Degradación aeróbica de tolueno:el plásmido TOL

Representative hydrocarbons in petroleum

Alkanes

Ciclics

n-alkane

Ramified alkane

Ciclopentane Ciclooctane Biciclooctan Ciclohexane Bicicloheptane

Aromatics

Benzene Naphtalene Fenantrene Benzo () pirene

Hidrocarburos aromático:

Representativos de contaminación (petróleo e industria)Estructuras muy estables

Contaminantes antropogénicos

Estructuras diseñadas para ser muy estables (Diseñadas para ser tóxicas)

DIFÍCILES DE DEGRADAR

COMPUESTOS CONTAMINANTES DE ORIGEN INDUSTRIAL

Orgánicos

Pesticidas (concentraciones traza pero MUY tóxicos)Compuestos aromáticos policíclicosHidrocarburos policlorados, solventes orgánicos y carburantes (BTEX)Solventes orgánicos NO cloradosTintes, detergentes, ...

Inorgánicos

Fosfatos y nitratos (agricultura intensiva)Metales tóxicos (Zn, Cd, Ni, Cu, Pb, Cr, Hg, Mo, As, Se)

ORGANISMOS IMPLICADOS EN LA RECUPERACIÓN DE SUELOS CONTAMINADOS

MICROORGANISMOSBacterias

Muy versátilesBuen nivel de conocimientoFáciles de manipular

HongosVersátilesBajo nivel de conocimiento de cepas silvestresDifíciles de manipular

PLANTAS Gran tamaño (visibles)Manipulables

INVERTEBRADOSComo reactores (futuro?)

Manipulación requiere CONOCIMIENTO PREVIO

• Organismos y sus posibilidades

• Rutas disponibles

• Regulación de la rutas

• Mecanismos disponibles para su manipulación

¿Qué conocimiento tenemos?

¿Cómo llegamos esta información?

CH3

tolueno

Compuesto naturalconstituyente del petróleo

(BTX)

Origen antropogénico

Clasificado como contaminante prioritario por la EPA

Ejemplo mejor estudiado

Compuesto modelo

Conocimiento profundo a nivel bioquímico, genético, fisiológico, manipulación de rutas, circuitos reguladores, evolución, etc...

Bioquímica de la degradación aeróbica de tolueno

Plásmido TOL

Pseudomonas putida mt-2

CH3

toluenoAislada en los años 60

Microbiología

1900

1930

Microorganismos capaces de crecer a expensas de compuestos aromáticos "Ecología microbiana"

1960 1as evidencias de una nueva ruta: rotura en meta

Bioquímica

1940

1950Oxidación de la cadena lateral del tolueno

Oxidación del benceno vía catecol

Estudios exhaustivos de degradación de alquilaromáticos

Aislamiento e identificación de intermediarios

Pseudomonas putida mt-2

Dos rutas diferentes para la degradación de benzoato:

Rotura en orto (puede degradar BENZOATO)

Rotura en meta (puede degradar METIL-

BENZOATOS)

COOH

COOH

CH3

Aparecen mutantes espontáneos que parecen cambiar su metabolismo de tipo meta a tipo orto.

ben+, m-ben-

Han perdido TODAS las enzimas de la ruta meta.

Son MUY estables (no hay revertientes).

Mismo fenotipo se obtiene curando con Mitomicina C

El carácter el TRANSMISIBLE

Los genes de la ruta meta presentes en un plásmido: TOL (pWW0)

Métodos para el estudio de rutas

• Detección e identificación de compuestos intermediarios

(resting cells)

• Estudios isotópicos

• Estudios de adaptación simultánea

• Obtención y análisis de mutantes

CH3 CH3OH

CH3

OH

OH

o-cresoltolueno 3-metilcatecol

H3C

OH

OH

H

H

CH2OH CHO COOH

H

HOOC OHOH

CH3

OH

CH2OH

OH

CHO

OH OH

COOH

CH3

OH

OHOH

COOH

OH

OH

ORTO

(ORTO)

cis-toluenodihidrodiol

m-cresol

META

alcoholbencílico

benzaldehído benzoato cis-benzoatodihidrodiol

catecol

p-cresol alcoholp-hidroxibencílico

p-hidroxi-benzaldehído

p-hidroxi-benzoato

protocatecuato

META

P. putida mt-2

P. putida F1

B. cepacia G4

R. pickettii PK01

P. mendocina KR1

TOL

TOD

TOM

TBU

T4MO

OXIDACIÓN del anilloRUPTURA OXIGENOLÍTICA

AEROBIOSIS

OH

OH

COOH

OHOH

protocatecuato

COOH

OH

HO

gentisato

Intermediarios centrales

catecol

CH3

OH

OH

COOHCOOH

O2

O2

Activación del anillo

Apertura del anillo Oxidación

Reacciones periféticas

OHCOOH

NH2

OH

CATECOLOH

OH

COOHNH2

CH CH

COOH

CHO

CH

COOH

CH2OH

CH3

CO COOH

NH

CH2CHNH2

COOH

CH2 CHNH2

CO CH2 CHNH2

NH2COOH

NHCHO

CO

anilina

antraceno

salicilato

antranilato

fenantreno

naftaleno

benceno

fenol

benzoato

benzaldehído

L-mandelato

cinamato

alcohol bencílico

tolueno

benzoilformiato

L-triptófano

formilquinurenina

quinurenina

HO COOH

COOH

Rotura en posición meta

P. putida mt-2

Ruta TOL

CH3

tolueno

CH2OH

Alcohol bencílico

CHO

benzaldehído

COOH

benzoato

XO DH DH

T1,2DO

HOOC

H

OHOH

Cis-benzoato dihidrodiol

OH

OH

catecol

DHDH

CH3

CH3

xyleno

X F C1 C2B A TSIGED H

CH3

ISPTOL

ISPTOL

(todC1C2)FerredoxinTOL

FerredoxinTOL

(todB)ReductaseTOL

ReductaseTOL

(todA)NAD+

NADH+H+

O2

CH3

OHOH

H

H

toluene

cis-toluene dihydrodiolNAD+

(todD)NADH+H+

CH3

OHOH

3-MethylcatecholO2 (todE)

Ring fission

Meta

Orto OH

OH

catecol

OH

OH

3-metilcatecol

CH3

OH

OH

4-metilcatecol

H3C

No todos los sustituyentes están permitidos

COOHCHO

OH

COOHCOOH

CATECOL

orto meta

OH

OH

Rotura del anillo: DIOXIGENASAS

cis,cis-muconato Semiladhido hidroximucónico

1,2 Dioxigenasa 2,3 Dioxigenasa

O2

HCOOH

COOH

OHO

4-hidroxi-2-oxovalerato aldolasa

O2

CH3COOH

4-hidroxi-2-oxovalerato

2-hidroxi, 6-oxo 2,4-heptadienoato hidrolasa

acetaldehído deshidrogenasa

CCH3

OSCoA

acetilCoA

OH

CHOCOOH

OH

OH

CH3 CO COOH

OH

COOHCOOH

O

COOHCOOH

CO2

O

COOH

OH

CCOOH

CH3

O

CH3

OH

OH

catecol

semialdehído 2-hidroximucónico

2-oxo 4-pentenoato

Catecol 2,3 Dioxiganasa

2-hidroxi-2,4-pentadienoato hidratasa

3-metilcatecol

2-hidroxi, 6-oxo

2,4-heptadienoato

4-oxalcrotonatoisomerasa

+

piruvato

CH3CHO

acetaldehído

META

4-oxalcrotonato (enol)

4-oxalcrotonato (ceto)

semialdehido2-hidroximuconatodeshidrogenasa

semialdehido2-hidroximuconatohidrolasa

4-oxalcrotonatodescarboxilasa

O2

-carboximuconatolactonasa

CHOOC

OSCoA CH3C

OSCoA

acetilCoAsuccinilCoA

O2

OH

OHHOOC

COOHCOOH

HOOC

COOHO

O

HOOC

ORTO

COOHO

O

COOHCO

OSCoA

COOHCOOH

O

OH

OH

COOHCOOH

COOHO

O

-cetoadipato enol lactona

muconolactonaisomerasa

-carboximuconolactonadescarboxilasa

-cetoadipato

-cetoadipato enol lactona hidrolasa

-cetoadipato succinilCoA transferasa

-cetoadipilCoA tiolasa

catecol

cis,cis-muconato

muconolactona

catecol 1,2-dioxigenasa

protocatecuato

-carboxi-cis,cis-muconato

-carboximuconolactona

protocatecuato3,4-dioxigenasa

muconato lactonasa

-cetoadipilCoA

OXIGENASASDioxigenasas

del anillo

abren el anillo

Monoxigenasas

del anillo

de la cadena lateral

Tolueno dioxigenasa

Benzoato dioxigenasa

(Metil)benzoato dioxigenasa (“toluate dioxygenase”)

Catecol 1,2-dioxigenasa

Catecol 2,3-dioxigenasa

Protocatecuato 3,4-dioxigenasa

Tolueno 2-monooxigenasa

Tolueno 3-monooxigenasa

Tolueno 4-monooxigenasa

Xileno monooxigenasa

Fenol hidroxilasa

4-hidroxibenzoato 3-hidroxilasa

COOH CH3

CH3

CH3

Flavoproteína reductasa sulfoférrica

Dioxigenasas del anillo

FAD o FMN

Flavoproteínareductasa

[2Fe-2S]

Ferredoxina

Rieske[2Fe-2S]

Fe++

OxigenasaNADH+H+

NAD+

Derivado dihidroxilado

Compuesto aromático

CH3

COOHCH3

OHOH

H

H

HOOC

OHH

OH

O2 + 2 H+

IA

IB

IIA

IIB

III

4-sulfobenzoato3,4-dioxigenasa

4-clorofenilacetato3,4-dioxigenasa

ftalato4,5-dioxigenasa

2-oxo-1,2-dihidroquinolina8-monoxigenasa

benzoato1,2-dioxigenasa

dibenzofurano4,4a-dioxigenasa

benceno1,2 dioxigenasa

naftaleno1,2 dioxigenasa

FMN

FMN

FMN

FAD

FAD

FAD

FAD

FAD

R

R

[2Fe-2S]

[2Fe-2S]

[2Fe-2S]

[2Fe-2S]

[2Fe-2S]

[2Fe-2S]

Transporte de electronesClase Oxigenasa Ejemplo

Reductasa Ferredoxina ISP ISP[2Fe-2S

(mononuclear]

Dioxigenasas del anillo

Generalmente varias subunidades

Cadena más o menos compleja de transporte de electrones.

La reacción que llevan a cabo es similar.

Especificidad de sustratoSustratos metabolizados por la ruta TOL: tolueno, m-xyleno, p-xyleno, 3-etiltolueno, 1,2,4 trimetilbenzeno, ...

Es una limitación, pero es manipulable.

“Rasgos” que identifican una ruta:Modo de activación del anilloModo de rotura del anillo

A resaltar:

Protocatecuato 3,4-dioxigenasa (Fe3+)12

P. putida

HOOC

OH

OHCOOHCOOH

HOOC

O2

protocatecuato -carboxi-cis,cis-muconato

Ohlendorf et al., 1988

Orville et al., 1997

C5

C4

C3 C2

C1

C6

O1

O2

4O

3O

Fe3+

Y408

H460

H462

O

O

OO

O

O

+ O2

+ H2O

- H2O

+ H+

O2

OFe3+

Y408

H460

H462

H

Fe3+

Y408

H460

H462

O

O

O

O

- H+

O

O

O

O

Fe3+

Y408

H460

H462

OO

O2Fe2+

Y408

H460

H462

O

O

O

O

O

O

O

O

O

Fe3+

Y408

H460

H462

O

O

O

O

Y447 OH

Y447 OH

OFe3+

Y408

H460

Y447

H462

H

COOH

COOHHOOC

Protocatecuato 3,4-dioxigenasa (Fe3+)12

P. putida

Catecol 2,3-dioxigenasa (Fe++)4

P. putida mt-2

Kita et al., 1999

O2

OH

OH OH

CHOCOOH

catecol semialdehído 2-hidroximucónico

Catecol 1,2-dioxigenasa (Fe3+)2

Acinetobacter sp. ADP1

Vetting & Ohlendorf, 1999

- catecol 4-metilcatecol

Degradación anaeróbica de tolueno

Introducción

Catabolismo de hidrocarburos aromáticos se consideraba EXTRICTAMENTE dependiente de O2.

En las rutas descritas, el ataque inicial del anillo requiere SIEMPRE O2 molecular (Mono- y Dioxigenasas).

Últimos 10 años: algunos organismos TAMBIÉN puede degradar Hidrocarburos en ANAEROBIOSIS.

Procesos anaerobios están empezando a mostrar un gran POTENCIAL para la solución de problemas de contaminación ambiental.

Historia

Observación: aromáticos NO se acumulan en la naturaleza en zonas anaerobias.

1985-86 El tolueno es degradado en sedimentos contaminados con hidrocarburos.

1990 Se consiguen los primeros cultivos puros.

Tanto de zonas contaminadas como pristinas

Están taxonómicamente relacionados

Aerobio vs anaerobio

Aerobios: Oxígeno cumple dos funciones:

- Aceptor de electrones (RESPIRACIÓN)

- Sustrato de las dioxigenasas

Anaerobios: - Oxígeno puede sustituirse por OTROS ACEPTORES

- La reactividad del O2 en Oxigenasas es INSUSTITUIBLE

Estos organismos deben de haber desarrollado rutas diferentes, novedosas, independientes del oxígeno.

Reacciones estequiométricas de oxidación anaeróbica de tolueno acopladas a la reducción de diferentes aceptores de electrones.

• Bacterias desnitrificantes :

C7H8 + 7.2 NO3- + 0.2 H+ 7 HCO3

- + 3.6 N2 + 0.6 H2O Gº’ = - 3554 kJ (mol tolueno)-1

• Bacterias sulfatoreductoras :

C7H8 + 4.5 SO4= + 3 H2O 7 HCO-

3 + 2.5 H+ +4.5 HS-

Gº’ = -205 kJ (mol tolueno)-1

• Bacterias reductoras de hierro (III) :

C7H8 + 94 Fe(OH)3 7 FeCO3 + 29 Fe3O4 + 145 H2O Gº’ = -3398 kJ (mol tolueno)-1

• Thauera aromatica K172• Thauera aromatica T1• Azoarcus sp. Cepa T.• Azoarcus tolulyticus Tol4• Azoarcus tolulyticus Td15

Bacterias reductoras de hierro (subclase de proteobacterias)

• Geobacter metallireducens GS15

Bacterias sulfatoreductoras (subclase de proteobacterias)

• Desulfobacula toluolica Tol2• Desulfobacterium cetonicum

Cepas bacterianas disponibles en cultivo puro e identificadas

Bacterias desnitrificantes (subclase de proteobacterias)

Elucidación de la ruta

La activación del sustrato (tolueno) y la rotura en ausencia de O2 es similar en todas las cepas anerobias, independientemente del aceptor de electrones que utilice.

¿Cómo se activa el anillo?

¿Cómo es la apertura del anillo?

Microbiología/ecología de anaerobios.

Métodos

Estudios isotópicos (compuestos marcados con 13C o 14C).Detección e identificación de intermediarios

Inhibodores metabólicosAnálogos del toluenoBajas temperaturas Limitación en aceptores de electrones

Adaptación simultáneaAnálisis de mutantes

En muchos cultivos, se observa acumulación transitoria de BENZOATO y/o BENZOIL-CoA

COOH SCoAO

CONFIRMACIÓN: aparece benzoil-CoA en

Estudios in vitro con extractos crudos libres de células.

Estudios in vivo con sustratos marcados

Se identifica BENCIL-SUCCINATOCOOH

COOHbencilsuccinato

Este compuesto se había considerado inicialmente un producto terminal no metabolizable (dead-end)

Se propone el primer paso de la reacción: ADICIÓN DE FUMARATO

CH3

toluenoHOOC

COOH

COOH

COOHbencilsuccinato

fumarato

Estudios cinéticos in vivo/in vitro apoyan la propuesta

Se identifica la bencilsuccinato sintetasa

Thauera aromatica K172

CH3

CSCoAO

benzoilCoA

tolueno

COOH

COOH

HOOCCOOH

OCOSCoA

COOH

2[H]HSCoA

2[H]

H2O

COSCoA

COOH

COSCoA

COOH

COSCoA

COOH

OH

bencilsuccinato

fumarato

bencilsuccinilCoA

E-fenilitaconilCoA

2-carboximetil 3-hidroxi fenilpropionilCoA

benzoilsuccinilCoA

Bencilsuccinato sintetasa SuccinilCoA:bencilsuccinatoCoA-transferasa

BencilsuccinilCoAdeshidrogenasa

E-fenilitaconilCoAhidratasa

succinilCoAsuccinato

succinilCoA

3-hidroxiacilCoA deshidrogenasa3-oxoacilCoA tiolasa

Se detecta E-fenilitaconilCoA

No requiere ATP

Velocidad aumenta en presencia de succinilCoA como fuente de CoA

Se detecta actividad SuccinilCoA:bencilsuccinato CoA-transferasa

No se han detectado ni todos los intermediarios ni todas las reacciones. Pero cada vez hay más datos que apoyan esta ruta.

Comprobado en detalle en Thauera y Azoarcus (desnitrificantes)

Algunas de las reacciones se han identificados en bacterias sulforreductoras (muy distintas filogenéticamente).

Mecanismo común a todas las cepas (?)

Anillo activado (benzoilCoA)

Rotura: en todos los casos, reacción hidrolítica.Es necesaria una reducción previa del anillo: BenzoilCoA Reductasa(requiere ATP; es MUY específica)

Sigue -oxidaciónLas reacciones hasta la rotura del anillo están DEMOSTRADAS en Thauera y en Rhodopseudomonas

CSCoAO

COOH

CSCoAO

O

benzoilCoA

CSCoAO

CSCoAO

CSCoAO

O

COOH

CSCoAO

HO

2 ATP 2[ADP+Pi] H2O NAD+ NADH+H+

2[H]

2H2O

COOH

SCoAOC

COOH

SCoAOC

SCoAOC

OH

SCoAOC

O

SCoAOC

CH3

SCoAOC

CO2 CH3

SCoAOC

2[H]2[H] H2O

2[H]

1,5-ciclohexadieno1-carboxilCoA

6-hidroxi 1-ciclohexeno1-carboxilCoA

6-ceto 1-ciclohexeno 1-carboxilCoA

3-hidroxipimelilCoA

1,5-ciclohexadieno1-carboxilCoA hidratasa

6-hidroxi 1-ciclohexeno1-carboxilCoA

deshidrogenasa

6-ceto 1-ciclohexeno1-carboxilCoAhidrolasa

BenzoilCoA reductasa

3-hidroxipimelilCoAdeshidrogenasa

2 acetilCoA

COOH

CSCoAO

Rhodopseudomonaspalustris

PimelilCoA

Bencilsuccinato sintetasa222

CH3 CH2

H2CCH

COO-

CCOO-

H

H2CCH

COO-

CCOO-

HH

EnzimaHOOC

COOH

Enzima-H

tolueno

fumarato

bencilsuccinato

Activador(¿ORF?)

’22

Muy sensible a O2

(V = 20 s)

BenzoilCoA reductasa

Fe/SFAD

Benzoil CoAreductasa

2[4Fe-4S]

FerredoxinaDonador de electrones?

CSCoAO

benzoilCoA

CSCoAO

2 ATP2[H]

2[ADP+Pi]

1,5-ciclohexadieno1-carboxilCoA

Especificida de sustrato

CO SCoA

COOH

OH

OH

OH

OHHO

OH

OH

COOH

OHOH

COOH

OH

HO

2 [H]2 ATP

OH

OH

Co-sustratos anaerobios: 2 [H], CO2, ATP, CoA, H2O

Co-sustratos aerobios: O2, H2O

REDUCCIÓN del anilloRUPTURA HIDROLÍTICA

OXIDACIÓN del anilloRUPTURA OXIGENOLÍTICA

benzoil-CoA

resorcinol

fluoroglucinol

catecol

protocatecuato

gentisato

CoASH

SCoAO

O2

O2

COOHCOOH

2O

Intermedioscentrales(aerobios)

Intermedioscentrales(anaerobios)

ANAEROBIOSIS

AEROBIOSIS

SCoAO

H

OHCOOH

NH2

OH

CATECOLOH

OH

COOHNH2

CH CH

COOH

CHO

CH

COOH

CH2OH

CH3

CO COOH

NH

CH2CHNH2

COOH

CH2 CHNH2

CO CH2 CHNH2

NH2COOH

NHCHO

CO

anilina

antraceno

salicilato

antranilato

fenantreno

naftaleno

benceno

fenol

benzoato

benzaldehído

L-mandelato

cinamato

alcohol bencílico

tolueno

benzoilformiato

L-triptófano

formilquinurenina

quinurenina

HO COOH

COOH

OHfenol

OHp-cresol

CH3

Oalcohol

p-metoxibencílico

CH2OH

CH3

OHp-hidroxibenzoato

COOH

tirosina

H2N CHCH2

COOH

p-hidroxibenzoilCoA

C

OH

SCoAO

OH

OH

COOH

OH

protocatecuatoOH

COOH

OCH3

vainillato

OH

CHCHCOOH

cumarato

COOH

Cl3-clorobenzoato

COOH

benzoato

CH2OH

a lcoholbencílico

BENZOILCoA

CSCoAO

fenilalanina

H2N CHCH2

COOH

fenil-oxoacetato

COOH

C O

NH2anilina

CSCoAO

NH2

o-aminobenzoilCoA

CSCoAO

NH2

triptófano

N

CH2

H

CHNH2

COOH

COOHNH2

2-amino benzoato

tolueno

CH3

Características generales de cepas anaerobias que degradan tolueno

Tanto estrictas como facultativas.

Espectro de hidrocarburos aromáticos que son capaces de degradar es MUY REDUCIDO.

tg generalmente mayor que en aerobios.(desnitrificantes son las que tienen velocidad de crecimiento mayor)

Muchas formas de respiración.

Identificación de GENES

Mutagénesis al azar- química- transposones SELECCIÓN de clones inactivos

secuenciación (cromosoma)

Análisis de secuencia

Confirmación - producto génico- Comparación con proteína conocida

Genoteca- Complementación- Búsqueda de actividades

Gran potencial para la solución de problemas de contaminación medioambiental.

Zonas contaminadas con frecuencia son ANAEROBIAS.

OXIGENACIÓN $$

TRANSPORTE no es considerable en áreas grandes.

Considerar recuperación in situ basada en organismos ANAEROBIOS.Adición de otros aceptores de electrones, más solubles (fácil y barato).Degradación lentaAplicable cuando la contaminación sólo afecta al suelo (no hay acuífero amenazado).

Aplicaciones

Oxígeno disuelto en agua saturada: 8,6 mg/lEsto permitiría oxidar

2,8 mg tolueno/l

Concentración saturante de sulfato en agua: 2 g/lEsto permitiría oxidar (anaeróbicamente)

300 mg tolueno/l

Estimaciones energéticas potenciales

Pero

Procesos aerobios son mucho más RÁPIDOS.Organismos aerobios son más versátiles.

Acuíferos

aeróbico

Zona no saturada

contaminante

NRMnR

O2

TiempoFeRSR

Accidente! O2

contaminante

O2NRMnR

contaminante

contaminante

NR O2

FeR

SR

M

O2

NO3-

SO4=

CO2

CH4

CO2

Fe(III) Fe(II)

CO2

SO4= S=

CO2

O2 H2O

CO2

NO3- N2

O2

Zona no saturada

Organización genética y regulación

Regulación

Proteínas

ARN-Polimerasa

ADNGen

Ausencia de sustrato

ADNGen

Presencia de sustrato

Regulador

ARN-Polimerasa

ARNRegulador

+

GenesADN

Gen

Ribosomas

ARN

Proteínas

ARN-Polimerasa

Reguladores

Operón

Proteínas

Reprimido

C

Regulador XylR

Deleción

ConstitutivoActivado por el efector

(desreprimido)

O‘Neill & al., 1998

ADP + Pi

ATP

A

C

ADP + Pi

ATP

C

A

Activación de un regulador

pWW0

P. putida mt-2

• Clonación de la ruta a partir del plásmido TOL aislado (genoteca)

• Mutagénesis al azar• Mapeo y localización de los mutantes

(secuenciación)• Análisis bioquímico: identificación de gen-función

CH3 COOH

Krebs

tolueno benzoato

U W C M A B Nxyl

Operón upper

X Y Z L T E FG J Q K HI S R

Operón meta

Organización genética

K

F

B

T

O

Tn4653

IN

X K

Tn4651

B H

FVD

xylR

xylS

D

A

E

E

JC

P

meta

A

D

GQ

F upper

I

E

H

A

G

S

G

CJ

C

MR

JL B

H

pWW0

XhoI

EcoRI

HindIII

Tra/Rep

tnpT

res

tnpS

tnpA

tnpA(Tn4653 )

117 kb

Operón

Operón(Tn4561 )

Regulación de la expresión

Determinar actividades en células creciendo en distintos medios:No-sustrato de la ruta (acetato)Sustratos de la ruta upperSustratos de la ruta meta

Sustrato de crecimiento TO BADH C2,3DO HMSD

Acetato - - - -Tolueno + + + +Bencilalcohol + + + +Benzoato - - + +3-metilbenzoato - - + + Acetato + Tolueno + + + +

TODAS las actividades son inducibles

Sustratos de la ruta meta sólo inducen a la ruta metaSustratos de la ruta upper inducen tanto a la ruta upper

como a la ruta meta

Mutante PaW210:

Sustrato de crecimiento TO BADH C2,3DO HMSD

Acetato - - - -Tolueno - - - -Bencilalcohol - - - -Benzoato - - + +3-metilbenzoato - - + +

Ruta upper NO es inducibleRuta meta SÓLO es inducible por sustratos de meta

xylRxylXYLTEGFJQKIHxylUWCMABNPu Pm

upper meta

tolueno

+Reguladores

XylR

+

benzoatos

xylS

XylSEsquema de regulación

?

CH3 COOH

Krebs

tolueno benzoato

Fusiones transcripcionalesHuésped heterólogo (Escherichia coli)

Examinar regulación en AUSENCIA de las rutas

Promotor Gen marcador desprovisto de promotor propio

xylS xylR Pm:: ‘lacZ

E. coli

E. coli (pKT570, pJLR107)

Inductor Actividad -galactosidasa

Ninguno -3-metilbenzoato + Xyleno +

• Xyleno NO tiene que ser metabolizado para activar la ruta meta

Expresión de XylS en P. putida mt-2

Xyleno (XylR) activa la síntesis de XylS

Altas concentraciones de XylS en la células activan la ruta meta en ausencia de inductor

P. putida (pWW0)

Inductor niveles de mRNA de xylS

Ninguno 103-metilbenzoato 10Xyleno 100

xile

no

xylS

3-m

etilb

enxz

oato

ning

uno

+Pr1Pr2 xylRPs1xylSxylXYLTEGFJQKIHxylUWCMABNPu

+

tolueno

+

benzoatos

Ps2Pm

upper meta Reguladores

XylR

XylS

CH3 COOH

Krebs

tolueno benzoato

BenR

32/38

+Pr1Pr2 xylRxylXYLTEGFJQKIHxylUWCMABNPu

+

- -

-

tolueno

+

54

IHF

Ps2

benzoatos

Pm

upper meta Reguladores

54

+

70

+

IHF

-

XylS

XylR

Ps1xylS

Reguladores

• Activa a los promotores Pu y Ps

• Es dependiente de 54 (familia NtrC)

• Reprime su propia expresión

• IHF activa en Pu y reprime en Ps

• En Ps HU es necesaria

• Requiere activación por un efector

• Represión dependiente de la presencia

de otras fuentes de C

XylR

A

C

A B C D

85Pro Ser

135Asp Asn

172Glu Lys

Perfil de efectores

Mutagénesis química

Regulador - 3-MBA 2NT 3-NT

XylR 180XylR6 1150XylR49 1500XylR7 150XylR49-7 70

105019002600900150

1000290035501050950

90450

30001000450

CH3

NO2

CH3

NO2

CH2OH

CH3

Represión catabólica

Crecimiento

Exp

resi

ón

de

la r

uta

u

pp

er

Inductor

Medio rico

Tasa de dilución (h-1)

Exp

resi

ón

de

la r

uta

u

pp

er

Cultivo contínuo(limitación de C)

0.05 0. 5 0.75

Limitación

Exp

resi

ón

de

la r

uta

u

pp

er

Cultivo contínuo (0.05 h-1)

C O2N PS

Sistema PTSCRC?Otro?

54-polimerasa

xylS xylR

XylR

IHFIHF

70-polimerasa

XylR Activa ReprimeIHF Facilita Impide54 +

Efector +

¿ Represor?

Elementos que participan en la regulación

Reguladores

XylS

• Activa al promotor Pm

• Pertenece a la familia AraC

• Es dependiente de 32 y 38

Extremo N-terminal

Extremo C-terminal

1 2 3 4 765

• Requiere activación por un efector

Crecimiento

Exp

resi

ón

de

la r

uta

m

eta

Inductor

32 38

- 39 2FBz 343

Bz 6369 3FBz 6801

2MBz 2724 4FBz 2886

3MBz 13452 2ClBz 141

4MBz 3377 3ClBz 9034

2,3DMBz 6491 4ClBz 2991

2,4DMBz 1737 2,6DClBz 397

2,5DMBz 4093 3,5DClBz 381

2,6DMBz 383 2BrBz 547

3,4DMBz 4630 3BrBz 5372

3,5DMBz 385 4BrBz 1726

Pm :: ‘lacZ

XylS

COOH

X

Efector Actividad Efector Actividad

XylS

• Mutagénesis química de XylS (NTG)

• Selección de resitencia a Tetraciclina:

- Constitutiva.

- Inducible por distintos efectores.

• Identificación del residuo mutado

Extremo N-terminal

Extremo C-terminal

Motivo HTH-1 Motivo HTH-2

1 2 3 4 765

Unión del efector

Pm :: tet

0 2 4 6 8

0

4000

8000

Time (h)

-g

alac

tosi

das

e (M

iller

U) wt

rpoS

rpoH

rpoSrpoH

XylS/Pm:lacZ

Proteínas desnaturalizadas

estress

Promotores dependientes de 32

32

+

Respuesta HS

DnaKJ

NO estress -

Proteínas desnaturalizadas

estress

DnaKJ

Promotores dependientes de 32

32

+

Respuesta HS

0

5

10

15

20

3-metilbenzoato

-G

ala

cto

sid

as

e (M

ille

r U

)

PrpoDhs-lacZ

Respuesta a choque térmico

HS

FtsH

32

38Faseestacionaria

54

IHF

70

Limitaciónanabólica

-

XylS

XylR

(XylR)

Pm+

Pu+

COOH

benzoato

CH3

tolueno

• Plásmido

Transferible

Incidencia sobre otras poblaciones

Tol tiene además 2 transposones!

Inestable%

cél

ulas

TO

L+

100

50

0

tiempo

benzoato

o-xyl

tolueno

Retrotransferencia

Consecuencias

• Represión catabólica: MEZCLAS

• Activación del regulador: INDUCIBILIDADLa inacapacidad de una cepa para degradar un determinado compuesto aromático puede tener dos causas:

- Enzima(s) no reconocen el sustrato- El regulador no reconocen al inductor, no se activa la

ruta

CH3 CH3OH

CH3

OH

OH

o-cresoltolueno 3-metilcatecol

H3C

OH

OH

H

H

CH2OH CHO COOH

H

HOOC OHOH

CH3

OH

CH2OH

OH

CHO

OH OH

COOH

CH3

OH

OHOH

COOH

OH

OH

ORTO

(ORTO)

cis-toluenodihidrodiol

m-cresol

META

alcoholbencílico

benzaldehído benzoato cis-benzoatodihidrodiol

catecol

p-cresol alcoholp-hidroxibencílico

p-hidroxi-benzaldehído

p-hidroxi-benzoato

protocatecuato

META

P. putida mt-2

P. putida F1

B. cepacia G4

R. pickettii PK01

P. mendocina KR1

TOL

TOD

TOM

TBU

T4MO

benABC(DKEF)PbenAbenR PbenR

benzoato XylS

+

pcaK pcaF pcaTB(DC)pcaRPpcaR

-cetoadipato

+-PpcaK PpcaF PpcaT pcaIJPpcaI

++ +

Cromosoma (ruta orto)

P. putida mt-2

catBCAPcatBcatR PcatR

+

-

cis,cis-muconato

COOHO

OCOOHCOOH

O

OH

OH

COOHCOOH COOH

OO

-cetoadipato enol lactona -cetoadipatocatecol cis,cis-muconato muconolactona

ABC1X DR* F E IG HC2tod TS

CH3

Krebs

tolueno

cromosoma

todXFC1C2BADEGIH todSTPtodX PtodS

P-

-P

+

tolueno

Tolueno dioxigenasa +

meta

Reguladores

P. putida F1

TOD

tbm A B C D E F

CH3

tolueno

CH3

o-cresol

OHCH3

OH

OH3-metilcatecol

Tolueno 2-monooxigenasa

tbmABCDEFPtbmAtb4m

tolueno

tbmR

54

++

Regulador Tolueno/benceno 2-monooxigenasa

Tolueno4-monooxigenasa

Burkholderia sp. JS150

TOM

plásmido

B

CH3

tolueno

CH3

m-cresol

CH3OH

OH3-metilcatecol

OHKrebs

Operón meta Tolueno3-monooxigenasa

Fenolhidroxilasa

Proteína demembrana

tbuR tbuS tbuA1UVBVA2CTPtbuA1 tbuX PtbuX

70?54 54

JIKGFEW tbu PtbuW tbuD PtbuD

54ANR?54

tolueno

tolueno

+ +++

meta Tolueno 3-monooxigenasa+

regulador

Fenol hidroxilasa Proteína demembrana

Reguladores

tolueno

Ralstonia pickettii PKO1

TBU

tbu A1U VA2 C T XD R SF E WI K GJ H

cromosoma

tmo A BC

DE FpcuCAB pobA

p-cresol metilhidroxilasa+

p-hidroxibenzaldehídodeshidrogenasa

Tolueno4-monooxigenasa

CH3 CH3

OH

COOH

OH

COOH

OHOH

Krebs

tolueno

p-cresol p-hidroxibenzoato

protocatecuato

p-hidroxibenzoatohidroxilasa

P. mendocina KR1

T4MO

cromosoma

A DB C E GF IHbbs

CO SCoA

CH3

HOOCCOOH

COOH

COOH

benzoilCoA

tolueno

bencilsuccinato

fumarato

acetilCoA + CO2

COOH

CSCoAO

HO

3-hidroxipimelilCoA

fdx

hadoah

dch

bcr

B A DC

benzoilCoA reductasa

Thauera aromatica K172

D C A BS Rtdi bss

reguladores bencilsuccinato sintetasa

?

E C D ?tuttutB

tdiSRPtdiS

P-

-P

bssDCABPbssD

+

tolueno

Bencilsuccinato sintetasaReguladores

Thauera aromatica K172

Características de la regulación

En todos los casos estudiados, las enzimas sólo están presentes cuando las células se cultivan en presencia de tolueno:INDUCIBLES

Sometidos a represión catabólica

Reguladores del tipo de 2 componentes

Expresión reprimida en presencia de O2

AadR (FNR) Activación en respuesta a anaerobiosis

Cuando la cepa puede degradar tanto en aerobiosis como en anaerobiosis, las rutas y su regulación son distintas.

Anaerobias facultativas