MÓDULO DE PROYECTO

CFGS DE DIRECCIÓN EN SERVICIOS EN RESTAURACIÓN

Cultura Biotecnológica

DEPARTAMENTO DE HOSTELERÍA Y TURISMO

Autor: Rafael Cánovas Ruiz

Tutor: Luis

MÓDULO DE PROYECTO

CFGS DE DIRECCIÓN EN SERVICIOS EN RESTAURACIÓN

Cultura Biotecnológica del Cultivo de la Vid

DEPARTAMENTO DE HOSTELERÍA Y TURISMO

Autor: Rafael Cánovas Ruiz

Tutor: Luis Emilio Carmona Ruano

Murcia, junio 2014

CFGS DE DIRECCIÓN EN SERVICIOS EN

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Índice

1. Introducción ............................................................................................... 4

1.1. La Biotecnología .............................................................................................. 4

1.2. Historia..............................................................................................................4

1.3. Importancia de la Biotecnología......................................................................5

1.4. Ventajas ............................................................................................................ 6

1.5. Inconvenientes ................................................................................................. 6

2. Cómo influye la biotecnología sobre la viticultura ................................. 7

2.1. Introducción.................................................................................................. 7

2.2. El Vino y su Producción................................................................................... 8

2.3. Barreras en la Implantación de Nuevas Tecnologías .................................. 11

3. Agentes biológicos que intervienen en la vinificación......................... 13

4. Las Bacterias: definición y tipos............................................................ 14

5. Principales Bacterias que intervienen en la vinificación ..................... 15

5.1. Clasificación y Características de las Bacterias Acéticas........................... 155.1.1. Evolución en el vino .................................................................................................................165.1.2. Métodos de detección.............................................................................................................185.1.3. Sistemas de Prevención ...........................................................................................................195.1.4. Conclusiones ............................................................................................................................21

5.2. Clasificación y características de las bacterias lácticas ............................. 215.2.1. Bioquímica de la fermentación maloláctica.............................................................................225.2.2. Otros aspectos beneficiosos del metabolismo de las bacterias lácticas en el vino .................235.2.3. Posibles perjuicios de las bacterias lácticas en los vinos .........................................................235.2.4. Carbamato de etilo ..................................................................................................................245.2.5. Causas de no realización o retrasos de la fermentación maloláctica ......................................25

6. Hongos: definición y tipos...................................................................... 26

7. Levaduras y fermentación ...................................................................... 27

7.1 Fisiología de la fermentación ......................................................................... 297.1.1 Saccharomyces cerevisiae, la estrella .......................................................................................297.1.2 Contribución al color ................................................................................................................307.1.3. Parámetros básicos para una mejor gestión ...........................................................................30

7.2. Una levadura para cada tipo de vino ............................................................ 317.2.1. La huella genética ....................................................................................................................317.2.2. La evolución de la Saccharomyces: hibridación.......................................................................327.2.3. Como se trabaja.......................................................................................................................33

7.3. Modificación genética de levaduras vínicas................................................. 337.3.1. Utilización de levaduras seleccionadas en la vinificación........................................................347.3.2. Mejora genética de levaduras vínicas......................................................................................35

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7.4 Desarrollo de nuevas levaduras más eficientes ........................................... 377.4.1. Mejoras para las denominaciones de origen...........................................................................39

8. Conclusiones finales............................................................................... 39

Anexo I ............................................................................................................ 41

Anexo II ........................................................................................................... 43

Anexo III .......................................................................................................... 45

Anexo IV.......................................................................................................... 48

Anexo V........................................................................................................... 49

Bibliografía...................................................................................................... 50

Webgrafía ........................................................................................................ 52

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1. Introducción

Antes de empezar a hablar sobre la biotecnología aplicada a la viticultura,explicaremos que es la biotecnología como concepto general, veremos cuálesson las ventajas y desventajas que tiene su aplicación, y analizaremos la importancia y la repercusión que tiene hoy en día. Entender primero que es la biotecnología nos ayudará a entender mejor las aplicaciones que tiene dentro del mundo de la viticultura y por qué es tan necesaria.

1.1. La Biotecnología

La biotecnología es una tecnología utilizada por el hombre desde hace miles de años y consiste principalmente en estudiar y aprovechar los mecanismos e interacciones de los seres vivos, en especial los unicelulares. La biología y la microbiología son las dos ciencias que conforman la base en la que se asienta la biotecnología ya que son las herramientas esenciales con las que trabaja pero no son las únicas. Veterinaria, medicina, química, física, ingeniería, ecología, agronomía, virología y genética entre otras también son disciplinas de la ciencia a las que recurre la biotecnología. La biotecnología hoy en día tiene multitud de usos, pero donde se emplea ampliamente es en agricultura, farmacia, ciencia de los alimentos, medio ambiente y medicina.

La Organización para la Cooperación y Desarrollo Económicos (OCDE) define la biotecnología como la “aplicación de principios de la ciencia y la ingeniería para tratamientos de materiales orgánicos e inorgánicos por sistemas biológicos para producir bienes y servicios”.

El ingeniero húngaro Károli Ereki fue el primero en acuñar este término en 1989, al cual hizo referencia en su libro Biotecnología en la producción cárnica y láctea de una gran explotación agropecuaria.

1.2. Historia

El uso de la biotecnología tiene su origen en el período del Neolítico cuando los seres humanos empiezan a formar asentamientos sedentarios, criar ganado y cultivar. A lo largo de todo este proceso que se prolongó durante miles de años, los humanos modificaron las características genéticas de los cultivos y de los animales que criaban. Para ello creaban o buscaban entornos que reuniesen una serie de características especiales en los cuáles las plantas o los animales que crecían y se desarrollaban en estos ambientes artificiales se veían obligados a adaptarse modificándose así su propio ADN. Más tarde, se seleccionaban a los mejores especímenes para crear una nueva generación de plantas o animales con el fin de acercarse un poco más al producto final que se

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deseaba conseguir. En el caso de las plantas estas fueron modificadas para incrementar su rendimiento, mejorar su sabor y alargar la campaña de cultivo.

Mucho más tarde, en 1830, Friedrich Theodor Schwann y Matthias Jakob Schleiden formularon juntos la teoría celular. Esta estipulaba que todo ser vivo está compuesto por células y en su interior se encuentran los cromosomas que contienen a su vez el material genético hereditario (ADN).

En el siglo XX, se hicieron descubrimientos de gran importancia en cuanto a genética se refiere. Las leyes de la herencia de Mendel junto con el estudio de la biología vegetal han permitido una gran evolución y mejora de las plantas. Los descubrimientos de Louis Pasteur en los campos de la medicina y microbiología industrial también supusieron un aporte importante.

El 90% de las especies vegetales destinadas al consumo humano que se producen en la actualidad en todo el mundo, han sufrido modificaciones genéticas y pasado por procesos de hibridación a lo largo de miles de años por parte de innumerables generaciones de agricultores decididos a obtener cosechas de la manera más eficaz y eficiente posible.

En definitiva, el objetivo que busca alcanzar la biotecnología no es otro que el de satisfacer las necesidades de los consumidores que demandan productos de más calidad, seguridad y sabor; satisfacer las necesidades de los agricultores que buscan nuevas formas de incrementar la productividad y aumentar el margen de beneficios; y satisfacer también las necesidades de los gobiernos o instituciones privadas que tratan de acabar con el hambre en el mundo, asegurar el futuro del medio ambiente, preservar la biodiversidad y garantizar la salubridad y la seguridad de los alimentos.

1.3. Importancia de la Biotecnología

El bienestar humano y la estabilidad social están directamente relacionados con los procesos naturales de la Tierra que sustentan la vida. Es indispensable asegurar la calidad del aire y del agua, disponer de suelos productivos y una biodiversidad rica en flora y en fauna para asegurar nuestra calidad de vida actual y la de nuestros descendientes en el futuro.

Por desgracia, nos encontramos en una situación en la que la población ya está sobre explotando los recursos de la Tierra. Si a este hecho le sumamos que para el año 2030 la población mundial se habrá duplicado para alcanzar cerca de los diez mil millones de habitantes, llegaremos a la conclusión de que nos encontramos ante un problema al que hay que buscarle soluciones con carácter de urgencia. La humanidad debe responder a las crecientes presiones que se ejercen sobre los recursos naturales de la Tierra para poder alimentar a una población que se encuentra en una continua expansión.

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Por tanto y teniendo en cuenta que se estima que las innovaciones biotecnológicas van a triplicar el rendimiento de las cosechas sin requerir tierras de cultivo adicionales, diremos que la biotecnología se convertirá en la herramienta que nos permitirá salvar los bosques naturales y el hábitat de los animales. Además otras innovaciones podrían reducir o eliminar la dependencia en agroquímicos que contribuyen a la degradación del medio ambiente, mientras que otras nos ayudarán a preservar el suelo y los recursos hídricos.

En conclusión, la importancia que tiene la investigación y el desarrollo de la biotecnología y su aplicación en la agricultura es totalmente innegable. La mayoría de los expertos están de acuerdo en que el mundo no se puede permitir el lujo de esperar más. Si actuamos ahora podremos cubrir las necesidades futuras de la humanidad, podremos alimentar al mundo durante los siglos venideros y mejorar la calidad de vida de la población mundial.

1.4. Ventajas

Se obtiene un rendimiento superior. Los cultivos de plantas transgénicas proporcionan más alimento utilizando menos recursos, se reduce el número de cosechas perdidas por enfermedad o plagas, así como por factores ambientales.

Se reduce el empleo de plaguicidas. Los cultivos de plantas transgénicas son más resistentes a las plagas contribuyendo así a reducir el uso de plaguicidas que suelen ser causantes de grandes daños a la salud y al medio ambiente.

Se consigue un mayor aporte de nutrientes en nuestra alimentación. Los productos obtenidos a partir de cultivos transgénicos pueden contener niveles más altos de vitaminas o proteínas que los productos convencionales, así como niveles menos elevados de alérgenos y toxinas naturales. Además, su predisposición genética permite cultivar este tipo de productos en lugares del planeta donde las condiciones climáticas y del entorno son extremas, permitiendo así que países que tienen menos recursos puedan abastecer a la población local.

Permite mejorar el desarrollo de nuevos materiales.

1.5. Inconvenientes

Disminución de la mano de obra a consecuencia de la mecanización; esto genera desempleo y éxodo rural en muchas áreas.

El acceso a las nuevas tecnologías supone una inversión de capital que no está alcance de todo el mundo, excluyendo así a los agricultores más

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pobres que no pueden acceder a estos recursos impidiendo su modernización y dejándolos en peores condiciones para competir con las producciones modernas.

Los cultivos transgénicos, aunque existen diferencias de opiniones entre los expertos, pueden suponer un grave riesgo medioambiental y para la salud.

2. Cómo influye la biotecnología sobre laviticultura

Una vez que ya sabemos en qué consiste la biotecnología y comprendemos la gran relevancia que tiene a la hora de ser aplicada en el sector agrario, nos encontramos en disposición de estudiar cual es la relación que tiene con la viticultura y cómo influye en la misma.

2.1. Introducción

La elaboración de vino es un proceso muy antiguo y los restos arqueológicossumerios hallados en Mesopotamia que datan de hace unos 6.000 a 8.000años así lo demuestran. Con lo cual, la implicación de la biotecnología, es decir, la utilización de organismos vivos en procesos industriales, que tiene en el vino, supuso un factor clave en el desarrollo de las primeras grandes civilizaciones. Aunque durante la mayor parte de la historia, la base de estas prácticas biotecnológicas fuera puramente empírica.

Casi todos los pueblos de la Tierra hicieron en la antigüedad descubrimientos similares a los de los sumerios. El vino se inventó seguramente hace 6.000 años en la zona del monte Ararat. Sin embargo, los más recientes hallazgos remiten a los chinos como los descubridores del vino hace 9.000 años (véase anexo I), en la Edad de Piedra. Los antiguos griegos y romanos sentían una gran predilección por el jugo fermentado de las uvas, el vino. Los romanos fueron, pues, lo que llevaron el desarrollo y la fabricación del vino al Rhin y Mosel.

Hasta hoy, la forma de producir vino no ha cambiado demasiado (véase anexo II): de uvas rojas y blancas, tras la vendimia, se obtiene por aplastamiento y presión (prensas de vino) el mosto de la uva. Este jugo filtrado fermenta en barriles cerrados. Antes eran barriles de madera, hoy se utilizan tanques de acero inoxidable con capacidad de hasta 250.000 litros. Mundialmente se producen cada año alrededor de quinientos millones de hectolitros.

Durante el proceso de elaboración del vino, el azúcar se transforma en alcohol a través de la fermentación (véase anexo III) que es el resultado final del metabolismo de las levaduras. Un 2 o un 3% de alcohol cambia la

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permeabilidad (fluidez) de la membrana citoplasmática de las bacterias e inhibe con ello su crecimiento. En los climas calurosos de Oriente, el medio de fermentación inhibidor de microbios es una ventajosa, si no decisiva, cualidad higiénica. Gracias a la agricultura la población creció enormemente. El agua potable limpia resultó de repente un problema, como también sucedió en el siglo XIX en Europa. Los productos de la fermentación, cerveza, vino y vinagre, estaban, sin embargo, exentos de gérmenes peligrosos. Incluso se podían elaborar con agua potable ligeramente contaminada, porque no solo el alcohol sino también los ácidos orgánicos inhibían a los patógenos existentes. El agua no colmó, pues la sed de nuestros antepasados, sino la cerveza, el vino y el vinagre. La biotecnología más antigua del mundo era nutritiva, estimulante y también segura –un avance revolucionario, que debió ser sencillamente favorable.

En la actualidad y en consecuencia de los avances científicos de los últimos 150 años principalmente, el conocimiento empírico está siendo sustituido por un adecuado conocimiento de los procesos que rigen estas transformaciones biotecnológicas. La importancia de la biotecnología en la industria vitivinícola se ve reflejada en el creciente número de países que han creado centros específicos de biotecnología aplicados a la industria del vino: España, Francia, Italia, Australia, Nueva Zelanda, Sudáfrica, Canadá, EEUU, etc. La creación de estas infraestructuras es un claro reflejo de la importancia que esta área del conocimiento tendrá, a medio y largo plazo, en la industria.

Sin embargo, los productos vitivinícolas, así como el resto de alimentos destinados al consumo humano, están sujetos a las exigencias y desafíos actuales de calidad, seguridad y sostenibilidad medioambiental. Es por esta razón por la que la gestión planificada, proactiva y centrada en los requerimientos, cada vez más exigentes de clientes y países, se ha convertido en imprescindible. Sin embargo, el sector de la industria alimentaria abarca una serie de características especiales, tanto sociales, culturales, turísticas, técnicas, científicas y culinarias, que comprenden prácticamente todas los estratos de la sociedad y el grueso de la mayor parte de la historia de la humanidad. Son precisamente estas características especiales las que hacen que la aplicación de los avances tecnológicos o de gestión, entre otros, sean muy específicos.

2.2. El Vino y su Producción

Desde mi punto de vista, el empleo de la biotecnología en el proceso de elaboración del vino da como resultado una de sus manifestaciones más hermosas. La agricultura de la vid y el cuidado de las condiciones para que las fermentaciones se lleven a cabo adecuadamente durante la elaboración del vino son procesos biotecnológicos muy antiguos.

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Existe un gran abismo entre la tecnología disponible y la tecnología empleada en el sector vitivinícola, la ausencia de control microbiológico en el proceso de elaboración y producción del vino es un claro ejemplo de ello. Y aunque es cierto que en los últimos veinte años se han producido avances en el sector vitivinícola relacionados con la biotecnología, la transferencia de conocimientos y tecnología no se ha llevado a cabo correctamente, los avances han sido pocos y se han ido incorporando muy lentamente.

En el caso de las actividades vitivinícolas, ciertos trabajos estudian esta tensión entre las nuevas tecnologías agronómicas adoptadas en la etapa agrícola y los saberes tácitos de los productores (Bocco, y cols, 2007; Bell y Giuliani, 2007). Un aspecto que refuerza esta tensión es el rol que han jugado los avances recientes en la biología molecular en las tecnologías de fermentación.

En la industria vitivinícola, el cambio tecnológico venía determinado por suincorporación en bienes de capital y por los saberes artesanales de los enólogos en la selección de las cepas de levaduras utilizadas en la fermentación. No obstante, la acumulación de capital exige avanzar en la industrialización de estos procesos a fin de asegurar, por un lado, la producción a gran escala y por el otro, reducir los tiempos de rotación del capital. Labiotecnología abre nuevas oportunidades en este sentido, a partir de la identificación, selección y finalmente modificación de las levaduras y bacterias que cumplan con estos objetivos. Esto requiere la ampliación de las capacidades y de los conocimientos en biología molecular que no todas las industrias (y empresas) tienen posibilidad de integrar.

El 90%, aproximadamente, de las bodegas españolas son susceptibles a los avances biotecnológicos que aportan las investigaciones tanto de las empresas dedicadas a este tipo de desarrollo como los centros públicos. Por el contrario, únicamente el 25% de las bodegas mantienen líneas para mejorar sus vinos a partir de biotecnología enológica.

Aunque pueda sonar extraño, la biotecnología enológica tiene aplicaciones reales en el sector. Gracias a la biotecnología, las bodegas pueden trabajar con levaduras que optimicen la calidad de los vinos (por ejemplo, que trabajen en frío, eliminen problemas de reducción o defectos del vino); se cuenta también con enzimas que lleven a la extracción de color y que sea estable; o con técnicas de biología molecular para ver cómo actúan las levaduras.

Uno de los temas “candentes” en la actualidad es la producción de manoproteínas, que ayudan a mejorar el volumen y la estabilidad de los vinos. Son moléculas naturales de las que se conoce ya su eficacia por parte de los enólogos. Otra línea actual en los laboratorios biotecnológicos dedicados a la enología es la selección de levaduras para eliminar defectos o que marquen más la fruta, con capacidades enzimáticas potentes.

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La industria de la viticultura destina una cuarta parte de sus recursos económicos a la investigación y desarrollo. Sin embargo, el reparto de recursos es diferente. El 90% de las bodegas utilizan la biotecnología como recurso pero solo un 25% tienen líneas propias de investigación.

Durante la realización de este estudio se pudo observar como algunas bodegasdejan fermentar el mosto de forma espontánea para que sean las levaduras autóctonas las que hagan el trabajo. Se les deja actuar sin tener el más mínimo conocimiento de su naturaleza y en ocasiones surgen problemas; menos graves como la aparición de aromas no deseados o la ausencia de aromas o sabores positivos que se podían encontrar en vinos de otros años, o problemas realmente graves como paradas o ralentizaciones de la fermentación.

Por lo general, no suelen haber paradas, pero los resultados de los análisis científicos revelan que la presencia y la concentración de levaduras comerciales en el proceso de fermentación del vino varía enormemente de una bodega a otra o de un año a otro. Con concentraciones altas de levaduras comerciales se obtienen vinos bastante más homogéneos pero se pierde tipicidad. Además no se potencian los aromas que residen escondidos en las levaduras autóctonas de la propia viña.

El sostenimiento de calidades homogéneas de una campaña agrícola a otra, la reducción de tiempos de fermentación y el control de desarrollos microbianos no deseados constituyen problemas técno-económicos cruciales en este tipo de industrias.

Por ello, las innovaciones en levaduras, bacterias y enzimas posibilitan mejorar la calidad sostenida en el tiempo y responder a las crecientes exigencias de diferenciación. Las innovaciones en nuevas levaduras posibilitan controlar la acción de procesos de fermentación espontánea, con efectos sobre la calidad que son altamente impredecibles. No obstante, existen segmentos industriales cuya estrategia se basa en la renovación de sabores bajo condiciones espontáneas de desarrollo de microorganismos durante la fermentación. Este es el caso de las bodegas boutique que optan por tecnologías artesanales, asumiendo los riesgos de la viabilidad del producto. En los segmentos industriales intensivos a gran escala, la lógica de acumulación exige procesos rápidos y confiables de fermentación, esenciales para lograr vinos con gustos consistentes y calidad predecible, reduciendo al mismo tiempo, los tiempos de rotación de capital. En estos casos se recurre a cepas de levaduras comerciales seleccionadas (levaduras de la especie Saccharomyces cerevisiae) y al desarrollo de enzimas (Véase anexo IV).

De esta forma, se asiste a una tensión entre la trayectoria tecnológica preexistente, asociada a una base estrictamente empírica limitada por el desconocimiento de las características a nivel molecular de los microorganismos y de su metabolismo, y los avances de la biología molecular,

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con el mayor conocimiento de los procesos que rigen las transformaciones en el proceso de fermentación.

Existen técnicas diferentes a las basadas en el ADN recombinante que utilizan la biología molecular para la identificación, diferenciación y seguimiento de los microorganismos involucrados en los procesos fermentativos, apoyadas en técnicas convencionales de selección (Anexo IV).

Cambiando ligeramente de contexto, observamos que en las bodegas donde se elaboran vinos mediante crianza biológica, finos o manzanillas, se sabe que las levaduras que forman el velo de flor son distintas en cada bota. Por esta razón, como bien saben ya los profesionales de las bodegas de Jerez o Sanlúcar de Barrameda, hay botas que desprenden mejores aromas que otras. Botas donde el vino envejece de manera distinta, mejor, con más cuerpo, inevitablemente este vino acabará mezclándose con el resto de botas, donde no se encuentran estas características. Sería interesante conocer qué clase de levaduras son las responsables de las características distintivas de la bota buena y de esta manera conseguir que el resto de botas cuenten con la presencia de estas mismas levaduras para obtener un mejor producto más uniforme o acelerar la crianza y conseguir así una mayor calidad en un tiempo más reducido.

Un mayor control microbiológico permitiría a las bodegas identificar y diferenciar las distintas clases de levaduras que confluyen en la fermentación del vino. Hoy en día contamos con un extenso catálogo de técnicas de biología molecular que sirven a este efecto y que solo falta que las bodegas empiecen a aplicar.

2.3. Barreras en la Implantación de Nuevas Tecnologías

El sector bodeguero y vitivinícola es un sector muy tradicional que aún no es plenamente consciente de la importancia que tiene la aplicación de la biotecnología en sus sistemas de producción. La administración pública ha hecho un gran esfuerzo en las últimas décadas para implantar un modelo de transferencia tecnológica destinado a la innovación y aumento de la competitividad de las empresas. Sin embargo, la falta de inercia que este modelo tiene en nuestro país se debe fundamentalmente al poco calado que ha tenido entre sus destinatarios. La ausencia de una comunicación adecuada entre investigadores y empresas ha ayudado a que esto sea posible. No obstante, la administración pública considera que los investigadores y lasempresas se deben reunir para abordar estrategias conjuntas que permitan acelerar el proceso de llevar el conocimiento y las innovaciones tecnológicas a los usuarios. Lamentablemente, son pocas las ocasiones en las que esto sucede impidiendo de esta forma desarrollar proyectos conjuntos que puedan llevarse a una fase de explotación de resultados exitosa.

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Ambas partes se siguen viendo como agentes totalmente independientes. Cuando los investigadores consideran a las empresas como entidades totalmente ajenas que alivian la falta de personal científico en el sistema español de I+D+i a cambio de unos cuantos análisis, los proyectos de desarrollo tecnológico y transferencia de conocimientos acaban fracasando. Por otro lado, cuando son las empresas las que ven a los investigadores como instrumentos para conseguir subvenciones de I+D+i y justificar departamentos de I+D+i formados por una habitación vacía, entonces los proyectos de desarrollo tecnológico y transferencia de conocimientos terminan fracasando. Si hasta el momento la mayoría de los proyectos de desarrollo tecnológico y transferencia de conocimientos en el sector vitivinícola no han cuajado en la innovación de las bodegas, habrá que empezar a preguntarse en cuantos casos se partió de la premisa adecuada y en cuantos casos se partió de las absurdas concepciones de cada agente anteriormente citadas.

A pesar de que las capacidades y el nivel en general de nuestros científicos es bastante bueno, son muchos los factores que quedan fuera de este estudio y que han dado lugar a que la cultura científica no haya calado en nuestra sociedad al mismo nivel que en otras que viven más pendientes de la ciencia y los descubrimientos que se hacen en este campo. Y al igual que los ciudadanos, las empresas no tienen una relación fluida con el mundo científico.

Esta situación supone un importante obstáculo para que las empresas depositen su confianza en los científicos como fuente de soluciones efectivas. También impide que las empresas maduren aspectos clave de la planificación de estrategias para solucionar problemas de carácter financiero, como evaluación de casos de éxito, gastos asociados, tiempo estimado de recuperación del dinero invertido, adecuado seguimiento de las actividades, etc. Por tanto, para eliminar esta barrera es necesario que exista un mayor acercamiento entre el mundo empresarial y la ciencia, y que se creen iniciativas que fomenten el contacto entre estos dos mundos. Para alcanzar este objetivo podrían crearse centros tecnológicos que sirvan como lugar de encuentro y nexo permanente de empresarios, en este caso del sector agroalimentario, y científicos. En este tipo de centros las empresas tendrían la posibilidad de acceder a los últimos avances tecnológicos y acceder a toda la información relacionada con su sector. Del mismo modo, los científicos tendrían la posibilidad de entender y analizar junto a las empresas cuales son los problemas sobre los que se debe actuar para dar con soluciones más efectivas y acordes con su magnitud.

La Asociación Española de Bioempresas (ASEBIO) llevó a cabo hace unos años, durante la última legislatura Socialista, una iniciativa que recibió fondos del Ministerio de Industria, Comercio y Turismo, y que consistía en la realización de diagnósticos tecnológicos y desarrollo de planes de implantación de soluciones biotecnológicas en sectores consolidados.

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Las conclusiones que se obtuvieron de esta iniciativa, denominada Innoempresa, fueron de lo más interesantes. Se pudo apreciar, por ejemplo, que el sector más activo en cuanto a participación fue el agroalimentario, lo que indica que este sector está especialmente necesitado de biosoluciones. Más concretamente, el sector bodeguero tuvo una participación muy activa en las jornadas sectoriales organizadas por ASEBIO y algunas bodegas participaron también en las jornadas como receptoras de diagnósticos y planes de implementación durante el desarrollo del programa. Y aunque las bodegas tenían claras sus necesidades, fue realmente complicado hacer que comprendiesen los conceptos científicos básicos que apoyaban las biosoluciones planteadas. Debían entender que la ciencia y la tecnología cambian a un ritmo vertiginoso, lo que hace que sea vital para el futuro de las empresas estar pendientes de las últimas novedades y actualizar tanto sus equipos como los conceptos de trabajo.

La formación continua y el reciclaje de los profesionales del sector vitivinícola facilitaría la apertura de debates y la creación de mesas de negociación entre los centros productores de conocimiento y las empresas con el fin de impulsar un mayor número de iniciativas innovadoras de transferencia de tecnología. Las universidades, por ejemplo, podrían hacerse eco de esta necesidad e implantar cursos de formación continua destinados a profesionales de empresas de su entorno en sectores clave.

Las bodegas, tanto las que ya están consolidadas como los pequeños productores que necesiten innovar o resolver problemas para adaptarse a nuevas situaciones pueden acudir a cualquiera de las empresas de base tecnológica especializadas en el sector que han proliferado durante los últimosaños. Donde además podrán exponer sus problemas y recibir soluciones en un lenguaje entendible, o reflexionar sobre temas concernientes al sector con técnicos especializados en la materia.

3.Agentes biológicos que intervienen en la vinificación

A continuación y después de haber explicado cual es la relación que vincula la biotecnología con el mundo del vino, nos centraremos y hablaremos de los principales protagonistas responsables directos de la vinificación que no son ni más ni menos que un grupo de fungidos y de bacterias.

Los hongos que encontramos en este proceso pertenecen al grupo de las levaduras que son las que se encargan de la fermentación alcohólica. Y dentro del grupo de las bacterias encontramos que son las bacterias lácticas las que se encargan de la fermentación maloláctica. Así mismo, también contamos conun grupo de bacterias llamadas acéticas que se encargan de estropear el vino.

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4. Las Bacterias: definición y tipos

Antes de centrarnos en las bacterias acéticas que son unos de los organismos principalmente responsables de intervenir de forma negativa en el proceso de elaboración del vino, o de las bacterias lácticas que por el contrario resultan beneficiosas y hacen una gran aportación positiva, repasaremos el concepto de bacteria de una forma general para así comprender mejor su interacción con el mosto de la uva.

El primer concepto que hay que saber y tener en cuenta sobre las bacterias es que son procariotas, es decir, su información genética no está localizada en un núcleo celular sino que se encuentra libre en el citoplasma como ADN de doble hebra en forma de anillo.

Les faltan los típicos orgánulos subcelulares de las eucariotas (levaduras, células de plantas y animales superiores), como las mitocondrias (para la respiración celular) o los cloroplastos (para la fotosíntesis) y el retículo endoplasmático.

Las bacterias viven predominantemente de modo heterótrofo, es decir, captan su energía de la materia orgánica. Sin embargo, también existen algunos tipos que pueden captar energía fotosintéticamente o de enlaces inorgánicos (por ejemplo azufre) mediante quimiosíntesis.

Entre las bacterias hay unicelulares móviles e inmóviles (por ejemplo pequeños bacilos), pero también pluricelulares, por ejemplo asociaciones celulares del género Nocardia y redes similares a hilos de hongos (micelios) del tipo de Streptomyces.

A los bacilos y cocos gramnegativos aeróbicos pertenecen Pseudomonas(utilización de hidrocarburos, oxidación de esteroides) y Acetobacter (formación de ácido acético), Rhizobium (oxidación del nitrógeno) y Methylophilus(proteína unicelular, oxidación de metanol).

Los bacilos gramnegativos anaeróbicos facultativos son, por el contrario, las bacterias intestinales Escherichia coli, los “animales de compañía” del ingeniero genético.

Bacilus (producción de enzimas) y Clostridium (producción de acetona y butanol) pertenecen a los bacilos y cocos grampositivos formadores de esporas.

Los cocos grampositivos son los formadores de ácido láctico, como Streptococcus, Staphylococcus (intoxicación de alimentos), Propionibacterium(vitamina B12, preparación de queso), Nocardia (oxidación de hidrocarburos) y estreptomicetos (antibióticos, enzimas).

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Lactobacillus (formación de ácido láctico) se encuentra entre las bacterias grampositivas no formadoras de esporas.

Las bacterias producen un gran daño al causar enfermedades y estropear alimentos, pero sin embargo también tienen un enorme significado económico en los procesos biotecnológicos.

5. Principales Bacterias que intervienen en la vinificación

5.1. Clasificación y Características de las Bacterias Acéticas

En primer lugar hay que señalar que en los últimos tiempos la clasificación de las bacterias acéticas ha variado enormemente. Esto se debe a la constante modernización de los equipos que emplean los científicos en los laboratorios y que obligan a revisar esta clasificación periódicamente. Actualmente podemos encontrar bajo el nombre de bacterias acéticas al grupo de bacterias pertenecientes a los siguientes géneros: Acetobacter, Acidicaldus, Acidiphilium, Acidisphaera, Acidocella, Acidomonas, Asaia, Belnapia, Craurococcus, Gluconacetobacter, Gluconobacter, Kozakia, Leahibacter, Muricoccus, Neoasaia, Oleomonas, Paracraurococcus, Rhudopila, Roseococcus, Rubritepida, Saccharibacter, Stella, Swaminathania, Teichococcus y Zavarzinia.Dentro del mundo enológico, las especies más conocidas son Acetobacteraceti, Acetobacter pasteurianus y Gluconobacter oxydans. Otras especies que también han sido asociadas a las uvas y al mosto son Gluconacetobacterhanseni (Du Toit y Lambrechts 2002; Du Toit y Pretorius 2002).

Para entender cómo actúan estas bacterias en el vino y saber por qué afectan tan negativamente al resultado final, es importante que sepamos primero que son. Las bacterias acéticas son un grupo de microorganismos presentes de forma natural en el mosto y que pueden causar problemas durante la elaboración y el envejecimiento del vino. Las BA son metabólicamente activas desde el momento en que se inicia el desarrollo de la uva en el campo hasta que el vino llega al consumidor, generando una serie de compuestos no deseados que tendrán consecuencias en la calidad del producto final. En un proceso que se da sobre todo en las bayas, las bacterias acéticas pueden convertir la glucosa y fructosa en ácido glucónico y oxofructosa, respectivamente. De igual manera, las BA pueden metabolizar algunas hexosas como manitol, manosa o ribosa.

A todo hay que sumar que su asociación con las levaduras de la uva, pueden producir ácido acético y acetaldehído, lo que incrementa la acidez volátil del mosto. La acumulación de estos metabolitos suele depender de la cepa, del estado de la uva y de la concentración de los diferentes azúcares. Al igual que

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en el caso de las levaduras, la población de las BA es mayor cuando la uva está dañada, ya que las bacterias pueden acceder fácilmente al interior de la uva, rica en nutrientes.

Por otro lado tenemos que en la bodega, la consecuencia más conocida de la actividad de las BA es el picado acético del vino. Este proceso se caracteriza por la oxidación del etanol en ácido acético, lo que puede elevar la acidez volátil del vino hasta valores de 0,8 g acético/l. Esto tiene consecuencias organolépticas de sobra conocidas por todos los enólogos. La velocidad de este proceso está determinada por la especie, la cantidad de BA presentes en el vino y por las características del vino. En las BA, este proceso metabólico se favorece cuando la concentración en oxígeno es baja.

Durante el proceso de transformación del etanol a ácido acético se puede obtener un metabolito intermedio llamado acetaldehído y que se puede encontrar libre en el medio. La concentración de este compuesto varía mucho entre los diferentes tipos de vinos, pero puede llegar a valores de 200 mg/l. Como norma general, podemos decir que se produce acetaldehído cuando hay poco oxígeno disuelto en el medio y cuando la concentración de etanol es alta; justo las condiciones que se dan en el vino. Sensorialmente, el acetaldehído da un carácter oxidado al vino a partir de 50 mg/l.

Hay que tener en cuenta que las BA pueden utilizar también el glicerol como fuente de carbono, generando principalmente dihidroxiacetona. De esta manera, se reduce en el vino la concentración de glicerol obtenido durante la fermentación alcohólica. También se pueden incrementar los niveles de acetato de etilo y de acetoína, lo que aporta al vino aromas similares a la mantequilla.

Sin embargo, los efectos negativos en el sabor no son los únicos efectos que causados por los compuestos resultantes del metabolismo de las BA. Algunos compuestos, como la dihidroxiacetona, el acetaldehído y la 5-oxofructosa, actúan como compuestos quelantes (secuestrantes) del dióxido de azufre, reduciendo la concentración de SO2 libre en el medio y debilitando el poder de acción antimicrobiana y antioxidante de este aditivo. Las bacterias del género Gluconobacter son grandes productores de este tipo de compuestos (Barbe y cols., 2001). Y para terminar mencionaremos que algunas BA tienen la capacidad de liberar en el vino cadenas de polisacáridos, lo que incrementa su viscosidad y filtración del mosto y del vino.

5.1.1. Evolución en el vino

A continuación estudiaremos brevemente cuál es la evolución que sufren las BA a lo largo del proceso de elaboración del vino ya que es muy importante tener una serie de conceptos claros para entender cómo podemos actuar sobre estos pequeños microorganismos y evitar así defectos en el producto final.

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En primer lugar hay que saber que las bacterias acéticas representan aproximadamente más del 68% del total de las bacterias presentes en la uva en el momento de la recogida, dependiendo del estado sanitario general de ésta (Barbe y cols., 2001). Actualmente no existe un consenso entre los investigadores y no se ponen de acuerdo en cómo se desarrolla la evolución de las diferentes poblaciones de bacterias acéticas durante los primeros días de la vinificación. Para González y cols. (2004), el número de BA crecía nada más comenzar la vinificación, mientras que para Joyeux y cols. (1984) este descendería (Ver tabla 1). Sin embargo, ambas investigaciones coinciden en que la concentración de BA desciende drásticamente durante la fermentación alcohólica. Pero finalmente, la concentración de BA se mantiene estable y por debajo de los 1.000 CFU/ml a lo largo de la fermentación maloláctica y la crianza en barrica.

Las bacterias acéticas son aerobias obligadas, lo que significa que necesitan oxígeno en el medio para su crecimiento y su actividad metabólica. Durante la fermentación alcohólica, el oxígeno presente en el mosto se agota a gran velocidad, lo que mantiene a la población de BA bajo control. Sin embargo, cualquier tratamiento que incluya agitación u oxigenación favorecerá el crecimiento de las BA. En la tabla 1, hay un ejemplo del efecto de las operaciones de vinificación sobre las poblaciones de bacterias acéticas. Tras el trasiego, cuando el vino se oxigena, se observa que el número de células capaces de formar colonias se multiplica por 1.000. Al comenzar la fermentación maloláctica pueden superar los 105 CFU/ml, lo que conlleva a un aumento en los niveles de concentración de ácido acético (Gonzáles y cols., 2005). Datos similares se han obtenido en experimentos a escala de laboratorio (Joyeux y cols., 1984). Con respecto a la

guarda, los mismos autores han propuesto que la tasa de penetración del oxígeno en la barrica (unos30 mg/l por año) es suficiente para mantener poblaciones pequeñas de bacterias acéticas.

A lo largo de la vinificación se puede observar como la especie de BA predominante en el medio es una u otra dependiendo de la fase en la que se encuentre o de las características del mismo entorno. En las uvas sanas, por ejemplo, la población de bacterias acéticas inicial estaría compuesta

CFU/mlMosto 16.000Fermentación alcohólicaTras 3 días 3.000Tras 7 días 100En el día 10

Antes del trasiego 20Tras el trasiego 30.000

Fermentación malolácticaAl comienzo 400Al final (3 meses) 120Envejecimiento en barricaTras 4 meses 160Tras 6 meses 900Tras 9 meses 600Tras 11 meses 600

TABLA 1. Evolución de la población de bacterias acéticas durante la elaboración de vino tinto (adaptado de Joyeux y cols, 1984).

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fundamentalmente por G.oxydans, mientras que las uvas con botrytis también acogen cepas de A. aceti y A. pasteurianus (González y cols., 2005; joyeux y cols., 1984). En el mosto, al principio de la fermentación, predominan cepas de G. oxydans, pero desaparece tras la fermentación alcohólica debido a la poca resistencia al etanol de esta bacteria (Gonzáles y cols., 2004; Drysdale y Fleet, 1989). Al final en la fermentación contamos con la presencia de cepas de A. aceti y de A. pasteurianus, ya que presentan gran resistencia al etanol y a las condiciones de microaerobiosis.

5.1.2. Métodos de detección

En este apartado veremos algunos de los métodos más conocidos que existen para detectar la presencia de bacterias acéticas en el vino que se estéproduciendo. Algunos de estos métodos de detección son el sistema GYC, el sistema Manitol o el sistema Agar carbonato. Sin embargo, el empleo de estos sistemas clásicos de detección pueden acarrear una serie de inconvenientes, sobre todo en muestras procedentes de vinagres. Cuando Bartwosky y cols. (2003) intentaron aislar bacterias acéticas a partir de vino embotellado, comprobaron que no se reproducían en los medios más comunes para las bacterias. Es por ello que se han desarrollado técnicas de doble capa de agar y ácido acético que presentan unas condiciones generales en el medio favorables para su reproducción (Entani y cols., 1985).

Hasta no hace mucho, la clasificación de las bacterias acéticas se hacía en función de sus características fenotípicas, como la apariencia y la fisiología. Sin embargo estas características pueden variar entre cepas de la misma especie de BA, lo que complica su identificación y obliga a realizar muchas pruebas. Actualmente, la mayoría de las especies bacterianas se clasifican de acuerdo a la secuencia del gen 16S. Este gen, como ya sabemos, se encuentra junto con el resto de genes presente en el ADN de las bacterias. Otras zonas que se suelen estudiar son las comprendidas entre los genes 16S y 23S.

Es curioso ver como en el caso de las bacterias acéticas, se da una situación especial. El gen 16S es una zona que conserva muy bien los rasgos a nivel de especie, lo que permite de una forma eficaz la identificación de las BA para Poblet y cols. (2000) y para Ruiz y cols. (2000), mientras que para Trcek y cols. (2000) esta zona estaría excesivamente conservada. Por otra parte la zona 16S-23S presenta una secuencia muy variable, demasiado variable para Ruiz y cols. (2000) pero sin embargo, para Trcek y cols. (2002), esta zona es la apropiada.

También existen otros genes como el gen adhA que se han investigado como posibles objetivos para discriminar las especies pero los resultados obtenidos no han mejorado con respecto a los obtenidos en los fragmentos 16S y 23S (Trcek, 2005). Recientemente, se han desarrollado métodos de real-time PCR para cuantificar bacterias acéticas que, según los investigadores, pueden

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detectar niveles de 10 células/ml (Gammon y cols., 2007; González y cols., 2007). Estas investigaciones han permitido a los laboratorios de análisis desarrollar técnicas de detección e identificación rápida para las bacterias acéticas presentes en el vino, ayudando a los enólogos a evaluar el riesgo de picado acético de sus vinos.

5.1.3. Sistemas de Prevención

Como ya hemos visto anteriormente, las condiciones que se dan en el vino no impiden el desarrollo y proliferación de las bacterias acéticas. Estas bacterias resisten altas concentraciones de etanol, se desarrollan adecuadamente en temperaturas de entre 18 y 30 ºC, a partir de los 10 ºC inician su actividad metabólica, y ni el pH del vino ni las concentraciones de dióxido de azufre (SO2) habitualmente utilizadas en bodega impiden su proliferación.

Actualmente, no se conoce ningún sistema que permita, a nivel industrial, eliminar las BA de una bodega, y mucho menos de la uva. Pero podemos frenar su proliferación hasta niveles peligrosos, evitando las consecuencias negativas que repercuten en el vino. Los puntos clave que hay que tener en cuenta para tener bajo control la actividad de las BA son:

- El oxígeno. Este es el auténtico factor que delimita su crecimiento. La ausencia de oxígeno no acaba con las bacterias, pero impide su normal desarrollo y afecta de manera importante a su metabolismo. Así pues, el riesgo de contaminación crece con los tratamientos que oxigenan el vino, los que retrasan la fermentación y los que permiten al mosto entrar en contacto con el aire. Por esta razón, es de gran importancia iniciar la fermentación alcohólica con prontitud, terminarla de la forma correcta y ser cuidadoso con los tratamientos que recibe el vino durante la fermentación y la guarda.

- La limpieza y desinfección de las instalaciones, incluyendo maquinaria, depósitos, barricas, botellas y demás elementos de las bodegas. De esta manera, reduciremos la concentración de BA inicial y la presencia de cepas resistentes. Llevar a cabo este proceso en superficies porosas, como pueden ser el interior de las barricas, entraña mayor dificultad.

- Las uvas suelen estar contaminadas con BA. Sin embargo, la concentración de BA es mayor en uvas dañadas que en uvas sanas, por lo que la utilización en el proceso de vinificación de uvas en buenas condiciones higiénicas permite reducir los niveles iniciales de BA.

- Los niveles de azúcar residual deben estar bajo control en los vinos, ya que con niveles altos de azúcar residual se aumenta la probabilidad

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de que aparezcan bacterias perjudiciales capaces de alterar al producto dando como resultado un producto de poca calidad.

- El embotellado es uno de los momentos clave para evitar la proliferación de bacterias acéticas durante el envejecimiento del vino ya que la transmisión de oxígeno, y con ello la actividad de las bacterias acéticas, va a depender del tipo de material en el que envasemos nuestro vino. Así pues, el uso de materiales plásticos (PET o formatos tipo Bag-in box) se ha visto limitado por su alta transmisión de oxígeno a través de este material pero actualmente se está investigando para mejorar este aspecto.

- El tipo de corcho que se emplee en el embotellado afectará en gran medida a la calidad del vino. El corcho natural presenta unos niveles bajos de porosidad frente al oxígeno, lo que favorece la conservación del vino. Sin embargo permite la entrada de cantidades justas de aire para que respire el vino y consiga un mejor sabor de envejecimiento. Por otro lado, los tapones sintéticos flojos pueden hacer que el oxígeno se filtre en el vino y, como resultado, que la bebida se avinagre. El corcho convencional, además, es un material que no se expande. Las botellas de vidrio suelen contraerse o expandirse dependiendo de la temperatura y los únicos que se adaptan a estos mínimos movimientos son los corchos naturales.

- El almacenamiento y el transporte. Un espacio excesivo entre el corcho y el vino, tras el embotellado, puede estimular la actividad de las bacterias acéticas. Así mismo, almacenar la botella verticalmente y con el tapón hacia arriba, o almacenarla a temperaturas inadecuadas, puede favorecer el picado del vino. Diversas investigaciones apuntan a que las BA son muy poco activas a temperaturas por debajo de 10ºC.

Una vez ha comenzado, el picado acético echará a perder casi con total seguridad el vino dejándonos un escaso margen de actuación para revertir la situación. En el caso de que la contaminación se encuentre en fase inicial, se puede intentar una filtración esterilizante, seguida de una sulfitación adecuada y la guarda del vino en botellas perfectamente limpias. Si la contaminación está en un grado avanzado, donde la concentración de acético es alta y se percibe con facilidad, el vino es difícilmente recuperable y deberíamos pensar en destinarlo a la elaboración de vinagre o destilación.

Por último, me gustaría llamar la atención sobre ciertas prácticas tecnológicas que se dan en el mundo del vino y que favorecen el crecimiento y la actividad de estas bacterias. Entre ellas, están la baja sulfitación del mosto, el abuso de los trasiegos, la falta de filtración, el uso de corchos de mala calidad, los retrasos en el rellenado de cubas y todos los tratamientos que implican un retraso en la fermentación alcohólica o la oxigenación excesiva del vino. Un

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claro ejemplo es la aireación, que aunque es una práctica que facilita el correcto desarrollo del color del vino, también posibilita la proliferación de bacterias acéticas. Es labor de cada enólogo por tanto, analizar los pros y contras de estas prácticas de acuerdo al vino que quiere obtener, apoyándose en las técnicas actuales disponibles para detectar y cuantificar el desarrollo de las bacterias que pueden echar a perder un buen vino.

5.1.4. Conclusiones

Nuestros vinos no están a salvo ni en las barricas ni en las botellas. Visto de forma general, las BA están presentes desde el momento en que se recoge la uva, pueden sobrevivir durante la vinificación y aguantan el embotellado y la guarda del vino. Pero contamos con la ventaja de que necesitan oxígeno para desarrollarse y reproducirse. Así pues, una correcta selección de la uva, un proceso de vinificación correcto y el cuidado durante el embotellado ayudarán a reducir el nivel de concentración inicial de bacterias acéticas e impedirán su crecimiento. Para evitar el picado acético del vino, debemos prestar especial atención a la limpieza e higiene en nuestras bodegas, a los tratamientos que pueden oxigenar el vino y al mantenimiento de las condiciones de anoxia durante la vinificación. Al tratar con las BA y haciendo alusión al refranero español, prevenir es primordial ya que curar es casi imposible.

5.2. Clasificación y características de las bacterias lácticas

La principal fermentación del vino es la alcohólica, producida por las levaduras. Ahora bien, como el mosto y los recipientes donde tiene lugar la vinificación no son estériles, aparte de las levaduras (autóctonas o comerciales) también hay otros microorganismos, como las bacterias acéticas y las bacterias lácticas. El papel beneficioso más conocido de las bacterias lácticas en los vinos es la fermentación maloláctica, que da lugar a una desacidificación del vino.

Las bacterias lácticas o bacterias del ácido láctico son bacterias grampositivas de bajo contenido en G+C. Tienen en común el hecho de producir ácido láctico a partir de azúcares, debido a su metabolismo exclusivamente fermentativo, sobre todo la fermentación láctica. Por eso son anaerobias, aunque también toleran la presencia de oxígeno. Son, por tanto, anaerobias aerotolerantes. Desde el punto de vista metabólico, tienen unos requerimientos nutritivos complejos (aminoácidos, vitaminas, etc.)

El número de bacterias lácticas presentes durante la fermentación alcohólica normalmente es muy bajo, como mucho 100 por ml, ya que la mayoría son inhibidas por el etanol y por el SO2 añadido al mosto para controlar la población bacteriana, especialmente las acéticas. Cuando la alcohólica termina y las levaduras mueren, algunas bacterias lácticas pueden prosperar y conseguir un cierto crecimiento, en ocasiones, hasta 10 millones por ml. Estas bacterias lácticas producen algunas transformaciones en el vino, de las cuales la más

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interesante es la llamada fermentación maloláctica (FML). Las bacterias lácticas que se pueden aislar en muestras de mostos y vinos son de los géneros Lactobacillus, Pediococcus, Leuconostoc, Weisella y, sobre todo, de Oenococcus oeni (véase anexo V).

5.2.1. Bioquímica de la fermentación maloláctica

El papel más beneficioso conocido de las bacterias lácticas en los vinos es la FML, que da lugar a una desadificación del vino. El mosto de la mayoría de las uvas, excepto los de climas muy cálidos, contienen una cierta cantidad de ácido L-málico (1-5 g/l), que tiene un sabor fuerte y áspero. Normalmente, después de la fermentación alcohólica, si bien muy ocasionalmente de forma simultánea a esta, las bacterias lácticas como O.oeni pueden realizar esta FML, que es la descarboxilación de L-málico en L-láctico, con desprendimiento de CO2 que aparece como pequeñas burbujas en el vino. Esta reacción es llevada a cabo porque dichas bacterias tienen la enzima maloláctica, que requiere MN++ y NAD+. Como el málico es dicarboxílico y el láctico es monocarboxílico, esto conlleva una reducción de la acidez, de 0,1 a 0,5 unidades de pH.

Desde el punto de vista metabólico, la FML no es una fermentación clásica como la misma láctica donde se utilizan azúcares como sustratos y obtienen ATP por fosforilación a nivel de sustrato en las reacciones de la glucólisis. La FML solamente es una descarboxilación que no parece que conlleve, en principio, ningún beneficio energético a las células que la realizan, y donde el único beneficio aparente sería la subida del pH externo. Sin embargo, se ha descubierto que la FML es una de las fermentaciones peculiares con ATP sintasa, ya que la salida del L-láctico de las células se efectúa mediante un simport con protones, y que paralelamente hay una entrada de protones a favor de gradiente (el pH externo es 3-4 y el interior es superior a 6), mediante una ATP sintasa, que lo acopla a la síntesis de ATP.

Así pues, O.oeni puede obtener algunos ATP por la descarboxilación del málico en un medio como el vino donde prácticamente no hay azúcares. Estos ATP, junto con algunos nutrientes remanentes de los restos de las levaduras, pueden permitir un ligero crecimiento de estas bacterias en el vino.

Desde el punto de vista enológico, esta desadificación del vino conlleva al mismo tiempo una mejora en su calidad, al reducir la sensación de aspereza del málico. Además, el ácido L-láctico que aparece es más agradable y suave al gusto de cualquier paladar.

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5.2.2. Otros aspectos beneficiosos del metabolismo de las bacterias lácticas en el vino

Un aspecto interesante desde el punto de vista enológico consecuencia de la pequeña subida de pH de la FML es que el color del vino tinto, debido sobre todo a los antocianos como la malvidina, evoluciona hacia tonalidades menos intensas y no tan rojas, lo que los hace más interesantes visualmente.

Desde el punto de vista organoléptico, la FML conlleva una mejora del vino porque además de la desacidificación, el desarrollo de las bacterias provoca cambios en los contenidos de los diversos compuestos orgánicos del vino.

Aparte del L-málico, el cítrico es otro importante ácido orgánico metabolizado por las bacterias lácticas del vino. Se ha comprobado que O.oeni, al igual que muchas otras bacterias, capta el citrato y lo metaboliza dando lugar a diversos compuestos. De todos estos, el diacetilo se considera el más importante por su aroma a mantequilla o nata (aromas lácteos) que caracteriza a muchos vinos que han realizado FML. Aparece en pequeñas concentraciones (hasta 2mg/l) aunque tiene un umbral de detección sensorial muy bajo. El diacetilo se forma químicamente por descarboxilación oxidativa del alfa-acetolactato, un intermediario inestable. Por otro lado, en función de las condiciones, el diacetilo puede ser utilizado por las mismas bacterias convirtiéndolo en acetoína y 2,3-butanodiol, mucho menos aromáticos.

Las bacterias lácticas del vino también pueden producir pequeñas cantidades de exopolisacáridos, que se unen con los taninos, responsables de la astringencia de los vinos jóvenes, con lo cual baja la astringencia y el vino se vuelve más agradable.

Otro beneficio muy importante es la estabilidad microbiológica que se consigue con la FML. Los vinos donde esta ha tenido lugar pueden ser embotellados sin el riesgo de un posible desarrollo bacteriano posterior, que podría dar lugar a la formación de CO2. Las bacterias lácticas agotan el málico y otros nutrientes como los azúcares, con lo cual es mucho más difícil el crecimiento posterior de otras bacterias.

5.2.3. Posibles perjuicios de las bacterias lácticas en los vinos

En algunas ocasiones, el desarrollo de las bacterias lácticas puede tener consecuencias negativas para la calidad de los vinos. Afortunadamente, la mayoría de estos casos se producen de forma muy esporádica, sobre todo cuando ha habido otros problemas previos a la fermentación o de poco control de la vinificación.

De estos posibles perjuicios, el más frecuente es el picado láctico, debido a la producción bacteriana de una cierta cantidad de láctico y también de acético. Cuando en el vino hay azúcares residuales que las levaduras no hayan

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consumido por diversos problemas de paradas de la fermentación alcohólica, las bacterias pueden consumirlos y proliferar, haciendo la fermentación láctica y, por tanto, produciendo láctico. En este caso se produce D-láctico, mientras que en la FML a partir de L-málico aparece L-láctico. Dado que Oenococcus, Leuconostoc y algunos Lactobacillus (como L.brevis y L. hilgardil) hacen la fermentación heteroláctica, además de láctico producen ácido acético a partir de azúcares. Sin embargo, las especies homofermentativas como Pediococcusy otros lactobacillus también pueden producir ácido acético a partir de pentosas.

En algunos vinos poco ácidos, la FML llevada a cabo por las bacterias lácticas puede dar lugar a una desacidificación excesiva, lo que no es conveniente porque parte del carácter del vino se pierde si es poco ácido y, además, el pH más alto puede favorecer el crecimiento de otras bacterias prejudiciales.

Solo hay dos compuestos en el vino que puedan ser tóxicos para los humanos y sean debidos a las bacterias lácticas: las aminas biógenas y el carbamato de etilo. Las aminas biógenas pueden llegar ocasionalmente en algunos vinos a más de 10 mg/l y su consumo puede comportar varias patologías, desde migrañas hasta trastornos cardíacos. Las principales aminas biógenas asociadas al vino son la putrescina, histamina, tiramina y cadaverina. Son el producto de la descarboxilación de diferentes aminoácidos presentes en el vino. Se han caracterizado diversas especies de bacterias lácticas como productoras de aminas biógenas, que incluyen L. hilgardii, L. brevis, L. buchneri y Pediococcus parvulus. Dichas especies son consideradas como contaminantes durante el proceso de vinificación, por lo que generalmente la aparición de aminas biógenas se asocia a falta de higiene en las prácticas enológicas. Algunas cepas de O. oeni también pueden producir ciertas cantidades de aminas biógenas como histamina y, en menor grado, putrescina, aunque las especies mayoritariamente responsables de elevados contenidos de estas aminas biógenas en vino son L. hilgardii y P. parvulus. La detección de los genes que codifican los enzimas responsables de la producción de aminas biógenas, como el de la histidina descarboxilasa (hdc) en el caso de la histaminas, puede ser una herramienta para la selección de cepas de O. oeni que carezcan de estos genes.

5.2.4. Carbamato de etilo

Otro compuesto tóxico, el carbamato de etilo, cancerígeno de carácter genotóxico, es detectado en algunos vinos en concentraciones muy bajas (unos 20 μg/l). Aunque el principal precursor del carbamato de etilo en vino por reacción con el etanol es la urea excretada por las levaduras, otros precursores del carbamato de etilo que también reaccionan con el mismo son los productos de degradación de la arginina (como la citrulina) por parte de diversas especies de bacterias lácticas mediante la vía de la arginina deiminasa (ADI). O. oeni

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presenta una capacidad variable de degradación de arginina y los genes de la ruta ADI se encuentran en gran cantidad de sus cepas. Sin embargo, algunas cepas de especies consideradas contaminantes, como L. brevis y L. buchneri, acumulan mayores cantidades de citrulina que O.oeni.

Por otra parte, se ha comprobado que el ácido L-málico inhibe el consumo de arginina. Así pues, un buen control del momento de finalización de la FML e inmediata estabilización del vino es clave para evitar el consumo de arginina y la posible acumulación de precursores de carbamato de etilo.

5.2.5. Causas de no realización o retrasos de la fermentación maloláctica

El vino es un medio hostil para los microorganismos, en general, y para las bacterias lácticas en particular. A diferencia del mosto que es un medio rico en componentes nutritivos (fundamentalmente azúcares), el vino es un medio mínimo, y con los problemas agravantes de contener etanol, que es un buen antimicrobiano, tener un pH relativamente ácido, y con una cierta concentración de sulfuroso añadido durante la vinificación.

El pH del vino es uno de los principales factores que afectan al comportamiento de las bacterias lácticas. Si bien su pH óptimo es alrededor de 4,5, pueden efectuar la FML a pH normales de los vinos (alrededor de 3,5), pero tienen muchas dificultades a pH inferiores a 3,2. En cuanto el etanol, por encima del 10%, la reducción de la actividad de la FML ya empieza a ser manifiesta, dando lugar a retrasos en su finalización cuanto más etanol tiene el vino, si bien esta influencia depende mucho de las cepas. Así pues, O. oeni se caracteriza por ser más resistente, a diferencia de varios Lactobacillus que resultan más afectados. En cualquier caso, la concentración máxima de etanol que permite la realización de la FML es del 15% (v/v).

En los últimos años, se han realizado numerosos estudios sobre la respuesta de O. oeni a los factores de estrés asociados al vino, como el elevado contenido en etanol o el bajo pH. En este sentido, han sido caracterizadas diversas proteínas de estrés, como Hsp18, y reguladoras como CtsR. Han sido también descritos otros mecanismo que ayudan a O. oeni a sobrevivir en condiciones desfavorables en función de las condiciones del medio y del estado de crecimiento. Respecto a la respuesta al pH ácido, los genes involucrados serían los relacionados con la degradación de ácidos presentes en el vino, como el málico y el cítrico, asociados a bombas de protones que ayudan a mantener la homeostasis del pH interno. El sistema ATPasa de membrana responde a la demanda de transporte de protones acoplada al catabolismo de sustratos, con la consiguiente producción de energía para la célula. Así pues, la actividad ATPasa y los mecanismos asociados a esta, como la propia FML, contribuirían a evitar la acidificación del medio interno favoreciendo el crecimiento celular.

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Respecto a la toxicidad del etanol, esta se asocia al aumento de permeabilidad de la membrana celular a modificaciones en la composición lipídica. El aumento de la permeabilidad supone un incremento del transporte pasivo hacia el interior de la célula, provocando una acidificación del medio interno. Así pues, los mecanismos que contribuyen a la respuesta al pH ácido estarían también relacionados con la tolerancia al etanol. Por otra parte, los cambios físicos y de composición en la membrana celular son cruciales para la defensa contra agentes de estrés externos.

La respuesta asociada al estrés es variable dependiendo de la cepa de O. oeniy se ha observado que los niveles de transcripción de determinados genes puede ser un indicador del comportamiento metabólico durante la FML de dichas cepas.

6. Hongos: definición y tipos

Antes de empezar a hablar de las levaduras que son las responsables de la fermentación del azúcar del mosto de la uva en alcohol, primero hablaremos de los hongos para entender mejor el comportamiento y el funcionamiento de las mismas.

Los hongos desempeñan un papel destacado en los ciclos de la naturaleza, sobre todo en los procesos de descomposición de la materia orgánica. Se han clasificado hasta ahora aproximadamente 70.000 hongos. Las levaduras pertenecen, como todos los hongos, a las células eucariotas, es decir, su material genético está concentrado en un núcleo celular. Son hongos productores de esporas (endomicetos).

A partir de las levaduras salvajes se obtienen cultivos de levaduras que tienen un gran significado industrial, como las levaduras de cerveza (por ejemplo Saccharomyces carlsbergensis), levaduras de vino y de pan (S. cerevisiae) y levaduras del forraje (Candida). Candida utilis crece sobre las aguas residuales de sulfito de las fábricas de celulosa como levadura de forraje. Candida maltosa se alimenta de alcanos (parafinas) del petróleo y puede generar forraje. Trichosporon cutaneum es un importante aeróbico que se encuentra en aguas residuales, que incluso puede degradar fenol –un veneno para otros hongos. Trichosporon y las levaduras Arxula adeninivorans se utilizan como sensores microbianos en aguas residuales.

Los mohos pertenecen a los mohos con sacos esporales o esporangios en forma de manguera (ascomicetos), que con 20.000 tipos es el grupo mayoritario de los hongos. Tienen, en contraste con las levaduras redondeadas, largas células estiradas, y viven principalmente estrictamente aeróbicos. Los mohos forman esporas asexualmente mediante división de los núcleos celulares de los sacos esporales, que en general se expanden en el

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aire del micelio. Las esporas maduras se propagan con facilidad con el viento. Si caen en un sustrato apropiado, germinan y forman nuevos micelios.

Muchos hongos se clasifican según su apariencia (morfología) y el color de sus sacos esporales (esporangios), porque el micelio generalmente es difícil de distinguir, pues es incoloro y representa un desorden en forma de tubo. Puesto que los hongos más importantes industrialmente se introducen (sumergen) principalmente en tanques como grumos móviles de micelios, no forman esporas.

En cuanto a la alimentación, los mohos son similares a las levaduras, aunque se tratan más versátilmente. Así, algunos pueden –en contraste con las levaduras– crecer también sobre celulosa (Trichoderma reesi) o lignina (Phanaerochaete chrysosporium).

Los mohos del género Asperggillus (mohos con esporangios en forma de regadera) y Penicillium (mohos con esporangio en forma de pincel) son la base para muchas fermentaciones, particularmente para la degradación del almidón y las proteínas en la cebada, el arroz, y las habas de soja.

Otros mohos con esporangio en forma de pincel ayudan a producir quesos como el camembert y el roquefort. Las amilasas y proteasas generadas por hongos se obtienen también como preparados enzimáticos industriales.

7. Levaduras y fermentación

Las levaduras se encuentran entre los hongos (fungi), en concreto pertenecen a la clase de los hongos con micelio tabicado (Ascomycetes), el tipo más abundante de la clasificación de los hongos.

En contraste con las bacterias procariotas, las eucariotas tienen una estructura celular compleja (comportamientos como mitocondrias) y un auténtico núcleo celular. Se denominan también hongos productores de esporas, porque se multiplican sobre todo asexualmente (vegetativos) mediante esporulación. Sin embargo, también se pueden reproducir sexualmente por copulación de dos células esporas haploides, Éstos tienen una composición cromosómica completa simple. Las levaduras se clasifican según el tipo de reproducción de los diferentes tipos de hongos.

Las levaduras constan de una única célula. Esta célula madre forma en la esporulación varias protuberancias, brotes hijos, que se separan, son a su vez viables y pueden formar nuevas células. Crecen de modo heterótrofo (a partir de nutrientes, sin fotosíntesis) preferentemente a valores de pH ácidos. Su pared celular consta, como la sustancia del esqueleto de los insectos, de quitina, y además de hemicelulosa.

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Pasemos ahora a la bioquímica, para responder a una “pregunta vital” de lascélulas de levadura. Las levaduras pueden vivir como respiradores (aeróbicos) o fermentadores (aneróbicos), y por lo tanto son aeróbicos facultativos. En presencia de oxígeno las levaduras crecen espléndidamente, con la respiración convierten el azúcar en CO2 y agua, y producen con ello energía, que utilizan para el crecimiento y la producción de nuevas células.

Si se detiene el suministro de aire a las levaduras, los microbios interrumpen su metabolismo de fermentación en la medida de la necesidad. La fermentación les ayuda a sobrevivir en tiempos hostiles, a pesar de ser energéticamente desfavorable. Louis Pasteur descubrió en 1861 que una levadura sin oxígeno utilizaba más glucosa. Esto se denominó efecto Pasteur. Las levaduras en condiciones anaeróbicas procesan más moléculas de azúcar para compensar las pérdidas de energía. Puesto que no hay más oxígeno para utilizar, tampoco puede quemarse en la cadena de respiración con el cofactor NADH + H+ acumulado. La transformación de glucosa permanece, por lo tanto, en la fase de piruvato.

La célula transforma piruvato en acetaldehído. Con ello se libera CO2. El ciclo de Krebs ya no puede ser utilizado. Para utilizar el NADH + H+ acumulado, que no puede reoxidarse a NAD+ en la “combustión fría” debido a la deficiencia de O2, a la célula le queda solamente un camino: utiliza la alcoholdeshidrigenasa y forma, a partir de acetaldehído, con la utilización de NADH + H+, etano y NAD+.

La glucosa se “quema” finalmente de modo incompleto a alcohol y CO2. En la fermentación de una molécula de glucosa se originan solo de una a cuatro moléculas de “moneda de cambio energético” ATP (en lugar de un máximo de 38 en la respiración con oxígeno); esto es suficiente para sobrevivir.

El alcohol no es, por lo tanto, un placer para la levadura, más bien una necesidad, pero muere si el contenido de alcohol supera un determinado valor. Contrariamente a la opinión clásica, el etanol también puede producirse aeróbicamente (efecto Crabtree) si el medio de alimentación contiene más de 100 mg de glucosa por litro, En esta “reacción en exceso” el piruvato no se oxida siguiendo el ciclo de Krebs, sino que se reduce a etanol.

Con la ayuda de los modernos chips gnéticos para ARNm de levadura (un ácido nucleico de una única hebra, que desde el ADN del núcleo celular alcanza los ribosomas con las instrucciones de construcción para las proteínas, se observa que cuando hay deficiencia de oxígeno las levaduras anaeróbicas producen otras enzimas diferentes a las de las levaduras aeróbicas. Es decir, los genes (ADN) se escogen de manera diferente y expresan diferentes proteínas, según la situación oxígeno de la célula de levadura.

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Otros fermentadores, las bacterias, forman ácido láctico (Lactobacillus), ácido butírico (Clostridium butyricum), ácido propiónico (Propionibacterium), acetona y butanol (Clostridium acetobutylicum), así como otros productos con gasto de ATP, y los secretan.

Los productos de la fermentación se forman, pues, en grandes cantidades, ya que solo la transformación libera mucha más cantidad de alimentos en ausencia de oxígeno que energía requerida en forma de ATP de las células.

Ahora está claro por qué los primeros procesos de biotecnología que utilizaron los humanos fueron la fermentación del alcohol y del ácido láctico: las fermentaciones liberan grandes cantidades de producto en un período de tiempo muy corto y son, por lo tanto, altamente efectivas.

7.1 Fisiología de la fermentación

Andrew Markides es Doctorado en Microbiología y Director General del laboratorio de investigación de Lallemand en Australia. Durante un seminario organizado por Lallemand en Burdeos (Francia), Markides acabó con la discusión “cultivos seleccionados versus indígenas”, explicando las diferencias en la fermentación.

“No es una versus la otra”, respondió a la pregunta de los periodistas presentes en el seminario. “El problema con las levaduras indígenas es su impredecibilidad, en términos del comienzo y la finalización de la fermentación. Las levaduras seleccionadas, en cambio, tienen características y comportamientos de fermentación conocidos. Se pueden variar los niveles de inoculación para conseguir distintos tipos de fermentación. Ésta es la diferencia”, detalló.

La vieja disputa que enfrenta a las levaduras seleccionadas con las indígenas, pierde todo su sentido cuando se tiene en cuenta que ni si quiera las levaduras seleccionadas son capaces de crear un vino uniforme que tenga el mismo sabor o estilo en todo el mundo. “La regionalidad del mosto de la uva en combinación con cualquier levadura, será lo que de la característica al vino”, recalcó Markides.

No obstante, estudios realizados indican que las levaduras seleccionadas, como las cerevisiae o las bayannus, aportan carácter, complejidad y peso en el paladar. Las bayannus, además, tienen el potencial de producir un cóctel de componentes aromáticos que parecen aportar carácter al vino.

7.1.1 Saccharomyces cerevisiae, la estrella

A la hora de elaborar un vino, los enólogos se enfrentan a un elemento de conflicto y a una pregunta: ¿debemos intervenir o dejar que la naturaleza actúe? Ante esta cuestión, “lo más importante” – anota el investigador – “es el

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conocimiento práctico, de esta manera podemos identificar y manejar los riesgos”.

“Cuando se trata de la fermentación, el enólogo se permite una expresión artística, minimizando los niveles de riesgo y decide si usar levaduras indígenas o levaduras seleccionadas. Cuando se utiliza un 100% de levaduras indígenas, si la fermentación se desvía hacia otros metabolismos no deseados, muchas veces es necesaria una intervención. En este caso se introducen levaduras seleccionadas.”

Markides explicó que hoy se conocen 700 especies de levaduras para vinos, de las cuales solamente 70 crecen en viñedos y la más difícil de encontrar es la Saccharomyces cerevisiae. Esta levadura, según se ha observado en laboratorio, permanece activa hasta el final de la fermentación alcohólica, permitiendo predecir que llegará exitosamente a buen término, lo cual ayuda a minimizar los riesgos.

La S. cerevisiae permite, además, equilibrar los sabores sobre-maduros o verdes de los varietales y los fenoles. “Para una cosecha con mucha madurez, en la fermentación se usan levaduras que no extraen tantos fenoles, que reducen la percepción de lo verde y si tiene mucha azúcar por gran madurez, son capaces de metabolizar esa cantidad”, detalló.

7.1.2 Contribución al color

Consultado sobre este punto, Markides respondió que la contribución de la levadura a las características del vino es significante. “La respuesta, sin embargo, es difícil, porque el proceso de hacer el vino es realmente complejo. La fruta importa, si no importara tendríamos azúcar, agua y levaduras, pero eso no daría estructura al vino. Sin embargo, estamos en condiciones de asegurar que las levaduras pueden demorar la desaparición del color en el vino, la oxidación. También existe al menos un 5% de levaduras en la fermentación que ayuda a estabilizar el color de los vinos tintos, aunque no tiene la habilidad de corregir un error en el origen del color”, explicó.

7.1.3. Parámetros básicos para una mejor gestión

Parámetros básicos para optimizar el rendimiento de las levaduras seleccionadas: concentración acuosa más azúcar significa menos agua, amenazando el estado del microbio, su vitalidad y viabilidad.

PH. Las levaduras prefieren pH más elevados. Un pH bajo con alcohol es malo para los microbios.

Temperatura. Afecta a la energía de biomoléculas.

Oxígeno. Es bueno para las levaduras.

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Tipo de alimento y concentración. Apoya el crecimiento microbiológico, la vitalidad y el mantenimiento de la célula.

Para obtener los mejores resultados posibles, el enólogo debe manejar su sinergia entre el mosto de uva y el ambiente de fermentación, con el comportamiento de la levadura. Aumentar los niveles de azúcar reduce las posibilidades de sobrevivir de las células. “La levadura tiene la capacidad de mejorar su pH cuando el pH del mosto de uva es muy alto o bajo. En cuanto al oxígeno, si en alguna etapa de la fermentación se puede introducir, esto ayudará a la levadura a producir elementos dentro de la membrana, que son vitales para su salud. Está demostrado que la introducción de un poco de oxígeno en las últimas etapas del desarrollo de la levadura es vital para su sanidad y estimulación”.

Otro punto a tener en cuenta es que la falta de oxígeno durante la fermentación alcohólica resulta en la reducción de la síntesis de proteína, llegándole a la célula menos azúcar y aumentando la posibilidad de incidencias de fermentación incompleta.

“La inclusión de nitrógeno inorgánico está siendo estudiada”, explicó Markides. “En cuanto a los tiempos de fermentación es necesario evitar que sean rápidos. También es imperioso evitar los demasiado largos. Con levaduras indígenas, la S. cerevisiae domina la fermentación en el jugo de uva una vez que el alcohol excede 3º 4% en volumen”, detalló.

7.2. Una levadura para cada tipo de vino

El doctor Sakkie Pretorius, Director General del Instituto Australiano de Investigación vinícola (AWRI por sus siglas en inglés de “Australian Wine Research Institute) fue invitado a disertar en el seminario sobre Levaduras Seleccionadas, organizado por la empresa Lallemand en Burdeos (Francia) a mediados de junio pasado, al que asistió prensa especializada de todo el mundo.

La conferencia de Pretorius se basó en las nuevas investigaciones llevadas a cabo por el AWRI en base a las conjunciones de componentes de levaduras seleccionadas que permiten incorporar modificaciones a los vinos durante la fermentación, para lograr los resultados deseados por el enólogo.

Esto, teniendo en cuenta que son combinaciones de componentes de levaduras, y no levaduras modificadas genéticamente.

7.2.1. La huella genética

El material genético básico, la huella genética (genómics) es el foco de investigación en fermentación en estos días. “Los metabolitos – explicó Pretorius – abarcan todo lo metabólico que un organismo es capaz de producir.

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Cuando bebemos un vino, lo que bebemos es la conjunción del metabolismo de la uva y de la levadura”

Los estudios científicos sobre los “metabolitos” o diferentes conjunciones metabólicas, han llevado al AWRI a desarrollar diferentes caminos para ayudar a “dar forma a un vino” en cuanto a calidad, aromas y sabores, mediante la correcta utilización de determinadas levaduras seleccionadas (Saccharomycescerevisiae).

Cuando hablamos de “carácter” aromático en un vino nos referimos a esto que en la jerga normal llamamos aromas “frutales”, “tropicales”, etcétera.

“Las levaduras le dan carácter a un vino, pero es la uva la que aporta la estructura básica”, aclara Pretorius. Partiendo de aquí, puntualiza que las últimas investigaciones sostienen que lo que genera pequeñas diferencias entre un vino y otro es el aporte de los metabolitos (compuestos generados por el metabolismo de los seres vivos), pequeñas partes que vienen tanto de la uva como de las levaduras.

“Existen cientos de componentes que generan diferentes características en el vino, de hecho si bien conocemos algunos de los componentes aromáticos en los blancos – se han caracterizado 14 compuestos con impacto en el aroma –prácticamente no sabemos nada acerca de los componentes aromáticos en los vinos tintos”.

7.2.2. La evolución de la Saccharomyces: hibridación

El trabajo con combinaciones de levaduras, o desarrollo de cepas, ha llevado a los investigadores a obtener grandes avances en la utilización de determinados componentes para obtener mejores aromas en un vino.

El doctor Sakkie Pretorius explicó el proceso. La célula madre de una levadura tiene como función transformar el azúcar, el nitrógeno, el fosfato, el sulfuro, el oxígeno y los minerales en etanol y CO2. A través de un proceso denominado glucólisis también se descomponen los precursores de los sabores, denominados terpenos.

La levadura convierte los compuestos no volátiles (no aromáticos) en componentes que podemos percibir mediante el olfato. Todo el proceso se explica a fin de llegar a la conclusión de que en este punto la levadura ha producido más glicerol que alcohol, logrando un efecto contrario al que se espera, ya que el glicerol es positivo para los aromas del vino. Pretorius puntualiza en este sentido que la fisiología de la levadura para obtener lo que se quiere de un vino puede ser manipulada por el hombre.

Con este fin se han desarrollado varios métodos para desarrollar diferentes cepas de levaduras: selección de cepas, evolución direccionada, mitogénesis

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(mutar componentes), hibridación (técnica que se emplea para cruzar diferentes especies de levaduras) e ingeniería genética (la única técnica utilizada para modificar genéticamente el ADN y lograr los OMGs).

7.2.3. Como se trabaja

El cruce o mezcla de levaduras ha logrado excelente resultados en laboratorio. “Cruzando levaduras podemos satisfacer ciertas preferencias del mercado”, explicó el doctor Pretorius. Por ejemplo, si se quiere obtener un vino con menos alcohol y más afrutado, se pueden realizar “cruces de cepas” de levaduras que le brindan al enólogo las herramientas para lograr lo que desea. Las levaduras así desarrolladas permiten, además, proteger a los vinos del exceso de sulfuro de hidrógeno, el H2S, responsable del olor a podredumbre o humedad.

Mediante la inoculación con mezclas de levaduras es posible además, sumar al vino componentes que permitan la aparición de aromas a frutos frescos. En el laboratorio han logrado, además, que tres mezclas de levaduras redujeran un 2,7% el nivel total de alcohol de un vino. “Estas combinaciones de levaduras no son mágicas, pero mejoran mucho el producto en la dirección deseada”, aseguran los investigadores de AWRI.

7.3. Modificación genética de levaduras vínicas

La fermentación del mosto en vino es una reacción microbiológica compleja en la que se produce un desarrollo secuencial de levaduras y bacterias lácticas. Tradicionalmente, el vino se produce por la fermentación natural llevada a cabo por las levaduras. El origen de estas levaduras puede estar en la superficie de los hollejos de las uvas o el ambiente de la bodega (maquinaria, fermentadores, etc.). La dinámica de la flora responsable del proceso fermentativo del mosto ha sido objeto de numerosos estudios.

La microflora presente en la superficie de la piel de la uva se ve afectada por un gran número de factores que influyen en la proporción de las diferentes especies presentes. Entre estos factores se incluyen la temperatura, la pluviosidad y otras influencias climáticas, el grado de madurez de la cosecha, el uso de fungicidas, el daño físico debido a hongos, insectos, y la variedad de uva. Por otro lado, cuando la superficie de la maquinaria de la bodega, como prensas, tanques, fermentadores y bombas, entre otros elementos, entra en contacto con el mosto de uva constituye otra fuente de aporte de levaduras. Esta flora residente en el ambiente de la bodega está formada mayoritariamente por S. cervisiae, aunque también se han aislado especies de los géneros Candida, Pichia, Hansenula, y Brettanomyces. Sin embargo, la especie Saccharomyces Cerevisiae es la responsable de la fermentación alcohólica a pesar de que sus niveles en la uva son bajos, alrededor de 50 células/ml, durante la fermentación se multiplica rápidamente y desplaza a otros microorganismos que eventualmente invaden el mosto. No obstante,

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variaciones en la flora inicial pueden influir en la calidad del vino y dar lugar a cambios en la acidez volátil y a sabores y olores desagradables.

7.3.1. Utilización de levaduras seleccionadas en la vinificación

Desde el punto de vista microbiológico, la variabilidad en la flora levaduriforme de los mostos puede solventarse adicionando en cada campaña de vendimia un inóculo microbiano que, al ser mayoritario, normalice la flora inicial y, de esta forma, dé lugar a una fermentación homogénea año tras año. Aunque cultivos líquidos de levadura vínica han sido utilizados desde 1930 (Instituto Laclaire, Francia), las levaduras vínicas secas no aparecieron hasta mediados de los años cincuenta, cuando de forma independiente varios laboratorios europeos, canadienses y estadounidenses llevaron a cabo una selección de levaduras vínicas que posteriormente utilizaron como inóculo en fermentaciones dirigidas. Todos ellos concluyeron que las levaduras vínicas seleccionadas crecían bien en una fermentación de mosto y que producían un buen vino. Desde entonces, en varias zonas de Europa, Estados Unidos, Canadá y Australia se realizan fermentaciones utilizando cultivos iniciadores. Hoy se comercializan más de cien cepas diferentes pertenecientes principalmente a seis casas comerciales.

Aunque pueden producirse diferencias en la diversidad microbiana del mosto inicial, ya no solo entre regiones vitivinícolas distintas, sino también dentro de la misma bodega en diferentes vendimias, la utilización de levaduras seleccionadas produce fermentaciones controladas y, como consecuencia de esta práctica, el vino mantiene sus características sensoriales típicas en cada región. Según Cuinier, la utilización de levaduras seleccionadas puede evitar alteraciones químicas y microbiológicas en las primeras fases de la fermentación, como paradas espontáneas, o mejorar la composición química e influir en la calidad, tanto gustativa como aromática del vino. Por esta razón, en los últimos años, se ha extendido el uso de levaduras autóctonas de cada región.

Los estudios de identificación y caracterización de las diferentes especies de levaduras, así como de las cepas que pertenecen a una misma especie han estado basados en criterios morfológicos y fisiológicos. Estas características pueden variar en función de las condiciones de cultivo y, en ocasiones, las especies han sido delimitadas por una única característica fisiológica, que en algunos casos estaba controlada por un solo gen. Más recientemente se han desarrollado técnicas de biología molecular que se presentan como una alternativa a los métodos tradicionales para la caracterización e identificación de levaduras.

Por otra parte, también resulta interesante la caracterización de cepas de levaduras con dos fines: en primer lugar, para controlar el proceso de elaboración de levaduras secas activas y, en segundo lugar, para comprobar la

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implantación de las levaduras comerciales durante la fermentación alcohólica en la bodega. Se han desarrollado diversas técnicas moleculares para la caracterización de cepas vínicas. Querol y cols. han desarrollado un método de análisis del ADN mitocondrial (mtADN) que evita la utilización de gradiantes en cloruro de cesio y el uso de una ultracentrífuga, factor limitante para su utilización en la industria. Esta técnica rápida permite el análisis de un mayor número de cepas en menos tiempo, y su aplicación resulta ideal en la industria por su rapidez, seguridad y economía, y por no requerir material sofisticado ni personal muy especializado. Mediante esta técnica Querol y cols. han mostrado la implantación y el papel de una levadura seca activa (LSA) que había sido inoculada en las fermentaciones de dos bodegas distintas. Se demostró que la cepa inoculada competía con las cepas naturales pero no suprimía completamente su crecimiento hasta varios días después de haber sido inoculada. Sin embargo, el predominio de la cepa inoculada era evidente en ambas bodegas y representó el 68,09% y el 89,46% de las colonias aisladas en la fase final de la fermentación.

El uso de levaduras inoculadas y la demostración formal mediante técnicas moleculares de su imposición, junto con los avances en biotecnología, abren la puerta a la modificación genética de las levaduras vínicas.

7.3.2. Mejora genética de levaduras vínicas

Las características genéticas de una levadura vínica pueden ser modificadas según las necesidades de la industria vitivinícola. Se han desarrollado diversas levaduras utilizando técnicas clásicas como la inducción y selección de mutantes, y la hibridación y fusión de protoplastos. Sin embargo, la aplicación de las técnicas de ADN recombinante se presenta como un enfoque más sencillo y preciso, tal como veremos a continuación.

Los pasos básicos para clonar un gen y transformar una levadura vínica son:

a) Identificación del gen que le va a conferir una característica nueva a la levadura y aislamiento del fragmento de ADN foráneo.

b) Identificación y linearización mediante el uso de enzimas de restricción del vector (plásmido) que va a servir para introducir el nuevo gen en la levadura (dicho plásmido posee sistemas de selección para las levaduras transformadas o modificadas genéticamente)

c) Transformación de la levadura, es decir, introducción del vector con el gen en el interior celular

d) Selección de las levaduras transformadas, aquellas que han incorporado el plásmido con el nuevo gen.

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Estos sistemas están basados mayoritariamente en resistencias a antibióticos. Estos plásmidos pueden permanecer de forma independiente en la célula o pueden ser <<integrativos>>, o sea que el nuevo gen se integra en una zona concreta del genoma de la levadura eliminando el ADN no necesario del vector y los genes responsables de las resistencias a antibióticos.

Siguiendo esta metodología es posible construir cepas que expresen actividades metabólicas de interés o que ejerzan efectos beneficiosos en las características organolépticas de los vinos. Se han desarrollado diversas levaduras vínicas recombinantes. Por ejemplo, se han diseñado levaduras vínicas que, al contener los genes que codifican los factores killer K1 y K2, presentan una ventaja ecológica evidente, ya que las levaduras vínicas solo expresan el factor K1 y, por tanto, son resistentes únicamente a este factor killer. Otro ejemplo es la construcción de cepas de laboratorio de Saccharomyces cerevisiae que, al expresar el gen de la L(+)- lactato deshidrogenasa de Lactobacillus casei, pueden llevar a cabo una fermentación mixta (lactoalcohólica) y por ello solventar el problema de baja acidez de los vinos de regiones cálidas. Aparte de la fermentación alcohólica, la fermentación maloláctica es un proceso tecnológico de gran importancia en enología. Mediante su uso se logra desacidificar los vinos tintos y algunos vinos blancos en regiones frías. Esta fermentación la llevan a cabo bacterias ácido lácticas, sobre todo Oenococcus oeni, y rebaja la acidez de los vinos al descarboxilar el ácido L-málico a ácido L-láctico. La reacción está catalizada por el llamado enzima málico que ha sido purificado de varias bacterias ácido lácticas. Los genes correspondientes han sido clonados a partir de aislados de Lactobacillus delbruecki, lactobacillus lactis y Oenococcus oeni. Las cepas de S. cerevisiaeno pueden metabolizar el melato del mosto, por lo que la idea de expresar el gen que codifica el enzima málico en la levadura vínica ha sido un objetivo prioritario de la biotecnología enológica. De hecho, durante los últimos años varios grupos han informado sobre la construcción de levaduras vínicas que, si bien expresaban eficazmente genes bacterianos que codifican la enzima málica, no daban lugar a la desadificación. Recientemente se ha conseguido una vía eficaz de degradación de málico en S. cerevisiae. Para ello se ha construido una levadura recombinante que porta un gen de la levadura Schizosaccharomyces pombe, que codifica un malato permeasa y el gen de L. lactis que codifica la enzima málica. Esta levadura es capaz de fermentar 4,5 g/L de malato en mostos artificiales en tan solo cuatro días.

Otro ejemplo interesante del uso de las técnicas de ingeniería genética en enología lo constituye la construcción de levaduras vínicas recombinantes que expresan genes que codifican celulasas y hemicelulasas. Es una práctica habitual en las bodegas la adición de estas enzimas para solventar problemas de filtración o incrementar aromas afrutados, pero la heterogeneidad de las preparaciones comerciales (una mezcla de enzimas que varía según el lote) h

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ha hecho de su uso algo imprescindible. En el laboratorio del Instituto de Agroquímica y Tecnología de los Alimentos (IATA) se han construido diversas levaduras vínicas recombinantes que contienen genes de hongos filamentosos que codifican beta-(1,4)-endoglucanasa, alfa-L-arabinofuranosidasa, beta-glucosidasa, endoxilanasas y alfa-ramniosidasas. Todas estas levaduras son capaces de secretar las enzimas correspondientes al mosto en cantidades suficientes para llevar a cabo el proceso tecnológico y producir vino en cantidades suficientes para llevar a cabo el proceso tecnológico y producir vino con adecuadas características organolépticas. También se ha desarrollado una levadura recombinante que contiene un gen fúngico que codifica una pectato liasa útil para solventar problemas de filtración. Todas estas cepas se pueden usar como herramientas para investigar el papel individual que desempeña cada enzima en el proceso de vinificación. En la actualidad se está investigado sobre la utilidad de enzimas puras y la combinación de enzimas más adecuada, dependiendo de las variedades de uva. Otra de las líneas de investigación del grupo, recientemente iniciada, consiste en aumentar la producción de los aromas secundarios mediante el incremento de la capacidad de síntesis de estrés por parte de la levadura durante la fermentación alcohólica.

La modificación genética de las levaduras vínicas exige conocer promotores de genes de levaduras que se expresen específicamente durante determinados tiempos de fermentación. Estos promotores se pueden comparar con los interruptores de la luz que encienden o apagan, es decir, que permiten que el gen codifique o no lo haga para la proteína de interés. Por ello, diversos trabajos de investigación tienen como objetivo entender la regulación de la expresión génica en S.cerevisiae durante la vinificación. En la actualidad se dispone de varios promotores que se inducen específicamente durante la prefermentación, fermentación tumultuosa o posfermentación. Por otra parte, estos estudios nos han permitido constatar que a nivel de expresión génica, las levaduras se comportan de forma muy distinta en condiciones de laboratorio o en vinificación, incluso se pueden observar diferencias según la variedad de mosto que se vaya a fermentar.

Por último, merece una mención especial el reciente desarrollo de protocolos de transformación para levaduras vínicas que rinden levaduras recombinantes GRAS (de Generally Recognized As Safe) mediante sistemas de integración en el genoma de las levaduras evitando el uso de resistencias a antibióticos, uno de los mayores problemas en el uso de microorganismos modificados genéticamente.

7.4 Desarrollo de nuevas levaduras más eficientes

Investigadores del Departamento de Bioquímica y Biología Molecular de la Universitat de València han logrado obtener, mediante procesos de modificación genética, levaduras industriales más eficientes para mejorar y

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agilizar la fermentación de los vinos. El Grupo de Biotecnología de Levaduras Vínicas, dirigido por la profesora Emilia Matallana, investiga la levadura Saccharomyces cerevisiae, un microorganismo imprescindible para la fermentación, pues es el responsable directo de la transformación de los azúcares presentes en el mosto del uva en alcohol.

Matallana argumenta que el papel de esta levadura es esencial, porque “sin ella no hay fermentación, ni vino, pero además, contribuye a las propiedades del vino mediante productos que vierte durante su crecimiento”. Saccharomyces cerevisiae aporta, por ejemplo, el glicerol, el alcohol, un alcohol que determina el cuerpo del caldo, además de multitud de compuestos aromáticos que se suman a los procedentes por la variedad de uva.

Estas líneas de investigación lideradas por la UV son vitales para la industria enológica actual, ya que las empresas del sector apenas realizan fermentaciones espontáneas, dependientes de la flora microbiana natural presente en las uvas y en la maquinaria de las bodegas, como antiguamente. “Hoy en día la producción de vino se basa en fermentaciones inoculadas, es decir, llevadas a cabo por levaduras vínicas naturales que han sido purificadas, producidas industrialmente y comercializadas. La ventaja de esta práctica es la garantía de una fermentación rápida, con menos riesgos de paradas y contaminaciones microbianas indeseadas, como también una mayor reproducibilidad en la calidad de los vinos”, destaca Matallana.

Paralelamente, esta práctica permite el uso de levaduras concretas, distintas y adecuadas para la producción de distintos tipos de vinos o en función de las características de cada cosecha. De esta forma, pueden escogerse levaduras comerciales óptimas para la fermentación de mostos procedentes de cosechas con un alto grado de maduración y, por tanto, muy ricos en azúcares. También es posible identificar levaduras adecuadas para llevar a cabo las vinificaciones en frío, práctica muy innovadora en la enología actual, o levaduras que producen vinos de propiedades organolépticas deseables y, al mismo tiempo, apreciadas por el consumidor.

El grupo de la UV, en el que también participa el profesor Agustín Aranda, investiga, desde hace más de una década, los mecanismos que permiten a las levaduras del vino adaptarse a las condiciones adversas a las que se enfrentan durante las diferentes fases de uso industrial. Mediante estos avances, “estamos mejorando la eficiencia de las levaduras vínicas en la industria enológica, a través de dos vías: la selección de levaduras naturales con mejor adaptación tecnológica o su manipulación genética para adaptarlas al estrés”, apunta Aranda. De hecho, recientemente, estos científicos han conseguido datos interesantes sobre la implicación de ciertos genes en la adaptación al estrés que sufren durante la vinificación debido, por ejemplo, a la alta concentración de alcohol o el agotamiento de nutrientes del mosto. Además,

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han logrado mejoras en la fermentación de las levaduras, gracias a la manipulación de genes implicados en la adaptación a condiciones de estrés oxidativo. Sus resultados han sido publicados este año en la revista Applied Microbiology and Biotechnology.

7.4.1. Mejoras para las denominaciones de origen

Otra de las iniciativas de este grupo de científicos de la UV es abordar una caracterización de diferentes levaduras vínicas, tanto comerciales como no, desde el punto de vista de su capacidad de adaptación al estrés. Con ello, “se podrían identificar y escoger levaduras de cada denominación de origen, que presentarán una óptima adecuación tecnológica, tanto para la producción de las levaduras a escala industrial como para la elaboración del vino”, añade Emilia Matallana. En consecuencia, las bodegas podrían utilizar estas levaduras para llevar a cabo fermentaciones con mayor estabilidad microbiológica y, por tanto, más seguras, mientras usan levaduras autóctonas que contribuyen a garantizar las continuidad de las propiedades y de la calidad típicas de cada vino.

8. Conclusiones finales

En los últimos años se ha ido conformando una industria vitivinícola a nivel global. Como consecuencia, la industria de vinos local enfrenta un proceso de intensa restructuración. La mayor presión competitiva da lugar a estrategiastecnológicas heterogéneas, en las que las empresas responden con distinto grado de esfuerzo tecnológico y vinculación con instituciones científicas, en función de sus capacidades tecnológicas acumuladas.

La biología molecular abre oportunidades mayores para aumentar la calidad, consistencia y diferenciación de los productos finales a partir de innovaciones en los procesos de fermentación. La realización de estudio nos ha permitido apreciar que las empresas se caracterizan por adoptar las nuevas técnicas a partir de la compra de estos ingredientes, reproduciendo el patrón de comportamiento tecnológico “determinado por los proveedores” en el cual las empresas usuarias no controlan ni la dirección ni el ritmo del cambio tecnológico.

Por su parte las capacidades tecnológicas de las empresas locales, ya sea en el desarrollo o en la adaptación de estos ingredientes, son limitadas. A excepción de las casas matrices de las grandes multinacionales, no intervienen en procesos de aprendizaje junto a los proveedores. En los casos excepcionales en los cuales existieron desarrollos puntuales, las empresas debieron recurrir a capacidades externas en microbiología, como lo evidencia una de las principales empresas locales con estrategias de innovación de

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productos orientadas a nichos de diferenciación. En estos casos las empresas de consultoría con científicos extranjeros o con instituciones locales.

Como resultado de las limitaciones de economías de escala en activos críticos para la fabricación de levaduras y otros ingredientes, no hay un segmento de empresas locales que produzca levaduras ni bacterias adaptadas a condiciones locales. De esta forma, si bien existe un fuerte potencial para desarrollar levaduras asociado a la existencia de una infraestructura de Ciencia y Técnica con capacidades en estas áreas y con desarrollos autóctonos a escala de laboratorio, no se ha conformado un sistema nacional de innovación. La ausencia de vinculaciones proveedor-usuario en la etapa de escalado y fabricación de ingredientes, y un débil desarrollo institucional que asegure un reparto de excedentes consistente con la innovación de los institutos públicos. En este contexto, estos desarrollos con en gran parte impulsados a partir de contratos de vinculación con empresas multinacionales que absorben los desarrollos locales de cepas, ampliando sus bibliotecas de microorganismos en el marco de su estrategia global.

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Anexo I

Patrick McGovern, de la Universidad de Pennsylvania, trabaja combinando la química analítica con la arqueología e investiga las pistas del vino. En estos momentos se está realizando una investigación detectivesca-histórica sobre la púrpura de los emperadores obtenida del molusco Murex trunculus. MaGovern defiende la “hipótesis de Noé”: el bíblico Noé llegó a la tierra en el monte Ararat, actualmente al este de Turquía, y empezó el cultivo de la vid. La agricultura se estableció en realidad en Ararat, con la domesticación del trigo.

El vino eurasiático natural (Vitis vinífera sylvestris) se encuentra desde España hasta Asia Central. La elaboración de vino procede de estos vinos naturales. McGovern busca en las montañas turcas Taurus (donde nace el Tigris) el lugar donde pudo tener su origen el vino natural. José Vouillamoz, del Instituto Italiano Agrario di San Michele all’Adige, en Trento, y Ali Ergül de la Universidad de Ankara, están en el equipo de ADN. El equipo colecciona todas las posibilidades de cultivadores de vino locales. Se quieres seguir el origen de la formación del vino.

Los investigadores buscan también fragmentos de arcilla con restos de vino. Un indicio potente corresponde al tartrato (ácido tartárico), investigado en su tiempo por Louis Pasteur, que se encuentra en el vino. Hace diez años, Patrick McGovern creía ya que las pistas más antigua del vino y de la cerveza de cebada son de hace 7400 años, en el pueblo iraní Hajii Firuz Tepe.

Sin embargo, ahora se han encontrado en Jiahu, en la provincia Henan de China, los más antiguos “huesos oraculares”, con caracteres chinos, y flautas de huesos de ave y fragmentos de arcilla. Se tomaron 16 fragmentos de arcilla de 9000 años de antigüedad con restos de vino del Museo de Pennsylvania de Arqueología y Antropología, en Filadelfia. Además, 90 recipientes de bronce cerrados de la Dinastía Shang.

Combinando la cromatografía de gas y de líquido, la espectometría de infrarrojos y el análisis de isótopos, se observó que el vino contenía una mezcla compleja de arroz fermentado, cera de abejas, frutas de espino 8 que mostraron un alto contenido de azúcar y posiblemente las levaduras para la fermentación) y vino natural.

6000 años más tarde, en la Dinastía Shang, la enología había hecho avances considerables. El vino del emperador Shang de los recipientes de bronce contiene restos de flores (crisantemos), resina de pino (que recuerda la moderna resina griega), restos de alcanfor, aceitunas, taninos ácidos y también ajenjo (que más tarde tomaron fatalmente los bebedores de absenta de la Belle Époque parisina de Toulouse-Lautrec).

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McGovern no probó el vino de Shang aromático, pues los recipientes contienen hasta un 20% de plomo… ¡Interesante! El vino, como se sabe, es ácido, y por ello disuelve los metales de modo sobresaliente. Como los romanos de clase alta con sus tazas de plomo, los emperadores chinos también debieron envenenarse: con síntomas de calambres hasta locura. El plomo es, como todos los metales pesados, un potente inhibidor para las enzimas, pues los metales pesados atacan los puentes disulfuro de las proteínas.

Algunas bebidas chinas de 9000 años de antigüedad se preparaban con mijo de panícula, y esto es asombroso, pues las mismas trazas de mijo se descubrieron también en los vinos iraníes de 7500 años de antigüedad. Parece ser que se desarrolló un intercambio de ideas en Asia Central.

Para Patrick McGovern, el estudio del vino con todas sus conexiones sociales y económicas es la puerta a las civilizaciones antigüas: “una botella de Merlot o Shiraz nos puede ayudar hoy a entender los sentimientos de la historia”.

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Anexo II

Para la preparación del vino primero se aplastan las uvas en las prensas. En la fabricación del vino blanco sigue enseguida el prensado (prensas) o el pisado, y el jugo (mosto) se separa del raspón, los hollejos y las semillas (como residuo, denominado orujo). La adición de pectinasas incrementa el rendimiento del jugo considerablemente y conduce a un mosto más claro. En la producción de vino tinto se mantiene sin separar el prensado directo del fermentado principal, pues el colorante de las antocianas está localizado principalmente en los hollejos de las uvas rojas y azules, y pasan a la disolución con la formación de alcohol. Por ello este prensado se separa tras 4 o 5 días en reposo.

La fermentación tiene lugar a través de la parte exterior de las semillas de la uva por las bacterias de ello o por la inoculación y calidad tras una anterior pasteurización mediante la adición de cultivos purificados de levadura (cepas de Saccharomyces cerevisiae). El proceso transcurre con una enorme formación de espuma. El “mosto del vino” así originado, que nubla las células de levadura, en algunas zonas es apreciado como bebida. Durante los cuatro a ocho días que dura la fermentación principal se utiliza casi el azúcar total. Las proteínas y pectinas se segregan en forma insoluble y se unen con las levaduras como almacenadoras de los restos descritos, que se separan del vino. En el primer año, en una lenta posfermentación en las frías bodegas fermentan aún el azúcar restante (crecimiento); entonces se origina un segundo almacenamiento. Simultáneamente se forman en el vino los materiales aromáticos que originan el bouquet (aroma, flores). El vino joven disponible tras la terminación de la fermentación se tapa heméticamente, antes de rellenar los barriles de almacenamiento ensulfatados, en los cuales (de vez en cuando con aireación temporal) se consigue su maduración. Durante este tiempo empieza también el tratamiento en la bodega. Éste sirve en primera instancia para aumentar la durabilidad (por ejemplo mediante azufre, pues el dióxido de azufre es más venenoso para las bacterias que para las levaduras) y la clasificación. Los principales vinos tienen un contenido en etanol entre el 10 y el 12%.

Un proceso más importante es la transformación del ácido málico (malato), mediante bacterias lácticas, a ácido láctico (lactato) esencialmente débil. Sin esta fermentación malo-láctica los vinos alemanes, debido a su alto contenido ácido (de 8 a 10 g/l), no podrían beberse.

La diferenciación de los vinos tiene lugar según el color (principalmente vino blanco y tinto), el origen y el tipo de vid (por ejemplo Riesling, Trollinger, Spätburgunder, Silvaner). El contenido restante de azúcar se produce interrumpiendo la fermentación o la adición del mosto: seco (max. 9 g/l), semiseco (max. 18 g/l) y dulce (más de 18 g/l) y dulce (más de 18 g/l). Los

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vinos fortificados o generosos, como Madeira, Jerez, Oporto o Vermut, son vinos a los cuales se añade azúcar, etanol y a veces hierbas. Los microbios no intervienen de ninguna forma.

El champán y otros vinos espumosos requieren una fermentación doble. Se incluye deliberadamente CO2 dentro de la botella. A una mezcla de vino blanco se le añade jarabe de azúcar y se rellenan botellas tapándolas con fuertes tapones de corcho. Las botellas se almacenan en un estante (púlpito), donde el vino puede fermentar lentamente. Una levadura de champán especial crece en el interior de la botella. Durante meses se dejan depositar lentamente, con las botellas boca abajo. Las levaduras y los residuos se almacenan entonces sobre el corcho. En ese momento se reemplaza rápidamente el corcho y se añade jarabe de azúcar y brandy. Así se origina un vino noble duradero, que gotea con lágrima fina durante largo tiempo después de abrirlo. En el vino espumoso, en cambio, se añade CO2 bajo presión a un vino tranquilo.

El famoso coñac se descubrió a principios del siglo XV por los cultivadores de vino en la Charante francesa, cuando debieron responder a la menor cantidad de su vino frente a la calidad del vino de la vecina región de Burdeos. Tuvieron la idea de destilar su vino. Más tarde el producto se destiló incluso dos veces, una tras otra. También todavía hoy el coñac joven viene con un contenido de alcohol del 70% en barriles de roble Limousin, donde madura parcialmente durante años hasta alcanzar la grandeza completa, asumiendo el color del tonel y el sabor. Solamente después se diluye a un 40%.

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Anexo III

A mediados del siglo XIX, 200 años después de que Leeuwenhoek descubriese los primeros microbios, prosiguió el desarrollo industrial de las grandes fábricas. Tampoco el alcohol se producía ya en pequeñas familias emprendedoras, sino al por mayor. Cada vez se necesitaban más urgentemente, por lo tanto, conocimientos exactos sobre los procesos de fermentación, para evitar fracasos costosos.

En la ciudad francesa de Lille, en el año 1856, un conocedor, Monsieur Bigo, visitante de una fábrica de alcohol, habló con el profesor de química Louis Pasteur sobre una rara enfermedad que atacaba a muchos de sus barriles de alcohol. Del jugo de azúcar de remolacha no se formaba sino un líquido gris, viscoso, con olor a ácido. Pasteur empaquetó su microscopio y se fue a la fábrica. Allí tomó muestras de barriles “enfermos” y “sanos”. El alcohol “sano” contiene, como se analizó mediante observación microscópica, pequeñas esferas amarillas, las levaduras que formaban racimos. Como con los gérmenes, brotaban semillas desde la parte lateral de las pequeñas bolas. Las levaduras, pues, vivían. Su vida causaba la conversión de azúcar en el alcohol. Después Pasteur investigó la masa viscosa. No descubrió en ella ninguna levadura, pero sin embargo sí pequeños puntos grises. Cada punto contenía una estructura tangible de palitos temblones, millones de palitos en cada punto gris. La materia ácida, que producían los palitos, se demostró por análisis químico que era ácido láctico (lactato).

Pasteur dejó caer unas gotas del líquido que contenía los palitos en una botella con una disolución clara de levaduras y azúcar. Tras un tiempo breve también habían desaparecido aquí las levaduras, y los palitos dominaban el campo. Se creaba de nuevo ácido láctico en lugar de alcohol.

Los palitos descubiertos eran bacterias. Tomaron su nombre de su forma: la palabra griega para palito es bakterion. Las bacterias producían obviamente ácido láctico mediante la fermentación láctica del azúcar, mientras que las levaduras fermentaban a alcohol y al gas dióxido de carbono.

Poco después del descubrimiento de las bacterias lácticas en los barriles de alcohol, Louis Pasteur fue requerido por los viticultores en Arbois (el padre de Pasteur había sido curtidor en Arbois). Ellos tenían problemas con la fermentación del vino. Una y otra vez obtenían del jugo de las mejores uvas un vino graso, denso, amargo. También aquí encontró Pasteur, en el caprichoso vino, en lugar de levaduras pequeñas bacterias, que sin embargo formaban estructuras como un collar de perlas. Pasteur descubrió en sus investigaciones básicas los diferentes tipos de bacterias que arruinaban el vino. Finalmente pudo pronosticar a los perplejos viticultores qué sabor tendría una muestra de vino, ¡sin que tuviesen que pagar previamente! Para ello observó la muestra

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bajo el microscopio y determinó el tipo de levadura o de bacteria. Pasteur encontró que es suficiente calentar brevemente el vino para matar las bacterias. La misma técnica también era apropiada para proteger la leche de agriarse. Este proceso, con el cual se mata la mayoría de microorganismos contenidos en una sustancia, se denomina hoy, en honor a Pasteur, pasteurización.

La pregunta sobre la naturaleza de la fermentación no preocupó solamente a Pasteur. En 1810 Joseph Louis Gay-Lussac (1778-1850) demostró que en la fermentación de jugo de uva a partir de azúcar de uva (glucosa) se origina alcohol etílico y el gas dióxido de carbono. A mediados del siglo XIX, el famoso químico alemán Justus von Liebig (1803-1873) propuso una teoría. Alegó que para la formación de alcohol intervenía un puro proceso químico y no un proceso biológico. Liebig encontró sencillamente ridículo que la fermentación fuera producida por pequeños seres microscópicos. Más bien deberían ser “vibraciones” en la descomposición de la materia orgánica sobre la transferencia de azúcar y su transformación a CO2 y a alcohol. En todas las fermentaciones alcohólicas se encontraban sin embargo, levaduras, o sea seres vivos.

Louis Pasteur, todavía al principio de su carrera científica, empezó una lucha científica vehemente con la autoridad internacional Justus von Liebig: “¡Sin levaduras vivas no hay alcohol!” insistía tercamente Pasteur. Liebig se burló por otro lado: “Cierta gente que piensa que el proceso de fermentación se debe a animalcules (animalitos), se parecen a los niños que creen que la circulación del río Rhin la producen las palas de las ruedas de los molinos de agua que se encuentran en su orilla”. La disputa se inclinó hacia un lado y hacia el otro durante años. Finalmente se decidió tras la muerte de ambos.

Pasteur divulgó en 1876 los resultados de dos décadas en un libro de envergadura. “La fermentación es la respiración sin oxígeno”, aclaró Pasteur. Sirve como “impulso” de los seres vivos, para generar energía. Todos los seres vivos requieren energía para la vida. Obtienen esta energía en su metabolismo principalmente mediante la asimilación de azúcares, grasa y proteínas en sus células corporales. El azúcar, por ejemplo, se quema en las células produciendo dióxido de carbono y agua como desecho. Ambos productos abandonan las células. La energía liberada entonces es utilizada por el cuerpo, por ejemplo, para el movimiento de sus músculos. Para esta combustión “fría” las células necesitan el oxígeno del aire, como es necesario en la combustión “caliente” de la madera a ceniza. Sin oxígeno, los animales y las plantas superiores no pueden generar energía y por consiguiente no viven. Los microorganismos poseen, en cambio, un tipo de respiración de emergencia en ausencia de oxígeno: la fermentación. Seguramente esta solución de emergencia proviene de los inicios de la vida, pues en la Tierra aún no había oxígeno. Se liberó más tarde por las plantas a partir de agua (fotosíntesis).

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Antes, en una atmósfera pobre en oxígeno, la fermentación fue para los microbios antiguos la forma normal de obtener energía.

¿Tenía razón Pasteur, pues, al decir que sin microbios no es posible la fermentación? Moritz Traube (1826-1894), un estudiante de Liebig, dijo ya en 1858 que las fermentaciones no vienen necesariamente de la actividad de las levaduras, sino que más bien constan de procesos químicos, que son reductores. Traube caracterizó los fermentos por primera vez como materiales proteicas que actúan catalíticamente, como moléculas químicas definidas, que pueden actuar por su propia oxidación y reducción en los organismos, pero también en reacciones de oxidación y reducción fuera de las células vivas.

Dividió los fermentos, en consecuencia, según el tipo de reacción. Más tarde señaló la necesidad de contacto molecular directo entre la enzima y el sustrato para la reacción. Has ahora no se menciona en la bibliografía de la historia de la bioquímica que él ya formuló las consideraciones cualitativas para la cinética de las reacciones, y por primera vez la dependencia del tiempo de reacción y la cantidad de fermento.

En 1897. Eduard Buchner (1860-1917) realizó el experimento decisivo, que acabó con la lucha entre Liebig y Pasteur.

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Anexo IV

Durante los últimos 20 años, como resultado de la difusión del nuevo paradigma tecnológico, el proceso de vinificación se han transformado, el enólogo necesita herramientas eficaces para conseguir los vinos que ha planificado. Los avances biotecnológicos en enología permiten resolver tres tipos de problemas técnicos en el proceso de fermentación (Combina, 2007):

La selección de levaduras y bacterias lácticas: la levadura es la responsable de la mayor parte de la transformación del azúcar del mosto de la uva en etanol durante la primera fermentación. La selección de levaduras permite aumentar la calidad y consistencia del vino. Durante la elaboración del vino, se realiza una segunda fermentación a partir de bacterias lácticas. Por estos motivos las bodegas utilizan en forma creciente levaduras y bacterias comerciales.

El mejoramiento del proceso de fermentación a partir del desarrollo de enzimas: la I+D en enzimas busca reducir los tiempos de producción y lograr mejores características del producto final. Al acelerar los procesos de clarificación durante la fermentación y la maduración, las enzimas aumentan la rentabilidad, y al mejorar las características de color y aroma durante la maceración permiten lograr una diferenciación de producto consistente en el tiempo.

Desarrollo de bio-controladores para evitar la formación de compuestos tóxicos y defectos en los vinos: existen levaduras que pueden inhibir el desarrollo de ciertos microorganismos en el mosto del vino que generan defectos en el sabor del vino o que justifican la aplicación de barreras para-arancelarias en la Unión Europea.

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Anexo V

Oenococcus oeni es la principal especie de este género, nombre que fue propuesto para la especie conocida hasta entonces como Leuconostoc eonos.Ates se consideraban Leuconostoc porque son cocos y realizan la fermentación heteroláctica, o sea, que fermentan los azúcares produciendo otros compuestos además de ácido láctico, sobre todo CO2 y también ácido acético y etanol en pequeñas cantidades. Sin embargo, Oenococcus tiene unas características exclusivas, que lo hacen diferente de Leuconostoc: su hábitat es exclusivamente el mosto y el vino, pueden crecer al pH del vino (entre 3 y 4), y toleran el etanol, un 10% (v/v) y más. O.oeni es la especie predominante en la FML de vinos, si bien en algunos casos se ha comprobado que esta fermentación la realizan otras especies, como Lactobacillus plantarum.

El dato más relevante para proponer que Oenococcus era otro género distinto fue la comprobación, por comparación de las secuencias del ARN ribosomal, de que filognéticamente está bien separado de Leuconostoc y otras especies de bacterias lácticas.

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