REPORTE FINAL DEL SERVICIO SOCIAL.

4o\iuRt:: Ortiz Polo :\racrii.

Sl . . \TRlC~~LA: 90336788 ,

JI.ICESCI.4TCRA: Ingenieria Bioquimica Indusirial. Lnidad Iziapalapa

Universidad Autonoma bleiropoliiana ,/División Ciencias Biológicas y de 13 Salud (CBSI.

~JEI;EFOSCJ: 6-12-77-01. lziapalapa Sléxiro. D.F. .

CARACTERIZACI~N DE CELULASAS PRODUCIDAS POR Aspergillus niger

POR FERMENTACIÓN SÓLIDA SOBRE PULPA DE CAFÉ.

&OS1BHE DEL ASESOR. PUESTO Y ARSCRILION: h1.U. K:ifarl C. Canipos hloniirl Proirsor Titular. Proícsor i i t u h r "A" Dcpanameiiio de Biorrcnologia.

Quiniico Josr Rlaria I3arl)a ChhvrL

Dcprnamcnto dc LIiofcriiologin. m.

Ia1'C,\R DONDE SE REALIZA EL SERVICIO: IJnivcrsidsd Autónoma Mttrnpolitnriri Unidnd Ittapalapa Edificio R. Laboratorios 109-I 1 I ltlnpalapn hlcxico, D.F.

U FECIlA I>E INICIO: 3 DE MAYO DE 1996.

~ t : L I l A DE l ~ E l l ~ l S A C ~ l O S : 18 DE ?iO\'lESlLIl<t~ D E 199ú 1 +Y& a c I A V t::

FlIlSlA DEL. r\LlJMNO: s Ararcli Ortiz Polo

DESARROLLO DEL TRABAJO.

CARACTERIZACIÓN DE CELULASAS PRODUCIDAS POR Aspergillus niger POR FERMENTACIÓN SOLIDA SOBRE

PULPA DE CAFE

INTRODUCCION: I

Como sabemos la Biotecnologia contempla procesos de producción de compuestos específicos por vía microbiana. Es decir, la utilización de microorganismos que produzcan enzima específicas que sean responsables de la degradación de ciertos substratos que puedan ser desechos NO utilizables para el ámbito industrial, pero de gran valor desde el punto de vista de la investigación, la economía y el medio ambiente.

*SOBRE LAS E N Z M S . Las mimas que son de naturaleza proteica son los catalizadores biológicos de las reacciones

químicas celulares, son sensibles a los efectos del calor, a los cambios de pH, y a otras circunstancias m b , sin embargo presentan gran especificidad biológica en la elección del substrato, dando actividades enirniticas a muy pequeñas dosis del mismo. Las enzimas son indispensables para la degradación de diversos productos y presentan además un gran potencial energético para la síntesis de nuevas sustancias.

Las emimas funcionan como catalizadores, es decir; modifican la velocidad de reacción sin ser consumidas durante ella. Como se comentó las enzimas aumentan la velocidad de las reacciones de las reacciones que ocurren espontáneamente, o sea. reacciones termodinamicamente posibles. Estas no modifican el equilibrio de la reacción, no desplazan la reacción hacia ninguno de los lados, ni de las partes reaccionantes, ni de los productos, solo acortan el tiempo para alcanzar el equilibrio. El estudio del comportamiento enzimatico comprende el andisis de las actividades, energías de activación, a si como el conocimiento de su comportamiento dentro de cada ente biológica a la cual pertenezcan, como es el caso de los microorganismos, de los cuales se obtienen estas eruimas para su explotación.

Debido a esto se entiende el interés por conocer su comportamiento para manipular genéticamente los microorganismos para hacerlos apropiados para la biosintesis de metabolitos primarios y secundarios de inter& comercial e industrial.

4 *SOBRE LA ENERGiA DE ACTIVACIÓN.

Las reacciones se llevan acabo espontáneamente liberando energia, pero a una velocidad muy lenta debido a la existencia de la barrera llamada Energía de activación iwii El efecto acelerador de las emimas se debe a su capacidad para disminuir esta energia, y facilitar la unión de las sustancias reaxionantes en la posición adecuada, para llevar a cabo la reacción. Los sitios activos de las enzímas son los que catalizan las reacciones quimicas teniendo la facultad de cambiar la molécula original en otra.

11i1 111 U 0

U a U U

t Enerqia de activoci6n n no cotoi9odo

Enerqia de activacibn y caialisis

La cinética enzimatica comprende el estudio de 10s factores que intervienen y regulan las reacciones catalizadas por las enzimas, como son: el tiempo de reacción, la concentración de enzima y de substrato etc. a si como se debe considerar las condiciones necesarias para mantener la estabilidad propia de las moléculas enzimáticas. Las enzimas se estiman a través del estudio de la velocidad de reacción catalizadas por ellas, la actividad se expresa en UNIDADES, relacionadas con la desaparición de substrato o la aparicion de alguno de los productos de la reacción, siguiendo dichos cambios en el tiempo. U

Sin embargo las condiciones del sistema no son uniformas a lo largo del tiempo, la formación de producto, cambios de pH, de temperatura, etc, pueden afectar la reacción.

La UNDAD lnternacional (vi) usada para la medición de la actividad enzimática, se define como: ~a cantidad de enzima que trasforma un micromol de substrato por minuto a 25"C, y en condiciones óptimas, es decir, sin limitación de substrato, cofactores, activadores, pH y temperatura ideal, etc.

Así, la velocidad de reacción es proporcional a la cantidad de enzima presente y a la capacidad catalítica individual de cada enzima.

Generalmente este sistema de medida se expresa en U1 sobre unidad de volumen. (VIA).

t V

'EFECTO DE LA TEMPERATURA. Por todo esto, el Efecto de la temperatura sobre las reacciones enzimáticas, es de suma importancia,

ya que la actividad enzimática es función de la temperatura de reacción. En las reacciones químicas habituales, el coeficiente térmico QIO es de alrededor de 2, o sea; se duplica la velocidad de reacción por cada 10°C de aumento de temperaturd. Por otra parte, si se aumenta la temperatura más allá de los límites que soporta la enzima, se presenta desnaturalización, con la pérdida consecuente de su actividad.

Efecio sobre b rdoeidod , de desnaturobaabn sobre

r e a c c h misma

~

Las reacciones enzimaticas difieren de las reacciones químicas, ya que estas soportan condiciones de temperatura más elevadas, siendo el los rangos más altos de temperatura donde la velocidad de reacción disminuye. Sin embargo el aumento en la temperatura produce generalmente aumento en la velocidad de reacción, esto es; que la velocidad de afinidad del sitio activo de la enzima con el substrato específico aumenta, por lo que del desdoblamiento del complejo Enzima-Substrato (ES) en los productos resultantes de la reacción se pueden calcular y estudiar.

El estudio de los efectos de la temperatura son complejos y están sujetos al análisis experimenta!. No debe de olvidarse que éste parámetro es dependiente de otras condiciones de estudio.

Existe una relación entre la temperatura y la velocidad de reacción, que ayuda a la determinación de la Energía de activación, propuesta por Arrhenius (1 899).

d I n k / d t = EaíRT'

Donde: K = constante de afinidad de la velocidad de reacción. Ea = Emergía de activación R = constante de los gases T = Temperatura

La Energía de activación se calcula con esta ecuación para determinar la cantidad de energía necesaria para que se realice la reacción.

*EFECTO DEL pH

De igual manera que la temperatura, el Efecto del pH, es importante para el análisis enzimático, ya que el pH donde la actividad es mayor es en el pH Óptimo. a partir de este punto, hacia uno u otro lado, la actividad baja. Cada enzima tiene un pH Óptimo de actividad, cambios grandes de pH pueden provocar la desnaturalización de la proteína y producir pérdida de la actividad enzimática.

V T I

DH

Erecio del DH sobre lo velocidad de los re#eciones cilm)lu#s

Cualquier modificación en el valor del pH, altera las condiciones de detednación en la actividad enzimática. El efecto del pH analizado adecuadamente proporciona información de cómo es el mecanismo de reacción, a si como ayuda a determinar la naturaleza de la enzima.

*SOBRE LAS CELULASAS. Las enzimas que nos importan para la realización de este trabajo son las CELULASAS, que

son organismos proteicos de origen natural, capaces de degradar mdes celulósicos, como fuente de carbono, produciendo energia y especialmente formas químicas de glucosa y celooligosacáridos.

Las celulasas pertenecen al grupo de enzimas que efectúan hidrólisis (Hidrotasas), teniendo acción sobre la celulosa, que es un polisacárido de alto peso molecular, formado por grandes cantidades de glucosas unidas por enlaces glucosidicos p-1-4 sitio donde se. produce la hidrólisis, con el fin de separar monómeros de D-glucosa fhcilmente detectables por algún método de cuantificación.

Si embargo para que se de realice esta acción es necesaria la presencia de enzimas celuliticas especializadas como las j3- glucosidasas, que atacan este enlace para la formación de glucosa.

La celulosa es un producto orgánico natural presente principalmente en los vegetales y plantas superiores. generalmente se localiza en la pared celular de las coirurcr, tallos, troncos y Cascarillas de estos productos, sobre todo en los granos y semillas, por lo que es altamente abundante en la naturaleza En plantas maduras la celulosa se presenta formando polimeros dando como resultado otra molécula de mayor peso molecular llamada lignina, la cual es el mayor contaminante de los desechos agroindustriales. D e esto depende la importancia del tratamiento enzimático de estos productos para el aprovechamiento de la celulosa, como fuente de energía y de produccion de compuestos.

Las calulasas son usadas para el tratamiento de bagazos de la producción de cerveza, del fiijo! soya Y de otros rastrojos. Las celulasas sirven para la producción de aromas y sabores, para la maceration de frutas y vegetales, a si como para la modificación enzimática de textiles. Por todo esto y nias, las ewimas celulósicas tienen gran.valor industrial, comercial, y por lo tanto económico.

LOS materiales celulósicos representan un recurso extraordinariamente abundante y renovable. Estos se emplean en la obtención de papel, textiles, materiales de construcción, muebles, productos quimicos, etc. Sin embargo se ha planteado desde hace tiempc la necesidad de aprovechar microbiológicamente ciertos compuestos, principalmente desechos agricolas como pajas, rastrojos, cascarillas, olotes, bagazos, etc. Desechos de la industria alimentana como pulpas y cáscaras de htas.

La celulosa, que contienen todos estos compuestos orgánicos. es un polisacárido estructural que constituye aproximadamente el 50% de los materiales vegetales y del cual se sintetizan anualmente de IS a 20 x 10" toneladas; consecuentemente es el material más abundante y renovable de nuestro planeta.

La fórmula estructural de la celulosa como se mencionó anteriormente, muestra que está constituida por unidades de glucosa eslabonadas por enlaces p 1-4. Las moléculas de celulosa se unen en haces cuya estabilidad se debe a la formación de puentes'de hidrógeno entre grupos hidróxilo que quedan a una distancia y orientación adecuadas. En general, salvo en el caso del algodón, donde la celulosa se encuentra casi pura, este polisacárido se asocia con otros compuestos, principalmente hemicelulosas y lignina, dando estructuras molenilares de gran cohesión que son dificiles de atacar por los microorganismos.

Los microorganismos que degradan la celulosa son principalmente hongos y bacterias filamentosos. El ataque requiere de la participaci6n de diversos tipos de entimas como la p 1-4 Exoglucanasas (EX) capaces de a t a w celulosa cristalina, las p 1-4 Endoglucanasas (EN), que pueden ser de dos tipos, las que liberan celobiosa a partir del extremo no reductor de la celulosa, y por último las p Glucosidasas, capaces de hidrolizar la celobiosa y oligosacáridos con glucosa en uniones p 1-4 hasta moléculas de glucosa. Todas las enzimas actúan sinergísticamente para llevar a cabo la hidrólisis de la celulosa.

El microorganismo que se utilizb para efectuar el presente trabajo es perteneciente al reino de los Fungi. Es un hongo microscópico filamentoso dela genero Aspergillus.

Los Aspergillus son miembros de la clase tentativa Deuteromicetos, están ampliamente distribuidos en la naturaleza en las frutas, vesetales u otros substratos que les sirven como alimento, algunas especies se han relacionado con el deterioro de los alimentos. Tienen importancia económica porque se usan en muchas industrias de la fermentación, que incluyen la producción de Acido cítrico y glucónjco, que son elaborados en abundancia por Asprgillirs iiiger.

LOS Aspergillus producen un micelio tabicado, ramificado, con la parte vegetativa introducida al nutnente, las hifas estériles emergen de las células de pie que también está en el substrato, en el ápice 10s conidióforos se hinchan formando una vesicula y ésta origina al esterígma, las conidias salen del estefiyma y se mantienen en cadenas, las vesículas varían en cada especie, el color de esporas generalmente es negro, café o verde, los Aspergillus de desarrollan en concentraciones altas de azúcares Y sales, 10 que indica que pueden tomar el agua que necesitan en sustancias relativamente secas.

a ~a especie de hongo que utilizamos fue Aspergillits iiiger. Esta especie es importante porque se ha

- comprobado por investigación que es un alto degradador de celulosa, ya que es capaz de producir enUmas celulósicas para la degradación, presentando altas actividades. En algunos casos Aspergillus niger presenta mayores actividades comparadas con otra especie de hongo llamado Trichoderma.

a A.yxrgi//iis iiiger puede producir enzimas celulósicas de tres tipos; Exoglucanasas p 1-4 (EX),

Endoglucanasas DI-4 (DE), y P-Glucosidasas (GL), capaces de romper los enlaces DI-4 de la celulosa, a o liberando azúcares mas pequeños y simples como glucosa. Estos microorganismos crecen en cualquier fuente orgánica que contenga celulosa.:Para nuestros fines el hongo se hizo crecer sobre pulpa de café sabiendo que ésta tiene un alto contenido de celulosa.

a

U

U

Este tipo de substrato pertenece al grupo de desechos orgánicos que, como producto del proceso industrial del beneficio de café, es no utilizado, y por esto es un gran contaminante del suelo y de las aguas donde se deposita. La protección ambiental ha venido exigiendo que esta industria contaminante se convierta en una industria limpia y esto significa el desarrollo de alternativas para el bioprocesamiento de las aguas residuales y para el aprovechamiento económico de la pulpa de café.

. *SOBRE LA PULPA DE CAFÉ.

La pulpa está formada por el exocarpio (epidemis) y parte del mesocarpio. El color de la epidermis varia de verde (clorofila) a rojo (antocianinas) y depende de la variedad de café y del grado de

,Ph maduración del fmto.

Podemos constatar que solamente el 6 % del peso del fmto fresco es utilizado para la preparación de la bebida. El 94 % restante, constituido por agua y subproductos del proceso, en la mayoría de los casos no es utilizado y se convierie en una fuente de contaminación del medio ambiente. Se observa que durante el proceso de beneficio húmedo del café se generan dos subproductos: La pulpa que constituye el 39 % del fmto fresco y el mucilago que representa el 22%.

U U

El contenido de nutrimentos de la pulpa de d é es superior al de la &scare de cítricos, material utilizado ampliamente en la alimentación de rumiantes

En México, la producción de café es alta, por lo tanto la de la pulpa es mayor. Estados como Chiapas, Veracruz, Oaxaca y Puebla son los principales productores de café, con una producción aproximada de 135, 641 toneladas de pulpa de cafe, es decir, el 91 % del total nacional.

iII

Esto siynifica un interés particular en el caso de instalación de una industria para el aprovechamiento integral de este substrato, debido a que son los estados de Chiapas y Veracruz los que podrían facilitar la mayor cantidad de materia prima (pulpa de café); los 2 estados siguientes en iniportancia serían Oaxaca y Puebla, ambos cercanos a Chiapas y Veracmz respectivamente.

La pulpa de cafe representa un desecho agroindustrial muy abundante pero de bajo valor nutncional debido a la presencia de sustancias tóxicas como la cafeína y los polifenoles. Sin embargo se puede mejorar su valor nutritivo a través de una fermentación sólida con hongos filamentosos (con Aspergillits n i ~ e r ) capaces de destoxificar la pulpa de café utilizando la cafeina como fuente de nitrógeno y ios polifenoles como fuente de carbono para su crecimiento.

‘SOBRE LA FERMENTACI~N SOLIDA. La fermentación sólida, es un proceso fermentativo para substratos donde la actividad de agua es

muy baja o nula. Este tipo de fermentación es un logro importante para la investigación y la industria, ya que cuenta con fuertes ventajas para ser usada, dentro de ellas están: que dan como resultado gran productividad, no se necesitan condiciones estériles extremas, no dejan como resultado de la fermentación efluentes a tratar, porque prácticamente se hace en “seco”. por lo tanto resulta mucho más económica comparada con los procesos de fermentación sumergida.

Por eso, para el éxito de este trabajo y su realización se contó c o n una donación de un preparado de Aspergillus niger por fermentación sólida sobre pulpa de cafe para la caracterización enzimática.

t

Un aspecto importante de la pulpa de café es su utilización para la producción de compuestos bioquímicos que serían de gran interés durante el beneficio del café. En particular, la pulpa del café puede servir de materia prima para la producción de enzimas que puede mejorar considerablemente el proceso de desmualaginkac¡6n. La biotecnología contempla procesos de producción de compuestos específicos por vía microbiana. Es decir, la utilización de microorganismos que produzcan sólo a las enzimas responsables de algún proceso dentro del beneficio del café, como es el caso de la desmucitaginización del café, lo cual es totalmente factible.

De hecho estas enzimas (principalmente pectinasas) se encuentran disponibles en el mercado Sin embrago, enzimas mas especificas que las comerciales (como es el caso de las celulasas), pueden ser producidas por los cafetaleros a partir de la pulpa de café en las mismas instalaciones del beneficio

Finalmente se puede comentar que una vez extraidas las enzimas, los residuos de la pulpa de cafe, tratándolos de manera adecuada, pueden quedar libres de d e í n a y con un mayor contenido proteico, de tal manera que pueden ser utilizados para la nutrición animal, y las enzimas producidas pueden ser explotadas a nivel industrial y comercial.

OBJETIVO:

Caracterizar las celulasas producidas por Aspergillus niger por fermentación sólida sobre

pulpa de café.

METODOLOGIA UTILIZADA.

A partir de la obtención de del microorganismo (Aspergiftus triger) por fermentación sólida sobre pulpa de café. se realizó lo siguiente.

o PREPARACI~N DEL EXTRACTO CRUDO ENZIMÁTICO A 50 ml. D e agua desionizada, se agregó un gramo de pulpa de café en un vaso de precipitado Se

agitó durante10 min. Y se filtró sobre algodón. A esto se le llamo FILTRADO.

SUBSTRATO UTILIZADO: CarboxiMetilCelulosa (CMC).

ACTIViDAD ENZIMATICA PARA LAS ENDOGLUCANASAS

4 D E T E W A C I O N DEL pH OPTIMO.

Se determinó el pH optimo de las celulasas &n la literatura. Se probó con soluciones amortiguadoras de fosfatos y citratos a pH de: 4.5.6.7.8 y 9.

Se prepararon las siguientes soluciones amortiguadoras.

- Solución amortiguadora de fosfatos pH 4.

- Solución amortiguadora de acetatos pH 5.

- Solución amortiguadora de fosfatos pH 6 .

- Solución amortiguadora de fosfatos pH 7.

- Solución amortiguadora de fosfatos pH 8.

- Solución amortiguadora pH 9.

hasta llegar a p H 9. Diluyendo con agua desionizada hasta 200 ml.

5 g de HNaz PO4 + 3 g de H2 KP04 en un litro de agua desionizada.

3 ml de ácido acético + 8.7 g de acetato de sodio en un litro de agua desionizada

2 g de HK2P04

500 mg de HNa PO4 + 300 mg de HI K PO4 en un litro de agua desionizada.

16 g de HKzPO4 + 0.5 g de HI K PO4 en un litro de agua desionizada.

1.25 g de ácido bórico + I80 ml de agua desionizada, agregando solución de NaOH 1 M

+ 8 g de H2 K PO4 en un litro de agua desionizada.

I

O PREPARACIÓN DEL SUBSTRATO. Se preparó una solución de CarboxiMetilCelulosa (CMC) al 1% de la siguiente manera:

0.5 g de CMC + 50 ml de cada solución amortiguadora.

METODO: Se colocó 1 ml de filtrado + 1 mi de substrato (CMC) en un tubo de ensayo, se agitó y se incubó en baño de temperatura controlada a 50' C durante 30 min. ( La temperatura sugerida por la literatura).

o DETERMINACI~N DE LA TEMPERATURA OPTIMA

Con el filtrado del fermento crudo de la pulpa de café, y se detennin6 la temperatura óptima. Una vez conocido el pH optimo ya que en este se encontró la mayor actividad enzimática, Se probó con: 30,40,50,60,60 y 70 "C.

m.TODO: Se colocó 1 ml del filtrado + 1 ml de substrato (CMC) al 1 % disuelto en la solución amortiguadora donde se detectó la mayor actividad encimatica, en un tubo de ensayo, se agitó y se incubó en baño de temperatura controlada en las diferentes temperaturas (30,40,50,60,60 y 70 C.) durante 30 rnin.

h i b a s determinaciones (pH y Temperatura) se realizaron por triplicado corroborando su actividad con los testigos correspondientes para cada caso.

-Preparación de los testigos:

condiciones. 1 ml de substrato (CMC) + 1 ml de agua desionizada en tubos de ensayo bajo las mismas

u CUANTIFICACI~N DE LAS ENDOGLUCANASAS .

Con los parámetros determinados anteriormente, se continuó con la caracterización de las celulasas, observando el efecto de la concentración de substrato.

- Efecto de la concentración de substrato: Se prepararon soluciones de CarboxiMetilCelulosa (CMC) a diferentes concentraciones. Ai O.OOO5, 0.005, 0.05, 0.5, 1.0, 5.0, 5.5 y 6.0 %. en las condiciones óptimas de

experimentación. Determinando en cual de éstas concentraciones se logró la mayor actividad enzimática

METODO: Se tomó 1 ml de CMC (al 1%) en las diferentes concentraciones disuelta en la solución amortiguadora donde se presentó la mayor actividad actividad enzimática, se adiciono a 1 ml de del filtrado en un tubo de ensayo. Posteriormente se llevo a un bailo de temperatura controlada (temperatura optima) durante 30 min.

Se comeron simultáneamente los testigos por triplicado:

Testigos:

manejaron estos tubos bajo las mismas condiciones. 1 ml de CMC al 1% en la solución amortiguadora ideal + 1 mi de agua desionizada. Se

ACTIVIDAD ENZIMATICA PARA LAS EXOGLUCANASAS (EX)

SUBSTRATO UTLLIZADO: Papel filtro (PF) Whatman No 1

4 DETERMINACION DEL PH OPTIMO.

Se utilizaron las mismas soluciones amortiguadoras que en el proceso anterior.

O PREPARACIÓN DEL SUBSTRATO. Se prepararon cortes de Papel filtro de 0.05 g ( i x 5 cin) de la siguiente manera:

un corte de papel filtro ,+ 1 ml de cada solución amortiguadora.

METODO: Se colocó 1 ml de filtrado + amortiguadora en un tubo de ensayo, se agitó y se incubó en baño de temperatura controlada a 50" C durante 90 min. ( La temperatura sugerida por la literatura).

1 corte de papel filtro + I ml de la solución

a DETERMINACI~N DE LA TEMPERATURA OPTIMA

Con el filtrado del fermento crudo de la pulpa de cafe, y se determinó la temperatura óptima. Una vez conocido el pH optimo ya que en este se encontró la mayor actividad enzimáh, Se probó con: 30,40,50,60,60 y 70 "C.

METODO: Se coloc6 1 ml del filtrado + I corte de papel filtro + 1 ml de solución amortiguadora optima (determinada en el paso anterior) donde se detectó la mayor actividad encimática, en un tubo de ensayo, se agitó y se incubó en baño de temperatura controlada en las diferentes temperaturas (30,40,50,60,60 y 70 "C.) durante 90 min.

Ambas deternimaciones (pH y Temperatura) se realizaron por triplicado corroborando su actividad con los testigos correspondientes para cada caso.

I

1

-Preparación de los testigos:

tubos de ensayo bajo las mismas condiciones. 1 corte de papel filtro + 1 ml de la solución amortiguadora ideal + 1 ml de agua desionizada en

DETERMINAClON DE LAS EXOGLUCANASAS .

Con los parámetros determinados anteriormente, se continuó con la caracterización de las celulasas, observando el efecto de la concentración de substrato.

- Efecto de la concentración de substrato:

concentraciones.

Determinando en cual de éstas concentraciones se logró la mayor actividad enzimatica.

Se prepararon cortes de diferentes tamaños ( Diferentes pesos) para lograr las siguientes

A 0,0005, 0.005, 0.05, 0.1, ‘ O. 12, 0.13, en las condiciones Óptimas de experimentación.

METODO: Se tomo un corte de cada tamaño señalado, mas 1 ml de la solución amortiguadora donde se presentó la mayor actividad actividad enzimitica, se adiciono a 1 ml de del filtrado en un tubo de ensayo. Posteriormente se llevo a un baño de temperatura controlada (temperatura optima) durante 90 min.

Se comeron simultáneamente los testigos por triplicado:

Testigos:

manejaron estos tubos bajo las mismas condiciones. 1 trozo de papel filtro en la solución amortiguadora ideal + 1 ml de agua desionizada. Se

Para los dos estudios realizados se (Actividad Exoglucanasas y Endoglucanasas) se cuantificaron las actividades por medio de la liberación de azúcares reductores determinada por el Método del DNS.

i

-DETERMINAClÓN DE AZUCARES REDUCTORES. Método del DNS (Acido 33- Dinitrosalicilico, segun Miller y descrito por Mandels en 1974)

Cuando el ácido 3.5- dinitrosalicilico es reducido en presencia de calor, por los azúcares reductores que se localicen en contacto con el, se desarrolla un cambio de color parecido al café ( con variaciones de amarillo hasta café) El cambio de coloración puede entonces de terminarse por lecturas de Densidad óptica, leidagpor espectrofotometria a una longitud de honda de h = 575 nm.

La concentración de los azúcares reductores totales liberados en la muestra se conoce haciendo una interpolación en la curva patron de glucosa, graficando la Absorbancia contra la Concentración , E n caso de que la absorbancia leída no cumpliera con la ley de Bird (menor a 0.6 nm) se hicieron dilusiones.

La actividad enzimatica final se expresa en UUi .

4

METODO:

Reactivo DNS. + 0.5 g de fenol en 100 ml de agua destilada. Esto se aforó en 250 ml de agua destilada.

2.5 g de ácido 3,5- dinitrosalicílico + 2.5 g de NaOH + O. 125 g de Na2SOj Anhidro,

-a: de 1 d).

0.25g de glucosa disuelta en 250 ml de agua desionizada. (Concentración

co o Tes- 2 ml de agua duionizada + el reactivo DNS.

CURVA PATRON.

TUBOS AGUA DESIONIZADA SOLUClON PATRON CONCENTRACION (d.) (mg./rnl.) (m64

1 2.0 0.0 0.0 2 I .5 0.5 62.5 3 1 .o 1 .o 125.0 4 0.5 1.5 187.5 5 0.0 2.0 250.0

A todos los tubos de la curva, junto con los de las determinaciones enzimáticas, se les adicionó 4 5 ml del reactivo del DNS, se agitó y de llevo a baño María en ebullición durante 5 minutos exactos. Se paro la reacción con agua fria. n

Después de este proceso se leyó en espectrofotometro ajustando a cero con el tubo blanco o testigo.

n n

ETAPAS:

ACTIVIDADES REALIZADAS

Meses

Primero Segundo Tercero Cuarto Quinto Sexto Antcpcoye*o y Conocimiento de Ca~aclerilscibn de Caracicnracib de Caraaenzaeibn de Anillisis de

rscsorlas iknicas. mclodos cclulasas CCIul8.W alulaaar para el resuliados Y wipes (exoglucanasas) (Endoglucanasas) extraclo crudo Interprelaci6n de

enzidtico los mismos y Reporte final

Presentacibn del trabajo en un

congreso nacional

OBJETIVOS Y METAS ALCANZADAS

El objetivo de este estudio fue caracterizar las enzimas celulósicas (Endoglucanasas y Exoglucanasas), producidas por Aspergillus niger que es un hongo filamentoso capaz de degradar celulosa, por medio de un cultivo en fermentación sólida sobre pulpa de café.

RESULTADOS Y CONCLUSIONES

Los resultados obtenidos fueron los siguientes:

La caracterización para las nzimas. Endoglucanasas (ED) que se determino con Carboximetilcelulosa (CMC) como substrato, cuantificando la actividad enzimhtica por la liberación de azucares reductores, y para el caso de las enzimas Exoglucanasas (EX), que para este caso se utilizo papel filtro (PF) como substrato, resulto:

4

CARACTERiZAC16N:

pH optimo

Temperatura optima

Actividad enzlmátlca

Energía de activación

(EXO)

5&0

70° C

2000 Ulll

14 kJlmoi

(ENDO)

4.00

6OoC

700 Uill

68.4 kJlmoi

5 6 7 8 9 4

PH

Tomporntun 6pümo

pH 6ptimo

4 5 6 7 8 9

PH

Temperatura 6ptima

o .L N D - - O O

8 8 0 8 O

o

El análisis de resultados demuestra que las enzimas celulósicas producidas por fermentación solida (sobre pulpa de café), actúan a mayores temperaturas comparándolas con las temperaturas obtenidas en procesos por fermentación sumergida.

A si como también se demostró experimentalmente el comportamiento enzimattco de las enzirnas celulósicas de acuerdo a la establecido en la literatura.

a

4

BIBLIOGRAFIA:

ANTIER Philip, Alfredo Mmjares, Sevastianos Roussos, Gustavo Viniegra-González -

STATE FERMETATION OF COFFE PULP.” Enzyme Microb. Technol, 1993 Vol I5 Marzo. “PECTINASE HYPERPRODUCING MUTANTS OF ASPERGILLUS NIGER C28B25, FOR SOLID- I

BENNETT J W & M A Klich “ASPERGILLUS BIOLOGY AND INDUSTRIAL APPLICATION” Ed Batterworth-Heinemann Estados Unidos

CABELLO Velasco. Silva Ruiz, “ESTUDIO PRELIMINAR SOBRE LAS POSIBILIDADES DE UTILIZACION MICROBIOLOGICA DE LOS RESIDUOS DEL BENEFICIO DEL C A F E , Departamento de Microbiologia Escuela Nacional De Ciencias Biológicas

R

COLOWICK S. & Kapplan N. “ METHODS IN ENZYMOLOGY ” Vol 1 Editorial Academic Press 1955 U.S.A.

DE la Torre Mayra “ MEMORIAS DEL SEMINARIO UTILIZACION DE LOS RECURSOS CELULOSICOS EN LA ALIMENTACION ANIMAL. CINVESTAV- IPN”, Ciudad de México 26 y 27 de Mayo de 1980.

GOKHALE V. D. & U.S. Puntambekar “PRODUCTION OF CELLULOLYTIC ENZYMES B Y MUTANTS OF ASPERGILLUS NIGER NCIM 1207”, India, Enzime Microb. Technol. 1988 Vol. IO Julio.

GOLDMAN Gustavo, P Maria Helena. “ CASSAVA RESIDUES INDUCE HIGH PRODUCTION OF CELLULOLYTIC ENZYMES.” Departamento de Genética. ESALQ USP Piracicaba Saó Paulo. Brasil.

mo HUITRON Carlos, “BIOTECNOLOGIA DE ENZIMAS , UNAM 1983

MANDELO Mary & James Weber. “CELLULACES AND THEIR APPLICATION, (THE PRODUCTION OF CELLULACES)”. Food, Microbiology, Division U.S. Army Natick Laboratories.

MANDELS Mary, Lloyd Hontz. ‘* ENZYMATIC HIDROLYSIS OF WASTE CELLULOSE.” Biotechnology and Bioengineering Vol XVI , Pp. 1471- 1493 . 1974.

MlLSTEIN O. Y. Vered, Sharna. “HEAT AND MICROBIAL TREATMENTS FOR NUTRITIONAL UPGRADING OF WHEAT S T R A W Biotechnology and Bioengineering . Vol. ~.

XXVIII, Pp. 38 1-386. 1986.

NEiLANDS J.B. & Pawlk Stumpf, “PRINCIPIOS DE ENZIMOLOGIA”. Ed. Aguilar, 1976 2’ Edición. m

. ,

.

U 3

GRES0 NACIONAL DE BIOTECNOLOGIA Y BIOINGENIERIA

Mapa, Gro. 10-14 de Septiembre de 1995

U "BIOTECNOLOGIA Y GLOBALIZACION"

maters S.A. de C.V. ;'ksifalia Mexicana S.A. de C.V.

1

FAX

PARA: P. Ortiz A. Institución. L.LM-1

FAX:

DE: Mariano Gutiérrar Rojas Institución: Depto. Biotecnoiogia.

Universidad Autónoma Metropolitana. lztapalapa

FAX: (5) 724.47.12 Teléfono: (5) 724.49.99

Fecha: 17 de julio de 1995 Phginas, incluyendo esta: Una -

Estimado colega:

Ei Comite Científico del VI Congreso Nacional de Biotecnologia y

Bioingenleria, tiene el agrado de comunicar:e que su trabajo

Caracterizacion de celulasas producidas por Asprrgillics niger por fermentacion sdida sobre pulpa de cafe

ha sido ACEPTADO con la clave FERLS C33, para su

pcesentación en forma de CARTEL, usted dispone de un espacio

de 1.22 X 2.44 m para este fin; con la clave asignada. Su trabajo se

mantendra en exposición durante todo el evento y se requiere su

presencia en los horarios y fechas especificadas en el programa

definitivo.

Agradeciendo su participación,

ATE AMENTE "ti.

'sa J!X la ai lprrpo

I NIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA 'IVISION DE CIENCIAS BIOLOGICAS Y DE U SALUD

PA7lAh:FNIV D i BIOTECNOLOGIA

Mexico. D. F., a 18 de No\iernbre de 1996.

DR. .JOSE'LL'IS ARREDONDO FlCl'EROA DlHECTOR DE LA DIVISION DE C.B.S.

P R E S E N T E

Nos permitimos dirigimos a Usted, para hacer de su conocimiento que una vez revisado el servicio social titulado "CARAflERIWCION DE CELUWSAS PRODUCIDAS POR ASPERGILLUS NIGER POR FERMENTACION SOLIDA SOBRE PULPA DE CAFE", realizado por la alumna ORTlZ POLO ARACELI, con matricula 90336788 de la Licenciatura ingeniena Bioquimica Industrial, x ACEF'TA, dado que cumplc con los requisitos del Reglirnento de ScMcio Sochl a nivel Licenciatura.

Sin otro particular por el momento. reciba un cordial saludo.

A T E N T A M E N T E "Cara Abierta 81 Tiempo"

.cp-.< Quim.. os&. la. Barba Chavn &oí. Titular "A" T.C.

Men BRafa W d L o s . Monticl Prof. Titular M.T.

Resúmenes del V I Congreso NUC~OM~ de Biorecno~ogío y Eioingeniená Ixtapa-Om., 10-15 de Septiembre de 1995

PRODUCCION DE INOCULOS DE Pleurotus P0R:CULTIVO SOLIDO, SUMERGIDO Y SUSPENSION

GutiCmz-Cerón M.A.. * Saucedo-Castañeda G., Aquiahuatl-Ramos M.A. y Favela-Torres E. Universidad Autónoma Metropolitana, Depto Biotecnología,

A.P. 55-535. C.P. 09340. México D.F.: Fax (525) 7.24.47.12. r

El cultivo de setas comestibles (fleworus) es un proceso sencillo que requiere de un in6culo en cantidad y calidad constante para mantener una productividad elevada. En este trabajo se evaluaron tres métodos para la producci6n de in6culo: Cultivo sólido (tradicional), sumergido y una suspensi6n de un cultivo superficial. En los trrs casos se usó una cepa de Plcurorus omcurus. Los tres tratamientos fueron usados para inocular granos de sorgo previamente humedecidos. esterilizados y empacados en tubos de vidrio donde fue posible mdir la tasa de crecimiento apical.

La tasa de crecimiento apical fue mayor en el caso de cultivo sumergido (1.08 cmidía), seguida de la ttcnica de suspensión (1.02 cddía ) y finalmente el cultivo sólido (0.91 cmidfa). El tiempo total de invasión del sustrato se redujo en un 30 5ó (5 días) al comparar el cultivo sumergido y el cultivo sólido tradicional. Estos inbculos primarios fueron a su vez empleados para sembrar un inóculo secundario a base de granos de sorgo. En esta eiapa no se observaron diferencias significativas en las tasas de crecimiento entre los tres tipos de inófulos. Sin embargo al comparar la productividad de inócuio producido se encontrararon difuu>ch importantes. Se lorn6 como base de comparación el in6culo producido a partir de una caja de Petri. La mayor productividad fue pan el cultivo sumergido (50.3 kgldía). seguido de la técnica de suspensión (4.3 kg/dfa) y finalmente el cultivo sólido (2.9 kg/dfa).

En este trabajo se presenta evidencia experimental que apoya el uso de técnicas alternativas mas productivas pua la producción dc in6culos de setas comestibles.

$i (-1 CARACTERIZACION DE CELULASAS PRODUCIDAS POR Alprrgills nigcr

POR FERMENTACION SOLIDA SOBRE PULPA DE CAFE

.*, Shchu P. M.. Barba Ch. J. Ma. y Campos M. R. G.

I

Depirtammio de Biotecnología.. D C.B.S. Universidad Autónoma Mdropolitana Unidad Iztapalapa

F u 724 47 23 E-nuil: cuhp@xmum.uam.mx Apdo. Posti1 55-535, C.P. 09340, México, D.F. Tel.. 724 47 11

El objetivo de este estudio hié caracterizar las célulasas endoglucanasa (ED) y exoglucanasa (EX) producidas por Ami//u.s nipcr por fermentación sólida sobre pulpa de café. La actividad de (ED) x dertninb con carbo~imctilcelulosa y la (EX) por papel filtro. determinando las actividades por la liberacion de saicarrs reductores Los resultados obtenidos demostraron.que la actividad promedio de las (ED) hie de 2000 U I L mientras (EX) fué de 700 UVL. Los resultados observados en pH se observa que en donde K tuvieron la myor actividad en (ED) hie pH 5 y en (EX) fué pH 4 Con res to a la temperatura la mayor actividad se obtuvo a 7OOC en ED y 6ooc en (EX). La enec 'a de activación tu C de 14 KJlmol para (ED) y de 68.4 KJlmol para (EX) El extracto crudo enzimático hie 11 ltrado en Millipore ultrafree-PFI de 100.OOO mconirando la

.Cr¡wdad (ED) y (EX) en ambas fracciones. Los resultadosdemuesuanque las enzimas producidas en fkfmenticibn d i d a actuan a mayores temperaturas que las reportadas en fermentacion sumergida

a

QI

Cto aM8bltrtc d t h l 0

UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA DIVISION DE CIENCIAS BIOLOGICAS Y DE LA SALUD DR TOMAS MORATO CARTAGENA SECRETARIO ACADEMIC0

A QUIEN CORRESPONDA:

Por medio de la pnsente se hace co~lstar que el (la): ', .,Qtosé 8 h n a A ; m . . .

del Depanammto de: BIOTECNOLOGfA de la Divisi611 de Ciencias Biol6gicas y de la Salud, asesor6 el siguiente Servicio Social:

TITULO: FERMENTACI6N SÓLIDA SOBRE PULPA DE CAFb

ALUMNO: OR& POLO ARACELI

CARACTERIZACI6N DE CELULASAS PRODUCIDAS POR Aspergillus niger POR

MATRICULA: 90336m

LlCENCiATURA : MGFNlEldA BIOQUhICA INDUSTRIAL

PERIODO: MAYO 3.19% ANOVIEMBRE 18,19%

Se extiende la presente para los Rnes que al intcrrsado movsigan, en la Ciudad de Mtxim. D.P. a lar dia dias de Diciembre de mil novecientos novata y sois

Atentamente,

0

UNIDAD IZTAPAUPA

Av. Michoacán y Is Purisima. Col. Vlcenüna, D.F. 09340 Tel. (5) 724 46 79, Fax (5)612 80 83