Cuaderno de prácticas de Técnicas Bioquímicas

Cuaderno de

prácticas

Aurora Criado MonteroCurso 2010.2011

FUNDAMENTOS Y TÉCNICAS DE

ANÁLISIS BIOQUÍMICOS

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Cuaderno de Prácticas de Análisis Bioquímicos FTBQ

Determinación cuantitativa de glucosa por el método de la glucosa oxidasa (GOD) (Método de Trinder)

ObjetivoDeterminar en una muestra problema la concentración de glucosa, utilizando para ello el

método de Trinder de la glucosa oxidasa (GOD).

Fundamento teóricoEstá basado en la capacidad de la Glucosa Oxidasa (GOD) para catalizar la oxidación de la

glucosa a ácido glucónico y peróxido de hidrógeno:

El peróxido de hidrógeno liberado, en presencia de Peroxidasa (POD), reacciona con un cromógeno (4-aminofenazona), por la reacción de Trinder, para dar una quinona, que absorbe entre 492 y 550 nm:

La intensidad del color formado es proporcional a la concentración de glucosa presente en la muestra. Es, por tanto, un método colorimétrico.

Por este método pueden analizarse muestras de suero o plasma, libre de hemólisis, y líquido cefalorraquídeo (LCR). Nosotros para realizar la práctica usamos como muestra un suero de control humano (spintrol® normal) que ya estaba preparado, que lleva muchos componentes con concentraciones conocidas, en el intervalo normal, y que normalmente sirve para controlar la exactitud o precisión de las técnicas.

Material. Reactivos Matraz Erlenmeyer Micropipetas Cubetas de vidrio de 1 cm de paso óptico Kit de Glucosa Trinder GOD-POD de Spinreact®, que incluye un reactivo R1 Tampón (TRIS

pH 7,4 y fenol), un reactivo R2 Enzimas (GOD, POD y 4-aminofenazona) y un patrón primario de glucosa (GLUCOSA CAL).

Suero control humano normal de Spinreact® (SPINTROL H NORMAL) Suero control humano patológico de Spinreact® (SPINTROL H PATOLÓGICO) Agua destilada desionizada

FUNDAMENTOS Y TÉCNICAS DE

ANÁLISIS BIOQUÍMICOS

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Procedimiento1. Se prepara el reactivo de trabajo (RT) disolviendo el contenido de un vial de R2 Enzimas

(lleva GOD, POD y 4-aminofenazona) en un frasco de R1 tampón (TRIS pH 7,4 y Fenol). Se tapa y se mezcla suavemente hasta disolver su contenido.

2. Se pipetea en cubetas de 1 cm de paso óptico, marcadas como B (blanco de reactivos), P (patrón, con una cc de glucosa de 100 mg/dL) y M (muestra de spintrol® normal), los siguientes reactivos:

Blanco Patrón

Muestra

RT (mL) 1,0 1,0 1,0Patrón de glucosa (µL) - 10 -Muestra Normal (µL) - - 10

3. Se mezclan bien y se deja incubando 15 minutos a temperatura ambiente. El patrón y la muestra presentan un color rosado.

4. Se ajusta el espectrofotómetro a cero de absorbancia a una =505 nm con el blanco de reactivos (B), y se hace la lectura de absorción a esta longitud de onda para los tubos Patrón y Muestra.

Resultados. CálculosLas lecturas de Absorbancia a 505 nm fueron las siguientes:

A505

Patrón 0,340Muestra 0,251

De manera que:

Observaciones. ConclusionesEste resultado, que se encuentra dentro del límite de linealidad del método (500 mg/dL), sin

embargo, queda fuera de los valores de glucosa que contiene la muestra de suero control humano normal, que son de 102 mg/dL (87-117 mg/dL).

Como el EFM tiene un portacubetas con cierta holgura desde una posición a otra, repetimos la lectura en un Fotómetro, obteniéndose los siguientes resultados:

A505

Patrón 0,340Muestra 0,256

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con lo que:

Pero este resultado tampoco es bueno. Posibles problemas que hemos podido encontrar: mala reconstitución del suero control o mal estado del mismo, patrón de glucosa contaminado, incorrecto pipeteado de los reactivos, mal calibrado de las pipetas, etc.

Ante estos resultados se decide REPETIR LA PRÁCTICA, pero esta vez con patrón, muestra de suero problema, suero de control normal y suero de control patológico. Se descongela la muestra de suero problema, y los sueros de control, humano y patológico, se reconstituyen para la práctica (añadir 5 ml de agua destilada al liofilizado, disolver en agitación suave evitando la formación de espuma y dejar reposar 30´). Además se van a hacer las lecturas de absorbancia a 505 nm en EFM y en FM. Se obtienen los siguientes resultados:

ESPECTROFOTÓMETRO FOTÓMETROMedida1 Medida2 Medida3 MEDIA Medida1 Medida2 Medida3 MEDIA

Patrón 0,399 0,377 0,373 0,383 0,377 0,382 0,373 0,377Spintrol N 0,332 0,301 0,299 0,311 0,299 0,307 0,303 0,303Spintrol P 0,754 0,792 0,739 0,762 0,729 0,738 0,734 0,734Muestra 0,344 0,267 0,263 0,291 0,264 0,269 0,265 0,266

Calculando la concentración de glucosa (en mg/dL) en los sueros de control y en la muestra tendremos:

EFM FMSpintrol N 81,20 80,37Spintrol P 198,9

6194,69

Muestra 75,98 70,56

Los valores reales de concentración de glucosa en los sueros de control humano normal y patológico son:

Spintrol N: [Glucosa] = 102 mg/dL (87-117 mg/dL)

Spintrol P: [Glucosa] = 272 mg/dL (231-313 mg/dL)

que como podemos observar son muy diferentes de los obtenidos con este método.

Los valores obtenidos en la muestra problema de suero se encuentran, en ambos casos, dentro del valor normal de glucemia (60-110 mg/dL).

Como los controles fueron preparados para esta práctica y no podemos achacar el problema a la mala conservación del spintrol reconstituido, puede haber un error en la conservación del spintrol liofilizado o que esté caducado. Por otra parte, aunque intentamos

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controlar los errores en el pipeteado y en la calibración de las pipetas, seguimos trabajando con el mismo patrón de glucosa y este pudiera estar en mal estado.

Por tanto, no podemos tener seguridad de que los valores de [glucosa] en la muestra problema sean los reales.


Determinación cuantitativa de glucosa por el método de la hexoquinasa (HK)

ObjetivoDeterminar en una muestra problema la concentración de glucosa, utilizando para ello el

método de la hexoquinasa (HK).

Fundamento teóricoEs el método de referencia para la determinación de glucosa.

La hexoquinasa (HK) cataliza la fosforilación de la glucosa por ATP a glucosa-6-fosfato:

Este producto, en presencia de glucosa-6-P deshidrogenasa (G6P DH), se transforma en 6-fosfogluconato y reduce el NAD+ a NADH:

Como el NADH absorbe a 340 nm, el incremento de absorbancia a esta longitud de onda está relacionado con el aumento en la concentración de NADH en el medio, que será proporcional a la concentración de glucosa presente en la muestra.

Este método enzimático no es colorimétrico, ya que la medida de absorbancia se hace en la región UV del espectro. Por este método se pueden analizar muestras de suero, plasma libre de hemólisis y orina. Nosotros utilizaremos sueros control humanos (spintrol® normal y patológico).

Material. Reactivos Matraz Erlenmeyer Micropipetas Tubos eppendorf Cubetas de vidrio de 1 cm de paso óptico Kit de Glucosa Hexokinasa de Spinreact®, que incluye un reactivo R1 Tampón (TRIS pH

7,5, ATP y Mg2+), un reactivo R2 Enzimas (Hexokinasa, Glucosa-6-fosfato Deshidrogenasa y NAD+) y un patrón primario de glucosa (GLUCOSA CAL)

Suero control humano normal de Spinreact® (SPINTROL H NORMAL) Suero control humano patológico de Spinreact® (SPINTROL H PATOLÓGICO) Agua destilada desionizada

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Procedimiento1. Se reconstituyen los sueros control humanos, el normal y el patológico, con 5 mL de agua

destilada cada uno. Se disuelven en agitación suave, evitando la formación de espuma. Se dejan reposar 30 minutos a temperatura ambiente antes de su uso. Los repartimos en tubos eppendorf, 20 tubos con 250 µL cada uno para cada suero, anotando en el mismo la referencia y el lote del control, y los conservaremos en el congelador, en el que son estables hasta un mes desde su reconstitución.

2. Se prepara el reactivo de trabajo (RT) disolviendo el contenido de un vial de R2 Enzimas (lleva HK, G6P-DH y NAD+) en un frasco de R1 tampón (TRIS pH 7,5, ATP y Mg2+). Se tapa y se mezcla suavemente hasta disolver su contenido. El RT se conserva estable 1 mes en la nevera.

3. Pipeteamos 1 mL del RT en una cubeta de vidrio de 1 cm (al estar muy cerca de la zona visible, aquí no absorbe la cubeta), que marcaremos como B, y será el blanco de reactivos que será común para todos. Si la absorbancia de B a 340 nm fuese 0,30, esto indicaría que el RT estaría deteriorado, pero no es el caso porque lo acabamos de preparar.

4. Cada uno de nosotros pipetea en cubetas de vidrio de 1 cm de paso óptico, marcadas como P (patrón, con una cc de glucosa de 100 mg/dL), MN (muestra de spintrol® normal) y MP (muestra de spintrol® patológico), los siguientes reactivos:

Patrón Muestra Normal Muestra PatológicaRT (mL) 1,0 1,0 1,0

Patrón de glucosa (µL) 10 - -Muestra Normal (µL) - 10 -Muestra Patológica

(µL)- - 10

5. Se mezclan bien y se dejan incubando 10 minutos a temperatura ambiente.6. Se ajusta el espectrofotómetro a cero de absorbancia a una =340 nm con el blanco de

reactivos (B), y se hace la lectura de absorción a esta longitud de onda para los tubos Patrón y Muestras. Las lecturas en el EFM las hicimos siempre de menor a mayor absorbancia, con lo que primero leíamos la muestra normal, luego el patrón y finalmente la muestra patológica.

Resultados. Cálculos. ObservacionesLas lecturas de Absorbancia a 340 nm en el espectrofotómetro fueron las siguientes:

A340

Aloia Aurora Fátim Marcial Rebeca

http://www.google.es/imgres?imgurl=http://alvaroofspain.files.wordpress.com/2010/08/tubos-de-ensayo.png?w=400&h=324&imgrefurl=http://alvaroofspain.wordpress.com/tag/universo/&usg=__TMXc9c1gvmlyNVCPvlxk600vmG8=&h=324&w=400&sz=170&hl=es&start=90&zoom=1&tbnid=8PmLjmskMOYhtM:&tbnh=114&tbnw=146&prev=/images?q=tubos+de+ensayo+y+colores&um=1&hl=es&biw=1260&bih=539&tbs=isch:1&um=1&itbs=1&iact=hc&vpx=984&vpy=89&dur=671&hovh=202&hovw=250&tx=178&ty=117&ei=hePZTMuRCt2G4gb0jeWHCQ&oei=2eLZTL6rE8a2hAeT1bXPAg&esq=5&page=5&ndsp=23&ved=1t:429,r:6,s:90

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aPatrón 0,33

80,365 0,370 0,394 0,349

Muestra Normal 0,268

0,336 0,344 0,344 0,272

Muestra Patológica 0,802

0,859 0,818 0,852 0,733

De manera que:

Teniendo en cuenta que la concentración de glucosa en el patrón era de 100 mg/dL, tendremos:

[glucosa]muestra (mg/dL)Aloia Aurora Fátim

aMarcial Rebec

aMEDIA

Muestra Normal 79,29 92,05 92,97 87,31 77,94 85,91Muestra Patológica

237,28 235,34 221,08

216,24 210,03 223,99

La concentración de glucosa que había en los controles era la siguiente:

[glucosa]normal =102 mg/dL (87-117 mg/dL) [glucosa]patológico = 272 mg/dL (231-313 mg/dL)

Vemos que todos los resultados son muy inferiores al valor real, e incluso algunos quedan fuera del intervalo de concentración. Los valores medios también quedan fuera del rango. Esto puede deberse a fallos en el pipeteado, a que el portacubetas del espectrofotómetro tiene una cierta holgura entre las posiciones de las cubetas que pueda originar fallos en la lectura, o lo que parece más probable, a que el patrón de glucosa esté contaminado y los controles de suero normal y patológicos estén en mal estado antes de reconstituirlos. Vamos a repetir todas las mediciones en el fotómetro.

Las lecturas de Absorbancia a 340 nm en el fotómetro fueron las siguientes:

A340

Aloia Aurora Fátima Marcial RebecaPatrón 0,350 0,357 0,370 0,350 0,414Muestra Normal 0,285 0,333 0,334 0,339 0,332Muestra Patológica 0,822 0,856 0,808 0,842 0,797

[glucosa]muestra normal (mg/dL) 81,43 93,28 90,27 96,86 80,19 Media: 88,41

[glucosa]muestra patológica (mg/dL) 234,86 239,78 218,38 240,57 192,51 Media:

10


225,22

Seguimos encontrando que todos los resultados son inferiores al valor real, y sigue habiendo valores que se encuentran fuera del intervalo de concentraciones de los sueros control. Incluso la media de la concentración de glucosa en el suero patológico está fuera del intervalo. Pero, en general, los resultados son mejores que con el espectrofotómetro (la media de la [glucosa] en el suero normal está dentro del intervalo de concentración).

Esto puede deberse a fallos en los reactivos (patrón de glucosa contaminado, mala conservación y/o reconstitución de los sueros control) o fallos en el calibrado de las pipetas, ya que Aloia y Rebeca usaron la misma pipeta de 10 µL, y ambas se encuentran siempre fuera del intervalo de concentraciones. Además, hay muchas diferencias entre los valores obtenidos con el espectrofotómetro y el fotómetro, lo que puede deberse a la holgura en el portacubetas del EFM que produce errores en la lectura o a que no está bien calibrado el EFM, cosa poco probable porque en una práctica anterior se comprobó que estaba bien calibrado.

Determinación cuantitativa de proteínas totales por el método de Biuret

ObjetivoDeterminar en una muestra problema la concentración de proteínas totales, utilizando para

ello el método de Biuret.

Fundamento teóricoEs el método de referencia para la determinación de proteínas totales.

Las proteínas en presencia de sales de cobre, y en un medio alcalino que contiene yoduro como antioxidante, forman un complejo de color violeta azulado, que absorbe a 540 nm:

Proteínas + Cu2+/m.OH Complejo violeta azulado

La intensidad del color es directamente proporcional a la cantidad de proteínas totales presentes en la muestra. Como la medida de absorbancia se realiza en la región visible del espectro, este es, por tanto, un método colorimétrico.

Por este método se pueden analizar muestras de sangre, suero o plasma, mientras que el análisis de proteínas en orina se realiza mejor por otro método. Nosotros utilizaremos muestras de suero de control humano (spintrol®), normal y patológico, que habíamos preparado previamente y conservábamos en el congelador.

Material. Reactivos Micropipetas Cubetas de vidrio de 1 cm de paso óptico (grandes 3,5 mL y pequeñas 1,5 mL)

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Kit de Proteínas totales Biuret de Spinreact®, que incluye un reactivo R Biuret (Tartrato de sodio y potasio, yoduro sódico, yoduro potásico y sulfato de cobre(II)) y un patrón primario de albúmina bovina (T PROTEIN CAL)

Suero control humano normal de Spinreact® (SPINTROL H NORMAL) Suero control humano patológico de Spinreact® (SPINTROL H PATOLÓGICO)

ProcedimientoComo en las prácticas anteriores habíamos detectado algún posible problema con el calibrado

de las pipetas, en esta práctica vamos a intentar comprobar si es cierto o no, y para ello marcamos las pipetas amarillas con un 1 y 2 y las pipetas azules también las marcamos como 1 y 2. Por otra parte, como vamos a usar dos tipos de cubetas (grande y pequeña), aunque con el mismo paso óptico, también registraremos ese dato. Finalmente, como también habíamos notado diferencias entre las medidas en el EFM y en el FM, haremos las lecturas de absorción con los dos aparatos: en el espectrofotómetro se mide A a 540 nm, mientras que en el fotómetro se harán a 546 nm, que es la longitud de onda más cercana en la que podemos medir.

1. Se prepara un blanco de reactivos (B) con la pipeta azul-2, añadiendo 1 mL del Reactivo Biuret a una cubeta pequeña. Este blanco de reactivos será común para todos. Se aprovecha además para añadir con esta misma pipeta 1 mL de reactivo Biuret a todas las cubetas que vamos a usar (de patrones y muestras)

2. Se preparan dos patrones (P), pipeteando además 25 µL del patrón de albúmina Bovina (con una [albúmina] = 7 g/dL), con pipetas amarillas 1 y 2, para que cada persona utilice el que necesite. Se marcarán como P1 y P2.

3. Cada uno preparará las muestras normal (MN) y patológica (MP). Particularmente, utilizaré cubetas pequeñas y la pipeta amarilla-2. Pipeteo en las cubetas, que ya contenían el reactivo R, 25 µL del spintrol® normal y del spintrol® patológico.

4. Se deja incubar todo 10 minutos a temperatura ambiente.5. Se ajusta el espectrofotómetro a cero de absorbancia a una =540 nm con el blanco de

reactivos (B), y se hace la lectura de absorción a esta longitud de onda para los tubos Patrón y Muestras. Las lecturas en el EFM las hicimos siempre de menor a mayor absorbancia, con lo que primero leíamos la muestra patológica, luego la muestra normal y finalmente el patrón.

6. Se repite la operación, pero esta vez en el fotómetro, ajustando el cero de absorbancia con el blanco de reactivos a 546 nm.

Resultados. Cálculos. ObservacionesLos resultados obtenidos fueron las siguientes:

A540

(EFM)A546

(FM)

Marcial(cubeta g)

P1

MNMP

0.4770.4320.323

0.4860.4430.333

Aloia(cubeta g)

P1

MN0.4790.448

0.4850.459

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MP 0.338 0.343

Rebeca(cubeta p)

P1

MNMP

0.4950.4430.310

0.4810.4410.310

Fátima(cubeta g)

P2

MNMP

0.5400.4880.372

0.5420.4930.375

Aurora(cubeta p)

P2

MNMP

0.4620.4620.337

0.4590.4580.335

De manera que:

[Proteínas]totales (g/dL)

(EFM) (FM)Marcial

(cubeta g, pipeta 1)MNMP

6,344,74

6,384,80

Aloia(cubeta g, pipeta 1)

MNMP

6,554,94

6,624,95

Rebeca(cubeta p, pipeta 1)

MNMP

6,264,38

6,424,51

Fátima(cubeta g, pipeta 2)

MNMP

6,334,82

6,374,84

Aurora(cubeta p, pipeta 2)

MNMP

75,11

6,985,11

Valor medioMNMP

6,4964,798

6,5544,842

La concentración de proteínas que había en los controles era la siguiente:

[proteínas]normal = 6,41 g/dL (5,62-7,20 g/dL) [proteínas]patológico = 4,56 g/dL (4-5,12 g/dL)

Con lo que se puede observar:

- Todos los valores se encontraban dentro del rango de concentración de proteínas- Las medidas fueron mejores en el espectrofotómetro- Con respecto al suero patológico, en casi todos los casos se obtenían valores de

concentración superiores al real, por lo que es de suponer que no estaba bien reconstituido.- Respecto a las pipetas, no se observan variaciones claras entre la 1 y la 2- Respecto a las cubetas tampoco hay diferencias entre las cubetas grandes y las pequeñas

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Determinación cuantitativa de proteínas totales en orina por medidas de absorción en el UV

ObjetivoDeterminar en una muestra problema de orina la concentración de proteínas totales,

aprovechando la propiedad que tienen las proteínas de absorber luz UV, y mediante una recta de calibrado.

Fundamento teóricoEste método de cuantificación de proteínas se basa en el hecho de que los enlaces

peptídicos de las proteínas pueden absorber luz en la región UV (sobre los 270 nm).

Para calcular la concentración de una solución utilizando la ley de Lambert-Beer existen dos formas:

- Por comparación con una disolución patrón de concentración conocida (lo que hemos hecho hasta ahora)

- Mediante una recta de calibración, que se construye midiendo las absorbancias de varias soluciones patrón de concentración conocida, de manera que con la medida de absorción de la muestra problema e interpolando en la recta de calibrado podemos obtener la concentración de la muestra problema. Esto es lo que vamos a hacer en esta práctica.

Este método presenta muchas interferencias, ya que hay muchas sustancias que absorben a esta longitud de onda, por lo que no sirve para cuantificar proteínas totales plasmáticas; pero sí es adecuado para la determinación de proteínas totales en orina, ya que la concentración de proteínas totales es pequeña y hay pocas interferencias. Este método tiene una exactitud, sensibilidad y precisión aceptables.

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Material. Reactivos Matraces aforados de 50 mL y de 20 mL Pipetas graduadas Micropipetas Cubetas de cuarzo de 1 cm de paso óptico Patrón primario de albúmina bovina (T PROTEIN CAL) de Spinreact® Ácido tricloroacético al 30% Agua destilada desionizada

Procedimiento1. A partir de una disolución patrón de proteínas, que contiene albúmina con una

concentración de 7 g/dL, prepararemos las distintas disoluciones patrón de la siguiente manera:

A partir de esta disolución madre vamos a obtener 8 disoluciones más:

Todas las disoluciones se enrasan con agua desionizada. Se homogeinizan bien las disoluciones teniendo cuidado para que no se formen muchas burbujas.

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2. Preparamos un blanco de agua (B) para poner a cero el espectrofotómetro, para lo cual se pipetea 1 mL de agua en una cubeta de cuarzo, ya que las medidas se harán en la zona UV.

3. Para realizar las lecturas de A a 280 nm en el espectrofotómetro de las distintas disoluciones, como no disponemos de tantas cubetas de cuarzo, se irán haciendo las medidas desde la más diluida a la más concentrada, y enjuagando la cubeta que usemos, primero en agua y luego en la propia disolución que vayamos a medir.

4. Se construye la recta de calibrado con los valores obtenidos5. Se mide la absorbancia de una muestra problema preparada por la profesora con agua y

una concentración determinada de proteínas, con lo que usamos el mismo blanco de agua. Se interpola el resultado en la recta de calibrado para determinar su concentración.

6. Se mide la absorbancia de una muestra de orina y mediante la recta de calibrado se determina su concentración.

Resultados. Cálculos. ObservacionesLas medidas de absorbancia a 280 nm de las diferentes disoluciones patrón fueron las

siguientes:

[proteínas](mg/dL)

10,5 21 31,5 42 52,5 84 105 157,5 210

A280 nm 0,079 0,156 0,228 0,307 0,384 0,612 0,761 1,099 1,475

Construimos con los datos la recta de calibrado:

0.0 20.0 40.0 60.0 80.0 100.0120.0140.0160.0180.0200.0220.0240.0260.00.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

1.6

f(x) = 0.00707673211464681 xR² = 0.999710356297228

[proteínas totales] (mg/dL)

Ab

sorb

anci

a

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La absorbancia de la muestra problema a 280 nm fue de 0,248. Interpolamos esta absorbancia en la recta de calibrado:

0,248=0,0071× [ proteínas ]→ [ proteínas ]=34,93mg /dL

Al no conocer la concentración de proteínas real en la muestra problema no podemos decir si el procedimiento fue bueno o no.

La absorbancia de la muestra de orina a 280 nm fue de 3,000, que es el límite del aparato, por lo que está fuera del rango de medida. Ahora bien, en la medida utilizamos un blanco de agua, que era útil cuando se utilizaban disoluciones acuosas de proteínas, pero no tiene sentido con la muestra de orina. Por tanto, vamos a realizar un blanco de muestra (orina sin proteínas):

- Se centrifuga la orina a 357g durante 5 minutos: eliminamos así las células y cristales que puedan estar presentes

- Se precipitan las proteínas con ácido tricloroacético al 30% (no da A a 280 nm)- Se centrifuga nuevamente para eliminar las proteínas

Se hace la lectura de absorbancia de la muestra de orina, utilizando este blanco de muestra para ajustar a 0 el EFM, y nuevamente sale 3,000.

Diluimos entonces la orina, dilución 1:8 (500 µL orina + 3,5 mL agua destilada), y repetimos el proceso. Nuevamente sale una A de 3,000, con lo que por falta de tiempo dejamos aquí la práctica.

17


Ç

Determinación cuantitativa de proteínas totales en orina mediante turbidimetría

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ObjetivoDeterminar en una muestra problema de orina la concentración de proteínas totales,

mediante turbidimetría, y utilizando para ello una recta de calibrado.

Fundamento teóricoEl análisis de proteínas totales en orina puede realizarse por varios métodos. En la práctica

anterior se cuantificaron las proteínas urinarias mediante medidas de absorción en el UV, y en esta vamos a utilizar un método turbidimétrico.

Este método se basa en que las proteínas desnaturalizadas con ácido sulfosalicílico permanecen un tiempo en suspensión antes de precipitar, lo que hace que la muestra de orina se vuelva turbia. Si se mide la intensidad de la luz transmitida, al mismo ángulo de incidencia, después de que un haz de luz atraviese esta suspensión, cuanto mayor sea la concentración de partículas, mayor es la dispersión y menor es la intensidad de la luz transmitida. Si se mide la intensidad transmitida con un espectrofotómetro y se construye una recta de calibrado con soluciones patrón de concentración conocida, es posible calcular la concentración de proteínas.

Las medidas de absorbancia en el EFM las haremos a 492 nm, por el tamaño de las proteínas en suspensión.

Este método tiene gran exactitud y precisión.

Material. Reactivos Micropipetas Cubetas de vidrio de 1 cm de paso óptico Patrón primario de albúmina bovina (T PROTEIN CAL) de Spinreact® Ácido sulfosalicílico al 3% Agua destilada desionizada

Procedimiento1. Utilizaremos las disoluciones patrón de concentración conocida de la práctica anterior,

que se prepararon de la siguiente manera:

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A partir de esta preparamos ocho disoluciones más:

2. Se prepara un blanco de reactivo (BR), para poner a 0 el EFM cuando se realicen las medidas de absorbancia con las disoluciones patrón, para lo cual en una cubeta de vidrio se añade 1 mL de agua destilada desionizada y 1 mL de ácido sulfosalicílico al 3%.

3. A 1 mL de cada una de las disoluciones patrón, en cubetas de vidrio, se les añade 1 mL de ácido sulfosalicílico, para desnaturalizar las proteínas.

4. Se realizan las lecturas de absorción a 492 nm en el EFM de las diferentes disoluciones.5. Se construye la recta de calibrado.6. Se centrifuga 4 mL de muestra de orina, para evitar que las células que puedan estar

presentes dispersen y produzcan interferencias, y se recoge el sobrenadante.7. A continuación se diluye la muestra en la proporción 1:4 y se prepara en cubetas de

vidrio para el análisis el blanco de muestra(BM) y la propia muestra(M): BM: (200 µL orina centrifugada + 800 µL agua desionizada) + 1 mL agua desionizada M: (200 µL orina centrifugada + 800 µL agua desionizada) + 1 mL de ác. sulfosalicílico

8. Se ajusta a 0 el EFM con el blanco de muestra y se hace la lectura de absorción de M a 492 nm.

9. Se interpola el resultado en la recta de calibrado para conocer la concentración de proteínas en la orina diluida. Si tenemos en cuenta el factor de dilución, se puede deducir la concentración de proteínas en la muestra de orina problema.

Resultados. Cálculos. ObservacionesLas medidas de absorbancia a 492 nm de las diferentes disoluciones patrón fueron las

siguientes:

[proteínas](mg/dL)

10,5 21 31,5 42 52,5 84 105 157,5 210

A280 nm 0,248 0,395 0,697 0,981 1,184 1,609 1,695 1,935 2,048

Construimos con los datos la recta de calibrado:

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Se ven dos líneas de tendencia en los datos, y como la turbidez es estable unos pocos minutos, podría pensar que se debe a que ha pasado tiempo desde que se añadió el ácido y han podido precipitar las proteínas desnaturalizadas.

Se ajusta el espectrofotómetro a 0 con el blanco de muestra y se obtiene que la absorción de la muestra de orina diluida es de 0,106, por lo que interpolando en la recta de regresión correspondiente se obtiene que:

0,106=0,0207. [ proteínas ]

[ proteínas ]=5,12mg /dL [ proteínas ]muestraorina=20,48mg /dL

Nota.- Se repitieron las medidas de absorbancia de las disoluciones patrón y de la muestra de orina diluida pasados 10 minutos con las cubetas grandes, pero la variación en las absorbancias era tan apreciable, que no registro los datos en esta práctica.

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Electroforesis de proteínas séricas en acetato de celulosa

ObjetivoSeparar las diferentes fracciones de las proteínas séricas mediante electroforesis en acetato

de celulosa y posterior obtención del proteinograma por fotodensitometría.

Fundamento teóricoLa electroforesis es una técnica de separación en la cual una partícula cargada se hace

desplazar a través de un medio aplicando un campo eléctrico: si la partícula está cargada positivamente (catión) migrará hacia el polo negativo (CÁTODO), si la partícula está cargada negativamente (anión) migrará hacia el polo positivo (ÁNODO).

Las proteínas del suero se pueden separar mediante esta técnica. Sus puntos isoeléctricos están entre 4,9 (Albúmina) y 7,4 (Gammaglobulinas). Así, al realizar la electroforesis con un tampón de pH=8,6 todas las proteínas tendrán carga negativa. La albúmina, al tener el pI más alejado del pH, tiene más carga negativa y avanza más rápido, quedando más cerca del polo positivo que las gammaglobulinas, que migran muy poco por ser el pH próximo a su pI. Las restantes proteínas séricas quedan situadas entre estas dos.

Las fracciones de proteínas séricas se pueden visualizar por tinción.

Se puede realizar el análisis cuantitativo de cada fracción por fotocolorimetría. Se cortan las distintas fracciones electroforéticas de la tira después de la decoloración y se colocan en tubos de ensayo. Se añade una solución disolvente (ácido acético al 80%), 9 mL de solución para la albúmina y 3 mL para cada globulina, y se leen con un fotómetro a 620 nm para el Negro Amido. Si

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conocemos la concentración de proteínas totales de la muestra, y mediante cálculos sencillos, se puede calcular la concentración de cada fracción.

También se puede realizar una cuantificación de cada fracción por fotodensitometría, después de transparentar las tiras de acetato de celulosa. De esta manera se obtiene el proteinograma, en el que el área bajo las curvas es proporcional a la concentración de cada fracción.

En los individuos normales existe un patrón electroforético clásico, en el que aparecen 5 bandas proteicas al separarse (Albúmina, alfa-1-globulinas, alfa-2-globulinas, beta-globulinas y gamma-globulinas) con determinadas alturas, relacionadas con su concentración. Cuando existe alguna anomalía, se modifican las concentraciones de alguna o algunas proteínas séricas, lo que se traduce en una variación de la fracción proteica en la que migran. Por ello, es una técnica útil en el diagnóstico clínico.

Nosotros utilizaremos un suero normal y uno patológico, para poder ver la diferencia en los proteinogramas.

Material. Reactivos Cubeta y puente de electroforesis Fuente de alimentación Tiras de acetato de celulosa (Cellogel) Papel de filtro Aplicador individual semi-micro Cubetas Pinzas Placas de vidrio de tamaño adecuado a las tiras de acetato de celulosa. Tubos de ensayo Pipetas graduadas Cubetas de vidrio de 1 cm de paso óptico Tampón TRIS Hipurato Buffer pH=8,8 Colorante Negro Amido 10B Decolorante de Negro Amido: 47,5 mL metanol + 47,5 mL agua + 5 mL de ácido acético Solución Transparentadora A y B: mezclar 9 partes de A (870 mL metanol + 30 mL

ciclohexanona) y 1 parte de B (100 mL ácido acético) Solución Disolvente: ácido acético al 80%

ProcedimientoELECTROFORESIS:1. Sumergir las tiras de acetato de celulosa en tampón TRIS Hipurato Buffer pH = 8,8

durante 10-15 minutos antes de su uso, para su equilibrado2. Retiramos las tiras y eliminamos el exceso de tampón poniendo las tiras entre dos hojas

de papel de filtro, con cuidado de que no se sequen por completo 3. Extender las tiras sobre el puente de la cubeta de electroforesis de modo que la

superficie penetrable quede hacia la parte superior. El lado penetrable es el que se ve

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cuando la tira se coloca en vertical delante de nosotros con el corte en la esquina inferior derecha

4. Cargar la muestra en la bandeja de carga, seleccionando una distancia entre pocillos adecuada para el ancho de la tira y el aplicador. Depositar con ayuda del aplicador las muestras de suero en cada tira, procurando no coger muestra en exceso. Cargamos dos tiras: tira A, con dos muestras, la normal y la patológica, y la tira B, con una muestra patológica, una muestra normal bien cargada, que utilizaremos, y una muestra normal mal cargada, con fines educativos.

5. Colocar el puente con la muestra cargada, teniendo cuidado de dejar la muestra en el cátodo, para que pueda correr hacia el ánodo.

6. Conectar la fuente de alimentación, aplicando una diferencia de potencial de 200V durante 35 minutos

REVELADO:7. Finalizada la separación, depositar las tiras, boca abajo, en una cubeta con solución

colorante Negro Amido, de modo que queden cubiertas por el líquido, durante 10-12 minutos

8. Preparar tres cubetas con solución decolorante de negro amido 1,2 y 3 (tienen distinta concentración).

9. Después de pasar las tiras a la primera cubeta y agitarlas durante unos minutos, se introducen en la número 2, se agitan unos minutos, y finalmente, se introducen en la cubeta 3 y se agitan unos minutos.

ESPECTROFOTOMETRÍA DE LA TIRA A:10. Una vez que se ha hecho la decoloración de la tira, se cortan las fracciones y se coloca

cada una en un tubo de ensayo11. Añadir 9 mL de ácido acético al 80% en el tubo de ensayo de la albúmina y 3 mL en los

tubos de ensayo de cada globulina.12. Preparar un BLANCO con ácido acético al 80% y un trozo de tira de acetato de celulosa

sin carga proteica, para eliminar las interferencias13. Se ajusta a 0 el espectrofotómetro con el blanco, y se realiza la lectura de absorbancia

de cada fracción a una longitud de onda de 620 nm.14. Determinamos cuantitativamente las proteínas totales en la muestra normal y en la

patológica (ver práctica de determinación cuantitativa de proteínas por el método de Biuret), realizando medidas de absorción a 540 nm de los complejos formados con el reactivo Biuret.

FOTODENSITOMETRÍA DE LA TIRA B:15. Deshidratar la tira B en un baño de metanol durante 1 minuto16. Sumergir la tira en una cubeta con solución transparentadora durante 1-2 minutos en

agitación17. Extender la tira entre dos placas de vidrio, y calentarla en la estufa a 60-70o durante 3-4

minutos.18. Dejar enfriar a temperatura ambiente durante 30 minutos, antes de retirar la tira19. Hacer una lectura de la tira con el fotodensitómetro

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Resultados. Cálculos. Observaciones

ANÁLISIS CUANTITATIVO MEDIANTE ESPECTROFOTOMETRÍA DE LA TIRA A

Las medidas de A620 nm de cada fracción de la tira A fueron las siguientes:

Muestra Fracción A620 nm Muestra Fracción A620 nm

Normal

Albúmina 0,155*3=0,465

Patológica

Albúmina 0,126*3=0,378α1-globulinas 0,024 α1-globulinas 0,015α2-globulinas 0,046 α2-globulinas 0,042β-globulinas 0.071 β-globulinas 0,036-globulinas 0,107 -globulinas 0,061

ATOTAL 0,713 ATOTAL 0,532 Hay que tener en cuenta que como la Albúmina se diluyó con 9 mL de disolvente, mientras que el resto se diluyó con 3 mL, habrá que corregir la absorbancia de la fracción de albúmina multiplicando por 3.

Y el porcentaje de cada fracción será:

Fracción Proteica

MuestraNormal

Muestra Patológica

Valores de referencia

Albúmina 65,22% 71,05% 57-65%α1-globulinas 3,37% 2,82% 1-4%α2-globulinas 6,45% 7,89% 6-10%β-globulinas 9,96% 6,77% 8-12%-globulinas 15,01% 11,47% 12,5-19,5%

Como se puede observar, en la muestra patológica la albúmina está aumentada, mientras que las β y -globulinas están por debajo de los valores normales .

Determinamos la concentración de proteínas totales en la muestra normal y en la patológica por el método de Biuret, de forma que las medidas de A a 540 nm y la concentración d eproteínas totales son:

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A540 nm [Proteínas totales]

Patrón 0,346 7 g/dL

Normal 0,446 9,02 g/dL

Patológica

0,418 8,46 g/dL

Podemos calcular entonces la concentración en g/dL de cada una de las fracciones:

Muestra Fracción [proteína] (g/dL)

Muestra Fracción [proteína] (g/dL)

Normal

Albúmina 5,88

Patológica

Albúmina 6,01α1-globulinas 0,30 α1-globulinas 0,24α2-globulinas 0,58 α2-globulinas 0,67β-globulinas 0,90 β-globulinas 0,57-globulinas 1,36 -globulinas 0,97

FOTODENSITOMETRÍA DE LA TIRA B

Los proteinogramas obtenidos para la muestra normal y la muestra patológica fueron los siguientes:

MUESTRA NORMAL MUESTRA PATOLÓGICA(Gammapatía monoclonal)

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Determinación de %HbA1c por cromatografía de intercambio iónico

ObjetivoDeterminar el %HbA1c de una muestra problema de sangre y de un control de HbA1c

normal mediante cromatografía de intercambio iónico y espectrofotometría de absorción a 415 nm.

Fundamento teóricoLa cromatografía de intercambio iónico en microcolumna es un método que separa las

variantes de hemoglobina por la carga eléctrica. La resina de intercambio catiónico (cargada negativamente), que constituye la fase estacionaria, retiene a la hemoglobina cargada positivamente. Como la Hb glicosilada (HbA1c) tiene más carga positiva que el resto de hemoglobinas, al añadir un tampón con un pH y fuerza iónica determinados eluyen todas las hemoglobinas excepto la A1c, y se desechan. Después, simplemente variando la fuerza iónica y/o pH del tampón eluyente se consigue cambiar la carga de la proteína y eluir de forma específica la hemoglobina glicosilada.

Como la hemoglobina absorbe a 415 nm, mediante lecturas espectrofotométricas a esa longitud de onda podemos determinar la absorbancia debida a las hemoglobinas totales y la debida a la HbA1c, previamente separada. Por comparación de ambas medidas se puede determinar el % HbA1c que había en la muestra problema y en el hemolizado del control de HbA1c.

La determinación de los niveles de hemoglobina glicosilada (HbA1c) representa hasta el momento la mejor prueba de laboratorio que determina si la diabetes se tiene bajo control, ya que indica el promedio de glucemias mantenido durante el trimestre anterior a la prueba. Mantener la HbA1c, por debajo del 7% es uno de los principales objetivos de lograr y sostener por toda persona con diabetes.

Material. Reactivos Micropipetas Pipeta Tubos eppendorf Tubos de ensayo Cubetas de vidrio de 1 cm de paso óptico Kit de Hemoglobina A1c de Biosystems®, que incluye reactivo R1 (Ftalato de potasio 50

mmol/L, detergente 5 g/L, azida de sodio 0,95 g/L, pH 5,0), reactivo R2 (Tampón fosfatos 30 mmol/L, pH 6,5, azida de sodio 0,95 g/L), reactivo R3 (Tampón fosfatos 72 mmol/L, pH 6,5, azida de sodio 0,95 g/L) y microcolumnas, que contienen una resina de intercambio catiónico equilibrada con tampón fosfatos 72 mmol/L, pH 6,5, azida de sodio 0,95 g/L

Control de HbA1c normal de Biosystems® Agua destilada desionizada

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Procedimiento

1. Dejar atemperar reactivos y columnas durante unos minutos, hasta que alcancen la temperatura ambiente.

2. Reconstituir el control de HbA1c normal , que es sangre humana hemolizada y liofilizada, para lo cual se pipetean 0,5 mL de agua destilada desionizada en el vial que contiene el control, dejar 5-10 minutos en reposo y a continuación agitar suavemente el vial, evitando la formación de espuma, hasta disolver por completo todo el liofilizado

3. Preparar el hemolizado del control (C) y de la muestra de sangre problema (MP) pipeteando en un tubo eppendorf lo siguiente:

C MPR1 (µL) 200 200

Control de HbA1c normal (µL) 50 -Muestra problema de Sangre

(µL)- 50

Se agita y se deja a temperatura ambiente durante 10-15 minutos.4. Preparar las columnas : destapar la parte superior de la columna y romper la lengüeta

inferior, y con la ayuda del extremo plano de una pipeta bajar el disco superior hasta el nivel de la resina. Dejar gotear sobre un tubo de ensayo hasta que el líquido alcance el nivel del disco, operación bastante lenta, desechando el eluido.

SEPARACIÓN Y LECTURA DE LA HbA1c

5. Se aplica cuidadosamente sobre el disco superior de una columna 50 µL del hemolizado C y sobre otra columna 50 µL del hemolizado MP, desechando el eluido que vaya goteando.

6. Cuando haya atravesado el disco todo el hemolizado se añaden 200 µL del reactivo R2, desechando el eluido.

7. Cuando deje de gotear se añade 2 mL del reactivo R2, nuevamente, y se desecha el eluido.

8. Cuando deje de gotear, colocar la columna sobre un tubo de ensayo y añadir 4 mL de reactivo R3. Recoger el eluido de cada columna, que ya contiene la fracción de HbA1c del control y de la muestra problema.

9. Se prepara un blanco de agua destilada, con el que se ajusta a 0 el espectrofotómetro, y se lee la absorbancia de la fracción HbA1c a 415 nm

LECTURA DE LA Hb TOTAL

10. Pipetear en dos tubos de ensayo 12 mL de reactivo R3 y añadir respectivamente 50 µL del hemolizado C y del hemolizado MP

11. Se agita bien y se lee la absorbancia de la Hb total a 415 nm frente a un blanco de agua destilada.

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Resultados. Cálculos. ObservacionesLos resultados obtenidos en el espectrofotómetro fueron los siguientes:

Control, C Muestra Problema, MPA415nm(HbA1c) A415nm(Hb total) A415nm(HbA1c) A415nm(Hb total)

0,125 0,854 0,167 0,734

4,88% HbA1c 7,58% HbA1c

Los valores esperados para el control de HbA1c de Biosystems® son: 4,7-7% HbA1c; por lo que el resultado es correcto.

Si analizamos el valor de la hemoglobina glicosilada en la muestra problema vemos que, si esta persona fuera diabética, no estaría muy bien controlada su glucemia.

Cuaderno de prácticas de Técnicas Bioquímicas

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