selección del tipo de grupo funcional permite escoger entre intercambiadores débiles y fuertes. Esta técnica se usa casi exclusivamente con muestras iónicas o ionizables. Cromatografía de Exclusión por Tamaño (SEC). Se emplea materiales de porosidad controlada, que funcionan como un filtro o tamiz y clasifica las moléculas de la muestra según un orden decreciente de tamaño molecular (las moléculas más grandes son las primeras en eluir, y las más pequeñas son la últimas). En cuanto a los dos primeros tipos, no siempre puede asegurarse cuál de los dos procesos implicados (adsorción o reparto) desempeña el papel más importante. Por esta razón, en la práctica se definen dos o más tipos, según sea la polaridad relativa de las dos fases: cromatografía en fase normal y cromatografía en fase reversa. En la cromatografía en fase normal, la fase estacionaria es de naturaleza fuertemente polar (por ej. Sílice) y la fase móvil es apolar (por ej. n- hexano o THF). Las muestras polares quedan retenidas en la columna durante tiempos mayores que los materiales menos polares o apolares. La cromatografía en fase reversa es exactamente a la inversa. La fase estacionaria es de naturaleza apolar (hidrocarburo), mientras la fase móvil, es un líquido polar, normalmente agua o un alcohol. En este caso, cuanto más polar sea la muestra, mayor será su retención. En la Figura 1 se representan estas dos técnicas, al tiempo que se indica el orden de elución de los distintos componentes de una muestra, en función de sus diferentes polaridades.


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Figura 1. Ilustración gráfica de la cromatografía líquida en fase normal y en fase reversa. Los círculos

representan los tipos de compuestos presentes en la muestra y su posición relativa en la dirección del flujo de la fase móvil indica su orden de elución.

Antecedentes generales. La cromatografía gas – líquido, G.C., que surgió en 1952 como continuación del trabajo sobre cromatografía líquido-líquido, L.C., presentaba la ventaja de la velocidad y la automatización. En la siguiente década su desarrollo fue espectacular, en especial desde que algunas muestras analizadas previamente por L.C. se pudieron analizar también por esta técnica. Sin embargo, muchas muestras de volatilidad insuficiente o térmicamente inestables no podían analizarse por G.C. Por tanto, en los años 60 se empezó a examinar la posibilidad de mejorar la técnica de L.C. Se pudo establecer la forma de superar la lentitud de la difusión de la fase líquida, comparada con la fase gaseosa. Para ello fue preciso utilizar partículas de mucho menor tamaño, lo que requirió el uso de mayores presiones de entrada, y de nuevos detectores capaces de operar a bajo caudal y de detectar pequeñas cantidades de sustancias. La moderna L.C. comparada con la clásica, se caracteriza por: columnas reutilizables de pequeño diámetro (2 – 5 mm)

rellenos de columna de partículas muy pequeñas (5-50 m) y desarrollo de nuevos materiales para usarlos como fases estacionarias.

Presiones de entrada relativamente altas y flujo controlado de la fase móvil. Introducción precisa de la muestra, sin necesidad de grandes cantidades. Detectores continuos especiales, capaces de operar a caudales muy bajos y de detectar cantidades muy

pequeñas. Instrumentos normalizados y automatizados. Análisis rápidos Alta resolución.


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Diagrama Básico de un sistema de HPLC La Figura 2 representa el esquema funcional de un equipo general de L.C.

Figura 2. Esquema funcional de un equipo moderno de HPLC. Los componentes básicos del equipo son:

Depósito de la fase móvil Una bomba para propulsar la fase móvil Un mecanismo para la introducción de la muestra Una columna que contenga la fase estacionaria Un detector para determinar la separación que tiene lugar y proporcionar datos que permitan

una evaluación cualitativa y cuantitativa de los resultados. Los equipos de HPLC pueden clasificarse en integrados y modulares. Depósito de la fase móvil Es el recipiente que contiene la fase móvil. Se ubica algunos centímetros sobre el nivel de la bomba para que la fuerza de gravedad dirija el solvente hacia ésta, manteniendo llenas las conexiones. Se utiliza como depósito cualquier frasco de laboratorio de buena calidad (de vidrio o polímero resistente), con una tapa adecuada para prevenir el ingreso de partículas al sistema. Los sistemas que necesitan procesos de desgasificación continua están provistos de una tapa especialmente diseñada, en la cual se puede encontrar un orificio para la entrada del gas inerte de desgasificación, otro para la salida del solvente y una válvula que permite una presión positiva del gas sobre el solvente venteando el exceso. La fase móvil en HPLC cumple un rol fundamental, ya que por sí misma puede modificar completamente la selectividad de las separaciones en fase normal y es a la vez, el verdadero motor de las separaciones en fase reversa. De hecho, esta es la principal diferencia que existe entre la GC y la HPLC, porque en G.C. la fase móvil es simplemente un portador de los solutos y su elección depende solamente del detector a utilizar. La única herramienta para modificar la selectividad de una separación es la columna y, por ello, suele utilizarse

DEPÓSITO DE FASE MÓVIL

BOMBA

FILTRO

INTRODUCCIÓN MUESTRA

MANÓMETRO

COLUMNA

DETECTOR PROCESADOR DE DATOS

COLECTOR FRACCIONES


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una columna para cada tipo de separación. En HPLC es posible lograr un número muy grande de diferentes separaciones con una columna, tan sólo variando la composición de la fase móvil.

Elección del Solvente Características: Poder solubilizante de las muestras Baja reactividad Ser compatible con el detector utilizado. Adecuado punto de ebullición. Tener baja viscosidad para reducir las caídas de presión. Seguridad Pureza y Estabilidad. En la actualidad se cuenta con productos de calidad de pureza cromatográfica. Transparencia óptica (cuando se usan detectores UV) Disponible comercialmente Precio Poder solubilizante de las muestras: Para inyectar la muestra es conveniente que el solvente de disolución sea la misma fase móvil. A veces no es posible, entonces debe tenerse en cuenta la miscibilidad entre el solvente de disolución y la fase móvil. Baja reactividad: Los solventes con un elevado grado de reactividad no se utilizan en HPLC, ya que pueden reaccionar con la muestra, la fase estacionaria o los componentes del equipo cromatográfico. Compatibilidad con el detector utilizado: El detector más usado es el espectrofotométrico, por lo que, es

habitual elegir un solvente transparente a la longitud de onda de trabajo. La transparencia se evalúa por la

de corte, , es decir, la longitud de onda a la cual la absorbancia del solvente, en una cubeta de 10 mm de

paso óptico, es igual a 1 unidad de absorbancia empleando aire como referencia. El metanol (c = 205 nm) y

el acetonitrilo (c = 190 nm), son los solventes más empleados en HPLC. La presencia de impurezas puede

aumentar el valor de la c; por ej., el hexano p.a. normalmente está contaminado con trazas de benceno, y no

puede usarse en HPLC a menores a 250 nm. Punto de ebullición: Se prefieren los solventes de p.e. intermedio. Si el solvente tiene un p.e. bajo su volatilidad es alta y la composición de la fase móvil puede variar. Solventes con alto p.e. se correlacionan, por lo general, con alta viscosidad, que es sinónimo de alta presión (menor vida media de los componentes del instrumento) y baja eficiencia. Baja viscosidad: La viscosidad de los solventes está estrechamente relacionada con la presión del sistema. Con solventes viscosos, la eficiencia de la separación es menos debido al que el coeficiente de difusión de la muestra se reduce, y se dificulta la transferencia de masa del soluto entre la fase móvil y la fase estacionaria. Seguridad: Debe evitarse el empleo de solventes que por sus características (inflamabilidad y toxicidad), representen riesgo para el operador. No se recomiendan por su alta toxicidad, sulfuro de carbono, benceno o tetracloruro de carbono.


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SOLVENTE CORTE UV nm

P.E. ºC

VISCOSIDAD cps a 25 ºC

Agua Acetona Acetonitrilo Ciclohexano Ciclopentano Cloroformo Cloruro de metileno Dimetilsulfóxido Dioxano Etanol n-heptano n-hexano Isooctano Isopropanol Metanol n-pentano n-propanol Tetrahidrofurano Tolueno

330 190 200 200 245 233 268 215 210 195 190 197 205 205 195 240 212 285

100 56 82 81 49 61 40 189 101 78 98 69 99 82 65 36 97 66 110

0.89 0.30 0.34 0.90 0.42 0.53 0.41 2.00 1.20 1.08 0.40 0.30 0.47 1.90 0,54 0.22 1.90 0.46 0.55

En la tabla anterior se presentan las propiedades de los solventes habituales de HPLC.

Pureza: Las impurezas pueden inducir modificaciones de la selectividad de la fase móvil y además contribuir a una señal de base importante en el detector.


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Propiedades químicas: La separación se produce por un balance de afinidades entre la muestra, la fase móvil y la fase estacionaria. Las propiedades químicas de la fase móvil son las que establecen el tipo y fuerza de interacción entre el solvente y la muestra, y por tanto, son determinantes de la separación. En la tabla siguiente se muestran propiedades importantes de algunos solventes: Índice de polaridad: es la resultante de todas las propiedades químicas e intenta medir

cuantitativamente la “fuerza” de interacción de los solventes frente a solutos polares. Fuerzas dispersivas: indican la polarizabilidad de una molécula y aumentan con el número de electrones

de la misma. Capacidad aceptora o donadora de protones: es una medida de la capacidad e las moléculas a

intercambiar protones. Momento dipolar: se refiere a la capacidad de una molécula para formar dipolos permanentes y está

estrechamente relacionado con la constante dieléctrica del solvente.


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Filtración y Desgasificación de solventes. Los solventes para HPLC, todos filtrados cuidadosamente en la fábrica, pueden: Acumular partículas en suspensión que pueden ser perjudiciales a los componentes del sistema HPLC.

Estas partículas en suspensión pueden venir de varias fuentes, incluso de la exposición al polvo en el aire durante el traspaso del solvente al depósito para solvente, la exposición a partículas del aire durante el almacenamiento del solvente en el depósito del solvente, la degradación lenta del recipiente solvente, o de condensación y polimerización del solvente.

Las partículas pueden ocasionar costosos daños a la bomba HPLC, y en general causar desgaste del

sistema de HPLC. Los fabricantes de los instrumentos tienen en cuenta este problema y recomiendan que se filtre y desgasifique los solventes HPLC antes de usarlos. En el instante que se abre una nueva botella de solvente para HPLC se expone el interior del solvente a la atmósfera y empieza a acumular gases disueltos que se encuentran en la atmósfera: El Oxígeno Disuelto que constituye el 21% de la atmósfera puede producir mayor interferencia en los

detectores de fluorescencia y electroquímicos. El Nitrógeno Disuelto es el otro componente de la atmósfera que puede producir burbujas en la columna

de HPLC y cuando el solvente entra al detector produce picos falsos y desviaciones de la línea base. El Dióxido de Carbono disuelto algunas veces puede ser la causa de los cambios de pH en el sistema de solvente.

Filtración de solventes en HPLC

La filtración de las fases móviles se considera parte de un tratamiento preventivo para cuidar el adecuado funcionamiento del equipo de HPLC.

La filtración se efectúa por medio de membranas de 0,45 ó 0,22 m de porosidad en equipos de filtración adecuados y es útil para eliminar tanto las partículas como las bacterias. La selección de la membrana, como se desprende de la siguiente tabla, depende de su compatibilidad con los solventes. Las soluciones a inyectar también deben filtrarse, idealmente a través de membranas semejantes a las empleadas para la fase móvil.


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Métodos de Desgasificación de Solventes en HPLC Existen cuatro métodos comunes usados para desgasificar solventes en HPLC previos a su uso: Reflujo Burbujear Helio Ultrasonido Vacío La cantidad de gas disuelto en un líquido depende de tres factores: temperatura, presión y afinidad La temperatura puede favorecer o no la disolución del gas en el líquido. Si el proceso de disolucíón es

exotérmico, el aumento de temperatura disminuye la solubilidad. La solubilidad del nitrógeno en agua disminuye con el aumento de temperatura, pero aumenta en el benceno.

La solubilidad de un gas en un líquido es directamente proporcional a la presión parcial que ese gas ejerce

sobre el líquido. Por ello si por algún método efectivo se reduce la presión, la cantidad de gas en solución disminuirá.

La cantidad de gas disuelto depende de su afinidad mutua. Si tanto en el gas como en el líquido las

fuerzas predominantes son las de Van der Waals, la solubilidad será mayor que en aquellos líquidos en los que predomine otro tipo de fuerzas, como puente hidrógeno, dipolo-dipolo, etc. Por ello, que gases como el oxígeno o nitrógeno, son más solubles en solventes como hexano, que en el agua.

Reflujo. Consiste en el calentamiento o la ebullición a reflujo de la fase móvil con la ayuda de agitación

durante unos 15 minutos. Así se eliminan prácticamente todos los gases disueltos. Se debe aplicar en forma continua para prevenir la redisolución de los gases atmosféricos. No puede emplearse en el caso de mezclas de solventes.

Burbujeo de un gas inerte. Se puede realizar en forma continua o por cortos períodos de tiempo. Se

realiza mediante una pieza de acero inoxidable sinterizado (“buzo”) con diámetro de poro de 2 a 10 m, y a un caudal de unos 80-100 mL/min. De esta forma, se logra un efectivo desplazamiento de los gases. Alcanzado el equilibrio, se reduce el caudal. Como el He es caro, es conveniente el uso de depósitos de solventes provistos de tapas con válvulas que permitan una cierta presión sobre la fase móvil para evitar la redisolución de los gases y que permita trabajar a un caudal constante de unos 50 mL/min.

Ultrasonido. El ultrasonido es una onda electromagnética producida por la propagación de un choque mecánico. Necesita un soporte material, no se propaga en el vacío y se caracteriza por la frecuencia, en los baños ultrasónicos de laboratorio se usan equipos en el rango entre 20 y 50 KHz. La onda se propaga a 20000 Hz dando lugar a la “cavitación”. Esto produce la limpieza de materiales en zonas de difícil acceso, la disolución de sólidos. Aplicado a la desgasificación de un líquido, no reduce la solubilidad de un gas disuelto y no puede expulsarlo sino cuando la solución está sobresaturada.

Vacío. Es el método más empleado. Se aplica junto al proceso de filtración. Se debe desgasificar a diario fases móviles que estén preparadas con anterioridad. Si se usa bomba de vacío, debe ser a prueba de explosiones (puede aspirar solventes volátiles de la fase móvil).


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Solventes y aditivos de fase reversa.

Las fases móviles de fase reversa están formadas por mezclas de solventes polares, en general agua, y un modificador orgánico (MeOH, acetonitrilo, THF) con o sin el agregado de aditivos (sales inorgánicas o reactivos de apareamiento iónico). Dioxano y THF se mezclan tanto con agua como con solventes no polares (cloroformo, hexano) y pueden considerarse tanto solventes de fase normal como de fase reversa. Agua. Es el más usado en HPLC. Se puede adquirir de calidad cromatográfica, o bien puede ser

purificada por el mismo usuario. El agua destilada y desionizada, pueden encontrar limitaciones en HPLC por la presencia de sustancias orgánicas (ftalatos, cloraminas, etc.) que no se eliminan por el tratamiento aplicado. Las columnas de fase reversa, muy hidrofóbicas, tienen afinidad por compuestos de baja polaridad.

Metanol. Es el modificador orgánico más utilizado en fase reversa, en mezclas con agua o buffers. Por su

mayor poder disolvente de sales y reactivos de apareamiento iónico se lo prefiere frente al acetonitrilo cuando es necesario utilizar altas concentraciones salinas. Es poco tóxico y el más barato de grado HPLC. Genera presiones algo mayores y tiene mayor afinidad por el oxígeno que el acetonitrilo.

Acetonitrilo. Tiene una selectividad muy diferente a la del MeOH y es una primera alternativa cuando se

busca cambiar la selectividad. El solvente grado HPLC se comercializa puro sin conservadores. Su baja c

(190 nm) lo hace el adecuado cuando hay que trabajar a cortas. Es caro. Tetrahidrofurano. Tiende a formar peróxidos, por lo que, se vende con antioxidantes (BHT,

hidroquinona), los que absorben en el UV. Dioxano. Tiene selectividad similar al THF, pero su alta viscosidad hace que no se emplee en HPLC,

salvo como aditivo en pequeñas proporciones.


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Aditivos. Numerosos métodos cromatográficos requieren el uso de sales en la fase móvil, para el control y regulación del pH o de la fuerza iónica. Deben tener un alto grado de pureza. Los fosfatos son muy usados en fase reversa como sales de sodio o potasio por su baja absorción UV

aún a longitudes de onda corta. Los buffers de acetato o citrato se usan menos, el primero porque presenta una alta absorción UV y, el

segundo, porque se compleja con la sílice de las columnas, reduciendo su vida útil. Si se desea recuperar el analito separado por L.C. se recomienda el uso de buffers de trifluoroacetato,

ya que es muy volátil y se elimina por aplicación de calor o vacío. Los modificadores orgánicos (metanol, acetonitrilo, etc.) actúan como inhibidores de crecimiento

bacteriano. Otros aditivos corrientes son los reactivos de apareamiento iónico, utilizados para el análisis de

sustancias orgánicas iónicas o ionizables. Básicamente, existen dos tipos de reactivos de apareamiento iónico: las sales de tetraalquilamonio empleadas para el análisis de solutos ácidos, y los alquilsulfonatos, para los solutos básicos. Ambos se emplean en baja concentración, entre 1 y 20 mM. Se debe tener presente que al usar estos reactivos, las columnas quedan “marcadas”, ya que no se logra eliminarlos completamene mediante el proceso de lavado, quedando modificada la superficie de las columnas y, por tanto, su selectividad. Solventes de fase normal En cromatografía de fase normal, donde se emplean solventes no polares, el problema más frecuente es

la desactivación de la columna de sílice o alúmina por adsorción de agua.

El agua adsorbida es responsable de los mecanismos mixtos de retención (partición y adsorción) y produce cambios profundos en la retención y selectividad.

Los solventes no polares que se usan en NP suelen tener trazas de agua. Debido a la baja solubilidad,

estas cantidades son muy pequeñas (0,09 % en cloroformo, 3,25 % en acetato de etilo), sin embargo, el agua resulta ser muy afín a la columna y comienza a concentrarse en la superficie del material de relleno.

El proceso de adsorción de agua es reversible. Para eliminar el agua de los solventes, se puede utilizar un desecante como el sulfato de sodio anhidro.


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Eteres Los éteres etílico, propílico e isopropilico tienen una alta presión de vapor, y son altamente inflamables. Son susceptibles de formar peróxidos, especialmente cuando son anhidros. Por ello, su empleo está muy

limitado en HPLC, aunque la selectividad que aportan impide sean descartados como solventes de elución.

Una alternativa menos riesgosa consiste en emplear metil-terbutiléter. Hidrocarburos alifáticos Son solventes muy transparentes a bajas longitudes de onda y poco viscosos, por lo que, son muy

apropiados para trabajar en HPLC. Sin embargo, suelen contener trazas de olefinas o benceno que dificultan su empleo por debajo de los 260

nm. Hidrocarburos halogenados Todos los compuestos halogenados pueden contener trazas de HCl o HBr, muy reactivos frente al acero

inoxidable. Estos contaminantes pueden eliminarse por pasaje a través de una columna de alúmina. Las mezclas de hidrocarburos halogenados con éteres y/o acetona son particularmente perjudiciales. El

CCl4 y el HCCl3, en mezclas con THF, acetona, dietiléter y alcohol isopropílico corroen el acero inoxidable, mientras que la corrosión no tiene lugar cuando se utilizan estos solventes en forma individual.

El cloruro de metileno es uno de los hidrocarburos halogenados más estables. Su degradación térmica en

aire seco se produce a temperaturas mayores a los 120 ºC. El HCCl3 se puede descomponer lentamente a la luz, en presencia o no de aire, formando fosgeno y HCl.

Para evitar esta descomposición se comercializa con el agregado de etanol como estabilizante en concentraciones de 0,5 a 1,0 %. La presencia de etanol modifica la polaridad y selectividad de la fase móvil, por lo que, los cromatogramas obtenidos utilizando HCCl3 con o sin estabilizador puede diferir.

El CCl4 prácticamente no se utiliza en HPLC, dado que es muy sensible a la ruptura oxidativa por

exposición al aire, humedad o luz y, además es un solvente muy tóxico. Preparación de las fases móviles. El trabajar con solventes de alto grado de pureza, implica también el empleo de materiales volumétricos

muy limpios. Se debe tener en cuenta la posible contracción de volumen, que se produce al mezclar solventes muy

polares. La alteración en la composición de la fase móvil debida a esto puede modificar los tiempos de retención de los analitos y, en casos críticos, superponer picos que en condiciones apropiadas serán separados.

La fase móvil luego de preparada, debe ser filtrada y desgasificada.


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Bombas Los requisitos o aspectos más importantes que debe reunir una bomba o sistema de bombeo en HPLC son rigurosos: Debe producir presiones estables hasta 6000 psi. Mantener el flujo libre de pulsaciones Generar intervalos de caudales de flujo (0,1 a 10 ml/min) Control y reproducibilidad del flujo de solvente. Componentes de la bomba resistentes a la corrosión (acero inoxidable o teflón) Las bombas que se usan en HPLC se pueden clasificar según su funcionamiento y diseño en: Reciprocantes o recíprocas. De desplazamiento continuo Neumáticas Bombas recíprocas Se utilizan en aproximadamente el 90 % de los sistemas de HPLC. Existen varios tipos: de un solo pistón, de dos pistones, de tres pistones y bomba a pistón y diafragma. Consisten generalmente en una pequeña cámara en la que el disolvente es impelido por el movimiento de

vaivén de un pistón accionado por un motor. Normalmente la válvula de entrada se ubica en la parte inferior y la de salida en la parte superior del

cabezal de la bomba. Este sistema permite que las burbujas que accidentalmente entren al sistema sean fácilmente eliminadas.


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El volumen de la cámara del pistón es pequeño. Este volumen permite cambiar fácilmente la fase móvil, y

disminuye el tiempo de demora para hacer efectivo un cambio de la composición de solvente durante un gradiente de elución.

La unión entre el cabezal de la bomba y el pistón se efectúa por medio de una junta de material inerte

(grafito o teflón) llamada sello, que facilita el desplazamiento del pistón y evita la pérdida de fase móvil. Las bombas recíprocas tienen la desventaja de que producen un flujo con pulsaciones, que se deben

amortiguar dado que su presencia se manifiesta como ruido en la línea base en el cromatograma.

Entre las ventajas de las bombas recíprocas se pueden citar su pequeño volumen interno (35 a 400 L), sus altas presiones de salida (por encima de los 10.000 psi), su fácil adaptación a la elución con gradiente, y sus caudales constantes, que son prácticamente independientes de la contrapresión de la columna y de la viscosidad del disolvente.


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La bomba de un solo pistón es la más sencilla: Impulsa a la fase móvil en ciclos alternados dados por los ciclos de llenado y vaciado de la cámara de

bombeo. En uno de los ciclos el pistón entrega el solvente contenido en la cámara y en el ciclo complementario

cierra su comunicación con la columna y toma solvente del depósito. Es evidente que cuando la bomba llena la cámara del pistón, el caudal se discontinúa. Este proceso se

visualiza como un pulso, no deseable, ya que durante este ciclo no circula fase móvil. Se reduce este inconveniente con el empleo de atenuadores de pulso, consistentes en una cámara

flexible, que se llena y entrega el solvente acumulado cuando no recibe solvente del pistón.


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Bombas de desplazamiento continuo o bomba jeringa. Consisten en unas grandes cámaras como una jeringa, equipadas con un émbolo que se activa por un

mecanismo de tornillo accionado mediante un motor. Producen un flujo que tiende a ser independiente de la viscosidad y de la contrapresión y, además, el flujo

que resulta está libre de pulsaciones, ya que la cámara no necesita ser recargada. Las desventajas incluyen una capacidad de disolvente limitada (alrededor de 250 mL) e incomodidad para

el cambio de disolventes.

Bombas neumáticas. En las bombas neumáticas más simples, la fase móvil se encuentra en un contenedor plegable colocado

en un recipiente que puede presurizarse mediante gas comprimido. Las bombas de este tipo son baratas y no provocan pulsaciones, aunque tienen una limitada capacidad y

presión de salida. Además el caudal depende de la viscosidad del disolvente y de la contrapresión de la columna. No son utilizables en la elución con gradiente y están limitadas a presiones menores de unos 2000 psi.


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Sistemas de Inyección de muestra o Inyectores. Estos sistemas han variado durante la historia del sistema de HPLC, en un principio de utilizaba la inyección de la muestra con jeringas de alta presión, las que ya están de desuso. Hoy se utiliza el sistema de Válvulas inyectoras. El inyector es el dispositivo que permite introducir la muestra sin interrumpir el caudal del solvente a través del sistema. El inyector debe reunir una serie de características importantes, entre ellas: Debe ser fácil de operar. Debe ser inerte al ataque químico y capaz de soportar altas presiones. Debe ser preciso en cuanto a la cantidad de muestra introducida en el sistema. No debe provocar diluciones importantes de la solución inyectada. En casos especiales puede requerirse que opere a altas temperaturas o que sea biocompatible, para lo

cual puede ser necesario que algunos de sus componentes sean de titanio o PTFE. Ya han sido descartados los inyectores de septum. Sus inconvenientes derivaban de: el desprendimiento del material del septum que obstruían la columna la contrapresión que debía vencerse al inyectar la muestra, lo que obligaba con caudales altos a su

interrupción momentánea. Válvulas

Hoy, los inyectores de HPLC son válvulas que orientan el caudal hacia la columna, pasando o no según su posición, a través de un loop en el cual se introduce la solución a inyectar. Pueden accionarse manual o automáticamente.

Están constituidas por un cuerpo fijo, un rotor con un sello que gira y un loop de muestra externo que

contiene la muestra. El loop es intercambiable, de modo que la cantidad de muestra inyectada puede escogerse entre una

serie de medidas estándar (en los inyectores convencionales, entre 5 y 2000 L)


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En la Figura se muestra las diferentes posiciones de una válvula de 6 vías. Para llenar el loop se gira el rotor hacia la posición de carga, obligando a la fase móvil a pasar

directamente a la columna. En este paso, la vía de inyección queda abierta y a presión atmosférica. Se llena el loop en forma completa o parcial por medio de una jeringa. Se vuelve a girar la válvula, obligando a la fase móvil a llegar a la columna a través del loop que contiene

la solución muestra, a la que arrastra hacia la columna.

Inyectores automáticos. Las válvulas de inyección de 6 vías se pueden accionar eléctrica o neumáticamente y se utilizan en la construcción de inyectores automáticos. La precisión obtenida es en general superior a la de los métodos manuales. Deben contener además de la válvula de inyección y del mecanismo que permite su llenado, un

dispositivo para colocar las muestras a inyectar (un carrusel que aloja viales)


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Las válvulas se accionan con motores eléctricos o por medios neumáticos ya sea empleando aire comprimido, nitrógeno o helio.

Columnas Se construyen generalmente con tubos de acero inoxidable, de diámetro interno uniforme. También se encuentran tubos de vidrio de paredes resistentes. Éstas se usan a presiones menores de 600 psi. Columnas analíticas. La mayoría tiene una longitud entre 10 y 30 cm. Comúnmente, son rectas y se pueden alargar, acoplando dos más columnas. El diámetro interno es a menudo de 4 a 10 mm.

Los tamaños de las partículas de los rellenos más usados son 3,5 y 10 m. La más usada es la de 25 cm de longitud y 4,6 mm de diámetro interno, y empaquetada con partículas de

5 m. Estas columnas tienen de 40.000 a 60.000 platos/metro. Las columnas de alta resolución tienen diámetros internos entre 1 y 4,6 mm y se rellenan con partículas

de 3 o 5 m. Su longitud es de 3 a 7,5 cm. Tienen hasta 100.000 platos/metro y presentan como ventaja la rapidez y mínimo consumo de disolvente.

Precolumnas. Para aumentar la vida de la columna analítica, se coloca delante una precolumna que elimina la materia

en suspensión y los contaminantes de los disolventes. En cromatografía líquido-líquido, la precolumna sirve para saturar la fase móvil con la fase estacionaria y

así minimizar la pérdida de ésta en la columna analítica. La composición del relleno de la precolumna debe ser semejante al de la columna analítica; el tamaño de

partícula es comúnmente mayor para minimizar la caída de presión. Tipos de relleno de la columna. Se han utilizado dos tipos de rellenos, pelicular y de partícula porosa. El pelicular consiste en bolas de vidrio o de polímero, no porosas y esféricas con unos diámetros

característicos de 30 a 40 m. En su superficie se deposita una capa delgada y porosa de sílice, alúmina o de resina de intercambio

iónico. Para algunas aplicaciones se aplica un recubrimiento adicional, constituido por una fase estacionaria

líquida que se mantiene fija por adsorción.


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Las bolas también se pueden tratar químicamente para obtener una capa superficial orgánica. Los rellenos peliculares se utilizan ampliamente en las precolumnas y no en las columnas analíticas.

Los de partícula porosa están formados por micropartículas porosas con diámetros entre 3 y 10 m y con la menor dispersión posible para un tamaño determinado.

Las partículas son de sílice, alúmina o resinas de intercambio iónico. Las de sílice se sintetizan aglomerando partículas de sílice de tamaños inferiores al micrón en unas

condiciones tales que se forman partículas mayores con diámetros muy uniformes. Termostatos. Muchas aplicaciones no necesitan un control estricto de la temperatura, y las columnas trabajan a

temperatura ambiente.

Muchas veces si se controla la temperatura de la columna en unas pocas décimas de grado centígrado, se obtienen mejores cromatogramas.

Actualmente, los instrumentos llevan hornos para las columnas que controlan la temperatura de la

columna a las décimas de grado, desde la temperatura ambiente hasta 150 ºC. Las columnas también se pueden colocar en camisas con agua que provenga de un baño a temperatura

constante, para controlar con precisión la temperatura. Detectores.

Permite “ver” y ubicar en tiempo y espacio la posición de cada componente de una muestra a la salida de la columna. Requisitos: Amplio rango dinámico de respuesta. Respuesta lineal. No contribuir al ensanchamiento de banda extracolumnar. Responder a todos los solutos. Sensibilidad apropiada. No afectarse por cambios de temperatura. Una buena relación señal/ruido. No destruir la muestra. Constante de tiempo baja. Tipos de detectores. Se clasifican en generales y selectivos.


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Detectores generales. Miden el cambio de alguna propiedad física de la fase móvil que contiene el analito en comparación con la fase móvil pura. Ejemplos: detector de índice de refracción detector de conductividad. Detectores selectivos.

Son aquellos sensibles a alguna propiedad propia del soluto. Ejemplos: el detector UV, que producirá una señal proporcional a la absorbancia del soluto a una longitud de onda

dada, el detector de fluorescencia, empleado para la detección de solutos con fluorescencia natural o conferida

por reacción con un reactivo fluorogénico, el electroquímico empleado para la detección de analitos que pueden oxidarse o reducirse ante la

aplicación de un potencial. Detectores Generales

Detector de Indice de Refracción. Mide la diferencia de indice de refracción entre el solvente puro y el solvente que contiene la muestra. Es un detector universal (ya que es muy improbable que el índice de refracción del soluto sea similar al

del solvente). No destructivo. Sin embargo, es muy poco sensible, lo cual limita su campo de aplicación y es muy afectado por cambios

de temperatura. No puede utilizarse con programación de solventes, porque el cambio de la composición de la fase móvil

se acompaña del cambio de su índice de refracción. Como consecuencia, no puede estabillizarse la línea base.

Existen varios diseños de estos detectores, pero solamente se usan ahora dos tipos: Tipo Fresnel Tipo Deflexión


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Detector de Indice de Refracción. Tipo Fresnel Es un detector diferencial que utiliza dos celdas, una de medición que es atravesada por el efluente de la

columna, y una celda de referencia por la cual fluye la fase móvil. Opera según la ley de Fresnel, que establece que “la cantidad de luz reflejada en una interfase

líquido/vidrio varía con el ángulo de incidencia y con el índice de refracción del líquido”.

Posee una celda de medición pequeña, del orden de los 3 L que está constituída por un prisma, una base de acero pulido y un sello de teflón entre ambos.

Para cubrir todo el rango de índice de refracción ( = 1,33 a 1,63) se utilizan dos prismas, el primero se utiliza con solventes de fase reversa y el segundo con solventes de fase normal.

Detector de Indice de Refracción. Tipo Deflexión Es un detector diferencial que, a diferencia del Fresnel, sólo usa un prisma para todo el rango de índices

de refracción, pero empleando celdas de mayor tamaño, del orden de los 8 a 10 L. El disolvente en su camino hacia la columna pasa a través de una mitad de la cubeta y el efluente de la

columna pasa por la otra mitad . Los dos compartimientos están separados por una placa de vidrio montada a un ángulo tal que si las dos

disoluciones difieren en el índice de refracción se produce una desviación del haz incidente. El desplazamiento del haz con respecto a la superficie fotosensible del detector provoca una variación de

la señal de salida, la que una vez amplificada y registrada, proporciona el cromatograma. La figura siguiente muestra un diseño típico de estos detectores.


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Detectores Selectivos Detector UV Es el detector más utilizado en HPLC. Posee buena sensibilidad y rango lineal. Permite detectar analitos en el orden de los nanogramos. No es destructivo y puede emplearse con gradientes de solventes, con la única limitación de que éstos

sean transparentes en la longitud de onda de trabajo. Para la medida de la absorbancia de los efluentes de la columna cromatográfica se usa una cubeta de

flujo en forma de Z. Para minimizar el ensanchamiento de banda extracolumna, el volumen de estas cubetas debe ser lo

menor posible,de modo que se limitan a volúmenes de 1 a 10 L.y las longitudes de la cubeta de 2 a 10 mm.

El uso de estas cubetas está restringido a presiones no mayores de 600 psi. A menudo, es necesario un

dispositivo para reducir la presión. Es un detector muy poco sensible a los cambios de caudal y de temperatura.


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Opera en el rango 190 a 350 nm, y en algunos equipos se puede extender a la zona visible del espectro (350 a 700 nm) recibiendo así el nombre de detector UV/Visible.

La concentración del analito en la muestra se determina por aplicación de la ley de Beer. Hay básicamente tres tipos: Detector de Longitud de Onda Fija Detector de Longitud de Onda Variable Detector de Arreglo de Diodos Detector de Longitud de Onda Fija o fotométrico

Opera a longitudes de onda prefijadas, determinadas por las líneas de emisión de su lámpara,

habitualmente de mercurio de baja presión. Como longitudes de onda de trabajo se utilizan las bandas de emisión de la lámpara de mercurio,

especialmente la línea intensa 254 nm. Para eliminar líneas de otras longitudes de onda se utilizan filtros de interferencia.

Suelen emplearse filtros que permiten trabajar a 313, 334, 365 nm. El empleo de filtros de óxido de fósforo permite trabajar incluso a 280 nm.

La lámpara de mercurio no emite a 280 nm, pero estos filtros al ser irradiados con la lámpara de mercurio,

emiten a esa longitud de onda. El cambio de lámpara permite incluso trabajar a otras longitudes de onda, por ejemplo, a 214 nm con una

lámpara de Zn, a 229 nm con una lámpara de Cd.


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Detector de onda variable o espectrofotométrico Es un espectrofotómetro, en el que se reemplaza el compartimiento de cubetas por una celda de flujo. Es más versátil que el de longitud de onda fija, ya que al tener red de difracción permite seleccionar

libremente la longitud de onda de trabajo. Se puede así escoger la longitud de onda de máxima absorción del analito para aumentar la sensibilidad de medición.

Emplea una lámpara de emisión continua, de Deuterio o de Xenón. Algunos instrumentos abarcan radiación UV y visible


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Detector de Arreglo de Diodos Emplea un sistema óptico invertido: la celda se ilumina con luz blanca, es decir, no monocromada. La luz emergente de la celda llega a la red de difracción y es dispersada hacia el elemento fotosensible,

que emplea un conjunto de fotoceldas o fotodiodos montados en un chip de silicio. Así, se consigue medir no sólo la luz transmitida a una longitud de onda, sino todo el espectro de absorción del efluente en tiempo real.

Este tipo de detector permite recoger los datos de un espectro completo en aproximadamente 1 seg. Así,

los datos espectrales para cada pico cromatográfico se pueden recoger y almacenar a medida que van saliendo de la columna.

Una de las formas de presentación de los datos espectrales, que resulta útil para la identificación de las

especies y para elegir las condiciones de determinación cuantitativa, consiste en un gráfico tridimensional.


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Detector de Fluorescencia. Este detector solamente puede detectar compuestos que tengan fluorescencia nativa o inducida por

derivatización con un reactivo fluorogénico. Su alta sensibilidad y selectividad lo hace adecuado para el análisis de trazas. La selectividad se debe a dos factores: 1) existen pocas sustancias de fluorescencia nativa y las

reacciones de derivatización implican la presencia de un grupo funcional derivatizable en la molécula del

analito y 2) se usan 2 , una de excitación y otra de emisión.

La luz emitida por la lámpara de Xe va al monocromador de excitación G1 por medio de un espejo cóncavo

M1, a través de la ranura de entrada S1. El haz monocromado sale por la ranura S2, se focaliza en un espejo esférico M2 e incide en un separador

de onda BS. De aquí la casi totalidad del haz luminoso entra en la celda de medida y un 7% incide en un

fotomultiplicador PM1 para el control de la intensidad. La emisión del haz luminoso que sale de la celda pasa al monocromador de emisión, formado por la

ranura de salida S3 y un espejo plano M3, una red de difracción cóncava G2 y una ranura de salida S4 siendo detectado por el fotomultiplicador PM2 que va a generar la señal de salida.

La lámpara de Xe es la fuente de emisión más difundida por producir un espectro continuo en el rango 260 a 660 nm y de muy alta intensidad.


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Detectores Electroquímicos. Se basan en cuatro métodos electroanalíticos que incluyen la amperometría, la voltamperometría, la

coulombimetría y la conductimetría. Muy sensible, unas 1000 veces más que el UV, y altamente selectivo (no sólo detecta compuestos

capaces de ser oxidados y reducidos, sino que puede reducirse el número de compuestos detectados por elección cuidadosa del potencial aplicado).

La detección de compuestos electrooxidables o electroreducibles ocurre en la superficie de un electrodo interpuesto en el paso del efluente de la columna.

Este detector emplea tres electrodos: el electrodo de trabajo, el de referencia y el auxiliar. La reacción redox es inducida en el electrodo de trabajo, mientras el electrodo auxiliar provee la carga de

neutralización complementaria. Entre estos electrodos se fija el voltaje apropiado para la detección. El electrodo de referencia produce un potencial fijo y estable contra el cual se mide el potencial del

electrodo de trabajo. Un potenciostato provee una diferencia de potencial estable entre el electrodo de trabajo y el auxiliar.

Un amplificador de corriente de nanoamperes produce una señal de salida, proveniente del flujo de corriente entre los electrodos auxiliar y de referencia, causada por la transferencia de electrones del proceso de óxido – reducción.

Es destructivo.

La principal limitación está dada por el tipo de fase móvil a emplear, que debe ser conductiva, limitando

su campo de aplicación a la cromatografía de fase reversa e Intercambio Iónico. Para la construcción de electrodos se emplean entre otros: pasta de carbón, carbón cristalino, platino oro

y mercurio. La desgasificación es muy importante en el modo “reductivo”, ya que la presencia de aire disuelto en la

fase móvil da lugar al gasto de potencial en la reducción de ese oxígeno, generando señales ruidosas y baja sensibilidad de detección. Se recomienda la desgasificación continua, por burbujeo con Helio.


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El hierro y sus óxidos presentes en la fase móvil en forma de iones provenientes de tuberías, válvulas, etc, son electroquímicamente activos, y pueden también producir corrientes de fondo. Resulta conveniente agregar EDTA 0,01 M a la fase móvil para complejar estos iones. Se deben tener algunas precauciones con los detectores electroquímicos para asegurarse análisis reproducibles:

Chequear que estén conectados adecuadamente a tierra la bomba, el detector e integrador. Usar bombas reciprocantes de doble pistón Mantener en todo momento el flujo de la fase móvil en el detector. Operar con el voltaje adecuado Monitorear la altura de los picos para observar cambios en la eficiencia que nos indique la necesidad de

reacondicionar los electrodos. Tener electrodos de referencias extras y reemplazar el electrodo de referencia en la celda 1 ó 2 veces a

la semana. Desconectar el detector electroquímico cuando esté limpiando las columnas. Utilizar agua, buffers y solventes orgánicos de alta pureza.


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Detección por espectrometría de masas, E.M. El acoplamiento de la cromatografía de líquidos con la E.M, (la primera se trabaja con volúmenes relativamente grandes y en la segunda se requiere de vacío), se ha realizado mediante diversas interfaces: En una, el efluente de la columna se divide y sólo una pequeñísima fracción se introduce directamente en

el espectrómetro de masas. También la utilización de columnas microcapilares, con caudales de 10 a 50

L/min. En otra interfaz, se puede depositar el efluente de la columna sobre una cinta o alambre que se mueve

continuamente y que transporta el solvente y el analito hacia una cámara calorífica para la eliminación del solvente por volatilización, luego los residuos del analito sobre la cinta o alambre pasan a la zona de ionización, donde tiene lugar la desorción y la ionización.

Otra, que se denomina termovaporizador, permite la entrada de todo el efluente, con caudales de hasta 2

mL/min, el líquido se vaporiza al pasar por un tubo capilar (acero inoxidable) calentado y forma un chorro de aerosol de solvente y analito. En el aerosol el analito se ioniza. Se puede aplicar a moléculas de analitos polares.

En la detección por E.M. se emplea el control y almacenamiento de datos por computador.

Programación del Solvente Existen dos métodos de programación de solvente en HPLC: 1. Isocrático: se usa una única sustancia como fase móvil durante el análisis de una mezcla de dos o más

sustancias, ajustando adecuadamente las características de la fase. 2. Elución por Gradiente: Es un término que se utiliza para describir el proceso mediante el cual se cambia

la composición de la fase móvil.

La elución por gradiente se utiliza con muestras cuyos componentes posean polaridades muy diferentes, pues en estos casos es preferible variar la polaridad de la fase móvil durante el análisis con el fin de mejorar la separación de los componentes que eluyen en último lugar.

En general, pero no necesariamente, se empieza con una sustancia única y se aumenta con el tiempo

la concentración del otro componente (o componentes) de la fase móvil. La figura siguiente representa el esquema funcional del sistema que efectúa las mezclas y suministra la fase móvil a la columna.


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Esquema funcional de un equipo para la elución por gradiente.

La selección de los líquidos usados como fase móvil depende de varios parámetros. En las cromatografías de adsorción y de partición, el papel más importante lo desempeña la polaridad, pero también son importantes la viscosidad y otras características que pueden influir en el funcionamiento del detector. En la cromatografía de intercambio iónico son importantes la fuerza iónica y el pH, mientras en la cromatografía de exclusión la consideración primordial es la solubilidad de la muestra en la fase móvil. En cromatografía líquida es corriente hablar de disolventes débiles y fuertes (fases móviles o componentes de la fase móvil respectivamente débiles o fuertes). Sin embargo, pueden conducir a error ya que su significado depende de la fase estacionaria: En la cromatografía en fase normal y en la de adsorción, en las cuales la fase estacionaria es

generalmente más polar que la fase móvil, un “disolvente débil” es menos polar que el otro componente de la fase móvil.

En la cromatografía en fase reversa, en la cual la fase móvil es más polar que la fase estacionaria, un

“disolvente débil” es más polar que el otro componente de la fase móvil. Existen dos tipos de formadores de gradientes: Los de baja presión Los de alta presión


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Los gradientes de baja presión emplean, en general, sólo una bomba y válvulas solenoides que entregan cada solvente en una cámara de mezclado de pequeño volumen.

La fase móvil “Instantánea”, es decir, la que se crea en ese preciso instante en base al programa deseado,

es entregada a la bomba. Este sistema permite mezclar 2 a 4 solventes individuales, regulando el ciclo de apertura de cada válvula

individual. La ventaja principal de los sistemas de baja presión está dada por el costo (ya que sólo es necesaria una

bomba impulsora) y por la precisión lograda en los extremos del gradiente, ya que todo el caudal es entregado por el mismo dispositivo.

Este sistema requiere la desgasificación continua para cada solvente individual. Esto se debe a que la

solubilidad de los gases en los solventes individuales es en general diferente de su solubilidad en la mezcla deseada.

Sistema de formación de gradiente de baja presión.


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Los gradientes de alta presión utilizan una bomba de alta presión para cada solvente individual. Cada bomba es comandada por un programador, y el solvente entregado se mezcla a alta presión en una

cámara de bajo volumen y dirigido hacia el sistema. El principal inconveniente de este sistema reside en el costo, ya que cada solvente necesita su bomba

impulsora. Las bombas deben ser exactas y precisas para que el gradiente mantenga su calidad en toda su

extensión, en especial a bajos caudales: Por ejemplo, si se emplean dos bombas para crear un gradiente lineal con un caudal de 1,0 mL/min, en

los extremos de 0 a 5% del gradiente una bomba entregará 0 hasta 0,05 mL/min. La otra bomba entregará ese caudal cuando la primera entregue más del 95% del programado.

Cuando se desarrolla un análisis usando el método de gradiente se deben tener presentes dos objetivos: Obtener la mejor resolución de los componentes de la muestra en el menor tiempo posible. Asegurar alta precisión y exactitud.

Sistema de formación de gradiente de alta presión.

HPLC TU S2 2014

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