-

Cultivo de tejidos vegetales (CTV)

Dra. Marisa LOPEZ BILBAO

lopezbilbao.marisa@inta.gob.ar

Instituto de Biotecnología, INTA

AGROBIOTECNOLOGIA CURSO 2018

El fundamento del CTV se basa en la teoría de la totipotencialidad celular.

Esta teoría sostiene la posibilidad de obtener una planta entera a partir de cualquier

célula viva, bajo condiciones controladas de cultivo.

Requisitos:

1° lograr la desdiferenciación (pérdida de las características de especialización

de la célula hasta un estado de desdiferenciación meristemática).

2° continuar con la rediferenciación de esta célula de partida, para lograr variadas

respuestas morfogenéticas tales como la obtención de un callo, la regeneración

de brotes o primordios de raíz, etc.

La expresión cultivo de tejidos vegetales (CTV) o cultivo in vitro de plantas, significa

cultivar plantas dentro de un frasco de vidrio en un ambiente artificial.

Esta forma de cultivar las plantas tiene dos características fundamentales:

- la asepsia (ausencia de gérmenes)

- el control de los factores que afectan el crecimiento

Gottlieb Haberlandt (1898) aisló células y tejidos de plantas superiores y las

colocó en soluciones nutritivas para su crecimiento y estudio, dando origen de

esta manera a la técnica de cultivo de células y tejidos vegetales.

Explante o explanto: se denomina así a la parte del órgano o tejido vegetal que

se cultiva in vitro

Las plantas continuamente responden a señales o estímulos, externos e internos,

que usan para alterar su fisiología, morfología y desarrollo: luz, nutrientes

minerales, compuestos orgánicos, agua, suelo, calor, frío, reguladores de

crecimiento vegetal, pH, gases (CO2, O2, C2H4)

Por lo que deben considerarse los siguientes factores cuando se desean establecer

cultivos in vitro :

a) fuente de explantos (hoja, hipocótiles, semillas maduras imbibidas, yemas , etc)

b) constituyentes nutricionales inorgánicos y orgánicos del medio de cultivo,

c) temperatura, luz y pH

d) PGR ( reguladores del crecimiento de plantas)

Auxinas estimulan el crecimiento por

elongación celular

Citocininas estimulan el crecimiento

por división celular.

Objetivos perseguidos con la utilización del CTV :

a) estudios básicos de fisiología, genética, bioquímica y ciencias afines

b) bioconversión y producción de compuestos útiles

c) obtención de plantas libres de patógenos

e) propagación masiva de plantas

f) conservación e intercambio de germoplasma

g) obtención de plantas transgénicas y/o editadas genéticamente

Sistemas de micropropagación vegetal

Proliferación de yemas axilares o apicales

Cultivo de meristemas

Cultivo de suspensiones celulares y de protoplastos

Liberación de patógenos

«Especialidades» o usos específicos del CTV

Biofábricas

Micropropagación vegetal

Presenta numerosas ventajas:

- Propagación vegetativa rápida y a gran escala

- Uniformidad seleccionada del material clonado

- Multiplicación de plantas recalcitrantes a las técnicas convencionales

- Reducción en el tiempo de multiplicación y el espacio requerido para tal fin

- Mayor control sobre la sanidad del material propagado

- Introducción rápida de nuevos cultivares

- Conservación de germoplasma

- Facilidades para el intercambio internacional del material vegetal.

La micropropagación constituye la principal aplicación comercial del CTV

Consiste en la propagación de un genotipo a gran escala a través del empleo de

técnicas de Cultivo de Tejidos.

Consideraciones técnicas de la propagación clonal

masiva de plantas Requiere:

una infraestructura mínima especializada

condiciones controladas de cultivo

Compuestos inorgánicos

Macronutrientes: NO4- , PO4

3- , K+, Ca2+, Mg2+, SO42-

Micronutrientes: Fe2+, Cu2+, Zn2+, Mn2+, Mo2+, Co2+, I-

Carbohidratos

Sacarosa, glucosa, mio-inositol

Vitaminas

Tiamina

Piridoxina

Acido nicotínico

Biotina

Aminoácidos

Glicina

Reguladores del crecimiento

Auxinas

Citocininas

Giberelinas

Soporte inerte (medios semisólidos)

Agar (0,7 a 1%)

Gelrite®

pH

5,6 – 5,8

Esterilización

1 atmósfera, 15 a 20 min en autoclave

Medios de cultivo: composición general

• El metabolismo de los tejidos puede modificarse dependiendo de las características

del medio de cultivo (líquido o semi-sólido).

• En el caso de un medio sólido, la concentración y calidad del ágar pueden tener

importantes efectos en el desarrollo del cultivo (hiperhidricidad, crecimiento lento, etc.)

• El cultivo en medio líquido resulta imprescindible cuando la propagación in vitro es

desarrollada a través de las siguientes vías:

- Cultivo de protoplastos

- Cultivo de suspensiones celulares

Consistencia

del medio

Semisólido

Líquido

Propiedades físicas de los medios de cultivo

• Intercambio gaseoso:

La organogénesis puede verse modificada si el intercambio de gases se ve

dificultado.

- La inducción de yemas a partir de callos de tabaco se reduce si no hay suficiente

oxígeno

- La acumulación de etileno puede inhibir la regeneración de brotes

Los recipientes de cultivo se tapan con un film de polietieleno / film “de cocina”/

Parafilm/ tapones de algodón, para posibilitar el intercambio de gases.

•pH:

- Constituye un factor crítico

- Se ajusta en el rango 5,5-5,8

- Se modifica durante el crecimiento de los cultivos

Propiedades físicas de los medios de cultivo

Composición de medios de cultivo comúnmente usados

8,6121-ZnSO4.7H20

--0,0250,2-CuSO4

6,2135-H3BO3

--1010-MnSO4.H2O

-600---NaNO3

1.900-3002.50081KNO3

----142Ca(NO3)2

--134--(NH4)2SO4

---300-NH4H2PO4

1.650----NH4NO3

-750--65KCl

44075150200-CaCl2.2H2O

37025050040074MgSO4.7H2O

22,30,1---MnSO4.4H2O

-125150--NaH2PO4.H2O

170---12KH2PO4

Concentración en el medio de cultivo (mg/L)

Compuesto

-

0,03

0,01

Heller

0,250,250,1-NaMoO4.2H2O

0,025---CuSO4.5H2O

0,830,751-KI

Murashige y Skoog

Gamborg(B5

Schenk y Hildebrandt

(SH)White

8,6121-ZnSO4.7H20

--0,0250,2-CuSO4

6,2135-H3BO3

--1010-MnSO4.H2O

-600---NaNO3

1.900-3002.50081KNO3

----142Ca(NO3)2

--134--(NH4)2SO4

---300-NH4H2PO4

1.650----NH4NO3

-750--65KCl

44075150200-CaCl2.2H2O

37025050040074MgSO4.7H2O

22,30,1---MnSO4.4H2O

-125150--NaH2PO4.H2O

170---12KH2PO4

Concentración en el medio de cultivo (mg/L)

Compuesto

-

0,03

0,01

Heller

0,250,250,1-NaMoO4.2H2O

0,025---CuSO4.5H2O

0,830,751-KI

Murashige y Skoog

Gamborg(B5

Schenk y Hildebrandt

(SH)White

Composición de medios de cultivo comúnmente usados

5,85,55,9pH

--10,5-Piridoxina-HCl

-0,03---NiCl2.6H2O

-0,03---AlCl3

0,025-0,0250,1-CoCl2.6H2O

----2,46Fe(SO4)3

27,86--15-FeSO4.7H2O

-1---FeCl3.6H2O

100-1001.000-Mio-inositol

37,26--20-Na2EDTA

--28--Sequestrene 330 Fe

----100Extracto de

Levadura

--15-Acido nicotínico

0,4-105-Tiamina-HCl

Concentración en el medio de cultivo (mg/L)

Compuesto

-

Heller

30.00020.00030.00020.000Sacarosa

Murashige y

Skoog (MS)

Gamborg

B5

Schenk y

Hildebrandt

(SH)

White

5,85,55,9pH

--10,5-Piridoxina-HCl

-0,03---NiCl2.6H2O

-0,03---AlCl3

0,025-0,0250,1-CoCl2.6H2O

----2,46Fe(SO4)3

27,86--15-FeSO4.7H2O

-1---FeCl3.6H2O

100-1001.000-Mio-inositol

37,26--20-Na2EDTA

--28--Sequestrene 330 Fe

----100Extracto de

Levadura

--15-Acido nicotínico

0,4-105-Tiamina-HCl

Concentración en el medio de cultivo (mg/L)

Compuesto

-

Heller

30.00020.00030.00020.000Sacarosa

Murashige y

Skoog (MS)

Gamborg

B5

Schenk y

Hildebrandt

(SH)

White

Ahora uno compra los medios de cultivo (hay muchísimas combinaciones!)

Reguladores del crecimiento comúnmente usados en medios de

cultivos vegetales/ PGR/ Fitoreguladores/ Hormonas vegetales

10-7-10-5215,2K6-furfurilaminopurina

(kinetina)

10-7-10-5203,32iPN-isopentenilaminopurina La zeatina es termolábil

y no debería ser

autoclavada

Las citoquininas

son normalmente

disueltas en

NaOH diluídas o

en etanol acuoso

10-7-10-5225,2BAP6-bencilaminopurinaCitoquininas

10-7-10-5175,2AIAAcido indol 3-acético

10-7-10-5221,02,4-DAcido 2,4-

diclorofenoxiacético El AIA puede ser

oxidado por células

vegetales. Es

frecuentemente usado

como única fuente de

auxinas en el medio

de cultivo

Las auxinas son

usualmente

tituladas en

solución con

NaOH

10-7-10-5186,6pCPAAcido clorofenoxiacéticoAuxina

10-7-10-5202,2NOAAcido -naftoxiacético

10-7-10-5186,2NAAAcido 1-naftalenoacético

10-7-10-5203,2IBAAcido 3-indolbutírico

10-7-5x10-6

10-7-10-5

Rango de

concentración

(M)

Soluble en agua

Preparación de

solución stock

Es termolábil, no debe

ser autoclavada. Es

comúnmente necesario

para la iniciación o el

mantenimiento de

callos y cultivos en

suspensión. Algunas

veces necesario para la

regeneración de

plántulas.

364,4GA3Acido giberelicoGiberelina

219,2ZeaZeatina

ComentariosPeso

MolecularAbreviaturaNombreClase

10-7-10-5215,2K6-furfurilaminopurina

(kinetina)

10-7-10-5203,32iPN-isopentenilaminopurina La zeatina es termolábil

y no debería ser

autoclavada

Las citoquininas

son normalmente

disueltas en

NaOH diluídas o

en etanol acuoso

10-7-10-5225,2BAP6-bencilaminopurinaCitoquininas

10-7-10-5175,2AIAAcido indol 3-acético

10-7-10-5221,02,4-DAcido 2,4-

diclorofenoxiacético El AIA puede ser

oxidado por células

vegetales. Es

frecuentemente usado

como única fuente de

auxinas en el medio

de cultivo

Las auxinas son

usualmente

tituladas en

solución con

NaOH

10-7-10-5186,6pCPAAcido clorofenoxiacéticoAuxina

10-7-10-5202,2NOAAcido -naftoxiacético

10-7-10-5186,2NAAAcido 1-naftalenoacético

10-7-10-5203,2IBAAcido 3-indolbutírico

10-7-5x10-6

10-7-10-5

Rango de

concentración

(M)

Soluble en agua

Preparación de

solución stock

Es termolábil, no debe

ser autoclavada. Es

comúnmente necesario

para la iniciación o el

mantenimiento de

callos y cultivos en

suspensión. Algunas

veces necesario para la

regeneración de

plántulas.

364,4GA3Acido giberelicoGiberelina

219,2ZeaZeatina

ComentariosPeso

MolecularAbreviaturaNombreClase

• Grupos básicos de reguladores del crecimiento:

- Auxinas

- Citoquininas

- Giberelinas

- Acido abscísico

- Etileno

• Generalidades:

- Actúan a bajas concentraciones

- Interactúan unos con otros (los resultados están determinados por las

concentraciones relativas entre las diferentes fitohormonas).

- Los reguladores endógenos del crecimiento están presentes en la planta

durante todo su ciclo de vida pero su concentración fluctúa. Su

concentración relativa varía en función del estado fisiológico de la planta y

en cada uno de los órganos de ésta.

- Están involucrados en numerosos procesos fisiológicos.

Reguladores del crecimiento

• Las auxinas fueron descubiertas entre 1933 y 1935 a partir

de bioensayos realizados para caracterizar el mensajero

responsable de la elongación y de la respuesta fototrópica

del coleoptile de gramíneas.

- Alargamiento y división celular

- Crecimiento de secciones de hojas, tallos y frutos

- Formación de raíces adventícias

- Dominancia apical

- Acción herbicida

- Estimulación de la producción de etileno

• Se sintetizan en las yemas, hojas jóvenes, frutos y en el

embrión. La concentración endógena en la planta varía

entre 0,001 y 0,1 mg/Kg.

• Su transporte es polar

• Auxinas sintéticas:

- Acido indol butírico (IBA)

- Acido naftalen acético (ANA)

- 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D)

N

OH

O

Acido indol acético (AIA)

(auxina endógena)

Las auxinas se

emplean como

promotores de la

proliferación

celular y la

inducción de la

morfogénesis

• Fueron descubiertas en 1955 estudiando sustancias

promotoras de la división celular in vitro.

• Están involucradas en variadas respuestas fisiológicas:

- Promoción de la división celular

- Promoción de la organogénesis (relación

auxinas/citoquininas)

- Retardo de la senescencia

- Síntesis de clorofila y desarrollo de cloroplastos

• Citoquininas endógenas:

- Zeatina (Zea)

- Isopenteniladenina (2iP)

• Citoquininas sintéticas:

- Kinetina (Kin)

- Benziladenina (BAP)

• Se sintetizan en el embrión y las raíces; se encuentran

en todos los tejidos. Su transporte es no polar.

Las citoquininas

determinan

diferentes respuestas

morfogenéticas en

combinación con las

auxinas

El manejo de diferentes concentraciones relativas de estos reguladores del crecimiento

determina las respuestas organogénicas. La composición de estos reguladores dirige la

diferenciación del tejido según las siguientes relaciones:

auxinas / citoquininas > 1: regeneración de raíces

auxinas / citoquininas < 1: obtención de brotes

• Fueron aisladas del hongo Gibberella fujikuroi, a partir de plantas de arroz

infectadas. Estas plantas presentaban marcada clorosis y largos entrenudos.

Los primeros ensayos se llevaron a cabo usando extractos solubles del hongo.

• El ácido giberélico (GA3) fue la primera giberelina identificada.

En la actualidad se conocen alrededor de 50 giberelinas diferentes.

• Algunos efectos mediados por las giberelinas son:

- Promoción del crecimiento en plantas de genotipos enanos o plantas

bianuales

- Crecimiento de yemas latentes

- Germinación de semillas en dormición

- Floración

- Movilización de reservas en la semilla

• Se sintetizan en hojas jóvenes, en yemas y en el embrión.

• Su transporte no es polar.

Las giberelinas

favorecen el

crecimiento y el

alargamiento de los

entrenudos de los

brotes

O

H

CH3H COOH

H

HO OH

CH3

C O

Acido giberélico (GA3)

Elección de una

planta madre selecta

Explantos

Desinfección superficial

Establecimiento en medio

de cultivo apropiado

Transferencia a un

medio de multiplicación

Formación de

brotes o embrioides

Transferencia a un medio

para el enraizamiento de

los brotes

Pasaje a maceta en

un invernáculo

ETAPA 1

ETAPA 2

ETAPA 3

ETAPA 4

El proceso de micropropagación de

especies vegetales consta de varias etapas

Km

Rooting

Greenhouse

Regeneration

Re1

Re2

Re3

Re4

RA

protocol Desinfection

Germination

Agroinfection &

Co-culture

Transient

GUS

Assay

Protocolo tipo de esterilización superficial de material vegetal:

- Etanol 70%, entre 5 y 10 seg.

- Solución de hipoclorito de sodio (NaCIO) de 5 a 20%, entre 5

y 30 min. Tritón X100. Este paso puede ser reemplazado por

el uso de soluciones diluidas de bicloruro de mercurio (HgCl2),

entre el 0,01 y 0,05%.

- Enjuagues con abundante H2O estéril (4 ó 5 veces).

En el caso del HgCl2, el material se debe enjuagar sucesivas

veces pues es difícil de eliminar.

Los explantos deben ser esterilizados antes de ser establecidos en

condiciones de cultivo

PPM™ (Plant Preservative Mixture) is a broad-spectrum preservative and biocide, which

kills bacteria and fungi cells, prevents germination of spores, and in higher concentrations,

can eliminate endogenous contamination in explants.

Otros posibilidad:

Posibles respuestas de los cultivos vegetales in vitro

Callo: masa de células

desdiferenciadas

obtenidas a partir de un

explanto cultivado in

vitro

Resulta posible

regenerar brotes

o yemas a partir

de tejidos

vegetales

desdiferenciados

in vitro

- La organogénesis es de origen pluricelular.

Un grupo o cluster de células del explanto inicial se desdiferencia

inicialmente para luego rediferenciarse dando lugar a un órgano vegetal.

mosaico

- La embriogénesis se presupone de origen unicelular.

Una célula del explanto constituye el punto de partida para la obtención de un

embrión somático. Se diferencian embriones o estructuras bipolares que

completan cada una de las etapas implicadas en la ontogenia de un embrión

cigótico. El resultado es una planta completa.

Propagación vegetativa por embriogénesis somática

Por lo general, se requieren 2

medios de cultivo diferentes

para promover la

embriogénesis somática:

1° medio de iniciación

conteniendo auxinas (ácido

2,4-diclorofenoxiácetico; 2,4-

D) y

2° medio para la

diferenciación de los

embrioides, sin agregado de

auxinas o con un nivel

reducido de este tipo de

compuesto

Sistemas de micropropagación vegetal

Proliferación de yemas axilares o apicales

Cultivo de meristemas

• Proliferación de yemas apicales o axilares

- Consiste en la multiplicación de plantas a partir

de las yemas axilares preexistentes. Representa

la aceleración in vitro del crecimiento natural de

dichos meristemas.

- La tasa de multiplicación (tm) se calcula en base

al número de brotes o vástagos obtenidos a partir

de un explanto inicial, entre un repique y el sucesivo.

Esta tasa puede variar entre 2 y 20 brotes por mes,

dependiendo de la especie en cuestión, entre otras

variables.

- Por ejemplo, con una tm de 5/mes podrían

obtenerse 10.000.000 plantas en un solo año

a partir de una única yema inicial.

- El cultivo de meristemas es un caso especial del

uso de esta técnica.

Propagación

vegetativa a

partir de yemas

preexistentes

• Posibilitan la micropropagación de diferentes especies

vegetales.

• Constituyen el explanto ideal para liberar de patógenos

in vitro a plantas infectadas por virus, hongos o bacterias.

• Son ampliamente utilizados como explantos para la

criopreservación y conservación de germoplasma.

Los meristemas son

grupos de células

indiferenciadas que

retienen la

capacidad de

dividirse durante

todo el ciclo de vida

de una planta

Los meristemas determinan el crecimiento de

la planta y dan origen a sus diferentes órganos

Cultivo de meristemas

El empleo de meristemas

como explantos es una

posible herramienta para

el saneamiento de plantas

infectadas. El cultivo de

meristemas facilita la

eliminación de patógenos

Meristema apical

Meristema axilar

Domo

meristemático

- El domo meristemático no está vascularizado

(muchos patógenos se translocan por los tejidos

de conducción).

- El número de partículas virales es menor

en los meristemas que en otros tejidos (White, 1934).

- La velocidad de división celular a nivel del meristema

es mayor que la velocidad de replicación de un virus.

- Las primeras plantas saneadas a partir del cultivo

de meristemas fueron obtenidas por Morel y Martin

entre 1952 y 1957 a partir de cultivos de papa y

Dahlia.

Mediante esta técnica es posible sanear

plantas infectadas sistémicamente por

diferentes tipos de patógenos como

bacterias, hongos, virus y viroides.

El cultivo de

tejidos posibilita

el saneamiento

de las plantas

multiplicadas

vegetativamente Síntomas producidos

por el Tomato mosaic

virus.

Partículas de Potato

virus Y

El material vegetal infectado por virus,

bacterias, hongos y/o micoplasmas puede

ser tratado con diferentes técnicas:

• Termoterapia

• Quimioterapia

• Cultivo de meristemas

Estos tratamientos pueden usarse por

separado, pero incrementan su efectividad

notablemente cuando se los combina,

trabajando in vivo e in vitro.

El tratamiento

de plantas

madres puede

efectuarse

por distintas

técnicas

• Las plantas regeneradas in vitro deben ser

evaluadas para comprobar si ha sido eliminado

el patógeno considerado.

• Estas pruebas se denominan ensayos de

indización (indexing) y difieren según el sistema

huesped-patógeno de que se trate.

• Se incluyen entre estas pruebas:

- Selección visual u observación de síntomas

- Empleo de hospedantes indicadores

- Métodos serológicos

- Microscopía electrónica

La metodología

de saneamiento

empleada debe

ser evaluada

Biofábricas

-Una biofábrica es un laboratorio de cultivos de tejidos que produce plantas

en gran escala, desde su introducción in vitro hasta la aclimatación.

-Permite la producción de plantas de homogeneidad genética y de gran

calidad sanitaria.

-Es aplicable en la producción de cultivos de propagación vegetativa y

probada en más de 1.000 especies.

-La fabricación de plantas es rutina en las agroindustrias de ornamentales,

frutales, caña de azúcar y árboles industriales.

-Las biofábricas de 1ra. generación usan las técnicas de la micropropagación

convencional.

Sistema de inmersión vertical

Sistema de inmersión horizontal

Uso intensivo de mano de obra en una Biofábrica 1.0

Biofábrica 2.0

El desarrollo de los sistemas de inmersión temporaria (SIT) provocó un fuerte impacto en

el desarrollo de las biofábricas.

La IT es capaz de optimizar la producción de plantas in vitro:

Potenciando la capacidad regenerativa.

Incrementa la producción de masa.

Mayor tasa de multiplicación.

Mejor calidad de plantas.

Reduce la necesidad de manipulación.

Reduce costos:

Menor demanda de electricidad

Disminución de mano de obra.

Ahorra espacio (elimina los envases pequeños).

Evita el agar.

Disminución de la demanda del uso del flujo laminar.

Gentileza de Dr. E. Lemos, Universidad da Alagoas,

Brasil

Ejemplo entre los 2 sistemas, en Banana

Ambos evaluados a los 60 días de iniciado el cultivo

http://www.biofabrica.com.ar/

Caña de azúcar

Mandioca

Eucalyptus grandis

Banano (Musa sp)

Dendrobium phalaenopsis

Asistencia Tecnológica a Campo:

Nuestros profesionales están capacitados para asistir al cliente en el manejo, recomendaciones y seguimiento

del desarrollo de los productos en campo.

Análisis Fitopatológico de Cultivos:

Tenemos un laboratorio de microbiología preparado para recibir muestras de plantas enfermas para su

respectivo Análisis con Diagnóstico y recomendaciones de Control Fitosanitario.

Análisis de Suelo:

Ofrecemos un servicio de Análisis de Suelo “in situ” de los principales nutrientes de forma práctica que permita

la toma de decisión en el manejo de los cultivos en corto espacio de tiempo.

Diagnóstico Molecular:

Hacemos Diagnóstico Molecular de las principales enfermedades de la Caña de Azúcar, permitiendo al cliente

tener la seguridad de propagar material vegetal sano.

Conservación de germoplasma

Las técnicas de cultivo in vitro de tejidos

vegetales costituyen parte esencial de una

estrategia general para la conservación

e intercambio de recursos fitogenéticos.

Conservación de germoplasma

• Colecciones in vitro

• Bancos de semillas

• Crioconservación

Métodos para la conservación

de germoplasma

• La conservación de germoplasma mediante

el cultivo de tejidos se basa en la limitación

del crecimiento del material vegetal.

• Implementación:

- Medios de cultivo de composición subóptima

- Baja intensidad lumínica (<500 lux)

- Temperaturas inferiores a las adecuadas

para el activo metabolismo de las células y

tejidos vegetales bajo cultivo (15-20 ºC)

- Alta concentración de compuestos

osmóticamente activos (sacarosa, manitol)

Bancos de germoplasma in vitro

• Resultan de utilidad en el caso plantas cuyas

semillas se mantienen viables durante un largo

período de almacenamiento.

• El material debe mantenerse bajo condiciones

controladas en una cámara de mantenimiento:

- Bajas temperaturas

- Bajo contenido de humedad

• Este método no puede aplicarse a la conservación

de plantas cuyas semillas presentan longevidad

reducida, especies autoincompatibles o especies

de propagación vegetativa obligada

Los bancos de

semilla permiten

la conservación

de especies

vegetales que

se propagan

sexualmente

• Consiste en el mantenimiento de material

vegetal a temperaturas ultrabajas (-196 ºC),

por inmersión en nitrógeno líquido

• Diferentes explantos (ápices de yemas,

meristemas, anteras, embriones inmaduros)

así como callos y suspensiones celulares

pueden ser crioconservados a

-196 ºC.

Crioconservación de germoplasma

Etapas del proceso de

crioconservación de material

vegetal

Cultivo de protoplastos

Los protoplastos son células vegetales desprovistas

de pared celular

Suspensión de protoplastos

de mesófilo de tabaco

Es el grado máximo de desdiferenciación celular !

Esquema general de la manipulación genética de protoplastos in vitro para la

realización de técnicas de mutagénesis, fusión o transformación.

Obtenciòn

• Protocolo para la obtención de protoplastos .

de mesófilo de hoja de tabaco:

- Esterilizar superficialmente el explanto (hojas jóvenes

de tabaco).

- Remover la epidermis abaxial. Cortar secciones de

hoja. Disponer los explantos en un regulador

osmótico.

- Disponer las secciones de hoja en una placa de Petri

conteniendo la solución mezcla de enzimas y medio

nutritivo para el cultivo de protoplastos en una

proporción 1:1.

- Incubar con la mezcla de enzimas durante 4 a 12 h

en oscuridad, a 22-25ºC, a 50 rpm.

Observar la liberación de los protoplastos en un

microscopio invertido.

- Lavar los protoplastos cuidadosamente tamizándolos

y centrifugándolos a 100 g. Usar las soluciones

formuladas para tal fin.

- Remover el sobrenadante y resuspender

los protoplastos en medio de cultivo.

Variación somaclonal

Causas:

• Modificaciones genéticas heredables por las progenies de las

plantas obtenidas mediante cultivo in vitro

• Prevalencia del cariotipo específico de plantas y tejidos

quiméricos y de mosaicos

• Cambios en el cariotipo, debidos a una respuesta diferencial a

los procedimientos de cultivo (composición del medio, etc.)

• Aneuploides no separables en el cultivo

La variación

somaclonal

puede explicar la

variación

fenotípica

de las plantas

regeneradas in

vitro

Otra posibles

causas de la

variabilidad de las

plántulas

regeneradas

Características de la variación somaclonal

• Indeseable en la micropropagación de

plantas de interés comercial (diversidad

genotípica)

• Potencial para el mejoramiento vegetal

cuando se trata de verdaderas

modificaciones del material genético

(variabilidad)

Cultivo in vitro de células haploides

y embriones

• Mejoramiento vegetal.

• Estudios de genética cuantitativa.

• Estudios de diferenciación celular y alternancia

de generaciones.

Aplicaciones del cultivo in vitro de células haploides

Tétradas de

microsporas Sacos polínicos

(con granos de polen)

Consiste en el cultivo de anteras

inmaduras en medios sintéticos que

promueven la división celular y la

formación de embriones o callos. Los embriones, transferidos a un medio de regeneración, darán lugar a plantas haploides.

Cultivo in vitro de anteras

anteras

- Genotipo de las plantas donantes

- Fisiología de las plantas donantes

- Caracterización citológica y bioquímica

de etapas muy tempranas del desarrollo de los

granos de polen

- Pretratamiento de las anteras con altas o

bajas temperaturas o con choque osmótico

- Medios de cultivo con alto contenido en

osmóticos para la inducción de callos y menores

concentraciones de sacarosa para la regeneración de

plantas

Condiciones que afectan el cultivo de anteras

- Permite la expresión e identificación

de alelos recesivos

- Constituye una fuente útil para el mejoramiento

intravarietal

- Permite la rápida introducción de caracteres

citoplasmáticos en un fondo genético

homocigótico

- Crea y acrecienta las reservas citogenéticas

y citoplasmáticas de los cultivos

- La obtención de haploides duplicados resulta

útil para el desarrollo de nuevas variedades

con el fin de distribuirlas en ambientes ecológicos

muy diversos y para ensayarlas en ellos.

- Las microsporas o células haploides pueden

usarse para la inducción de mutantes y para

la selección de caracteres esporofíticos.

El cultivo de

anteras ofrece

numerosas

ventajas para el

mejoramiento

de plantas de

interés comercial

• Estudio de requerimientos nutricionales

de embriones en desarrollo.

• Rescate de embriones híbridos derivados

de cruzamientos interespecíficos e intergenéricos.

• Produción de monoploides.

• Superación de la latencia de las semillas.

El cultivo de embriones inmaduros permite realizar

diferentes aplicaciones

Embrión cigótico

Corte longitudinal de una semilla de Brassica

Embriones somáticos (es) obtenidos a partir

del cultivo de óvulos de Arabidopsis.

• Rescate de embriones (mediante polinización

y fertilización in vitro)

• Inducción de la embriogénesis somática

a partir de nucelos de diferentes especies

vegetales.

Aplicaciones del cultivo de óvulos

es

Semillas sintéticas

Las semillas

artificiales

reproducen la

estructura de una

semilla de origen

sexual

Las semillas

artificiales

poseen una

cubierta de

protección,

contienen

sustancias de

reserva y

portan un

embrión en su

interior.

Procedimiento

para encapsular

embriones

somáticos