Gloria L. CamargoLaboratorio de VirologíaUniversidad de Boyaca

Que son los cultivos celulares?...

Conjunto de técnicasMantenimiento o

crecimientoCell, tejidos u

órganos (animal o vegetal)

Cto, x.x, metabolismos Ambiente artificial

in vitro

Fisiológicas, bioquímicas,

genéticas

propiedades

APLICACIÓN...

AislamientoAmplificació

n

Descubrimiento

Vacunas Rta inmunitaria

Hospedero

Biología molecular

Bioquímica

HISTORIA...

1866• Von Recklinghansen.• Logro mantener vivos por mas de un mes hematies de anfibios

1885• Roux.• Demostró la factibilidad de mantener cell vivas en medios artificiales

1907• Harrison. • Estudio sistemático de los cultivos en cell in vitro

1913

• Steinhadt.• Virus de la viruela sobrevivía varias semanas en cultivos de tejidos de • cornea de conejos y caballos

1932• Topacio y Hyde • Los virus al multiplicarse producen cambios en los cultivos cell ECP

1948

• Earle y col.• Demostraron que para que una cell se divida necesita ser alimentada• con los nutrientes correctos

1949

• Enders y col.• El virus de la poliomielitis puede propagarse en cultivos cell de origen• diferente al tejido nerviosos

1952

• Gry y col.• Establecen la primera línea cell continua (HeLa).• Medios con plasma de pollo, extracto SFB

1955• Se investiga los requerimientos nutritivos de las cell en cultivo.• Suero, a.a, azucares.

1961

• Hayflick y Moorhead• Usaron por primera vez a/b para prevenir la contaminación de los • cultivos de fibroblastos. Pudieron realizar 12 pases de los cultivos.

1969• Austi Tocco y Sato.• Se empiezan a establecer las primeras líneas celulares diferenciadas

1979

• Sato y col• demuestran que las diferentes líneas celulares requieren mezclas • distintas de hormonas y factores de crecimiento.

Hoy • Se realiza la vacuna para la Influenza A H1N1 en Cultivos Cell

Consiste en transferir células de un cultivo crecido a un nuevo recipiente, para que se genere otro cultivo. (PASE)

Extraer el órgano o tejido del organismo

de origen

Tienen diferentesclases de cultivo, que se caracteriza

Capacidad de replicacion

Capacidad de ser sub-cultivado

CLASES DE CULTIVOS CELULARES...

CULTIVOS EN MONOCAPA...

Células adherentes ocultivos fijos

Requieren unirse SUPERFICIE

Dependientes de anclaje

MULTIPLICARSE2 TIPOS

AGITACIÓNESTACIONARIO

CULTIVOS EN SUSPENSIÓN ...

Células se multiplican Suspendidas

Medio liquido

Subcultivo por dilución No adhesión

Cultivo inicial adquirió máximo

de saturación

CULTIVO PRIMARIO...

• MÁXIMO 10 SUBCULTIVOS.

Células provenientes del tejido original

Trasplantados a Condiciones artificiales

Porción celular variada

POBLACIÓN CELULAR PASES SUCESIVOSPROLIFERAR

LENTAMENTERÁPIDAMENTE

DESAPARECEPREDOMINA

LINEAS CELULARES...

Derivadas deun cultivo

primario, se puedencultivar in vitro repetidamente

y se dividen en :

DIPLOIDE HETEROPLOIDES

+ 75%

• Mismo cariotipo de las células • Se originan normales y siguen normales

- 75%

• Mismo cariotipo de las células • Se originan tejido normal o anormal • Cell sufren transformaciones

LINEA CELULARES TEJIDO DE ORIGEN VIRUS QUE PUEDEN SER AISLADOS EN CADA TIPO

CELULAR

HEp-2 Carcinoma epidermoide de laringe humana

Herpes simplex, Enterovirus, Poliovirus, Adenovirus.

MDBK Riñón bovino Herpes y Adenovirus bovino, estomatitis vesicular.

MDCK Riñón canino Influenza, Adenovirus

MRC-5 Pulmón embrionario humano Citomegalovirus

Vero Riñón de mono Herpes y Poliovirus

BHK-21 Riñón de hamster Estomatitis vesicular y feibre aftosa

HeLa Carcinoma de cervix humano

Poliovis, Adenovurus

RD Rhabdomiosarcoma humano Poliovirus, Herpes simplex

PK 15 riñón porcino Estomatitis vesicular, Parvovirus porcino.

A. albopictus Larva de Aedes albopictus Arbovirus.

MEDIOS DE CULTIVO...

MEMMedio de

crecimientoMedio de

mantenimientoMedios

selectivosMedios de

congelación

Requerimiento Mínimo

MEM MEMTipo de células

MEM

SSB, a.a. vitaminas

10-15% 2% SFBPropósito del

cultivo50% SFB

Base para losdemás medios

SFBIntervalo desubcultivos

Crecimientoutilización

8% dimetilsulfoxido

Factores basicos para la supervivencia celular...

Presión osmótica

pH

CO2Oxigeno

Agua

SSBVitaminas

A.A. Suero

Aminoácidos Vitaminas Sales Otros compuestos* Proteínas

requeridas en los

medios definidos

libres de suero

Arginina Cisteína Glutamina Histidina Isoleucina Leucina Lisina Metionina Fenilalanina Treonina Triptofano Tirosina Valina

Biotina Colina Folato Nicotinamid

a Pantotenato Piridoxal Tiamina Riboflavina

NaCl KCl NaH2PO4 NaHCO3 CaCl2 MgCl2

Glucosa

Penicilina

Estreptomicina

Anfotericina

Rojo fenol

Suero fetal

bovino

Insulina Transferrina Factores de

crecimiento

específicos

Tabla 1. Requerimientos moleculares de un medio de cultivo para virus.

Obtención de las células..

Unión a colorantes acoplados a colorantes

fluorescentes

MICRODISEPCIÓN POR CAPTURA DE LASER

Contenedores para cultivo celular

A: Fraso T. B: Frasco triple. C: Botellas rodantes. D: Biorreactor. E: Frasco con pipetas. F: Frascos con agitación.

Contaminación de los cultivos cell...

La contaminación puede tener varios origenes:Tejidos originalesProductos biológicos (suero –mycoplasma R a

penicilina)El personal del laboratorio con su propia floraDel medio ambiente (laboratorio- material)

Cuando esta presente en cultivos celulares, no

siempre resulta en alteraciones

microscópicas de las células o del medio;

muchas infecciones crecen lentamente y pueden tener

los siguientes efectos:

Niveles y normas de seguridad

Nivel 1. No presentan peligros reconocidos.

Nivel 2. Se emplean materiales de origen primario que no se conoce el riesgo de infección o que tienen la posibilidad de que en las muestras contengan VIH, TBC, hepatitis B u otros patógenos.

Nivel 3. Su manejo presenta un riesgo potencial.

Nivel 4. Extremadamente peligrosos.

Contaje celular...

Porcentaje de viabilidad (%) = Número de células vivas/Número de células totales *100 (>85-90% se siembra).

Número de células vivas/ml = Células contadas vivas x factor de dilución x 104

Número de células necesarias = Número de placas x la mitad del volumen de cada placa x células viables (1.350.000 para neuronas).

Ventajas...

• CULTIVO DE CELULAS INFECTADA CON SARAMPION 7 DIAS POST INOCULACIÓN SE OBSERVAN CÉLULAS GIGANTES Y MULTINUCLEADAS (40X)

• SE OBSERVAN INCITOS (AGRUPACIONES DE CÉLULAS) EN 100X

• CÉLULAS VERO SIN INFECTAR 48 HORAS POS INFECCION.

• CÉLULAS VERO SIN INFECTAR, SE OBSERVA BIEN DEFINIDO EL CITOPLASMA, LOS NUCLEOS CON SUSU RESPECTIVOS NUCLEOLOS.

• CÉLULAS VERO 24 HORAS POS INFECCION

• CELULAS DE HIGADO DE CONEJO TEÑIDAS CON GIMSA , 48 HORAS POS INFECCION (100X) NORMALES.

• CÉLULAS DE HIGADO DE CONEJO SIN INFECTAR, SE OBSERVAN LOS NUCLEOLOS Y CITOPLASMA SINAFECTAR.

• CÉLULAS GIGANTES POR EFECTO CITOPATICO ( CULTIVO DE CELULAS DE CONEJO) CAUSADO POR VIRUS DE Herpes zoster.

• CÉLULAS DE HIGADO DE CONEJO INFECTADAS con virus Herpes Zoster.

INFECTADA Vs NO INFECTADA

GRACIAS…