UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR

FACULTAD DE CIENCIAS QUMICAS

CARRERA DE QUMICA DE ALIMENTOS

AISLAMIENTO, SELECCIN Y CONSERVACIN DE LOS MEJORES MICROORGANISMOS, AISLADOS DEL MOSTO DE VINO DE ARAZ (Eugenia stipitata)Plan de Tesis para optar por el Ttulo Profesional de

QUMICO DE ALIMENTOS

Autor: Mara Gabriela Salazar Martnez

Tutor: Dra. Blanca E. Bravo

QUITO, 16 de Enero del 2011UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR

FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS

ESCUELA DE QUIMICA

CONSTANCIA DE APROBACIN DEL TUTORPor la presente, dejo constancia que he ledo el Plan de Tesis presentado por la Seorita Salazar Martnez Mara Gabriela, para optar por el ttulo profesional de Qumico de Alimentos cuyo tema es: AISLAMIENTO, SELECCIN Y CONSERVACIN DE LOS MEJORES MICROORGANISMOS, AISLADOS DEL MOSTO DE VINO DE ARAZ (Eugenia stipitata), el mismo que rene los requerimientos y los mritos suficientes para ser sometido a evaluacin por el Tribunal Calificador.

En la ciudad de Quito, a los _______das del mes de ______ de _________------------------------------------------------

Blanca E. Bravo

LUGAR DONDE SE REALIZAR LA TESIS

El presente tema de tesis se realizar en el Laboratorio de Microbiologa, en la Universidad Central del Ecuador, Facultad de Ciencias Qumicas. En la ciudad de Quito.

NDICE DE CONTENIDOS

11.1.PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

21.2.FORMULACIN DEL PROBLEMA

21.3.OBJETIVOS

22.1OBJETIVO GENERAL

22.2OBJETIVOS ESPECFICOS

31.4.JUSTIFICACIN e IMPORTANCIA DE LA INVESTIGACIN

52.MARCO TERICO

52.3ANTECEDENTES

62.4GENERALIDADES

7Tabla 1 CARACTERIZACIN FSICO-QUMICA DEL FRUTO DE ARAZ EN ESTADO MADURO

72.5Proceso de Fermentacin

92.6Las Rutas Bioqumicas de la Fermentacin

102.7Fermentacin

112.8MICROORGANISMOS IMPLICADOS

142.9FERMENTACIN ALCOHLICA

162.7Clasificacin de las levaduras

182.7.1Aplicaciones nutricionales de las levaduras

202.8HIPTESIS DE TRABAJO

202.8.2VARIABLES DE LA INVESTIGACIN

202.8.3DEFINICIN DE VARIABLES

223.MARCO METODOLGICO

243.4CINTICA DE LAS CEPAS SELECCIONADAS

264.Marco Administrativo

264.1Recursos

264.1Presupuesto

274.2Cronograma de actividades

15.BIBLIOGRAFA

CAPITULO I1.1. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

La produccin de vinos en nuestro pas se encuentra todava en desarrollo. Esto se debe principalmente a que en el Ecuador no se cultivaba uvas para la elaboracin de vinos. En el siglo XVI el cultivo de uvas se prohibi por parte de un decreto real de la Corona espaola a pesar de que en Chile y Argentina no se prohibi (Rev. Vistazo, 2006).

En Ecuador no hay datos oficiales sobre la produccin de vino de mora, sin embargo existen investigaciones principalmente de Universidades, para desarrollar la tecnologa en la elaboracin de vino de mora y una produccin artesanal de vinos en provincias como Tungurahua y Cotopaxi.

El Araz, es una fruta con gran aceptacin tanto para su consumo en fresco por su exquisito sabor, aroma y atractivo color; as como, por la facilidad para su industrializacin como materia prima para la preparacin de: dulces, mermeladas, jugos, helados, entre otros productos.

En nuestro pas existe una deficiencia en la post-cosecha y cadena de fro, lo cual nos lleva a buscar alternativas tecnolgicas para conservar la fruta (Carrera Molina, 1999).

Para elaborar vino de araz en el Ecuador no se ha encontrado informacin sobre la utilizacin de cepas nativas como cultivos iniciadores en la fermentacin de Araz. Para este objetivo utilizan cepas comerciales de Saccharomyces cerevisiae, microorganismo aislado comnmente de las diferentes variedades de uva.

En este contexto no se obtiene los rendimientos y dems caractersticas sensoriales, como color, sabor, aroma y textura bucal propias, mientras que si utilizamos una cepa nativa la misma se encuentra adaptada a las condiciones del mosto y al mismo tiempo le da caractersticas sensoriales especiales, por el hecho de que son aisladas directamente del proceso de fermentacin natural de la mora. Tambin da uniformidad en la calidad de los vinos. 1.2. FORMULACIN DEL PROBLEMA

En nuestro pas, hay una baja produccin de vino de uva y de frutas como Araz y en el proceso de vinificacin no se utilizan levaduras nativas seleccionadas, produciendo prdidas de calidad sensoriales y bajos rendimientos.

1.3. OBJETIVOS

2.1 OBJETIVO GENERAL

Aislar, seleccionar, conservar y realizar un estudio cintico de los mejores microorganismos, aislados del mosto de vino Araz (Eugenia stipitata), cultivada en sectores de las provincias de Tungurahua y Cotopaxi, para estudios preliminares de vinificacin. 2.2 OBJETIVOS ESPECFICOS Elaboracin del mosto de la fruta Araz.

Aislar las mejores cepas fermentadoras del Araz, en la segunda y tercera etapa de fermentacin.

Seleccionar las mejores cepas con criterio y/o pruebas de rendimiento y capacidad de adaptacin.

Caracterizar los microorganismos por gnero y especie.

Preservar las cepas seleccionadas (mtodos que preserven las caractersticas genticas).

Realizar estudios cinticos en funcin de: produccin de biomasa (X), produccin de producto (P) y consumo de sustrato (S).

1.4. JUSTIFICACIN e IMPORTANCIA DE LA INVESTIGACINEn el Ecuador, la importacin de vinos se ha convertido en un negocio rentable. Ahora existen ms de 29 bodegas que distribuyen los mejores vinos del mundo en todo el pas, provenientes de Chile, Argentina, Espaa, Alemania, entre otros (Diario HOY, 2008).El Banco Central del Ecuador registr en el primer trimestre del 2007 que la importacin de vino alcanz los $ 3.510 millones. En 2006, el pas import cerca de $ 2.700 millones y en 2005, la importacin estuvo alrededor de los $ 2.600 millones.

En el pas no existe una cultura vincola, la cual se perdi hace muchos aos desde la prohibicin por parte de la Corona espaola de cultivar viedos. Solamente se conoce de pequeos productores que producen vinos considerados de boutique (no solo por su calidad sino por el nmero limitado de botellas ofertadas). Segn datos de la CORPEI, Csmica Ca. Ltda., es la nica empresa reconocida que exporta vinos, a pesar de que los mostos para la fabricacin del vino no son ecuatorianos. Segn dice su gerente En el Ecuador no hay ni en cantidad ni en calidad la uva para producir vinos, por ello importa en forma de mosto concentrado desde los pases productores: Argentina, Chile, Italia y Espaa, ("EL MERCURIO", 2008).

De acuerdo a los datos del Ministerio de Agricultura, al ao 2005 en el Ecuador el cultivo de Araz alcanza las 2.197 hectreas, siendo la provincia de Esmeraldas la ms importante, con 1.195 Ha., que corresponden al 54,39%; en segundo lugar est Santo Domingo con 400 Ha., del total de la superficie cultivada en el Ecuador.

Lo que nos indica que en nuestro pas existe Araz en suficiente cantidad para la fabricacin de vino. Dado el delicado manejo pos-cosecha del Araz, y las grandes deficiencias que en este campo existen se lleva a cabo investigaciones, las cuales muestra una interesante alternativa tecnolgica para el aprovechamiento de la fruta. Consientes de las limitaciones en la cadena de fro que tiene Ecuador para los productos agrcolas perecederos se puede aplicar procesos fermentativos como mtodo de transformacin y conservacin de la fruta (Carrera Molina, 1999).

Con la necesidad de desarrollar tecnologas de produccin de vino de araz nacen otros problemas. Uno de ellos es contar con cepas apropiadas para la fermentacin.

En nuestro pas no se ha encontrado industrias o laboratorios destinados a la produccin de starter para la fermentacin vnica y peor an starter de levaduras aisladas propias de las zonas de cultivo de araz y produccin de vino. Todas las fbricas productoras de vino de cualquier fruta utilizan starter comercial que se importan de diferentes pases principalmente europeos, pero que no se encuentran adaptadas a las condiciones de fermentacin del Araz.

El vino de Araz es muy apetecido, por razones especiales como el color suave, no es turbio y el aroma es impresionante. Hay semi dulce y dulce. En nuestro pas se importan esta clase de vinos ya que no se producen. Por lo que estn las puertas abiertas para el desarrollo de este producto.

CAPITULO II2. MARCO TERICO

2.3 ANTECEDENTESEn las regiones de clima clido hmedo existe una enorme variedad de especies frutcolas tropicales nativas de gran potencial que, si se explotan racionalmente, podran contribuir al desarrollo local. Entre estas frutas regionales, se encuentra el araz (Eugenia stipitata) que despierta cierto inters por las cualidades organolpticas del fruto y por el ndice de produccin de la planta.

El araz es una especie que se adapta a suelos de baja fertilidad, as como a las variaciones climticas de la regin Su fruto suculento posee un aroma y sabor agradable, el mismo que puede ser consumido en jugos, dulces, nctares, jaleas, licores, yogurt, etc.

La planta produce su fruto durante el ao entero y dependiendo del manejo de la plantacin, existe problemas en la post cosecha por la abundante produccin y suele existir desperdicio. Siendo una fruta altamente perecible; y principalmente debido a sus caractersticas organolpticas especiales se percibe la posibilidad de generar una alternativa tecnolgica para el aprovechamiento de la fruta y uno de ellos es aplicar procesos fermentativos como mtodo de transformacin y conservacin de la fruta.

En investigaciones recientes sobre el anlisis de la actividad de levaduras y la utilizacin de sustratos de jugos de frutas tropicales como la pia, mango y papaya, se encontr un alto grado de adaptabilidad de las levaduras en estos sustratos, la pia fue la fruta que mejores resultados dio para la elaboracin de vinos de fruta tropical, para el mango y papaya se debe aumentar la cantidad de azcar.

2.4 GENERALIDADESFruta originaria de la Cuenca Amaznica Occidental. Domesticada y consumida inicialmente por los pueblos indgenas. El Araz es una de las frutales cuyos registros se remontan a los principios de la fruticultura amaznica. Siendo identificado en el principio como un ambientador natural, por su delicioso aroma algunos locales se abstenan de consumir y solo lo utilizaban para aromatizar los ambientes.

Se desarrolla en zonas con temperaturas medias de 18 a 30C, con precipitaciones que van desde los 1.500 a 4.000 mm/ao y una altitud variable desde el nivel del mar hasta los 650 msnm. Se adapta en suelos con alta saturacin de aluminio y bajos niveles de fertilidad, con un pH de 4,5 a 5,5.El fruto de araz posee un alto contenido de humedad, alrededor del 90%, lo que contribuye al incremento de la tasa respiratoria e incide directamente en la alta perecibilidad. Los contenidos proteicos resultan moderadamente altos y pueden estar asociados a una alta tasa metablica, con un importante nivel de actividad enzimtica.

Por otra parte, la fibra cruda constituye un interesante aporte a la dieta bsica. El araz aporta una moderada cantidad de cido ascrbico, entre otras vitaminas, favoreciendo de esta forma la seguridad alimentaria en la regin amaznica, ya que de otra manera el consumo de vitaminas provendra siempre de frutos importados a la regin.

Tabla 1 CARACTERIZACIN FSICO-QUMICA DEL FRUTO DE ARAZ EN ESTADO MADURO

2.5 Proceso de Fermentacin Los procesos fermentativos o fermentaciones han sido utilizados por el hombre desde hace ocho mil aos, a pesar de que no se conoca la existencia de la influencia de los microorganismos en esos procesos.

La palabra fermentacin proviene de una adaptacin de la palabra en latn fermentare, que significa ebullir; se utiliz ya que se asemejaba a la ebullicin aparente que se observ en la fabricacin de vino, a causa de la produccin de dixido de carbono, gas que se libera en forma de burbujas y provoca el movimiento del lquido. (Hernndez, 2003).

El concepto de fermentacin ha sido modificado con el tiempo, y actualmente, abarca una gran cantidad de procesos y productos diversos: el trmino se aplica a procesos muy simples como a los que se desarrollan a escala industrial.

Desde el punto de vista bioqumico, fermentacin se define como el proceso por el cual las sustancias orgnicas (sustrato), sufren una serie de cambios qumicos (reducciones y oxidaciones), que producen energa: al final de la fermentacin se produce una serie de productos, unos ms reducidos (donadores de electrones) y otros ms oxidados (aceptores de electrones) que el sustrato, con un balance total de energa positivo. Esta energa ser utilizada en el metabolismo del microorganismo.

Cuando el aceptor final de electrones es el oxgeno molecular y no es una sustancia orgnica, el proceso se llama respiracin. A continuacin se incluyen dos ejemplos de fermentaciones, desde el punto de vista bioqumico.

La produccin de etanol y dixido de carbono, a partir de la glucosa:

C6H12O6 C2H5OH + CO2 + H2OGlucosa Etanol Dixido de Agua

Carbono

(Ecuacion 1) La produccin de lactato, a partir de glucosa:

C6H12O6 C3H5O3 + H2OGlucosa Lactato Agua

( Ecuacion 2)Desde el punto de vista microbiolgico la fermentacin es un proceso en el que los microorganismos producen metabolitos o biomasa, a partir de la utilizacin de sustancias orgnicas, en presencia o no del oxgeno. La descomposicin de los sustratos es llevada a cabo por enzimas producidas por los microorganismos para tal finalidad.

Para la microbiologa industrial no hay diferencia entre fermentacin y respiracin, ya que en ambos casos el microorganismo hidroliza los compuestos orgnicos, ya sea en presencia o ausencia del oxgeno. Por lo que la fermentacin abarca los procesos donde interviene microorganismos.

Un proceso de fermentacin, visto como un todo est compuesto de tres etapas:

La preparacin de inoculo.

La seleccin del medio de cultivo.

La produccin de biomasa o de los metabolitos de inters.

2.6 Las Rutas Bioqumicas de la FermentacinEs de gran importancia conocer las rutas bioqumicas de degradacin de los compuestos orgnicos, no solo para determinar cules son los productos que se obtendrn en una fermentacin, sino las posibilidades de manipular el proceso para producir otro tipo de sustancias. Existe varias rutas o secuencias bioqumicas de utilizacin y conversin de los azcares, sin embargo dos de ellas son consideradas de mayor relevancia desde el punto de vista industrial.

2.6.1 La gluclisis

Una fermentacin es una reaccin de xido-reduccin interna equilibrada en la que algunos tomos de la fuente de energa (donador de electrones) se reduce, mientras que otra de oxidan, y la energa se produce por fosforilacin a nivel sustrato. (Brock, 2002).

Una ruta bioqumica muy usada es la gluclisis, tambin denominada va de Embden-Meyerhof. La gluclisis se puede dividir en tres etapas principales, cada una de las cuales comprende una serie de reacciones individuales catalizadas enzimticamente.La primera etapa no implica ninguna oxidacin ni reduccin, en esta se produce una transformacin de la glucosa hasta dos molculas de gliceraldehido-3-fosfato, no se genera energa ms bien se gasta dos molcula de ATP.

En la siguiente etapa se produce una reaccin redox que hace que el gliceraldehiso-3-fosfato, forme piruvato generando energa en forma de ATP por fosforilacin a nivel sustrato. En este momento el balance general de energa es de dos ATP,

Las siguiente etapa ocurre otra reaccin redox y se originan productos de fermentacin (por ejemplo, CO2 y etanol o acido lctico).

2.7 Fermentacin

Es un proceso catablico de oxidacin incompleta totalmente anaerbico, siendo el producto final un compuesto orgnico. Estos productos finales son los que caracterizan los diversos tipos de fermentaciones.

En la fermentacin el proceso redox ocurre en ausencia de aceptores finales de electrones. La oxidacin es acoplada a la reduccin de un compuesto que se genera a partir del propio sustrato inicial; por tanto, no implica la intervencin de ningn aceptor externo de electrones.

En la fermentacin, el ATP se produce mediante fosforilacin a nivel sustrato, en el que el ATP se forma durante los pasos de catabolismo de un compuesto orgnico (Grfico 1). El balance neto de ATP, en comparacin con la respiracin es bajo por lo que se generan gran cantidad de productos de desecho para as obtener la energa requerida.

Para el organismo, el producto importante es el ATP, que se usa en multitud de reacciones que se requieren energa, y los productos de fermentacin son solo productos de desecho. Sin embargo, estos ltimos no son considerados de desecho para los destiladores, cerveceros, productos de derivados lcteos o panaderos, sino un medio de obtener productos naturales para consumo humano. (Brock, 2002).

Grafico 1 Ruta de Embden-Meyerhof-Parnas (gluclisis)

ELABORADO POR: Mara de Lourdes Escamilla Hurtado, Frida malpica Snchez, Alberto Reyes Dorantes y Jos Ramn Verde Calvo. Depto. Biotecnologa. Div. Ciencias Biolgicas y de la Salud. Unidad Iztapalapa. Universidad Autnoma Metropolitana.

2.8 MICROORGANISMOS IMPLICADOS En los primeros das de fermentacin, los gneros mayoritarios son:

Hanseniasporal Kloeckera, Candida y en menor medida Hansenula, Pichia, Rhodotorula, Metschnikowia (Querol et al., 1990; Longo et al., 1991; Fleet y Heard, 1993; Schtz y Gafner, 1994). Despus de estos 2 o 3 primeros das, estos gneros reducen su nmero, dando paso al crecimiento de otras especies ms tolerantes al etanol como son las de Saccharomyces. De hecho, S. cerevisiae es considerada la principal especie responsable de las fermentaciones alcohlicas (Ribreau-Gayon, 1985).

De todas maneras, algunos estudios realizados (Fleet et al., 1984; Heard y Fleet, 1986) han mostrado que algunas especies de no-Saccharomyces (especialmente Kloeckera apiculata, Candida stellata y Candida colliculosa) tambin contribuyen a la fermentacin, ya que estas especies sobreviven ms de lo que se pensaba inicialmente, pudiendo alcanzar poblaciones mximas de 106-107 ufc/ml. Por tanto, este crecimiento es cuantitativamente significativo y seguramente influenciar la composicin organolptica del vino. Adems, las modificaciones que produzcan stas en la composicin del mosto tendrn un efecto en la cintica de la fermentacin y comportamiento bioqumico de Saccharomyces.

En la actualidad existe una tendencia a realizar fermentaciones controladas, empleando levaduras seleccionadas para mejorar la calidad de los vinos y evitar, de esta forma, variaciones debidas al crecimiento de microorganismos silvestres no deseables (Delfini y Bardi, 1990; Giudizi y Zambonelli, 1992; Melero, 1992; Surez, 1990).

Para este fin, a pesar de la existencia de levaduras seleccionadas comerciales, es preferible el empleo de levaduras autctonas seleccionadas. (Surez e Iigo, 1990; Melero, 1992). A modo de ejemplo citare a Regodn Mateos y col. (1996) que, seleccionando 12 cepas de Saccharomyces cerevisiae procedentes de mostos y vinos extremeos y tras realizar vinificaciones experimentales con las mismas y un anlisis de los vinos concluyen que la mayora de las cepas seleccionadas produjeron vinos ms apreciados que los realizados mediante levaduras comerciales estudiadas.

Mediante el prensado de la uva para la obtencin del mosto, las levaduras van a pasar al mismo inicindose de esta forma el proceso transformador de mosto en vino.

Este es un proceso dinmico, de forma que al comienzo de la fermentacin van a ser numerosas las diferentes especies de levaduras presentes en el mosto, para a lo largo del proceso ir disminuyendo el nmero de las mismas hasta llegar, en la fase post-fermentativa a predominar una/s especie/s.

La evolucin que se produce en la flora blastomictica es debida a cambios en el medio de desarrollo (Ruiz y col., 1986).

Los aislamientos que se realizan para llevar a cabo la identificacin de la flora levaduriforme de un mosto determinado se han de efectuar en tres momentos muy bien definidos del proceso fermentativo:

En la primera fase el elevado nmero de especies presentes en el medio van a desarrollarse de forma activa al tiempo que mediante este desarrollo inician la fermentacin. El primero de los aislamientos mencionados, se efecta durante este Periodo de induccin o Fase I, cuando el desprendimiento de anhdrido carbnico no es perceptible. En este momento, las condiciones del medio prcticamente no se modifican para una serie de parmetros tales como el pH y los nutrientes. Sin embargo, y de una forma muy rpida, la concentracin de oxgeno en el mosto disminuye a causa del consumo celular.

El medio anaerobio inhibe el crecimiento de las especies oxidativas, favorecindose por el contrario el de las especies de menor poder fermentativo. Dentro de estas no es raro obtener aislamientos de Kloeckera apiculata, Torulopsis stellata y K. veronae. Como especie de alto poder fermentativo ms representativa que se asla de forma habitual tambin en esta fase cabe destacar a Sacch. cerevisiae.

Un segundo anlisis del mosto, del contenido levaduriforme de ste, se realiza cuando se encuentra en Fermentacin tumultuosa (Fase II) y el desprendimiento de CO2 es mximo. En este momento la temperatura del mosto crece de forma considerable, y la velocidad fermentativa es mxima.

En esta fase puede que no se encuentre un predominio claro entre las especies de alto y bajo poder fermentativo. Sin embargo, ya a este nivel si se origina una importante disminucin de la diversidad de especies que permanecen viables en el mosto.

Generalmente, aparecen en este momento especies de poder fermentativo intermedio del tipo Sacch. rosei, Sacch. uvarum y K. veronae. De idntica forma que en la primera fase, la especie de alto poder fermentativo predominante es Sacch. cerevisiae. El desarrollo del proceso fermentativo hace que la concentracin de alcohol vaya incrementndose. Este aumento del grado alcohlico origina una disminucin de la multiplicacin celular y suprime las levaduras poco tolerantes al mismo (Snchez Infante y col., 1985).

Finalmente un tercer aislamiento se realiza en la fase post fermentacin tumultuosa que se corresponde con el descenso en la intensidad fermentativa (Fermentacin lenta o Fase III). La fermentacin se hace lenta, y una patente disminucin en el desprendimiento de CO2 nos indica el inicio de esta tercera fase. En este momento, la concentracin de etanol suele ser muy elevada, los nutrientes escasos y el pH bastante bajo.

En estas condiciones el nmero de especies que son capaces de sobrevivir en el mosto-vino es mnimo, no resultando extrao que las especies aisladas en esta fase se reduzcan a una sola especie predominante, generalmente Saccharomyces cerevisiae, quien finalmente es la responsable de terminar la fermentacin.

2.9 FERMENTACIN ALCOHLICA

La fermentacin alcohlica es la base de la vinificacin, sin embargo su importancia no radica nicamente en la obtencin de etanol a partir de los azcares de la fruta, sino adems durante el proceso fermentativo se van formando una gran cantidad de productos secundarios que influyen en la calidad y tipicidad del vino.2.9.1 CONDICIONES NECESARIAS PARA LA FERMENTACIN ALCOHLICA 2.9.1.1 Temperatura

Es un factor preponderante para la vida de las levaduras, las temperaturas mximas y mnimas dependern de la especie de levadura que se use, si es resistente o no y cul es la temperatura ptima para su desarrollo.

Tambin se deber manejar la temperatura dependiendo del vino que se quiera obtener. El mosto debe fermentar de forma controlada, es decir, con lentitud (hasta 21 das) y en ambientes frescos (12-14 C para vinos blancos y 20 a 24 C para vinos tintos). (Belitz, 1997).

La temperatura crtica de la fermentacin es el grado por encima del cual las levaduras ya no se reproducen y acaban muriendo, lentificando y deteniendo la fermentacin. Es muy difcil decir cul es el lmite exacto, sin embargo, es posible indicar una zona peligrosa que depende de la aireacin, la riqueza del mosto, los factores nutritivos de las levaduras y la naturaleza de las mismas. En regiones templadas, la temperatura crtica se fija, generalmente, por encima de los 32 C; en regiones ms clidas puede ser un poco ms alta. Esto no significa que cuando un depsito alcance estas temperaturas su fermentacin se vea ya comprometida y que forzosamente deba detenerse, pero si indica que hay peligro de detencin y que hay que intervenir a tiempo para evitar ese peligro.

2.9.1.2 Aireacin

Las levaduras necesitan oxgeno para multiplicarse. En ausencia completa de aire, en un mosto, se producen slo algunas generaciones y su reproduccin se detiene. La vinificacin se conduce, normalmente, al abrigo del aire y el oxgeno es entonces el factor que limita la multiplicacin de las levaduras. La rapidez del arranque de la fermentacin depende de las condiciones de aireacin. Generalmente con los trabajos previos a la fermentacin (estrujado, despalillado, bombeo, etc.) se asegura una primera aireacin til para el arranque. La aireacin se realiza bien por contacto continuo con el aire, por la operacin de remontado. Para evitar el cese de la fermentacin por asfixia de las levaduras se necesita airear cuando se opera en depsito cerrado y ms cuanto mayor sea el contenido de azcar de la vendimia.

2.6.1.3 Influencia de la acidez

Las levaduras hacen fermentar mejor los azcares en un medio neutro o poco cido. Cuando una fermentacin se detiene no se debe a una falta de acidez, sino a un exceso de temperatura que asfixia las levaduras. Sin embargo, una acidez dbil puede convertir en muy graves las consecuencias de esa detencin, pues las bacterias de enfermedades se desarrollan ms fcilmente cuanto mayor es el pH. La acidez debe ser tal que no favorezca el desarrollo de las levaduras, pero que perjudique a las bacterias peligrosas en caso de cese de la fermentacin.

2.9.1.3 Necesidades nutritivas

A las levaduras les es totalmente necesario encontrar ciertos alimentos en el mosto donde se desarrollan. Sus necesidades de azcar y minerales son fcilmente satisfechas, pero los mostos estn peor provistos de sustancias nitrogenadas asimilables.Las levaduras de vinificacin estn constituidas por un 25 a un 60% de sustancias nitrogenadas. Por lo que para desarrollarse y multiplicarse necesitan encontrar en el medio en que viven suficiente nitrgeno asimilable.

El nitrgeno amoniacal (catin amonio) es el primer alimento nitrogenado consumido por las levaduras, le siguen ciertos aminocidos libres, como el cido glutmico.

En treinta y seis horas de fermentacin, las levaduras agotan literalmente el nitrgeno asimilable del mosto, as como tambin otros factores nutritivos. La vendimia puede ya de por s ser pobre en nitrgeno asimilable, debido a una excesiva maduracin o un ndice elevado de podredumbre, que agota los elementos nitrogenados.

La adicin de nitrgeno amoniacal en forma de sal de amonio es indispensable en algunos casos y nunca est contraindicado, ya que si las levaduras se benefician, las bacterias no la utilizan. Aadiendo a una vendimia de 10 a 20 gramos de fosfato amnico por hectolitro, casi siempre aumentan las colonias de las levaduras y se acelera la fermentacin. En los mostos ricos (vinos licorosos o similares), esta adicin permite que la fermentacin alcance un grado de alcohol ms elevado.

Si se decide enriquecer la cosecha con nitrgeno amoniacal, la adicin debe hacerse preferentemente al iniciarse la fermentacin. El nitrgeno adicionado de este modo es ntegramente consumido por las levaduras. Son indispensables una disolucin previa y una buena mezcla. Si se efecta la adicin al segundo da de fermentacin, las levaduras slo utilizan dos tercios, despus de cuatro das, slo la mitad, y hacia el trmino de la fermentacin, apenas un tercio. Si se agrega para reavivar una fermentacin perezosa o para reactivar una fermentacin detenida, la adicin debe ser pequea, no sobrepasando los 10 g por hectolitro. 2.6 Clasificacin de las levaduras

Desde un punto de vista taxonmico, es un grupo de microorganismos muy heterogneo, que ya en 1984 comprenda 60 gneros y unas 500 especies (Kreger-Van Rij, 1984), y que en la ltima revisin engloba 100 gneros que contienen alrededor de 700 especies (Kurtzman y col., 1998).

Grafico 2 Clasificacin de las levaduras segn Bernett y col. (1990).

ELABORADO POR: Francisco Martin-Lagos Lpez

Grafico 3 Principales especies de levaduras as como algunos de sus sinnimos ms importantes.

ELABORADO POR: Francisco Martin-Lagos Lpez2.6.1 Aplicaciones nutricionales de las levaduras

Las levaduras son objeto de un creciente inters en el campo de los alimentos por su aportacin en el aspecto nutritivo y aromtico (Dziezak, 1987). Las levaduras pueden emplearse en numerosos procesos industriales tales como la produccin de bebidas alcohlicas y varios productos relacionados con el metabolismo de estas. La ltima clasificacin comprenda enzimas, vitaminas, polisacridos capsulares, carotenoides, alcoholes polihdricos, lpidos glucolpidos, cido ctrico, etanol, dixido de carbono y finalmente, compuestos sintetizados por introduccin de DNA recombinante en las levaduras. Algunos de estos productos se obtienen con fines comerciales mientras que otros presentan un valor biotecnolgico potencialmente interesante.

Como se observa, las fermentaciones producidas por levaduras intervienen en la elaboracin de alimentos como el pan, la cerveza, los diferentes tipos de vino, el vinagre, los diferentes tipos de quesos de maduracin externa, cultivndose tambin para obtener enzimas y otros tipos de alimentos. En un extremo opuesto, las levaduras son perjudiciales cuando producen la alteracin de los zumos de frutas, de los jarabes, de las melazas, de la miel, las carnes, vino, cerveza y otros muchos alimentos.

En los procesos fermentativos que se basan en la utilizacin de las levaduras se utiliza principalmente tres especies: Saccharomyces cerevisiae (cervecera, vinificacin, destilera y panificacin), tambin las levaduras del gnero Dekkera (forma imperfecta: Brettanomyces) se utilizan en algunos pases para la produccin de cerveza rubia, Candida utilis y Kluyveromyces fragilis (Levadura-alimento). En la vinificacin se emplean muchas otras especies. (ICMSF, 1983).Tabla Error! No hay texto con el estilo especificado en el documento. Utilizacin presente y potencial de las levadurasAplicacinLevaduras

Fermentacin de la cervezaSaccharomyces cerevisiae

PanS. cervisiae, Saccharomyces exigius,Saccharomyces rosei

D-arabitolCandida diddensiae

EmulsificanteCandida lipolytica

Fermentacin del etanolS. cerevisiae

Alimentacin de peces y pollosPhaffia rhodozyma

Fermentacin de leche y lactosaCandida pseudotropicalis, Kluyveromyces fragilisKluyveromyces lactis

Fermentacin de cerveza LagerSaccharomyces carlsbergensis (=S. Pastorianus)

Manitol (humectante)Torulopsis mannitofaciens

Shoyu, MisoZygosaccharomyces rouxii

Fermentacin del vinoS. cerevisiae

Xilitol (edulcorante )torulopsis candida

Fermenctacion de la D-XilosaCandida shehatae, Pachysolen tannophilus, Pichia stripitis, Pichia segobiensis

ELABORADO POR: Francisco Martin-Lagos Lpez2.7 HIPTESIS DE TRABAJO

Las mejores levaduras aisladas y seleccionadas de la fermentacin natural del mosto de raza producirn vino con caractersticas sensoriales especiales y altos rendimientos?

2.8.2 VARIABLES DE LA INVESTIGACIN

Variable independiente: Mtodos de aislamiento, seleccin y cintica de microorganismos para la vinificacin.

Variable dependiente:

Mejores cepas fermentadoras del mosto de raza

2.8.3 DEFINICIN DE VARIABLESVARIABLES INDEPENDIENTES

Aislamiento por enriquecimiento selectivo

Procedimiento por el cual se aslan levaduras, empleando un medio selectivo. El enriquecimiento se realiza en el mismo mosto y el aislamiento en un medio selectivo (YPD), en el cual la composicin del medio permite el crecimiento de levaduras, mientras que las bacterias son inhibidas por el pH 3,5-5 (Stanier, 1996).

Seleccin de levaduras

Criterios con los cuales se seleccionan, de acuerdo a caractersticas deseadas que deben tener las levaduras para ser usadas como starter para vinos.

Resistencia al SO2.- Prueba que se somete al microorganismo para ver su resistencia a concentracin de SO2, que se emplea en la vinificacin ya que evita la oxidacin de mostos y vinos, no permite que se produzcan fermentaciones salvajes, inhibe las bacterias lcticas (Belitz, 2002).Resistencia al etanol.- Prueba para ver la tolerancia del microorganismo frente al etanol que se genera en la fermentacin de los azcares del mosto. La resistencia al etanol permite que se siga fermentando el sustrato, a pesar del efecto inhibidor del etanol en el medio. Cintica de las levaduras

Parmetros cinticos que permiten seleccionar las mejores cepas

Velocidad especfica de crecimiento ().- Esta referidas a la concentracin de biomasa (X), presente en un instante dado y es obtenida de la pendiente de la curva ln X vs t, durante la fase exponencial. Yx/s: biomasa producida expresado en g/l ((x) correspondiente a la utilizacin de una determinada cantidad de sustrato ((s) expresada en g/l en el que slo se tienen en cuenta los valores finales e iniciales de biomasa y sustrato.

Yp/s: Gramo de producto formado por gramo de sustrato consumido (Acevedo, 2002).VARIABLE DEPENDIENTE.-

Mejores cepas fermentadoras del mosto de mora de Castilla.

Mejores cepas de levaduras obtenidas despus de haber utilizado los parmetros de seleccin y cinticos. Las mismas que estn adaptadas al mosto del cual fueron aisladas; y servirn como starter para la vinificacin del mosto de raza.

CAPITULO III3. MARCO METODOLGICO

3.1 TIPO DE INVESTIGACIN

Se aplicar una investigacin experimental en donde se manipulan y se controlan las variables con el fin de observar resultados sin que otros factores intervengan (Grajales, 2000).3.2 MUESTREO

3.2.1 TIPO DE MUESTREO

No probabilstico, de tipo seleccin intencional o de juicio.MUESTREO INTENCIONAL O DE JUICIOEl araz con la cual se realizar el proceso de aislamiento deber reunir las siguientes caractersticas:

Segn una escala de color establecido que muestra el grado de maduracin, el tipo de fruto a muestrear deber ser 5.

Se tomar las muestras de cultivos de Araz donde se usen la menor cantidad de productos qumicos para el control de plagas, ya que estos qumicos pueden inhibir a la flora que tiene el fruto. TRANSPORTE DE LAS MUESTRAS Se obtendr de los sitios de cultivo para que sufra la menor cantidad de manipulaciones o procesos de desinfeccin.

La transportacin se realizar de manera que no tenga contacto con el medio exterior para evitar contaminaciones.

3.3 MTODOS Y TCNICAS ESPECFICAS DE ANLISIS 3.3.1 AISLAMIENTO3.3.2 MTODO DE ENRIQUECIMIENTO

El mtodo de enriquecimiento a usarse consiste en realizar la fermentacin natural del mosto de Araz, en el mismo que se desarrollan todos los microorganismos que intervienen en la fermentacin espontanea.

Para esto se preparar el mosto de acuerdo a los antecedentes de investigaciones realizadas estas son: mosto con relacin 2:1 (agua: raza ), 23 Brix, 150 ppm de NH4SO4 (complemento nutricional) y se realizara en recipientes adecuados con salida de CO2 (Ortiz, 2005).

3.3.3 TCNICA DE AISLAMIENTO CON UN MEDIO ALTAMENTE SELECTIVOLa tcnica de aislamiento que se usar es estriacin en placa y tiene como objetivo aislar por seleccin las cepas puras de levaduras, para esto se utiliza el medio YPDA, con el factor de seleccin es el pH que se ajustara de 3,5-4 con HCl (Torija Martnez, 2002; Martin-Lagos, 1999).

Se tomar muestras durante los das de fermentacin espontnea en la segunda y tercera fase. 3.3.4 SELECCIN

PARMETROS DE SELECCIN: Las levaduras aisladas se seleccionaran de acuerdo a caractersticas deseadas para vinificacin (Torija Martnez, 2002).3.3.5 EFECTO DEL ETANOL

La tolerancia al etanol se realizar en tubo conteniendo mosto de raza adicionado en etanol hasta alcanzar concentraciones de 10 y 13 % v/v. Se inocular con una suspensin de cada una de las cepas hasta alcanzar una concentracin 1x106ufc/ml.

Paralelamente se realizar como control una microfermentacin sin el agregado de etanol. Se determinar el nmero de microorganismos totales por densidad ptica a 660 nm (Brock, 2002) y se calcular la actividad relativa respecto a un control luego de 18 horas de fermentacin a 25 C.

Se definir actividad relativa como la relacin (expresada en porcentaje) entre el nmero de levaduras alcanzado en presencia de etanol y el nmero de levaduras en el control en un mismo tiempo

3.3.6 RESISTENCIA AL ANHIDRO SULFUROSO

De las cepas que tengan resistencia al etanol: se realiz en tubos conteniendo mosto de Araz adicionado metabisulfito de sodio hasta una concentracin de 150mg/L y 210 mg/L(UE 1943/99), Cada tubo se inocular con una suspensin de cada una de las cepas hasta alcanzar una concentracin 1x106ufc/ml. Paralelamente se realizar como control una microfermentacin sin el agregado de metabisulfito.

Durante 5 das a 25 C, se mide el crecimiento por densidad ptica a 660 nm. Con esto se determinar el tiempo que requiere cada cepa en las condiciones de estudio, para comenzar a crecer (fase lag).

3.3.7 IDENTIFICACIN

Se identificar el biotipo de las mejores cepas seleccionadas resistentes al etanol y SO2, utilizando el kit de pruebas API 20C AUX (bioMrieux) para levaduras (Linares-Sols, 2001).

3.3.8 CONSERVACIN: MTODO DE CRIOPRESERVACIN

Se conservar las cepas a -80 C, en viales con medio crioprotector (M.L.Muruaga, N.I.Perotti y M.E. Lucca; 2001). Es recomendada para la preservacin de levaduras que no son muy exigentes en su metabolismo.3.4 CINTICA DE LAS CEPAS SELECCIONADAS

Parmetro cintico:

Velocidades especificas de crecimiento:

Rendimientos:

Yx/s: unidad de biomasa obtenida por unidad de nutriente consumido (Acevedo, 2002)

Yp/s: Unidad de producto formado por unidad de nutriente consumido.

3.4.1 MEDICIN DE LA BIOMASA POR DENSIDAD PTICA

Para la medida del crecimiento y rendimientos, se realiz una vinificacin a nivel de laboratorio en el mosto de raza, el cual se lo preparo de acuerdo a los resultados encontrados en investigaciones sobre la vinificacin de raza . Se ajusto a 23 Brix, relacin 2:1 jugo de mora/agua y filtrado, 150 ppm de sulfato de amonio. Se realiz el Sulfitado con 150 mg/l de metabisulfito y se dejo reposar por un da.

Se realiz la fermentacin en frascos sellados con un desfogue permanente, durante 22 das y mantenidos a 25 C.

El crecimiento se mido por densidad ptica en un espectrofotmetro a 660 nm (Brock, 2002). 3.4.2 CONSUMO DE SUSTRATO (Brix vs Tiempo)

Se mide el consumo de sustrato (en este caso el azcar), por medio de los Brix los cuales bajaran conforme sigue la fermentacin. Su medida est basada en el ndice de refraccin de la disolucin y se realiz a 20 C. En el mosto, aunque existen otras sustancias, estas apenas afectan al ndice de refraccin, por lo que las lecturas son muy cercanas al contenido real de azcares.

3.4.3 PRODUCCIN DE PRODUCTO (Grado alcohlico vs Tiempo)

De igual manera se midi la produccin de etanol conforme avanza la fermentacin. El mtodo utilizado ser de acuerdo a la norma INEN 360. Determinacin del grado alcohlico en vinos (destilacin y picnmetro).

El grado alcohlico es igual al nmero de litros de alcohol etlico contenido en 100 litros de vino, medidos ambos volmenes a 20 C. El mtodo ms extendido para evaluar el grado alcohlico de los vinos consiste en separar el alcohol por destilacin y determinar su grado por medida de la densidad.CAPITULO IV

4. Marco Administrativo

4.1 Recursos

La adquisicin de materias primas y reactivos para el anlisis los realizar directamente la autora.

Los experimentos para la comprobacin de la vinificacin del mosto de raza se realizarn en el Laboratorio de Anlisis Qumico Instrumental, de la Facultad de Ciencias Qumicas.

La vinificacin del mosto de raza y los estudios de cinetica se realizar en los laboratorios de Microbiologa de Alimentos de la Facultad de Ciencias Qumicas.

Las pruebas sensoriales se realizarn en el Laboratorio de Tecnologa de Alimentos en la Facultad de Ciencias Qumicas.

4.1 Presupuesto

Tabla 3. Gastos estimados para el desarrollo del trabajo.

Material experimentalCantidad Costo unitario ($)Costo total ($)

raza 3kg1,504.50

Azucar 100 g0,651.20

*Reactivos10/ anlisis15

Pruebas Sensoriales

Copias 1500.039.00

Vasos desechables15 docenas1.5022.50

Agua5 galones1.256.25

Material de consulta

Internet 30 horas 0.8 24.00

Copias 0.0310.00

Otros 150150

Muestreo

Viticos3 das15.0045.00

Horas4501.50675.00

Subtotal 1102.25

Imprevistos 10% 110.22

Total 1212.47

Elaborado por Salazar, Ma Gabriela.

4.2 Cronograma de actividades

ACTIVIDADMARZO

ABRILMAYOJUNIOJULIO

Sondeo de mercadox

Bsqueda de informacin xx

Plan de TesisxX

Entrega del Plan de Tesis x

Defensa del Plan de Tesisx

Muestreo y caracterizacin de la materia primax

Realizacin del aislamiento seleccin y preservacin xxx

Aplicacin de las pruebas cinticas y evolucin sensorial xxxxxx

Anlisis de resultados de la evaluacin sensorial y cinticos xxxxxx

Caracterizacin del productoxx

Elaboracin del trabajo escritoxxxx

Entrega del trabajo escritox

Defensa del trabajo escritox

5. BIBLIOGRAFA

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Flanzy, Claude. 2003. Enologa: fundamentos cientifcos y tecnolgicos. [ed.] A.Madrid Vicente y Mundi-Presa. Segunda edicin. Pars: Technique et documentation, 2003. ISBN:2-7430-0243-3.

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