CULTIVO CELULAR APLICACIONES EN MEDICINA Centro Comunitario de Sangre y Tejidos del Principado de...
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CULTIVO CELULAR APLICACIONES EN MEDICINA
Centro Comunitario de Sangre y Tejidos del Principado de
Asturias.
Unidad de Ingeniería Tisular
Sara Llames
CULTIVO CELULARCULTIVO CELULAR: mantenimiento, proliferación y/o diferenciación de células in vitro en un medio artificial.
REQUERIMIENTOS MÍNIMOS DE UN LABORATORIO REQUERIMIENTOS MÍNIMOS DE UN LABORATORIO DE CULTIVO:DE CULTIVO:
Asepsia: cabina de flujo, esterilizador
Incubador
Nevera/congelador
Baño agitador
Centrifuga
Microscopio Invertido
MEDIO DE CULTIVOMEDIO DE CULTIVO:
proporciona a las células los nutrientes necesarios.
BASAL: medio definido, adecuado al tipo celular.
SUERO: fuente de proteínas, minerales, lípidos, hormonas, mitógenos.
ANTIBIÓTICOS
ADITIVOS: hormonas, factores de crecimiento, etc.
MEDIO DEFINIDO: sin suero, componentes conocidos, reproducible.
MEDIO INDEFINIDO: con suero, variación entre lotes.
CONDICIONES DE CULTIVOCONDICIONES DE CULTIVO:
pH: 7.4, tamponamiento 5% CO2
temperatura: 37ºC humedad: 90-95%
INCUBADORINCUBADOR
CONTAMINACIÓN BIOLÓGICA:CONTAMINACIÓN BIOLÓGICA:
Bacteriana Fúngica MICOPLASMA
CULTIVO DE CONDROCITOSCULTIVO DE CONDROCITOS
Britterg y colaboradores 1994, condrocitos humanos autólogos cultivados para el tratamiento
de lesiones completas de cartílago articular.
Desde 1997 condrocitos comerciales. Elevado coste.
Unidades hospitalarias de cultivo celular.
PROCESAMIENTO Y CULTIVO:PROCESAMIENTO Y CULTIVO:
Fragmentación mecánica (bisturí)
Digestión enzimática (colagenasa)
Cultivo en presencia de suero autólogo
CONTROLES:CONTROLES:
Bacteriológicos
Micoplasma: ELISA, PCR, Fluorocromo
Cultivo infectado por micoplasma
Cultivo negativo
Producción de matriz cartilaginosaProducción de matriz cartilaginosa
Tinción Safranina
Tinción Azul Alcián Inmunodetección de Colágeno II
Estudio de normalidad celularEstudio de normalidad celular
Cariotipo Bandas G Hibridación Genómica Comparada.
Viabilidad CelularViabilidad Celular
Azul Tripán
TRANSPLANTE Y/O CONGELACIÓNTRANSPLANTE Y/O CONGELACIÓN
Transplante: suspensión celular en DMEM sin rojo fenol.
Congelación para uso posterior.
CULTIVO DE QUERATINOCITOSCULTIVO DE QUERATINOCITOS
PIEL ARTIFICIALPIEL ARTIFICIAL
CULTIVO DE EPITELIO AISLADOCULTIVO DE EPITELIO AISLADO
Digestión enzimática
Biopsia del paciente Fragmentación
mecánica
Células aisladas de piel + 3T3
radiados
Cultivo primario de queratinocitos
Células del cultivo primario + 3T3
radiados
Cultivo secundario de queratinocitosTransporte y trasplante
LIMITACIONES DEL EPITELIO CULTIVADO:LIMITACIONES DEL EPITELIO CULTIVADO:
Fragilidad
Dispasa daña la membrana basal
Formación de ampollas
Infección
Antisépticos
Resultados clínicos pobres
Escasa disponibilidad
Coste elevado
Modelo de piel artificial completacompleta destinado al tratamiento definitivo de grandes lesiones
epiteliales
Epidermis
Dermis
INGENIERÍA TISULARINGENIERÍA TISULAR
Biopsia de piel
Fragmentación mecánica
1ª Digestión T/E
Células aisladas de piel + 3T3 radiados
Cultivo de Cultivo de queratinocitosqueratinocitos
2ª Digestión colagenasa
Cultivo de Cultivo de fibroblastosfibroblastos
Cultivos PrimariosCultivos Primarios
Cultivo de fibroblastos
Cultivo de queratinocitos
Plasma humano
Dermis artificial basada en plasma humano Piel cultivada
Cultivo SecundarioCultivo Secundario
PREPARACIÓN DE LA PIEL ARTIFICIAL PARA PREPARACIÓN DE LA PIEL ARTIFICIAL PARA TRASPLANTETRASPLANTE
Biopsias procesadas Biopsias procesadas (patologías)(patologías)
0
2
4
6
8
10
12
Nº
de
pa
cien
tes
Año 2000 Año 2001 Año 2002 Año 2003 Año 2004(agosto)
Quemados Nevus Úlceras CutáneasEICH Neurofibromatosis EpidermolisisTx familiar Retracción Fascitis Necrot.Mucosa oral