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UNIVERSIDAD DE JAÉN

Centro de Estudios de Postgrado

Trabajo Fin de Máster

PAPEL DE LA MELATONINA EN LOS PROCESOS DE

HIPOXIA CEREBRAL

Luz Divina Lamelas Alguacil

Tutores:

Dra. Raquel Hernández Cobo Dr. Santos Blanco Ruiz

Departamento de Biología Experimental

Septiembre, 2015

Papel de la melatonina en los procesos

de hipoxia cerebral


Tutores:

Dra. Raquel Hernández Cobo

Dr. Santos Blanco Ruiz

Área de Biología Celular

Departamento de Biología Experimental

Máster en Biotecnología y Biomedicina

Universidad de Jaén

Papel de la melatonina en los procesos

de hipoxia cerebral

Trabajo Fin de Máster presentado por la Licenciada

en Biología Luz Divina Lamelas Alguacil

Fdo. Luz Divina Lamelas Alguacil

VºBº

Los directores del trabajo

Fdo. Dra. Raquel Hernández Cobo Fdo. Dr. Santos Blanco Ruiz

Jaén, 25 de septiembre de 2015

Parte de los resultados expuestos en este trabajo han sido presentados en el VI International Cogress of Histology and Tissue Engineering (Bilbao 16-18 Septiembre):

• Role of melatonin on the NO/NOS system in a model of brain hypobaric hypoxia

Peinado MA, Hernández R, Lamelas L, Blanco S

Agradecimientos

A mis padres y mis hermanas, fuente de apoyo constante e incondicional durante toda mi

vida, sin su ayuda nada de esto hubiera sido posible. Gracias por vuestra comprensión y por

hacerme fuerte.

A mis tutores Raquel Hernández y Santos Blanco, por haberme enseñado tanto, por confiar

en mí, por ser tan atentos y tan pacientes, y por ayudarme siempre. Muchas gracias.

A mi amiga Pepa, que es parte de mi familia, porque hasta el peor de los días se transforma

en el mejor, después de un rato de conversación y risas con ella. Gracias.

A mi amiga María y mi amiga Leles, que se han visto obligadas a emigrar de este país para

buscar un futuro posible, por el cariño que me dan, por tener siempre unas palabras de

ánimo, porque son para mi fuente de admiración y porque las quiero muchísimo.

A mis compañeras de máster Silvia, Sandra y Candelaria, con ellas todo ha sido mucho más

fácil, son para mí un ejemplo de lucha y superación. Gracias por convertiros en mis amigas.

A Antonio Sánchez Baca por ser tan generoso, por prestarme su tiempo, por estar siempre

dispuesto a ayudarme, por enseñarme tantas cosas y por hacerme sonreír. Muchas gracias.

“No temas a las dificultades: lo mejor surge de ellas"

Rita Levi-Montalcini.

A mi abuelo Matías

Índice

Resumen……………………………………………………………………………………………..1

Abstract……………………………………………………………………………………………….2

1. Introducción……………………………………………………………………………………….3

2. Hipótesis y objetivos…………………………………………………………………………….11

3. Material y métodos………………………………………………………………………………12

3.1. Animales

3.1.1. Distribución de los animales en grupos experimentales

3.2. Administración de melatonina y modelo de hipoxia hipobárica

3.2.1. Hipoxia hipobárica

3.3. Técnicas Histológicas

3.3.1. Preparación de los animales, fijación y extracción de las muestras destinadas a

análisis histológico

3.3.2. Actividad NADPH-diaforasa in situ

3.4. Técnicas Bioquímicas

4.1. Extracción y procesamiento de las muestras destinadas a técnicas bioquímicas

4.2. Determinación de la concentración de proteínas

4.3. Análisis de la expresión de proteínas mediante Western Blot

4.4. Determinación de sustancias reactivas de ácido tiobarbitúrico (TBARS)

4.5. Determinación de NFκB

4.6. Determinación de factor inducible por hipoxia (HIF-1α)

3.5. Análisis Estadístico

4. Resultados……………………………………………………………………………………….24

5. Discusión…………………………………………………………………………………………32

6. Conclusiones……………………………………………………………………………………..37

7. Bibliografía………………………………………………………………………………………..38

8. Resumen de las asignaturas cursadas en el máster………………………………………...50

9. Currículum vítae………………………………………………………………………………….53

Papel de la melatonina en los procesos de hipoxia cerebral

1

RESUMEN

El sistema nervioso central (SNC) es particularmente vulnerable al daño oxidativo generado

tras una situación de hipoxia/reoxigenación. Las alteraciones neurológicas y fisiopatológicas

asociadas a las situaciones de hipoxia hipobárica se conocen con detalle, sin embargo, los

mecanismos moleculares que subyacen a estas alteraciones no se han descrito en

profundidad. En este sentido, el óxido nítrico (NO) parece desempeñar un papel importante

en la respuesta del SNC a la hipoxia. Además, se ha demostrado que la administración

controlada de antioxidantes disminuye las lesiones producidas tras esta patología aunque no

está clara la vía mediante la cual estos puedan ejercen esta acción.

El objetivo de este trabajo ha sido analizar la respuesta del sistema NO/NOS en el cerebro

de ratas sometidas a un modelo de hipoxia hipobárica, seguido de dos períodos de

reoxigenación: uno de 0 y otro de 2 horas. Adicionalmente, estudiamos los efectos de una

sustancia con probada capacidad antioxidante como la melatonina sobre dicho modelo

experimental.

Los resultados acerca de los niveles de peroxidación lipídica y reactividad glial obtenidos

parecen indicar que el modelo experimental de hipoxia hipobárica ejerce un daño moderado;

además, la administración de melatonina disminuye la expresión de nNOS y eNOS tras la

hipoxia, pero no altera la expresión de iNOS.

Finalmente, podemos concluir que la melatonina puede actuar ejerciendo un efecto

neuroprotector ante la hipoxia mediante un precondicionamiento; además esta

neuroprotección parece estar íntimamente relacionada con su influencia sobre el sistema

NO/NOS.


2

ABSTRACT

The central nervous system (CNS) is particularly vulnerable to the oxidative damage

generated after a situation of hypoxia/reoxygenation. Neurological and pathophysiological

changes associated with situations of hypobaric hypoxia are known in detail; however, the

molecular mechanisms underlying these disorders have not been fully described. In this

regard, nitric oxide (NO) appears to play an important role in the response of the CNS to

hypoxia. Furthermore, it has been shown that the controlled administration of an antioxidant

can reduce the damage that follows hypoxia, although the means by which antioxidants can

exert this action is unclear.

Thus, the aim of this study is to analyze the response of the NO/NOS system in the brain of

rats subjected to a model of hypobaric hypoxia, followed by two periods of reoxygenation of 0

and 2 hours. Additionally, we studied the effects of a substance with proven antioxidant

capacity, such as melatonin on this experimental model.

The results concerning the levels of lipid peroxidation and glial reactivity suggest that the

experimental model of hypobaric hypoxia exerts a moderate damage; moreover,

administration of melatonin decreases nNOS and eNOS expression after hypoxia, but does

not alter the expression of iNOS.

Finally, we can conclude that under hypoxic conditions, melatonin may act exerting a

neuroprotective effect by means of preconditioning; moreover, this neuroprotection seems to

be closely related to its influence on the NO / NOS system.


3

1. INTRODUCCIÓN

El oxígeno es una molécula esencial para la supervivencia de la mayoría de los

organismos vivos. El suministro suficiente y adecuado de oxígeno a los tejidos es una

función fisiológica fundamental, ya que un déficit de oxígeno puede producir daños celulares

irreversibles (López-Barneo et al., 2001). Así, un insuficiente aporte de oxígeno es crítico en

la patogénesis de diversas enfermedades como accidentes cerebrovasculares,

tromboembolismo cerebral, infarto de miocardio, patologías pulmonares crónicas, etc, todas

ellas con altos índices de morbi/mortalidad en la población en países desarrollados.

La hipoxia se define como la disminución transitoria o permanente de la presión

parcial de oxígeno (pO2) en una zona determinada del organismo. Como consecuencia de la

hipoxia, en la zona afectada se puede producir daño tisular, que dependiendo de la

capacidad de restablecimiento de las concentraciones fisiológicas de O2 mediante una

adecuada restitución de la perfusión sanguínea (reperfusión), puede ser de mayor o menor

intensidad.

Se pueden distinguir diferentes tipos de hipoxia en función de las causas que la

originan. Concretamente, la hipoxia hipobárica es un tipo de hipoxia provocada por una

reducción en la presión atmosférica total. Esta situación ocurre de forma natural al ganar

altitud respecto al nivel del mar (Castro-Blanco et al., 2003; López-Ramos et al., 2005;

Cañuelo et al., 2007; Hernández et al., 2013).

El sistema nervioso central (SNC) es particularmente vulnerable a los procesos de

hipoxia, dadas sus características, es (Zhu et al., 2012), ya que incluso cortos periodos de

hipoxia pueden inducir una cascada de eventos que pueden llegar a provocar un daño

neuronal irreversible (Samdani et al., 1997). Uno de los motivos por los que el SNC se ve

más severamente afectado por la hipoxia es su alto nivel de metabolismo energético, lo que

favorece la generación de una gran cantidad de radicales libres de oxígeno (ERO) y

nitrógeno (ERN) que contribuyen especialmente al daño neuronal derivado de la hipoxia

(figura 1) (Nassar et al., 2011); de hecho, se ha demostrado que los procesos apoptóticos y

necróticos que tienen lugar tras un fenómeno hipóxico están relacionados con la producción

de ERO y ERN (Li et al., 1999). Además, durante el proceso de reoxigenación se produce

un aumento considerable de los niveles de ERO (Chandel et al., 1998; Duranteau et al.,

1998), que pueden ocasionar un importante deterioro de proteínas, lípidos y ADN, y origina

daños irreparables para la célula (Thompson et al., 2012).


4

Figura 1: Esquema de los efectos citotóxicos derivados de la formación de ERO y ERN. El anión superóxido (O2•-

) puede oxidar y fragmentar el ADN mitocondrial y nuclear. Las ERO generadas en mitocondria también pueden

oxidar las membranas mitocondriales, causando la eventual liberación del citocromo C, una molécula de

señalización proapoptótica. Si el superóxido reacciona con NO; se produce peroxinitrito (ONOO-), éste tiene

diversos efectos y comparte numerosas vías de señalización con las ERO. mtDNA: ADN mitocondrial, cytC:

citocromo C; MPTP: poro de transición de permeabilidad mitocondrial; O2-: anión superóxido; e-: electrón; ETC:

cadena de transporte de electrones; IMS: espacio intermembrana (Modificado de Thompson et al., 2012).

Durante la hipoxia se induce también la expresión de ciertos factores de transcripción

entre los que se encuentra el factor inducible por hipoxia (HIF-1), un heterodímero

compuesto por las subunidades HIF-1α y HIF-1β (Greer et al., 2012). Mientras que HIF-1β

se expresa de forma constitutiva en la mayoría de las células, HIF-1α se encuentra

prácticamente ausente en condiciones de normoxia (Huang et al., 1998), pues en esta

situación HIF-1α es hidroxilado por las enzimas prolil-hidroxilasas (PHD) y posteriormente

reconocido por el dominio β de la proteína von Hippel-Lindau (pVHL). La proteína pVHL

forma un complejo proteico que ubiquitina a HIF-1α, marcándola para su degradación en el

proteosoma (figura 2). En situación de normoxia, las enzimas PHD son reguladas por el

óxido nítrico y las ERO, entre otros (Greer et al., 2012).

Sin embargo, en situaciones de descenso de los niveles de oxígeno tisular, las ERN

pueden llegar a bloquear la actividad de las enzimas que hidroxilan HIF-1α, provocando una

disociación del factor pVHL y la consiguiente acumulación de la proteína debido a su

deficiente ubiquitinización y posterior degradación (Metzen el al., 2003; Berchner-

HYPOXIA


5

Pfannschmidt et al., 2010). Por tanto en hipoxia, ambas subunidades se ensamblan y HIF-1

actúa promoviendo la trascripción de una batería de genes que participan en la respuesta a

la hipoxia, entre los cuales se encuentran EPO (involucrado en eritropoyesis) y VEGF

(asociado a angiogénesis), entre otros. En este sentido, es destacable el hecho de que los

genes que se activan por bajas presiones de oxígeno poseen una región específica,

denominada elemento de respuesta a hipoxia (HRE), para la unión con HIF-1 (Wang y

Semenza, 1993). Dicha región HRE contiene una secuencia consenso base 5´-[A/G]CGTG-

3´ y secuencias flanqueantes altamente variables en los promotores de los genes regulados

por HIF.

Figura 2: Modelo expandido de la regulación de HIF. (A) A presiones normales de oxígeno HIF-1α está sujeto a

prolil-hidroxilación por parte de prolil-hidroxilasas (PHD), lo cual permite el reconocimiento y ubiquitinación por

pVHL su complejo ubiquitin-ligasa asociado. HIF-1α ubiquitinado es degradado por el proteosoma 26S. (B) Bajos

niveles de oxígeno permiten que HIF-1α escape de la prolil-hidroxilación y pueda asociarse con HIF-1β. El

heterodímero se une a una secuencia consenso en los promotores HIF-sensibles y, una vez que se une a los

coactivadores p300/CBP y PKM2, inicia la transcripción (Tomado de Greer et al., 2012).

El óxido nítrico (NO) es una molécula que participa de forma activa en la regulación

de HIF-1 mediante bloqueo de HIF por nitración de la Cys800 (Sumbayev et al., 2003;

Yasinska y Sumbayev, 2003). Además, la actividad transcripcional de HIF-1 puede ser

regulada también por el nivel de NO (Metzen et al., 2003; Martínez-Romero et al., 2011),

mediante su control sobre la actividad de las enzimas prolil-hidroxilasas (PHD) y sobre el

factor inhibidor de HIF (FIH) (Berchner-Pfannschmidt et al., 2010). Estos efectos de la

actuación del NO sobre HIF-1, ponen de manifiesto la importancia que desempeña esta

molécula en los procesos de hipoxia. Por su parte, HIF-1 puede actuar bien inhibiendo la

A B

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Berchner-Pfannschmidt%20U%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19861159


6

muerte por apoptosis (Rapino et al., 2005), o bien por el contrario promoviéndola (Helton et

al., 2005).

El óxido nítrico (NO) es un neurotransmisor gaseoso que se encuentra ampliamente

distribuido en el organismo y que presenta un electrón desapareado, característica que le

permite comportarse como un radical libre. Han sido muchos los estudios que han

demostrado la implicación del óxido nítrico en los procesos hipóxicos en el SNC (Bolaños y

Almeida, 1999; Rodrigo et al., 2001; Moro et al., 2004) a pesar de que los mecanismos

moleculares mediante los cuales el NO ejerce su acción en estos procesos no están

totalmente descritos. Sin embargo, sí se ha podido demostrar que uno de los mecanismos

de actuación del NO se lleva a cabo mediante la activación de la guanilato ciclasa soluble;

de forma que ésta genera cGMP, un segundo mensajero capaz de activar a quinasas, las

cuales, y mediante fosforilación, pueden llegar a modular la expresión génica en diferentes

rutas de señalización intracelular (Francis et al., 2010). Bajo determinadas circunstancias, el

NO puede ser sintetizado en grandes cantidades y de forma no regulada, pudiendo ejercer

en este caso un papel neurotóxico, de forma que puede llegar a inhibir la fosforilación

oxidativa, con la consiguiente disminución en la producción de ATP (Almeida y Bolaños,

2001). El NO puede actuar también directamente sobre proteínas implicadas en

determinadas vías de señalización, reaccionando con grupos tioles de las proteínas y

alterando así su actividad (Peinado et al., 2003). Mediante esta vía, el NO también puede

autorregular su propia producción, influyendo sobre la activación de las enzimas productoras

de NO u óxido nítrico sintasas (NOS). El NO es sintetizado por la enzima óxido nítrico

sintasa, de la que clásicamente se han descrito tres isoformas. El mecanismo por el cual

esta enzima sintetiza NO consiste en la conversión de L-arginina en L-citrulina con la

consiguiente producción de NO; dicho proceso se esquematiza en la figura 3.

Figura 3. Reacción de formación del óxido nítrico a partir de L-arginina (Andrew y Mayer, 1999).


7

Una de las tres isoformas descritas de la NOS es la NOS neuronal o nNOS, que se

describió por primera vez en neuronas, y que se expresa habitualmente de forma

constitutiva; de forma que su actividad está regulada por Ca2+ y calmodulina (Bredt y

Snyder, 1990). Otra de las isoformas clásicamente considerada como constitutiva es la

endotelial o eNOS, que se expresa principalmente en células endoteliales. En este caso

también la calmodulina activada por Ca2+ es necesaria para regular su actividad. Esta

isoforma sintetiza NO de manera intermitente cuando los niveles intracelulares de calcio

citosólico aumentan (Berchner, Pfannschmidt, 2012). Por otro lado, la isoforma inducible o

iNOS, se expresa ante la presencia de lipopolisacárido y citoquinas, entre otros (Kleinert et

al., 2004). Se la puede encontrar en prácticamente cualquier tejido (Geller y Billiar, 1998) y

una vez inducida, su actividad es constante y no se halla regulada por los niveles de Ca2+

intracelular. Participa en la respuesta inmune y además aparece asociada a patologías

neurodegenerativas inflamatorias (Moncada y Higgs, 1991; Lee y Trojanowski, 2003). Los

procesos inflamatorios que acompañan a la hipoxia implican la liberación de citoquinas

inflamatorias, estas últimas ponen en marcha la vía de IkB/NF-kB y la consiguiente

biosíntesis de iNOS, que sintetiza NO en grandes cantidades y de forma no regulada,

(Rodrigo et al., 2001; Siles et al., 2002; Pannu y Singh, 2006; Blanco et al., 2007).

El NO producido puede también reaccionar con el anión superóxido para formar el

potente oxidante peroxinitrito (ONOO-) (Koppenol et al., 1992; Pryor y Squadrito, 1995;

Thompson et al., 2012). El ONOO- es liposoluble y tiene un amplio abanico de moléculas

diana, causando oxidación de grupos -SH, peroxidación lipídica, roturas en el ADN y ARN,

entre otros (Beckman y Ames, 1997; Lipton, 1999; Pacher et al., 2007). En hipoxia, el

peroxinitrito puede actuar en la vía de la apoptosis, facilitando la formación de poros

mitocondriales de permeabilidad transitoria (Clementi et al., 1998; Pacher et al., 2007) y

provocando una rápida modificación de la estructura del citocromo c, probablemente vía

nitración de tirosina, lo que facilita su salida al citosol y la puesta en marcha de la muerte

celular (Cassina et al., 2000).

Por consiguiente, el NO desempeña un papel importante en la respuesta a la hipoxia

(Willmot et al., 2005); así, por un lado, esta molécula ejerce un efecto protector mediante la

vasodilatación y el mantenimiento del flujo cerebral (Samdani et al., 1997), y por otro puede

provocar efectos negativos mediados por la formación de peroxinitrito (figura 4) (Beckman,

1991; Yang et al., 2008).


8

Figura 4. Vías principales de generación de oxidantes in vivo. El NO y O2- se producen en el cerebro durante un

evento de hipoxia/reperfusión. El óxido nítrico induce nitrosilación de proteínas y reacciona con superóxido para

dar peroxinitrito. La superóxido dismutasa detoxifica el superóxido a peróxido de hidrógeno, que a su vez es

convertido en agua. El radical hidroxilo generado a partir del peróxido de hidrogeno a través de las reacciones de

Fenton y Haber-Weiss ocasiona daño celular mediante oxidación de lípidos, proteínas y ácidos nucleicos

(Modificado de Chen et al., 2011).

Otro factor regulador del papel dual del NO en hipoxia es el estado oxidativo del

tejido (Dweik, 2005). De las tres isoformas, la nNOS parece ser la primera isoforma

implicada en los daños neuronales que siguen a la hipoxia cerebral por efecto de la

formación de peroxinitrito, al encontrarse elevados tanto los niveles de NO como de

superóxido (Lizasoain, 1998; Pacher et al., 2007). Por su parte, la iNOS actuaría

incrementando los niveles nocivos de NO generados inicialmente por la nNOS

contribuyendo al incremento del daño (Pacher et al., 2007). A diferencia de los efectos

neurotóxicos mediados por las isoformas neuronal e inducible, la eNOS parece ejercer un

papel neuroprotector tras la hipoxia cerebral debido a sus propiedades hemodinámicas, ya

que estimula la vasodilatación y la angiogénesis, e inhibe otros procesos como la

agregación plaquetaria y la adhesión de leucocitos al endotelio (Iadecola, 1997; Huang,

2004). Justo en el momento de inicio de la hipoxia, se produce un incremento de NO

producido por las células endoteliales a partir de la eNOS, ejerciendo su efecto protector a

través de la vasodilatación de urgencia que produce en un intento de evitar o reducir el daño

hipóxico (Zhang et al., 1993). Además, el NO puede inhibir la apoptosis y estimular la

neurogénesis, participando de ese modo en mecanismos de reparación en el SNC. Así, la

Cerebral Hypoxia & Reperfusion


9

mayoría de estudios consultados apuntan a un papel beneficioso por parte del NO producido

en la hipoxia por la eNOS; mientras que, por otra parte, se ha sugerido que el NO producido

por las isoformas neuronal e inducible conlleva principalmente al desencadenamiento de

efectos neurotóxicos (Huang et al., 1994). Esta dualidad del NO, que depende de la

actividad de las isoformas y del estado oxidativo de la célula, determina por tanto en gran

medida el destino final de las células tras la hipoxia (figura 5).

Figura 5: Papel del NO, peroxinitrito e isoformas de NOS en la fisiopatología del daño por hipoxia/reperfusión. La

isoforma endotelial es capaz de inducir neuroprotección a través de un incremento del flujo sanguíneo colateral,

reducción de la agregación plaquetaria y merma de la apotosis neuronal. La isoforma inducible, producida por

neutrófilos, células de la microglía, etc; conjuntamente con la nNOS son responsables de la neurotoxicidad

(Modificado de Pacher et al., 2007).

Uno de los hechos más destacables en diferentes neuropatologías, incluida la

hipoxia, es la hiperplasia e hipertrofia astrocítica, evidenciada por una sobreexpresión de

GFAP. De hecho, muchas de las acciones de estas células reactivas en hipoxia se han

asociado con la excitotoxicidad mediante la ruta del glutamato-NO-GMPc, que lleva a un

incremento en la producción de NO (Swanson et al., 2004). Además, los astrocitos reactivos

producen NO y otros factores que pueden contribuir a modular la actividad del NO en

hipoxia (Gibson et al., 2005).

Hypoxia-reperfusion


10

Conseguir frenar la producción excesiva de ERO y por tanto de ERN, potenciando

por ejemplo los mecanismos de defensa antiestrés nitro-oxidativo, es una vía que está

siendo explorada en la actualidad como medida de lucha frente al daño derivado del proceso

hipóxico. En este sentido, una forma de actuar podría consistir en la inducción de un

precondicionamiento farmacológico frente a hipoxia mediante el uso de antioxidantes

naturales, como por ejemplo la melatonina. La melatonina debe su actividad antioxidante a

su papel como secuestrador de radicales libres (Galano et al., 2011; Jang et al., 2012). De

hecho, se conoce ampliamente su papel neuroprotector en patologías degenerativas tales

como la enfermedad de Parkinson, Alzheimer, epilepsia y en otras situaciones de daño tales

como la isquemia-reperfusión (Reiter, 1998; Tütüncüler et al., 2005; Cervantes et al., 2008;

Jang et al., 2012). Así, se sabe que la melatonina protege de la peroxidación lipídica

inducida por NO en el cerebro hipóxico (Escames et al., 1997). Además, y en relación a su

potencial terapéutico, modula la respuesta inmune, previene la proliferación de células

tumorales y ejerce efectos citoprotectores en células normales (Das et al., 2010). La

melatonina también previene la muerte neuronal en un gran número de modelos de

neurodegeneración y estimula a las enzimas antioxidantes (Kondoh et al., 2002). Dicha

capacidad de inducción de la cascada antioxidante incrementa su efectividad en la

resistencia al daño oxidativo (Das et al., 2008). Por esta razón, el uso de este antioxidante

permite conseguir un efecto observable sobre los niveles de estrés oxidativo y nitrosativo

que se produce por efecto de la hipoxia.


11

2. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS

Los fenómenos de hipoxia suponen una de las principales causas de muerte y

morbilidad en el mundo occidental, por lo que el estudio de los mecanismos moleculares

implicados en estas situaciones, así como el uso de tratamientos para reducir el daño

producido presenta un especial interés. El NO desempeña un papel fundamental en el

desarrollo de los procesos hipóxicos, y aún no se han esclarecido por completo los

mecanismos mediante los cuales el NO ejerce esta acción. Numerosos estudios han

demostrado el efecto neuroprotector de la melatonina basado en su capacidad antioxidante,

protegiendo al cerebro del daño derivado de la privación de oxígeno, mediante la regulación

de la vía NO/NOS.

Por consiguiente, los objetivos generales de este trabajo, han sido: 1) analizar la

respuesta del sistema NO/NOS en el cerebro de ratas sometidas a un modelo de hipoxia

hipobárica aguda, seguido de dos períodos de reoxigenación (0 y 2 horas), y 2) estudiar el

efecto producido por la melatonina en este modelo experimental.

Concretamente, se ha evaluado el nivel de estrés oxidativo y nitrosativo, así como la

expresión y actividad de las NOS, y los mecanismos moleculares relacionados (HIF-1α y NF

NF-κB), en cerebro de ratas sometidas a un modelo de hipoxia hipobárica aguda (HHA) sin y

con el tratamiento con melatonina.


12

3. MATERIAL Y MÉTODOS

3.1. Animales

Para el desarrollo de este trabajo se utilizaron un total de 60 ratas macho de la

variedad Wistar de 250-300g de peso. Los animales se mantuvieron en condiciones

estándar de luz y temperatura y fueron alimentados ad libitum con pienso comercial y agua.

Todos los experimentos se llevaron a cabo conforme a la directiva 2010/63/EU, revisada por

el Comité de Bioética del Consejo Español de Investigaciones Científicas, y aprobados por

el Comité de Bioética de la Universidad de Jaén.

3.1.1. Distribución de los animales en grupos experimentales

La distribución de los animales entre las diferentes situaciones experimentales y las

técnicas utilizadas se ha realizado de acuerdo al esquema representado en la tabla 1.

Tratamiento Grupo Experimental N

No tratados

Control 10

0 h 10

2 h 10

Tratados con melatonina

Control 10

0 h 10

2 h 10

Tabla 1. Esquema de la distribución de los animales entre los grupos experimentales y de las técnicas

empleadas.


13

3.2. Administración de melatonina y modelo de hipoxia hipobárica

La melatonina (100 mg/kg peso corporal) fue administrada por vía intraperitoneal una

hora antes de los experimentos de hipoxia. Debido a su papel sobre el ritmo circadiano, la

administración de la melatonina se realizó todos los días a la misma hora.

Los experimentos de hipoxia hipobárica aguda se realizaron en una cámara

hipobárica instalada en el Centro de Instrumentación Científico-Técnica (CICT) de la

Universidad de Jaén, diseñada y puesta a punto por miembros del grupo de investigación

“Estrés Celular y Edad” (BIO-0184) (figura 6).

Figura 6: Imágenes de la cámara hipobárica experimental diseñada por miembros del grupo de

investigación “Estrés celular y Edad” (BIO-0184). (A) Cámara hipobárica provista de manómetro y

llaves reguladoras de entrada de aire. (B) Rata macho Wistar en el interior de la cámara hipobárica

durante el proceso de hipoxia hipobárica aguda (HHA).

Para llevar a cabo los episodios de hipoxia hipobárica, los animales fueron

introducidos en la cámara. La presión se controló por medio de una bomba de vacío con

flujo ajustable. Por otro lado, la cámara fue provista de un manómetro con el cual se controló

la presión a lo largo de todo el experimento. La situación de hipoxia se logró mediante la

reducción de la presión parcial de oxígeno (pO2) alcanzándose en el interior de la cámara

una presión aproximada de 300 hPa. Dichas condiciones emulan una altitud de

aproximadamente 9.144 metros (30.000 pies), a la cual los animales fueron mantenidos

durante 1 hora. Las velocidades de ascenso y descenso fueron controladas y mantenidas en

1.000 pies/min. Una vez finalizado el experimento, los animales fueron retirados de la

cámara y se sacrificaron inmediatamente (grupo de 0h de reoxigenación) o dos horas tras la

salida de la cámara (grupo de 2h de reoxigenación). El procedimiento se esquematiza en la

figura 7.

A BA B


14

Figura 7 Esquema conceptual de la administración de antioxidante, hipoxia, y posterior reoxigenación.

Como grupo control se tomaron individuos sometidos a condiciones normobáricas y

normóxicas en el interior de la cámara durante el mismo intervalo de tiempo que el resto de

los grupos experimentales.

3.3. Técnicas histológicas

3.3.1. Preparación de los animales, fijación y extracción de las muestras destinadas a

técnicas histológicas

Los animales fueron anestesiados mediante inyección intraperitoneal de ketamina

(Imalgene 1000, 50 mg/Kg de peso del animal) y xilacina (Rompun, Bayer, 5 mg/ Kg de peso

del animal), y anticoagulados con 15 u. de heparina (Heparina sódica 5%. Ref.: 20095-A.

Rovi, Madrid, España) vía cardiaca. Posteriormente fueron perfundidos a través de la aorta

ascendente con 250 ml de solución lavadora (tampón fosfato salino 0,01 M, pH 7,4) seguida

de 250 ml de solución fijadora (paraformaldehído al 4% en tampón fosfato 0,1 M, pH 7,4)

(tabla 2).


15

Solución lavadora

Tampón fosfato salino (PBS)

0,01 M pH = 7,4

Solución de fijación y postfijación

Paraformaldehido al 4% en

PB 0,1 M pH = 7,4

Fosfato sódico monobásico

0,2 M

PB 0,01 M, pH 7,4

Paraformaldehído 8% (p/v)

(añadir NaOH 1 N hasta que

la

solución quede transparente)

Fosfato sódico dibásico 0,2

M Cloruro de sodio 0,15 M PB 0,2 M, pH 7,4

Mezclar en proporción

18/82 para obtener un pH =

7,4

Cloruro de potasio 0,003 M Mezclar 1:1 (v/v)

Tabla 2. Composición y preparación de las soluciones empleadas en la fijación y extracción de las muestras

destinadas a técnicas histológicas.

Tras la perfusión se extrajeron los cerebros, se lavaron con solución lavadora e

inmediatamente después se introdujeron en 100 ml de una solución de paraformaldehído al

4% en PB 0,1 M durante 3 horas para su postfijación. Posteriormente los cerebros se

sumergieron en 100 ml de una solución de sacarosa al 30% en PB 0,1 M, pH 7,4 para su

crioprotección, donde se mantuvieron 48 horas a 4º C hasta su procesamiento.

3.3.2. Actividad NADPH-diaforasa in situ

Esta técnica permite localizar de manera indirecta la actividad de las NOS, ya que

éstas presentan actividad nicotinamín adenín dinucleótido fosfato diaforasa (NADPH-d)

debido a la presencia del dominio reductasa, que permite transferir electrones desde el

coenzima β-NADPH (coenzima específico para la actividad NOS) hasta diferentes

cromógenos, como por ejemplo el azul de nitrotetrazolio (NBT), que da lugar a un producto

coloreado cuando se reduce. El diformazán azul es la forma reducida e insoluble del NBT y

es resistente a una posterior reoxidación. Esta reacción histoquímica se basa en una

reacción de reducción simple, y hay que tener en cuenta que otras muchas enzimas redox,

como la citocromo c y la citocromo P-450 reductasa, también muestran actividad NADPH

diaforasa, pero solamente la actividad NADPH-diaforasa de las NOS es resistente a la


16

fijación por aldehídos. Los tejidos tratados con aldehídos muestran, por lo general, un

modelo de distribución de la actividad NADPH-d que coincide de modo casi idéntico con la

inmunorreactividad para las NOS (Kugler et al., 1994; Roufail et al., 1995). El estudio

histoquímico para detectar la actividad NADPH-diaforasa mediante microscopía óptica en el

cerebro se llevó a cabo en libre flotación siguiendo el protocolo descrito a continuación:

1. Congelación de los cerebros en Tissue-Tek O.C.T.TM (Ref.: 0113710014.

Sakura, Torrance, CA, EE.UU.).

2. Obtención de secciones rostrocaudales de 40 μm de grosor a -21º C

mediante el uso de un criostato (Leica CM1950, Wetzlar, Alemania). Estos

cortes se recogieron en tampón fosfato salino (PBS) 0,01 M, pH 7,4 de

forma seriada.

3. Incubación de los cortes con Tritón X-100 al 0,2% (v/v) en PBS 0,01 M, pH

7,4, durante 1 h a temperatura ambiente y en agitación suave.

4. Lavado de los cortes con Tris-HCl 0,1 M, (compuesto de Trizma® Base 0,1

M) pH 7,4 (ajustado con HCl) mediante tres cambios de 5 min cada uno, a

temperatura ambiente y en agitación suave.

5. Incubación en oscuridad y a 37º C de los cortes en la siguiente mezcla de

reacción: tampón Tris-HCl 1 M (0,1M), pH 7,4; β−NADPH 10 mM (1 mM);

NBT 61 mM (2 mM) en N,N-dimetilformamida al 70%; y agua destilada.

6. Lavado de los cortes con Tris-HCl 0,1 M, pH 7,4 mediante tres cambios de 5

min cada uno, a temperatura ambiente y en agitación suave.

7. Situar los cortes sobre portaobjetos tratados con gelatina y dejar secar a

temperatura ambiente.

8. Deshidratación de los cortes mediante sucesivos pasos de 1 min cada uno

por soluciones de alcoholes de concentración creciente (50º, 70º, 96º y

100º).

9. Aclarado mediante dos pasos de 1 min cada uno en xilol.

10. Montaje de las preparaciones con DPX (DPX mountant for histology. Ref.:

44581. Sigma, St. Louis, MO, EE.UU.).

Como control de esta técnica se introdujeron cortes que fueron incubados con una

mezcla de reacción que contenía α−NADPH en lugar de β−NADPH, de manera que en

dichas secciones no se observó precipitación de diformazán azul.


17

3.4. Técnicas bioquímicas

3.4.1. Extracción y procesamiento de las muestras destinadas a Western Blot

Los animales fueron sacrificados mediante muerte por dislocación. A continuación se

extrajo el cerebro y se congeló inmediatamente en nitrógeno líquido.

La corteza cerebral se homogenizó primeramente mediante el uso de unas tijeras. La

alícuota destinada a la técnica de Western Blot se homogeneizó 1:3 (p/v) en el tampón

correspondiente (tabla 3) a 4º C con la ayuda de un homogeneizador (Ultra-turrax T8. IKA ®

Werke, Staufen, Alemania). El homogenado resultante se centrifugó durante 1 hora a 42.000

rpm en una ultracentrífuga (OPTIMA lL-90K. Rotor TY 50TI. Beckman Coulter, Fullerton, CA,

EE.UU.) a 4º C. Tras la centrifugación se separó el sobrenadante y se almacenó a -80º C.

Tampón de homogenización

Tris-HCl 30 mM, pH 7,4

SDS 1%

Mezclar y ajustar el pH a 7,4

Añadir a 10 ml de la mezcla anterior 12,5 µl de metil

sulfonil fluoruro (PMSF) 0,1 M

Añadir a 10 ml de la mezcla anterior media pastilla de

Cocktail de inhibidores de proteasas (Ref.: 1836153.

Roche, Basilea, Suiza).

Tabla 3. Composición y preparación del tampón de homogenización

para las muestras destinadas a la técnica de Western Blot.


18

3.4.2. Determinación de la concentración de proteínas

La determinación de proteínas se llevó a cabo por el método de Bradford (1976)

utilizando albúmina sérica bovina (BSA) (Albumin fraction V (pH 7,0). Ref.: A1391.

AppliChem, Darmstadt, Alemania) a concentraciones conocidas para elaborar la recta

patrón. Se realizaron dos diluciones de cada muestra con un volumen final de 10 µl a las

que se añadieron 200 µl del reactivo comercial (Protein assay reagent. Ref.: 500-0006.

BioRad, Hercules, CA, EE.UU.), y después de 5 minutos se determinó la absorbancia de las

muestras mediante el empleo de un espectrofotómetro (Infinite ® F500. Tecam, Suiza) a una

longitud de onda de 595 nm frente a un blanco que contenía 10 µl de agua destilada y que

se procesó siguiendo el mismo protocolo experimental que las muestras.

3.4.3. Análisis de la expresión de proteínas mediante Western Blot

Se realizaron los cálculos para obtener los volúmenes necesarios para cargar 20 μg

de proteína por pocillo. Las muestras se calentaron a 70º C durante 10 minutos. Luego se

centrifugaron brevemente.

Para el fraccionamiento electroforético se utilizó el gel NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris

Gel 1.0 mm, 10 well (Invitrogen NP0321BOX). El equipo de electroforesis empleado fue un

XCell SureLock™ Mini-Cell (Invitrogen EI0001). El gel se corrió durante 1 hora y 5 minutos a

200 V.

La transferencia se realizó usando un iBlot Gel Transfer Device (Invitrogen IB1001EU) y

siguiendo las instrucciones del fabricante (20 voltios durante 7 minutos).

Posteriormente, se bloqueó la membrana durante 2 horas a temperatura ambiente en

agitación suave utilizando tampón de bloqueo al 5% (tablas 4 y 5).

Concentración (M)

Sodio Cloruro (Panreac 141659, Mr: 58,44) 0,68

Potasio Cloruro (Fluka 60130, Mr: 74,56 0,013

Trizma Base (Sigma T6066, Mr 121,1) 0,123

Mezclar y ajustar pH a 7,6 con HCl (Panreac 141020, Mr 36,46)

Tabla 4. Composición y preparación del tampón de TBS 5x para el tampón de

bloqueo.


19

Concentración

TBS 5x 1x

Leche desnatada en polvo sin calcio

(Carrefour)

5%

Tween 20 (Bio-Rad 170-6531) 0,1%

Tabla 5. Composición y preparación del tampón de bloqueo.

Las membranas se incubaron toda la noche a 4ºC en agitación suave con el

anticuerpo primario correspondiente (tabla 6).

Antisuero Carácter Dilución Procedencia

Anti-GFAP Policlonal 1/5.000 Cow glial fibrilar acidic protein. Ref.: Z0334. Dako, Glostrup,

Dinamarca.

Anti-nTyr Policlonal 1/2.000 Cedido por el Dr. Rodrigo. Instituto Cajal, CSIC, Madrid, España.

Anti-eNOS Monoclonal 1/800 Purified mouse anti-eNOS. Type III MAb. Ref.:610327.

Transduction, Lexington, KY, EE.UU.

Anti-nNOS Policlonal 1/3.000 Cedido por Dra. V. Riveros-Moreno. Wellcome Res. Laboratories,

Beckenham, RU.

Anti-iNOS Policlonal 1/500 Cedido por el Dr. L.O. Uttenthal (Uttenthal et al., 1998)

Tabla 6. Características, concentraciones y procedencias de los anticuerpos primarios utilizados en

Western Blot.

A continuación se realizaron tres lavados de 5 minutos cada uno a temperatura

ambiente y en agitación suave, usando tampón de lavado (tabla 7).

Concentración

TBS 5x 1x

Leche desnatada en polvo sin calcio

(Carrefour)

1,5%

Tween 20 (BioRad 170-6531) 0,05%

Tabla 7. Composición y del tampón de lavado.


20

Posteriormente, se incubaron las membranas con anticuerpo secundario unido a

peroxidasa durante 1 hora a temperatura ambiente y en agitación suave. Las

concentraciones del secundario variaron en función del primario (tabla 8):

Anticuerpo 1º Denominación y procedencia Anticuerpo 2º Dilución

Anti-GFAP Anti-Rabbit IgG (whole molecule)–Peroxidase antibody

produced in goat (Sigma A-0545)

1/10.000

Anti-nTyr Anti-Rabbit IgG (whole molecule)–Peroxidase antibody

produced in goat (Sigma A-0545)

1/10.000

Anti-eNOS Anti-mouse IgG (FC specific)-peroxidase antibody produced

in goat. Ref.: A-0168. Sigma, St. Louis, MO, EE.UU.

1/2.000

Anti-nNOS

Anti-rabbit IgG (whole molecule)-peroxidase antibody

produced in goat. Ref.: A-0545. Sigma, St. Louis, MO,

EE.UU.

1/10.000

Anti-iNOS

Anti-rabbit IgG (whole molecule)-peroxidase antibody

produced in goat. Ref.: A-0545. Sigma, St. Louis, MO,

EE.UU.

1/10.000

Tabla 8. Características, concentraciones y procedencias de los anticuerpos secundarios utilizados en Western

Blot en función del anticuerpo primario.

Finalmente se realizaron tres lavados de 10 minutos cada uno a temperatura

ambiente y en agitación suave.

El procedimiento de revelado se realizó íntegramente en cámara oscura:

- las membranas fueron incubadas con solución de revelado ECL Prime Western

Blotting Detection Reagents (GE Healthcare RPN2132) durante 5 minutos.

- se situaron en un sistema de exposición Hypercassette Neutral (GE Healthcare

RPN11643), colocando sobre ella una película fotográfica X-OMAT UV film 100 NIF

(Kodak 3260552). Se realizaron exposiciones a tiempo variable, de acuerdo a la

intensidad de la señal en la membrana.

- tras la impresión de la película, se sumergió en revelador (AGFA G150), agua, fijador

(AGFA G354) y agua, en ese orden.

- se dejó secar la película revelada temperatura ambiente.


21

Finalmente, las membranas fueron escaneadas y densitometradas haciendo uso del

software TotalLab (Newcastle upon Tyne, R.U.). Cada banda fue cuantificada por

quintuplicado.

3.4.4. Determinación de sustancias activas de ácido tiobarbitúrico (TBARS)

La determinación de sustancias reactivas del ácido tiobarbitúrico (TBARS) se llevó a

cabo mediante el método descrito por Buege y Aust (1978). La homogeneización de las

muestras fue realizada en 3 volúmenes (p/v) de PBS 0,01 M pH = 7,4 en tubos eppendorf

sumergidos en hielo. A continuación, las muestras se sonicaron con 2 ciclos de 5 segundos.

Seguidamente, se centrifugaron a 10.000 g durante 40 minutos a 4ºC. Se recogieron los

sobrenadantes y se repartieron en alícuotas de 0,3 ml con una concentración de 18 mg

proteína/ml. Las mismas se mantuvieron a temperatura ambiente durante 5 minutos, luego

de lo cual se le agregaron 0,7 ml de reactivo (15% ácido tricloroacético, Sigma Ultra, Ref.:

T9159; 0,38% ácido tiobarbitúrico, Sigma, Ref.: T5500; 2% ácido clorhídrico 37%, Sigma, St

Louis, MO, EE.UU, Ref.: H1758) y se incubaron durante 15 minutos a 95ºC en tubos de

vidrio. Finalmente, se extrajeron los sobrenadantes y se colocaron en una placa multipocillos

para su lectura espectrofotométrica a 535 nm en un equipo Sunrise TECAN. Se utilizó como

blanco una mezcla de 0,3 ml PBS 0,01 M (pH = 7,4) y 0,7 ml de reactivo.

3.4.5. Determinación del factor inducible por hipoxia (HIF-1α)

Debido a la localización celular de HIF-1α, como paso previo a su determinación, se

procedió al aislamiento de la fracción nuclear de las muestras empleando un kit comercial

(Nuclear Extraction Kit, Cayman Chemical (10009277) y siguiendo las indicaciones del

fabricante.

HIF-1α Transcription Factor Assay Kit de Cayman Chemical (10006910) es un

método sensible para la detección le la actividad de unión específica al ADN de factores de

transcripción en extractos nucleares. En la placa de 96 pocillos se encuentra inmobilizada

una secuencia específica de ADN de doble cadena (dsDNA) que contiene el elemento de

respuesta de HIF-1α (5’-ACGTG-3’). De esta forma, el HIF-1α que se encuentre en los

extractos nucleares, se unirá de forma específica al elemento de respuesta de HIF-1α. El

complejo del factor de transcripción HIF se detecta añadiendo un anticuerpo primario

específico dirigido contra HIF-1α. Se añade un anticuerpo secundario conjugado con HRP

para obtener una lectura específica a 450 nm (figura 8).


22

3.4.6. Determinación del factor nuclear potenciador de las cadenas ligeras de las células B

activadas (NFκB)

Debido a la localización celular de NF-κB, como paso previo a su determinación, se

procedió al aislamiento de la fracción nuclear de las muestras empleando un kit comercial

(Nuclear Extraction Kit, Cayman Chemical (10009277) y siguiendo las indicaciones del

fabricante.

NF-κB (p65) Transcription Factor Assay Kit de Cayman Chemical (10007889) es un

método sensible para la detección le la actividad de unión específica al ADN de factores de

transcripción en extractos nucleares. En la placa de 96 pocillos se encuentra inmobilizada

una secuencia específica de ADN de doble cadena (dsDNA) que contiene el elemento de

respuesta de NF-κB. De esta forma, el NF-κB que se encuentre en los extractos nucleares,

se unirá de forma específica al elemento de respuesta de NF-κB. El complejo del factor de

transcripción NF-κB (p65) se detecta añadiendo un anticuerpo primario específico dirigido

contra NF-κB (p65). Se añade un anticuerpo secundario conjugado con HRP para obtener

una lectura específica a 450 nm (figura 8).

Figura 8. Esquema representativo del fundamento en el que se basan los kits comerciales de determinación de

HIF-1α y NFκB.


23

3.5. Análisis estadístico

Se aplicó el test t de Student para datos apareados o no apareados a fin de

comparar las medias entre grupos. Los valores se expresaron como media aritmética ±

desviación estándar, aceptándose un p-valor menor de 0,05 como nivel de significación.


24

4. RESULTADOS

4.1. Técnicas histoquímicas

4.1.1. Localización tisular de la actividad NADPH diaforasa (NADPH-d)

Se ha observado actividad NADPH diaforasa en neuronas y en el endotelio de los

vasos sanguíneos en todos los grupos experimentales analizados (figura 9).

Figura 9. Microfotografía de individuo control que muestra la presencia de

actividad NOS in situ, mediante la técnica NADPH-diaforasa. Flecha:

neurona. Asterisco: vaso sanguíneo. 100X. Barra: 20µm.

Respecto a la intensidad del marcaje, no se han observado diferencias entre los

grupos analizados, ya que en todos ellos aparecen gran cantidad de neuronas y vasos

sanguíneos marcados uniformemente distribuidos a lo largo de la corteza cerebral (figura

10), a excepción del grupo HH2h en los que sí se aprecia una disminución en la intensidad

de la actividad diaforasa, fundamentalmente la asociada el endotelio vascular (figura 10).

*


25

HH2h

C

Figura 10. Microfotografías de la presencia de actividad NOS in situ, mediante la técnica NADPH-diaforasa. Flecha: neurona. Asterisco: vaso sanguíneo. Barra: 100µm.

HH0h

Mel+C

Mel+HH0h

Mel+HH2h

*

*

*

*

* *

*

*

*

*

*

* *


26

4.2. Técnicas bioquímicas

4.2.1. Especies Reactivas de Ácido Tiobarbitúrico (TBARS)

El ensayo de TBARS constituye una forma de evaluar el grado de peroxidación

lípidica (Seljeskog et al, 2006). En los animales no tratados con melatonina se observa un

incremento de los niveles de TBARS tras la hipoxia, siendo además estos valores más

elevados que en los tratados. En estos últimos no se aprecian diferencias significativas en

los niveles de TBARS en ningún de los grupos analizados (figura 11).

Figura 11. Análisis del nivel de peroxidación lipídica mediante la determinación de TBARS. C: Control; Mel+C:

Control con melatonina; HH0h: Hipoxia hipobárica (0h); Mel+HH0h: Hipoxia hipobárica con melatonina (0h);

HH2h: Hipoxia hipobárica (2h); Mel+HH2h: Hipoxia hipobárica con melatonina (2h). a,c,ep<0,05.

4.2.2. Proteína glial fibrilar ácida (GFAP)

Mediante el análisis de las bandas obtenidas con el empleo del antisuero contra la

proteína glial fibrilar ácida (GFAP) tras realizar la técnica de western blot a muestras de

corteza cerebral de ratas control e hipóxicas tratadas y no tratadas con melatonina, se

detecta un descenso de la expresión de la GFAP en los animales tratados inmediatamente

tras el episodio hipóxico (Mel+HH0h), aunque estos valores tienden a recuperar los valores

basales tras 2 horas de reoxigenación (Mel+HH2h) (figura 12).

02468

101214161820

a

a a

c

e

nmol

/ml


27

Figura 12. Análisis de la expresión de GFAP por western blot. C: Control; Mel+C: Control con melatonina; HH0h:

Hipoxia hipobárica (0h); Mel+HH0h: Hipoxia hipobárica con melatonina (0h); HH2h: Hipoxia hipobárica (2h);

Mel+HH2h: Hipoxia hipobárica con melatonina (2h). a,b,c,dp<0,05.

4.2.3. Óxido nítrico sintasa neuronal (nNOS)

Tras realizar el análisis de las bandas obtenidas mediante el empleo de la técnica

semicuantitativa de western blot, se obtuvieron los resultados que se detallan a

continuación. En los animales no tratados con el antioxidante, se produce un aumento

significativo de la expresión de la isoforma neuronal NOS con el proceso de hipoxia respecto

a los controles (C). En los individuos tratados se observa un comportamiento similar, aunque

tras 2 horas de reoxigenación (Mel+HH2h) se aprecia un descenso respecto a las 0 horas

(Mel+HH0h) (figura 13).

4.2.4. Óxido nítrico sintasa endotelial (eNOS) Al cuantificar las bandas obtenidas con la técnica de western blot realizada a

homogenados de cortezas cerebrales de ratas tratadas y no tratadas con melatonina y tras

un proceso de hipoxia, se aprecia un aumento significativo de la expresión de la isoforma

endotelial de la NOS en los animales no tratados en el punto de 0 horas de reoxigenación

(HH0h), aunque estos valores volvieron a los valores basales a las 2 horas (HH2h) (figura

14). No se observan variaciones significativas en el grupo de animales tratados con

melatonina (figura 14).

0

20

40

60

80

100

120a

c b

d b

51 kDa

Uni

dade

s ar

bitr

aria

s


28

Figura 13. Análisis de la expresión de nNOS por western blot. C: Control; Mel+C: Control con melatonina; HH0h:


Mel+HH2h: Hipoxia hipobárica con melatonina (2h). a,b,d,ep<0,05.

Figura 14. Análisis de la expresión de eNOS por western blot. C: Control; Mel+C: Control con melatonina; HH0h:


Mel+HH2h: Hipoxia hipobárica con melatonina (2h). a,cp<0,05.

0

20

40

60

80

100

120

a

b a

b a d b

e

160 kDa

0102030405060708090 a

c

131 kDa

c

Uni

dade

s ar

bitr

aria

s U

nida

des

arbi

trar

ias


29

131 kDa

Uni

dade

s arb

itrar

ias

0

20

40

60

80

100

120

4.2.5. Óxido nítrico sintasa inducible (iNOS) El análisis de la expresión, mediante la técnica semicuantitativa de western blot, de la

isoforma inducible de la NOS no ofrece diferencias significativas en ninguno de los grupos

analizados, tanto tratados como no tratados con el antioxidante melatonina (figura 15).

Figura 15. Análisis de la expresión de iNOS por western blot. C: Control; Mel+C: Control con melatonina; HH0h:


Mel+HH2h: Hipoxia hipobárica con melatonina (2h).

4.2.6. Nitración de tirosinas (nTyr)

Mediante la técnica de western blot aplicada a homogenados cerebrales de animales

tratados y no tratados con melatonina en los que se experimentó nuestro modelo de hipoxia,

se detectan un total de 7 bandas inmunorreactivas frente al antisuero anti-n-Tyr, con unos

pesos moleculares de 53, 51, 47, 35, 33, 30 y 27 kDa. Para el cálculo densitométrico de las

proteínas nitradas se consideró el total de bandas inmunorreactivas. Tras analizar los datos

no se observaron diferencias significativas en ninguno de los grupos analizados (figura 16).


30

53 kDa 51 kDa 47 kDa

35 kDa 33 kDa

30 kDa

27 kDa

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

Figura 16. Análisis de la nitración de tirosinas por western blot. C: Control; Mel+C: Control con melatonina; HH0h:


Mel+HH2h: Hipoxia hipobárica con melatonina (2h).

4.2.7. Factor Nuclear Kappa B (NF-κB)

Al ensayar los niveles NFκB, ambos grupos control presentaron niveles semejantes

(figura X). En ausencia de antioxidante, la hipoxia eleva significativamente (p<0,05) los

niveles de dicho factor respecto del control. No obstante, el incremento observado entre las

0 y las 2 horas no es estadísticamente significativo (figura 17).

4.2.8. Factor Inducible por hipoxia (HIF-1α)

Los niveles de expresión de HIF-1α son similares en ambos grupos control (figura

18). En ausencia de antioxidante, se aprecia una descenso significativo sólo tras 2 horas de

reoxigenación (HH2h). La tendencia es similar en los grupos experimentales tratados con

melatonina, aunque en etse caso el descenso es más precoz, pues se ya entre las 0 y las 2

horas no es estadísticamente significativo (figura 18).

Uni

dade

s arb

itrar

ias


31

Figura 17. Análisis del nivel de expresión de NF-κB. C: Control; Mel+C: Control con melatonina; HH0h: Hipoxia

hipobárica (0h); Mel+HH0h: Hipoxia hipobárica con melatonina (0h); HH2h: Hipoxia hipobárica (2h); Mel+HH2h:

Hipoxia hipobárica con melatonina (2h). ap<0,05.

Figura 18. Análisis de la expresión de HIF-1α. C: Control; Mel+C: Control con melatonina; HH0h: Hipoxia

hipobárica (0h); Mel+HH0h: Hipoxia hipobárica con melatonina (0h); HH2h: Hipoxia hipobárica (2h); Mel+HH2h:

Hipoxia hipobárica con melatonina (2h). a,b,c,dp<0,05.

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7 a U

nida

des a

rbitr

aria

s a

0

2

4

6

8

10

12

14

c a

d b

Uni

dade

s arb

itrar

ias c

b


32

5. DISCUSIÓN

Uno de los mecanismos del daño hipóxico está mediado por la oxidación de ácidos

grasos poliinsaturados de membrana, que se puede medir mediante la detección de las

especies reactivas del ácido tiobarbitúrico (TBARS) (Seljeskog et al., 2006). Nuestros

resultados muestran un incremento de estas especies reactivas tras la aplicación del modelo

de hipoxia, tanto a las 0 como a las 2 horas de reoxigenación en los animales no tratados

(figura 11). Por el contrario, los niveles de TBARS aparecen disminuidos en los animales

tratados con el antioxidante respecto a los controles sin melatonina. Este resultado vendría a

justificar la capacidad antioxidante de la melatonina, ya que aunque pudiera estar

generándose una mayor cantidad de NO, la menor disponibilidad de radicales libres debido

a la acción de la melatonina disminuiría la capacidad de alterar lípidos. Estos resultados

coinciden con los descritos por otros autores en numerosos trabajos (Escames et al., 1997;

Akbulut et al., 2008; Zamorskii et al., 2012), en los que se ha descrito la capacidad de la

melatonina para prevenir la peroxidación lipídica.

La proteína glial fibrilar ácida (GFAP) es una proteína monomérica del citoesqueleto,

que se encuentra en astrocitos de las sustancias blanca y gris del sistema nervioso central.

El aumento en la expresión de esta proteína se utiliza como indicador de una reactividad

glial en diferentes procesos patológicos (Wunderlich, 2006); de hecho, dos factores

distintivos de la reactividad glial son la hipertrofia de las prolongaciones astrocíticas y el

aumento en la expresión de esta proteína. Concretamente, el sistema de filamentos

intermedios es importante en la respuesta celular al estrés celular inducido por privación de

oxígeno y glucosa seguida de reperfusión (de Pablo et al., 2013), donde la astrogliosis

representa un aumento en la neuroprotección, reparación y aporte trófico a las neuronas

dañadas. El resultado global de éste fenómeno debería ser claramente beneficioso para el

sistema nervioso, y su supresión exacerbaría el daño tisular (Verkhratsky et al., 2013).

Nuestros resultados, sobre expresión de GFAP tras la HH son ligeramente diferentes en los

animales tratados respecto a los que no lo están. Así, mientras que en los primeros se

detecta un descenso de expresión de GFAP tras la hipoxia (Mel+HH0h), en los segundos

prácticamente no se aprecian cambios (figura 12). Estos datos se pueden interpretar, como

que el tratamiento con melatonina altera la respuesta de activación de los astrocitos ante la

HH, pues los astrocitos también pueden influenciar el estado antioxidante neuronal y servir

como un sumidero de NO, que sucesivamente reduce el estrés oxidante neuronal durante la

isquemia (Chen y Swanson, 2003). Más aún, los astrocitos, que pueden expresar las tres

isoformas NOS, secretan NO que puede tener tanto efectos citotóxicos como protectores

sobre las células cercanas, dependiendo dicho efecto de factores como la cantidad de NO

suministrado o del estado redox de las células diana (Gibson et al., 2005). Estos


33

antecedentes permiten sugerir que cambios en la expresión de GFAP podrían acabar

afectando al sistema NO/NOS en el cerebro hipóxico.

Los resultados acerca de la expresión de nNOS, sugieren un incremento inmediato

en la expresión de la isoforma neuronal ante un episodio hipóxico, tanto en animales

tratados con melatonina como en los que no lo fueron (figura 13). Este fenómeno ha sido

descrito previamente en la bibliografía (Zhang et al., 1994; Lizasoain, 1998; Pacher et al.,

2007). Más concretamente, está demostrado que la nNOS se induce y es activa durante la

fase aguda de la hipoxia, aunque la producción prolongada de NO puede ser neurotóxica

(Pacher et al., 2007). De hecho, la administración de inhibidores selectivos de nNOS reduce

el volumen de infarto tras la hipoxia, sugiriendo que el NO producido por parte de la isoforma

neuronal es perjudicial (Sun et al., 2009). Sin embargo, en los animales tratados con el

antioxidante, nuestros resultados muestran una disminución de los niveles de expresión de

nNOS tras 2 horas de reoxigenación (figura 13). Esto podría interpretarse como un

mecanismo de freno de producción de NO procedente de la nNOS por parte de la

melatonina en un momento en el cual, una excesiva producción de NO podría acarrear

consecuencias negativas (Serrano et al., 2006). El mecanismo de acción por el cual la

melatonina podría estar realizando esta acción protectora puede deberse a su capacidad

para unirse a la calmodulina (CaM) e inhibir su capacidad de interacción con otras proteínas

(Turjanski et al., 2004), como la nNOS (Koh, 2008). En cualquier caso, este no sería el único

mecanismo de inhibición de la nNOS, puesto que la fosforilación de la Ser-847 también es

capaz de inhibir la expresión de la nNOS (Rameau et al., 2003); lo que pone de manifiesto la

complejidad de la regulación de la isoforma neuronal de la NOS.

Clásicamente, la eNOS se ha descrito como el principal agente responsable del

aumento de la vasodilatación que se produce bajo condiciones hipóxicas (Bolanos et al.,

1999). Sin embargo, también se ha establecido que la formación de ONOO- en respuesta a

señales de estrés requiere la activación de eNOS (Han et al., 2006; Mitchell et al., 2007), y

además, la producción excesiva de NO por eNOS puede ser perjudicial ya que puede

conducir al desarrollo de edema vasogénico y daño cerebral secundario (Thiel et al., 2001).

Nuestros resultados indican un aumento en la expresión de la proteína inmediatamente tras

la HH en los animales no tratados (figura 14), lo que se corresponde al rol clásico atribuido a

la eNOS de facilitadora de una vasodilatación como respuesta a la disminución del aporte de

O2. En los animales tratados con melatonina, sin embargo, no hemos observado variación

en los niveles de expresión tras la HH (figura 14). Se ha descrito que este antioxidante es

capaz de ejercer un efecto directo sobre la actividad de la eNOS a través de incrementos de

calcio intracelular (Pogan et al., 2002), o mediante la estabilización de la forma homodímera

de eNOS mediante la reducción de los niveles de ERO (Maxwell et al., 2002), pero también


34

se ha descrito que la melatonina es capaz de producir una disminución de los niveles de NO

algunos tejidos (Alonso et al., 2006; Tamura et al., 2006) mediante la inhibición de la eNOS

(Sivakumar et al., 2007). Así, se ha demostrado que la melatonina puede atenuar la

activación de CaMKII y en consecuencia regular a la baja la eNOS, a través de la

eliminación directa de algunos radicales libres (Tan et al., 2000). Sin embargo, también se

ha descrito que la melatonina es capaz de aumentar los niveles de eNOS (Hung et al.,

2013), lo que pone de manifiesto que aún no está esclarecida la forma en la que la

melatonina afecta a la eNOS.

La isoforma inducible de la iNOS produce NO en grandes cantidades y es por lo

tanto, la mayor responsable del daño derivado del NO tras un daño de tipo

hipóxico/isquémico. Respecto a nuestros resultados, la expresión de la isoforma inducible de

la NOS no muestra variaciones significativas en ninguno de los grupos analizados, tratados

o no tratados con el antioxidante melatonina, tras la HH (figura 15). De hecho, otros autores,

no encuentran expresión de la iNOS determinada por western blot en el cerebro de animales

hipóxicos (Castro-Blanco et al., 2003; Cañuelo et al., 2007), aunque en algunos de estos

casos sí pudieron detectarse mensajeros de esta isoforma, que aumentaron tras los

diferentes periodos de reoxigenación. Los resultados obtenidos se pueden deber a que el

modelo de hipoxia hipobárica, al no ser un modelo altamente agresivo, no llegue a activar a

la iNOS. Parece ser que el NO procedente de la eNOS y nNOS es suficiente para

desencadenar la respuesta frente a la hipoxia. Sin embrago, en otros modelos más

agresivos, que cursan con déficit de oxígeno, como la isquemia, sí se ha demostrado un

incremento en la expresión de la iNOS (Wei et al., 2014). Aun así, en estos mismo modelos

más agresivos, se ha demostrado que la melatonina es capaz de atenuar la sobreexpresión

de iNOS (Koh et al., 2008).

La actividad NOS determinada mediante la detección de la NADPH-d, indica un

marcaje tanto en el endotelio vascular como en neuronas, clásicamente asociado a eNOS y

nNOS respectivamente (Czarnecka et al., 2013), uniformemente distribuido por toda la

corteza cerebral en todos los grupos experimentales analizados, no observándose tampoco

diferencias apreciables en cuanto a la intensidad de la marca, a excepción del grupo HH2h

donde se observa una disminución en la intensidad del marcaje en el endotelio vascular

(figura 10). Teniendo en cuenta estos resultados, parece que no se observa una respuesta

vascular exacerbada tras la HH, lo que vendría a apoyar la idea de que el modelo empleado,

si bien produce daño cerebral, no es muy agresivo. Además, aunque podríamos atribuir la

marca detectada en vasos con esta técnica casi exclusivamente a la actividad de la eNOS,

el descenso de actividad detectado en el punto de HH2h no se corresponde con los valores


35

de expresión de eNOS detectados por western blot, si bien es cierto que no se puede

establecer una correlación entre expresión y actividad.

Como se ha expuesto previamente, el NO puede interaccionar con el anión

superóxido para formar peroxinitrito, éste a su vez, puede reaccionar con el anillo fenólico de

los residuos de tirosina de las proteínas y formar 3-L-nitrotirosina (n-Tyr). La formación de n-

Tyr puede alterar la estructura y función de las proteínas, y el peroxinitrito puede ser un

marcador in vivo de estrés nitrosativo. Por consiguiente, la formación de ONOO- y por tanto

la nitración proteica es favorecida en gran medida por el incremento simultáneo de los

niveles de NO y de superóxido. El análisis del total de proteínas nitradas no varía

significativamente con la hipoxia en ninguno de los grupos analizados, independientemente

de la administración de melatonina (figura 16), lo que parece indicar que el NO producido

tras la hipoxia no incrementa la nitración proteica. Estos resultados siguen el mismo patrón

que los obtenidos tras el análisis de la expresión de la iNOS, en los que tampoco se

apreciaban diferencias significativas entre los distintos grupos. De hecho, el NO proveniente

de esta isoforma es el que se destina en mayor medida a la nitración proteica, por lo que

ausencia de incrementos de expresión de iNOS parece justificar los escasos niveles de

nitración detectados.

El papel de NF-κB en la hipoxia cerebral se encuentra bien caracterizado; de hecho,

se sabe que es un mediador importante en la respuesta a hipoxia y que puede activarse en

presencia de ERO. NF-κB participa en la cascada inflamatoria, y son diversos los

mediadores de inflamación que tienen sitios de unión a NF-κB en sus promotores: moléculas

de adhesión, iNOS y citoquinas. Nuestros resultados acerca de la expresión de NF-κB,

indican una inducción moderada por efecto del modelo de hipoxia (figura 17). Sin embargo,

en los animales tratados con melatonina no se aprecia variación alguna. De hecho, otros

autores han descrito que la melatonina es capaz de bloquear el proceso inflamatorio

afectando a la vía de traducción de señales de NF-κB (Alonso et al., 2006; Mohan et al.,

1995; Chuang et al., 1996), lo que conllevaría a una atenuación del daño hipóxico. Sin

embargo, y debido a que éste factor de transcripción puede promover tanto factores

proinflamatorios como de supervivencia celular, y a que su mecanismo de acción varía

según la estirpe celular (Hämäläinen, 2008), los resultados referentes al mismo deben ser

tomados con cautela y necesitan de un estudio más profundo.

Bajo condiciones de bajas presiones de oxígeno, HIF-1α puede escapar de la prolil-

hidroxilación y degradación proteosomal posterior y asociarse con HIF-1β (Greer et al.,

2012), por lo que sería razonable esperar un aumento de los niveles de HIF-1α en los

individuos hipóxicos en comparación con los grupos control. A este respecto, aunque hay

evidencias sólidas que sugieren que el NO contribuye a la estabilización de este factor a


36

través de la inhibición de la prolil-hidroxilasas (PHD) (Greer et al., 2012), también se sabe

que el NO puede ejercer el efecto opuesto, ya que varios donadores de NO reducen la

estabilización de HIF-1α y la activación transcripcional de genes diana (Huang et al., 1999;

Berchner-Pfannschmidt et al., 2010). Esto último parece ser lo que está ocurriendo en

nuestro modelo, pues nuestros resultados muestran una disminución de la expresión de

HIF-1α después de 2 h de reperfusión en animales no tratados (figura 18). Sin embargo,

después de la administración de melatonina, se detecta una disminución más temprana en

la expresión de HIF-1α (Mel+HH0h) (figura 18). En este sentido, la capacidad de la

melatonina para inducir una caída en los niveles de HIF-1α ha sido ampliamente

documentada (Park et al., 2010; Lanoix et al., 2013). No obstante, los mecanismos que

subyacen a la inhibición por parte de la melatonina de la acumulación de HIF-1α inducida

por hipoxia aún no se conocen completamente (Cho et al., 2011), aunque se ha propuesto

que podría ser debido a su capacidad de neutralización de las ROS mitocondriales, lo que

revertiría la inactivación de PHDs por ROS. Estos mecanismos ponen de manifiesto la

complejidad de la modulación de la melatonina sobre HIF-1α tras la hipoxia.


37

6. CONCLUSIONES

1) Los resultados de los niveles de peroxidación lipídica y reactividad glial apuntan a que

nuestro modelo de hipoxia hipobárica ejerce un daño moderado.

2) La melatonina parece ejercer cierto precondicionamiento en el tejido frente al daño

hipóxico, posiblemente regulando el estado redox del mismo.

3) La administración de melatonina disminuye la expresión de nNOS y eNOS en el modelo

hipóxico estudiado, pero no altera la expresión de iNOS.

4) El efecto neuroprotector de la melatonina frente a la hipoxia parece estar íntimamente

relacionado con su papel sobre el sistema NO/NOS.


38

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50

7. RESUMEN DE LAS ASIGNATURAS CURSADAS EN EL MÁSTER

Seguridad en el Laboratorio y Experimentación Animal

Con esta asignatura conocimos los aspectos más relevantes de los riesgos asociados al

trabajo de laboratorio, las estrategias para prevenirlos y la legislación vigente al respecto. Se

revisaron además las normativas y leyes que rigen la experimentación con animales y con

seres humanos, tanto a nivel nacional como a nivel de la Unión Europea.

Proteómica y Dinámica de Proteínas

La asignatura consistió en un análisis de los aspectos más importantes de la biología de las

proteínas, como los procesos de plegamiento, recambio, modificaciones post-

traduccionales, transporte intracelular, degradación e interacciones con otras moléculas. Se

describieron las técnicas de fraccionamiento más utilizadas en proteómica, los equipos y

software utilizados en dicha disciplina, y algunas de sus aplicaciones

Regulación de la Expresión Génica y Desarrollo

La asignatura estuvo dividida en diferentes bloques en los cuales se estudiaron los procesos

de transcripción y traducción, los diferentes tipos de ARN polimerasas y sus características,

los mecanismos de regulación de la expresión génica a nivel transcripcional y post-

transcripcional, los diferentes tipos de marcadores genéticos, técnicas de amplificación de

ADN y ARN, y métodos de purificación de ADN.

Ingeniería Genética Avanzada

Esta asignatura nos proporcionó una visión global sobre conceptos de clonación, vectores

más frecuentes utilizados (fagos, plásmidos, cósmidos, BAC, YAC, HAC), conjuntamente

con conocimientos generales de genotecas e ingeniería genética en bacteria y levaduras.

Además, se revisaron algunas estrategias de mejora genética en animales y plantas.

Cultivos Celulares, Diferenciación y Terapia Celular

Se trató de un curso teórico-práctico donde se estudiaron las cualidades y ventajas del

trabajo con cultivos celulares, los cuidados a tener en cuenta para su correcta manipulación,

las técnicas de laboratorio más habituales, y sus múltiples aplicaciones.


51

Biología Molecular de las Enfermedades Infecciosas

Con esta asignatura realizamos una revisión de los aspectos más importantes de la

Parasitología y la Virología a nivel molecular, así como de las técnicas de diagnóstico

específicas para cada organismo y sus tratamientos.

Citogenética Molecular y Clínica

En esta asignatura se revisaron conceptos como la organización y las técnicas de estudio de

los cromosomas y sus mutaciones; pero además, nos aportó una visión general de la

citogenética humana y clínica, así como de las técnicas y aplicaciones más novedosas de

dicha disciplina.

Estrés Celular

El curso incluyó una revisión sobre las especies reactivas de oxígeno y nitrógeno,

conjuntamente con sus propiedades fisicoquímicas y sus funcionas en el metabolismo

celular. Se estudió cuáles son los lugares de la célula donde se producen, y las

metodologías utilizadas para su detección en el laboratorio. Además, se estudiaron los

sistemas de defensa antioxidantes en tejidos animales y las técnicas utilizadas en su

detección.

Biotecnología Diagnóstica

Este curso nos proporcionó una visión global sobre técnicas moleculares de última

generación aplicadas al diagnóstico, permitiéndonos la elección de aquellas más adecuadas

en cada situación particular.

Biología Molecular y Celular del Envejecimiento

Nos permitió entender el envejecimiento como un proceso multifactorial, en el cual un

organismo sufre un deterioro progresivo en su capacidad para mantener la homeostasis, el

curso aportó los aspectos más relevantes sobre la biología del envejecimiento, algunas de

sus patologías asociadas, los eventos fisiológicos y moleculares que lo caracterizan, y los

modelos experimentales más usados en la actualidad para estudiarlo.


52

Patología Molecular y Celular

La asignatura nos ayudó a conocer en profundidad las bases moleculares de la enfermedad

y la aplicación de la biología molecular en su diagnóstico y tratamiento, así como los

principios de la terapia génica.

Neuroendocrinología

Esta asignatura nos aportó una visión global de la neuroendocrinología, considerándola

como la integración bilateral de los dos principales sistemas de comunicación interna: los

sistemas nervioso y endocrino, y cómo interactúan en el mantenimiento de la homeostasis.

Se adquirieron conocimientos sobre fisiopatología, y sobre técnicas en investigación

neuroendocrina.


53

8. CURRÍCULUM VÍTAE


C/ Doctor Martínez Ruiz, 32

23360 La Puerta de Segura Jaén

[email protected]

Tel: 600378724

⊱ Formación:

⊱ Otros

Enero 2014 – Actualidad B. Braun Medical, S. A. Operaria industrial. Polígono Industrial Los Olivares. Jaén.

Julio 2011 – Enero 2014 Salud Responde. 061. Consejería de Salud. Operadora telefónica. Arvato Customer Services. Arvato Bertelsman, S.A. Jaén.

Oct 2009 – Sept 2010 PRÁCTICAS EN SERVICIO DE ANÁLISIS CLÍNICOS. Complejo Hospitalario de Jaén.

Feb 2007 - Jun 2008 ALUMNA COLABORADORA GRUPO DE INVESTIGACIÓN DE LA JUNTA DE ANDALUCÍA BIO-184 “ESTRÉS CELULAR Y EDAD”. Área de Biología Celular. Departamento de Biología Experimental.

Universidad de Jaén.

Septiembre 2012 LICENCIADA EN BIOLOGÍA. Universidad de Jaén.

En curso MÁSTER EN BIOTECNOLOGÍA Y BIOMEDICINA. Universidad de Jaén.

Abril 2014 PREVENCIÓN DE RIESGOS EN EL LABORATORIO. Adecco, S. A. Jaén.

Julio 2012 CURSO DE MANIPULADOR DE ALIMENTOS DE ALTO RIESGO. Asesoría de Empresas Alimentarias Plan-A. Jaén. Febrero 2014 CURSO DE PREVENCIÓN RIESGOS LABORALES. Adecco, S. A. Jaén. Mayo 2014 SOCORRISTA. Técnico en primeros auxilios y soporte vital básico. Técnico en mantenimiento de piscinas. Federación Española de Salvamento y Socorrismo. IFP-Rescate. Jaén.

⊱ Experiencia profesional:

Idiomas Nivel medio de inglés

Informática Office, Internet, Openlab, Matlab, TotalLab, ImageJ, Statgraphics Plus… Nivel usuario.

d U J e m o Trabajo Fin de Máster i B y a í o B Tutores:...

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