DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGÍA Y...
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DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA FACULTAD DE FARMACIA UNIVERSIDAD DE SEVILLA OPTIMIZACIÓN DE LA AUTO-BIORREMEDIACIÓN DE AGUAS RESIDUALES PROCEDENTES DE LA INDUSTRIA DEL CORCHO KARINA PAREDES PÁLIZ SEVILLA, 2012
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DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGÍA Y
PARASITOLOGÍA
FACULTAD DE FARMACIA
UNIVERSIDAD DE SEVILLA
OPTIMIZACIÓN DE LA
AUTO-BIORREMEDIACIÓN DE AGUAS
RESIDUALES PROCEDENTES DE LA
INDUSTRIA DEL CORCHO
KARINA PAREDES PÁLIZ
SEVILLA, 2012
OPTIMIZACION DE LA AUTO-BIORREMEDIACION DE AGUAS
RESIDUALES PROCEDENTES DE LA INDUSTRIA DEL CORCHO
Trabajo de Fin de Máster
Máster en Genética Molecular y Biotecnología
Este trabajo ha sido realizado en el Departamento de Microbiología y Parasitología de la
Facultad de Farmacia. Universidad de Sevilla
TUTORA
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Eloísa Pajuelo Domínguez
AUTORA
Karina Paredes Páliz
Sevilla, Septiembre del 2012
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A mis papis, hermanos y sobrinos, la mejor familia que Dios me pudo dar y el
orgullo más grande de mi vida
A todas las personas, que al igual que yo, continúan creyendo en el poder de los
sueños y la voluntad
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Ya había oído de la magia que encerraba Sevilla, su belleza cautivante y la amabilidad
de su gente, pero me faltaba una cosa, comprobarlo por mi misma. Y llegué una noche
de Otoño con la nostalgia de haber dejado toda una vida a más de 9 mil Km de distancia
y la incertidumbre de lo que deparaba esta nueva aventura, aventura, que como todas las
demás, se sabe el comienzo, pero no su final.
No tardé en encontrarme con todos los sitios que los había visitado imaginariamente: el
Prado de San Sebastián, la Catedral, la Giralda, el Barrio de Santa Cruz, la Plaza de
España, el Puente de Triana. Todo estaba ahí, más bonito que en mi cabeza y en las
fotografías que había visto. Y sin más, empezó mi nueva vida, con un nuevo hogar y
nueva gente. Mentiría si digo que todo fue bueno desde un principio, pero mentiría
también si digo que de todos esos momentos “malos” no saqué un beneficio, de hecho
creo que fueron los que más enseñanzas personales me dieron y en los que aprendí a
tomar la vida desde otros puntos de vista, con nuevos retos y matices distintos. Estaba
sola en físico, pero más acompañada que nunca, eso lo tuve claro siempre. Pero el
miedo, la incertidumbre y la tristeza fueron cada vez más quedando únicamente como
malos recuerdos, a la par que iban apareciendo personas que hicieron de este viaje, un
viaje inolvidable.
La gratitud es uno de los valores que más he aprendido de mis padres, esa gratitud
sincera hacia las personas que, cualquiera hayan sido las circunstancias, formaron y
siguen formando una parte esencial de mi vida.
Un gracias a la flaca, Gabriel y la pequeña África, que me dieron su cariño sincero en el
momento que más lo necesité, que bueno fue habernos encontrado en una tierra tan
lejana a la nuestra y habernos visto como si el tiempo nunca pasó, con la misma
complicidad y confianza de siempre, nunca olvidaré ese abrazo fraterno al empezar el
nuevo año, sabiendo que todo iría bien, lejos las dos de nuestras familias, pero juntas y
dichosas de, por ese instante, tenernos la una a la otra.
Gracias también a todos los amigos que fueron apareciendo en el camino Paola H, Gina,
Zue. A todos los de “los que más te quieren en la mesa de los viernes” en especial a
Andrés y Fernando. Todos ellos le pusieron al máster esa chispa de alegría que permitía
levantarnos a clases en mañanas frías de invierno y asistir a todas las clases de los
viernes, siempre con el plan de pasar un buen rato, entre comida y cervecitas, pero
sobretodo entre risas y buen rollo.
A Cármen, que fue el remplazo temporal de mamá. A ella toda mi admiración por
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enseñarme que la edad nada tienen que ver con que logremos o no cumplir nuestros
sueños, que sólo es cuestión de proponernos algo y hacerlo, nunca es tarde para nada,
los obstáculos nos los ponemos nosotros mismos, y por tanto somos nosotros quienes
tenemos que alzarnos de valor y seguir, independientemente de lo que puedan decir los
demás. Gracias por las pláticas, las salidas de compras, nuestro “atún a la plancha” de
los domingos, y por haberme visto y tratado con el mismo cariño que a una hija, esas
cosas no se olvidan nunca.
No podía faltar toda la gente del laboratorio. Más que el sitio dónde hacer mi trabajo de
fin de Máster fue mi refugio y zona de seguridad. Me encantó conocer a personas
sensibles, que muy aparte de ser buenos profesionales o científicos, se destacan por su
don de gente. No puedo olvidar la amabilidad de Miguel Ángel al recibirme e invitarme
un cafelito el primer día que llegué al BIO-181. Cada uno de los que conforman el
equipo de trabajo, que más que equipo son una auténtica familia, se caracterizan por
algo especial. Gracias a Ana Mari, Bouchra, Nacho, Alejandro, Jenny, Manuel y Luis.
Mi profundo agradecimiento a Eloísa, por su paciencia, buen humor y confianza. Me
encanta que sean el ejemplo claro que trabajo y disfrute son dos cosas que pueden ir de
la mano. Aprendí mucho, profesionalmente hablando, pero aprendí más del significado
auténtico de trabajar en equipo. Simplemente llegué al mejor laboratorio de todos, por
eso debo decir que nuevamente el mundo conspiró a mi favor. También estuvieron los
vecinos, Magda, Vani, María y Esaú, amigos de comidas, charlas y viajes. Gracias por
las conversaciones simpatiquísimas y las charlas “interculturales”.
Paty y Sabri pasaron de ser compañeras de laboratorio a auténticas amigas. Gracias Paty
por todos los buenos momentos vividos, por haberme integrado desde el primer día, por
la ayuda desinteresada, las palabras de ánimo y las locuras que pasamos, estoy segura
que nos volveremos a ver, espero y sea en mi Ecuador querido, y continuaremos con
nuestros viajes. De igual manera mi verano no hubiese sido el mismo sin la Sabri, no
hay nada que hacer que compartida la vida es más bonita y llevadera.
El gracias que escribo a continuación tiene un especial significado por estar dedicado a
las personas que más se asemejaron a mi familia aquí en España. A Maleny y Paola,
que de ser mis “caseras”, pasaron a ser un todo: vecinas, amigas, hermanas. Su amistad
fue pieza clave en mi adaptación. Nunca tuvieron obligación alguna de hacerme parte de
sus vidas, y sin embargo lo hicieron sin ningún reparo. Los momentos vividos, las
conversaciones, y el apoyo incondicional los llevaré siempre en mi mente y corazón.
6
Gracias a mis amigas de siempre, las de toda la vida. Las que han estado ahí, desde hace
ya muchos años acompañándome en risas y lágrimas y las que espero envejezcan
conmigo.
Finalmente quiero agradecer a las personas que forman el pilar y sustento de mi vida:
mi familia. Imposible hablar de ellos sin que me brillen los ojos de felicidad y orgullo.
Ellos han sido y serán por siempre mi compañía, gracias por los “terribles encantos de
un hogar”.
..y vi todas las estaciones, el caer de las hojas, el olor a azar.. y regreso de nuevo en un
Otoño.. Sólo me queda decir que el viaje valió la pena y que dejo en Sevilla un pedazo
enorme de mi corazón..
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La verdadera ciencia enseña, por encima de todo, a dudar y a ser ignorante
Miguel de Unamundo
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Abreviaturas
AC: Agua de corcho
API 20: Sistema estandarizado para la identificación de bacterias
ATSDR: Agency for Toxic Substances & Disease Registry
BAE: Balsa de Almacenamiento Enriquecida
BC: Balsa de Cocción
Benzoil-CoA: Benzoil – Coenzima A
BLAST: Basic Local Alignment Search Tool
DBO: Demanda Bioquímica de Oxígeno
DQO: Demanda Química de Oxígeno
D.O: Densidad Óptica
D.O.600nm: Densidad Óptica o absorbancia a una longitud de onda de 600 nm
mg.L-1: Miligramos por litro
g.L-1: Gramos por litro
UFC.mL-1: Unidades Formadoras de Colonias por mililitro
dNTP: Deoxiribonucleótidos trifosfato
DCPH: Diclorofenol-hidroxilasa
DTT: 1, 4 Ditio – 1 – treitol
EHD: Descargas Electro – Hidráulicas
EPA: Environmental Protection Agency
mM: miliMolar
MMS: Medio Mínimo Suplementado
MTC: Concentration Maxima Tolerable
NCBI: National Center for Bioinformatics
NADH: Nicotinamin – Adenín Dinucleótido Reducido
PCR: Polymerase Chain Reaction
RDP: Ribosomal Database Project
rpm: revoluciones por minuto
SEM: Microscopia Electrónica de Barrido
TSA: Agar Tripticasa Soja
TSB: Caldo Tripticasa Soja
UV: Ultravioleta
VR: Villanueva del Río
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INDICE
1.1 Antecedentes 1
1.2 Marco Teórico 3
1.2.1 Características, obtención y usos del fenol 3
1.2.2 Efectos en el medio ambiente 4
1.3 Generalidades de la Industria productora de corcho y sus aguas
residuales
4
1.3.1 Características químicas del corcho 5
1.3.2 Características del agua residual de la industria del corcho 5
1.4 Tratamientos para aguas contaminadas con compuestos fenólicos 6
1.4.1 Métodos físico-químicos 6
1.4.2 Métodos biológicos 6
1.4.2.1 Biodegradación bajo condiciones aerobias 7
1.4.2.2 Degradación bajo condiciones anaerobias 7
1.4.3 Mejora de la degradación de compuestos fenólicos 8
1.5 Estudios preliminares 9
2. Objetivos 10
3. Materiales y Métodos 11
3.1 Material Biológico 11
3.1.1 Cepas bacterianas utilizadas y procedencia de las mismas 11
3.1.2 Identificación de microorganismos 11
3.2 Tolerancia a fenol y clorofenoles en medio de cultivo rico 12
3.3 Resistencia a fenol y clorofenoles en medio mínimo 12
3.4 Determinación de fenoles/polifenoles mediante método
espectrofotométrico
12
3.5 Degradación de Fenol 13
3.6 Formación de biofilms en partículas de corcho 13
3.7 Optimización de las condiciones para la biodegradación de fenol 14
3.8 Ensayos de toxicidad aguda con semillas de alfalfa ( Medicago
sativa)
14
3.9 Mejora del proceso de auto-biorremediación por métodos
moleculares
15
4. Resultados 17
4.1 Identificación de bacterias procedentes de aguas residuales del
procesamiento del corcho
17
4.2 Tolerancia a fenol y clorofenoles en medio TSA 18
4.3 Resistencia a fenol y clorofenoles en medio mínimo 18
4.4 Degradación de fenol en solución acuosa 19
4.5 Consorcios 20
4.6 Degradación de compuestos fenólicos en “muestras reales” de aguas
residuales del procesado del corcho
22
4.7 Formación de biofilms en partículas de corcho 23
4.8 Mejora del proceso de auto-biorremediación por métodos
moleculares
25
4.9 Ensayos de toxicidad de semillas de alfalfa (Medicago sativa) 27
10
5. Discusión 28
6. Conclusiones 31
7. Bibliografía 32
1
1.1 Antecedentes
El rápido crecimiento de las industrias químicas y del sector petrolero está acompañado
del aumento en la generación de residuos, los cuales pueden traer consecuencias
indeseables para el ecosistema y la salud pública. Estos compuestos son dispuestos de
manera indiscriminada en el medio ambiente y muchas veces pueden permanecer en él
largos períodos de tiempo (Ahumada y Gómez, 2009).
Los compuestos fenólicos requieren una relevante atención en el estudio de la
contaminación del ambiente, debido a su toxicidad y prevalencia en agua y suelo. En la
naturaleza, estos contaminantes se generan por procesos de humificación y degradación
de proteínas. Su incremento ambiental se ve reflejado por la quema de bosques
(Morrison, 1998). Sin embargo, la mayor cantidad de compuestos fenólicos es liberada
al ambiente a causa de la actividad industrial y la comercialización de productos que lo
contienen (ATSDR, 2008a,b). Son compuestos químicos ampliamente utilizados en la
industria farmacéutica, papelera, de plásticos, textil, de refinamiento de petróleo, entre
otras. Se utilizan en la preparación de antisépticos, tintas, resinas, biocidas, aceites y
otros semejantes (Ahumada & Gómez, 2009).
Estos compuestos son reportados como contaminantes peligrosos de prioridad relevante
por diferentes instituciones nacionales e internacionales. La Agencia de Protección
Medioambiental de los Estados Unidos (USEPA), considera once compuestos fenólicos
como contaminantes prioritarios: pentaclorofenol, 2,4,6-triclorofenol, 2,4-diclorofenol,
2-clorofenol, fenol, 4,6-dinitro-2-metilfenol, 2,4-dinitrofenol, 2-nitrofenol, 4-nitrofenol,
4-cloro-3-metilfenol y 2,4-dimetilfenol (Silva, 2000). La Agencia para Sustancias
Tóxicas y Registro de Enfermedades (ATSDR) ha reportado los efectos adversos que
presenta la ingestión de fenol en la salud humana, mencionando que puede causar la
muerte al ingerir cantidades de 1 a 32 g (ATSDR, 2008a). La baja volatilidad del fenol y
su solubilidad con el agua hacen que el consumo de agua contaminada sea un gran
peligro en la salud (Prpich & Daugulis, 2005; Agarry & Solomon, 2008). Además de ser
un compuesto tóxico para los seres humanos, es una amenaza tanto para la vida acuática
como para la terrestre, pues su presencia en diversos ambientes impide un desarrollo
adecuado de organismos que viven en estos medios, causando alteraciones en el
2
ecosistema (Annachhatre & Gheewala, 1996).
Por lo tanto, es necesario eliminar los compuestos fenólicos de efluentes industriales
antes de ser descargados al medio ambiente (Kanekar et al., 1999; Suárez et al., 2007).
Se han buscado diferentes alternativas para el tratamiento de estos contaminantes. La
biorremediación de ambientes contaminados representa una alternativa amigable con el
medio ambiente, siendo ésta una herramienta ampliamente utilizada por organismos
internacionales como la EPA para el tratamiento de este tipo de residuos, ya que resulta
ser menos costosa, se aplica a áreas grandes y es relativamente sencilla. La
biorremediación permite que los microorganismos transformen o degraden compuestos
peligrosos que se encuentran en agua y suelos (Muñoz et al., 2001). Muchas especies
de microorganismos han sido aisladas y caracterizadas como organismos degradadores
de compuestos fenólicos, tales como Pseudomonas, Serratia marcescens, Bacillus
subtilis y Bacillus brevis, y Candida tropicalis, siendo capaces de utilizar estos
compuestos como única fuente de carbono y energía (Jiang et al., 2004).
Sin embargo, uno de los problemas que presenta trabajar con fenol como única fuente
de carbono, es que el crecimiento microbiano puede sufrir una inhibición por el sustrato,
debido a que es usado en altas concentraciones; para evitar este problema se puede
colocar una fuente convencional de carbono, como glucosa, extracto de levadura o
glutamato de sodio. Este tipo de compuestos incrementan la tolerancia celular al
sustrato, mejorando además la biodegradación de fenol. Otros métodos pueden ser
modificar microorganismos genéticamente o la inmovilización celular (Mamma et al.,
2004).
La aplicación de consorcios microbianos para procesos de biorremediación es
considerada beneficiosa pues tiene algunas ventajas con respecto a los cultivos puros
(Ambujom, 2001). Sin embargo, es necesario trabajar con comunidades microbianas
nativas compuestas, puesto que son capaces de realizar una mineralización completa de
fenoles, transformándolos a anhídrido carbónico (CO2) y agua (H2O) sin ningún residuo
tóxico (Saravanan et al., 2008a). Otra ventaja de trabajar con consorcios microbianos es
mantener la estabilidad en el cultivo incrementando así sus capacidades metabólicas
(Ambujom, 2001).
3
Se puede aumentar la tasa de degradación de fenol (Ambujom & Manilal, 1995;
Cordova et al., 2009) y permitir que el consorcio supere limitaciones para la completa
biodegradación de este tipo de compuestos tóxicos (Ambujom, 2001).
1.2 Marco Teórico
1.2.1 Características, obtención y usos del fenol
La ATSDR de los Estados Unidos (2008b) describe al fenol como un sólido incoloro a
blanco cuando se encuentra en forma pura. A temperatura ambiente tiene una presión de
vapor baja y es una masa cristalina clara o ligeramente rosada, polvo blanco o líquido
espeso. Es muy soluble en alcohol y ligeramente soluble en agua. El fenol en su
preparación comercial es un líquido que se evapora más lentamente que el agua. Su olor
es alquitranado y dulce (ATSDR, 2008c).
La fórmula química del fenol es C6H5OH. Posee un anillo bencénico y un grupo
hidroxilo sustituyendo uno de los átomos de hidrógeno. La presencia del anillo
bencénico confiere mayor estabilidad y esto puede producir que pierda con relativa
facilidad el hidrógeno de su grupo hidroxilo, permitiendo que se comporte como un
ácido débil (Ahumada & Gómez, 2009).
Reactividad del fenol: El fenol es sensible a agentes oxidantes. Puede sufrir múltiples
reacciones de sustitución electrofílica, como por ejemplo, halogenación y sulfonación.
Además, reacciona con compuestos carbonílicos, en medio ácido y básico. La
formación de resinas fenólicas es producto de la hidroximetilación con la subsecuente
condensación del fenol en presencia de formaldehído. Asímismo, el fenol puede
quemarse en presencia de oxígeno y producir monóxido de carbono (CO) como
producto de combustión incompleta, siendo éste ultimo un gas tóxico (Morrison &
Boyd, 1998).
Obtención de fenol: El fenol es un sustancia que se obtiene natural o manufacturada
químicamente (ATSDR, 2008b), por destilación fraccionaria del alquitrán de hulla y
también de cresoles (Morrison & Boyd, 1998; Consejería de Sanidad Región de Murcia,
4
2007). Además es sintetizado usando hidroperóxido de cumeno, ácido benzóico y
clorobenceno (Kanekar, 1999). La mayor cantidad de fenol producida es sintética; como
por ejemplo a través de la fusión del bencenosulfonato de sodio con álcali (proceso de
Dow). Así también, se lo puede obtener a partir de cumeno (Morrison & Boyd, 1998;
Busca et al., 2008). La producción de fenol alrededor del mundo se encuentra en una
tasa de 6 millones de toneladas por año.
1.2.2 Efectos en el medio ambiente
Tanto el fenol como los componentes fenólicos son comúnmente encontrados en
efluentes de procesos industriales, por ejemplo en aguas procedentes de refinerías (6 –
500 mg.L-1
), plantas petroquímicas (2,8–1 220 mg.L-1
), plantas de cerámica,
manufacturación de textiles, fungicidas y herbicidas (Rigo & Alegre, 2004; Tziotzios et
al., 2005; Busca et al., 2008; Saravanan et al., 2008a; Moussavi et al., 2009). Otras
fuentes de agua residual que contienen fenoles son las industrias farmacéutica,
producción de plásticos, productos de madera, pinturas, pulpas y papel, con cargas de
0,1–1 600 mg.L-1
(Busca et al., 2008).
Al ser los compuestos fenólicos descargados en cuerpos de agua, representan un alto
riesgo frente a organismos acuáticos. En concentraciones de 5 a 25 mg.L-1
pueden ser
tóxicos y/o letales para los peces (Annachhatre & Gheewala, 1996). En concentraciones
bajas, no permanecen ni en el aire, ni en el suelo o el agua superficial, esto se debe a que
reacciona fotoquímicamente en el aire y en el agua superficial y puede ser biodegradado
aeróbica y anaeróbicamente tanto en el agua como en el suelo (Morrison & Boyd,
1998).
1.3 Generalidades de la Industria productora de corcho y sus aguas residuales
El género Quercus, al cual pertenece el alcornoque, comprende unas 300 especies, de
las cuales en España tiene su óptimo ambiental media docena, entre ellas, y según la
clasificación científica el Quercus ilex, conocido como encina y el Quercus suber, o
alcornoque (Márquez y González, 1996).
Dentro de la producción mundial, España y Portugal son los países con mayor
5
producción anual de corcho, con un 22,7% y 50,5% respectivamente. De hecho, en
España la producción de corcho al año se sitúa alrededor de 85 000 toneladas, de las
cuales el 25% se destina a fábricas nacionales y el resto se dedica a la exportación. Las
industrias corcheras se manifiestan como el grupo industrial más pujante de todo el
sector forestal, ya que el alza constante de precios hace que siga siendo beneficioso el
tratamiento y especulación de este producto (Barroso y Lamas, 1998). En el tratamiento
del corcho hay empresas dedicadas a la preparación del mismo (fundamentalmente
situadas en Extremadura y Andalucía), mientras que otras empresas se dedican
exclusivamente a la transformación (la mayoría de ellas ubicadas en Cataluña)
(Sánchez, 2007).
1.3.1 Características químicas del corcho
Atendiendo a la composición química del corcho, se sabe que es la suberina la sustancia
más importante de la que está compuesto el tejido suberoso. Además de la suberina
(40%), el corcho se compone de componentes poliméricos como la lignina (22%) y
polisacáridos (celulosa y hemicelulosa, 20%). También lo componen ceras, taninos y
otros componentes extraíbles (Gil, 1997).
1.3.2. Características del agua residual de la industria del corcho
La primera etapa en el procesado del corcho consiste en hervir las planchas de corcho a
95-100º C durante aproximadamente 1 hora en grandes contenedores de tratamiento.
Con la finalidad de ahorrar agua, se utiliza el mismo volumen para hervir 10-15 partidas
de corcho. Como resultado de este tratamiento se generan grandes volúmenes de aguas
residuales, de un color negro. El agua del hervido del corcho se caracteriza
químicamente por las siguientes propiedades: alta demanda química de oxígeno (DQO
= 4,5-5,5 g L_1
), alta demanda biológica de oxígeno (DBO = 1,1-1,8 g L_1
), pH
ligeramente ácido (entre 5- 6,5) y un elevado contenido de compuestos fenólicos (0,6-
0,9 g L_1
) (Benitez et al., 2003; Domínguez et al., 2007; Pintor et al., 2011). La fracción
fenólica contiene compuestos como fenol, taninos, ácidos gállico, protocatecuico,
vaníllico, siríngico, ellágico, 2,4,6- tricloroanisol and pentaclorofenol, (Benítez et al.,
2003, 2006). Algunos de estos compuestos son de los más tóxicos según directrices de
la EPA.
6
1.4 Tratamientos para aguas contaminadas con compuestos fenólicos
1.4.1 Métodos Físico-Químicos
Los métodos más utilizados para el tratamiento de aguas procedentes de la industria del
corcho persiguen bien la separación de los compuestos fenólicos de la fase acuosa
(mediante procedimientos como destilación, extracción con solventes orgánicos,
adsorción, coagulación/floculación, etc.) o bien la destrucción de los compuestos
fenólicos mediante oxidación (la cual puede realizarse mediante oxidantes fuertes como
ozono, agua oxigenada, cloro, etc., o bien electroquímica o fotoquímicamente) (Tabla
1). Estos procedimientos son bastante costosos de manera que las pequeñas y medianas
empresas transportan el agua a estaciones de depuración centralizadas para compartir
los costes.
Tabla 1. Métodos físico-químicos utilizados en el tratamiento de aguas contaminadas
con compuestos fenólicos.
Clasificación Método Características Referencia
Métodos
Físicos
Destilación a 180º C Busca, 2008
Adsorción con carbono activado Berardinelli, 2008
Extracción con solventes Busca, 2008
Coagulación/Floculación con sulfato de aluminio Busca, 2008
Ultrafiltración con membranas Busca, 2008
Métodos
Químicos
Oxidación con ozono producto: ácido oxálico Busca, 2008
Oxidación con H2O2 bajo costo Pintor et al., 2011
Oxidación con perclorato Con electrodo de Ni Moodley et al., 2011
Oxidación con aire en presencia de Cu y Fe Mohan et al, 2007
Oxidación electroquímica necesita de medio ácido Mohan et al, 2007
Foto-oxidación usando TiO2 Busca, 2008
1.4.2 Métodos Biológicos
Existen varias cepas microbianas capaces de degradar compuestos fenólicos como:
Pseudomonas putida, Pseudomonas fluoroescens, Acinetobacter, Trichosporon
cutaneum, Bacillus brevis, Serratia marcescens, Bacillus subtilis, Rhodococcus
7
Figura 1. Rutas catabólicas centrales de compuestos aromáticos de microorganismos
aerobios (de Lorenzo y Rojo, 1994).
erythropolis, Actinomicetes, Nocardia hydrocarbonoxydans, entre otras (Hidalgo et al.,
2002; Arutchelvan et al., 2006). También han sido reportadas cepas de hongos con
actividad para biodegradar fenol como la levadura Candida tropicalis, Cryptococcus
elinivoii, etc. Algunos de estos hongos presentan un nivel de concentración inhibitorio
más alto, en comparación con muchas especies bacterianas degradadoras de fenol
(Busca et al., 2008).
1.4.2.1 Biodegradación bajo condiciones aerobias
La biodegradación bajo condiciones aerobias puede se produce principalmente por dos
vías metabólicas. La vía metabólica de la degradación de fenol comienza con la
hidroxilación del anillo en una posición orto, para formar catecol, mediante la acción de
la enzima fenol hidroxilasa. Este es el principal intermediario que resulta del
metabolismo del fenol por diferentes cepas de microorganismos (Agarry & Solomon,
2008). Dependiendo del tipo de cepa, el catecol sufre después una ruptura del anillo, el
cual puede suceder en la posición orto o meta, y de esta manera iniciar la vía metabólica
orto, que termina en la formación de succinil Co-A y acetil Co-A, o en la posición meta
que termina en la formación de piruvato y acetaldehído (Figura 1.) (Tziotzios et al.,
2005; Agarry & Solomon, 2008).
1.4.2.2 Degradación bajo condiciones anaerobias
Existen varias vías metabólicas de degradación de fenol bajo condiciones anaerobias; en
este caso el anillo aromático no es oxidado, pero sí reducido (Rigo & Alegre, 2004). En
condiciones mesófilas se han sugerido las siguientes vías, el fenol es convertido primero
a través de carboxilación para producir benzoato; después, es desaromatizado para
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formar ciclohexanocarboxilato, el cual es fraccionado para formar heptanoato y este es
posteriormente degradado a través de β-oxidación para formar valerato, propionato y
acetato, o directamente formar propionato y butirato, los cuales más tarde pueden ser
degradados en acetato. Estas vías metabólicas se basan en la presencia de enzimas que
realizan reacciones de carboxilación, descarboxilación y dehidroxilación durante la
degradación anaerobia (Fang et al., 2006). En otra vía metabólica de degradación, el
fenol es reducido en presencia de nitrato a ciclohexanona y después a n-caproato, el cual
subsecuentemente sufrirá una β-oxidación para formar ácidos grasos volátiles, como se
muestra en la Figura 2. (Fang et al., 2006). También, el fenol puede ser transformado a
benzoato por vía de carboxilación reductiva y después a través de la vía del benzoil-
CoA producir acetato e hidrógeno (Chen et al., 2008).
En el diseño de biorreactores se puede utilizar una primera etapa aerobia, seguida de un
biorreactor en condiciones anaerobias. Este tipo de sistema de biorreactores podrían
eliminar una concentración de fenol de 4 000 mg.L-1
hasta 0,02 mg.L-1
(Rittmann &
McCarty, 2001).
1.4.3 Mejoras en sistemas de degradación de fenol
El fenol puede ser usado como única fuente de carbono y energía por los
microorganismos, o en combinación con otros sustratos tales como extracto de levadura,
A B
Figura 2. A. Vía del benzoato:
degradación anaerobia del fenol
(Bell, J., Young, e., Stephens, S.,
2011). B. Degradación de fenol a
través de la vía de la
ciclohexanona (Fang et al., 2006).
9
glucosa, fructosa, glutamato de sodio, entre otros. La presencia de más de un
compuesto orgánico en el sistema puede afectar las funciones de biodegradación.
Muchos estudios han reportado los efectos inhibitorios o aumento en los sistemas de
degradación de fenol al adicionar glucosa o compuestos fenólicos (Ambujom, 2001). Al
colocar un co-substrato, se puede mejorar, disminuir o no afectar en la biodegradación
de contaminantes como el fenol (Bajaj et al., 2008b). Por ejemplo, Arutchelvan y
colaboradores (2006), pudieron observar que al adicionar un co-substrato (dextrosa) en
rangos de 0.2 – 0.8% (p/v), existe una reducción en la eficiencia de degradación de
fenol. El organismo ignora el fenol en presencia de dextrosa y el periodo de degradación
de fenol es retrasado.
Por otro lado, debido a las altas concentraciones de fenol que puede encontrarse en el
sistema, los microorganismos pueden sufrir inhibición, afectando su crecimiento (Lob
& Tar, 2000). Existen varios métodos que han sido propuestos para tratar aguas
residuales con altas cargas fenólicas. Entre estos métodos se incluye la adaptación de los
cultivos a altas concentraciones de fenol, uso de microorganismos genéticamente
modificados e inmovilización de cultivos. La inmovilización puede realizarse en
hidrogeles, carbón activado y membranas de fibras (Lob & Tar, 2000; Mamma et al.,
2004).
1.5 Estudios preliminares
Existen varios trabajos sobre la biorremediación de suelos y aguas contaminadas con
fenoles, en los cuales se aíslan bacterias capaces de vivir en ambientes hostiles para su
posterior uso como microrganismos degradadores de contaminantes. Sin embargo, la
información acerca de la biorremediación usando partículas de corcho como soporte
para la adhesión de bacterias es limitada (del Castillo et al., 2012; Hernández, 2011).
El trabajo de investigación realizado en el BIO-181 (Hernández, 2011) denominado
“Auto-biorremediación de aguas residuales del procesamiento del corcho por bacterias
degradadoras de fenol inmovilizadas en partículas de corcho” ha servido de base para la
realización del presente trabajo. En estos estudios previos se aislaron e identificaron
bacterias del agua residual del hervido del corcho, capaces de degradar compuestos
10
fenólicos. Varias de estas bacterias presentaron elevada resistencia a fenol y
clorofenoles, siendo las cepas BAE9A y BAC4 las que mostraron una mayor tasa de
degradación de los mismos, tanto individualmente como en consorcios. La
inmovilización de bacterias en partículas residuales de corcho, junto con el uso de
consorcios bacterianos bajo determinadas condiciones de incubación, ha demostrado ser
un método adecuado y de bajo coste para la auto-biorremediación de este residuo. En
este trabajo de avanza un paso más en el proceso de auto-biorremediación
optimizándose las condiciones para una óptima remoción de la fracciones fenólicas en
aguas residuales del procesamiento del corcho.
2. OBJETIVOS
Diseñar un sistema de auto-biorremediación efectivo de aguas residuales del
procesamiento del corcho.
Optimizar las condiciones de auto-biorremediación.
Analizar la degradación de compuestos fenólicos en el agua de corcho.
Probar la calidad del agua tratada mediante un test de fitotoxicidad.
Realizar modificaciones genéticas en bacterias para mejorar la biodegradación.
11
3. MATERIALES Y MÉTODOS
3.1 Material Biológico
3.1.1 Cepas bacterianas utilizadas y procedencia de las mismas
Se utilizaron bacterias aisladas de las balsas de aguas residuales del procesamiento del
corcho procedentes de la empresa de Aglomerados Morell, S.A (Villanueva del Río,
Sevilla).
Las muestras obtenidas se enriquecieron con medio TSB en una proporción 9:1. El agua
residual enriquecida se incubó 48h a 28º C y transcurrido ese período se aislaron las
bacterias. Luego del recuento de microorganismos de las muestras, se aislaron aquellos
que presentaron colonias diferentes tras incubarse 24h a 28º C en placas con medio
TSA. Las cepas aisladas en este estudio fueron denominadas como: VR1, VR2 y VR3,
haciendo referencia al sitio de recolección de muestras de agua de corcho (Villanueva
del Río, Sevilla). Finalmente los microorganismos fueron identificados tanto por sus
características morfológicas como moleculares. Las cepas BAE 9A y BAC4 pertenecen
a la colección de bacterias del BIO-181 (Hernández, 2011; del Castillo et al., 2012).
3.1.2 Identificación de microorganismos
Las bacterias aisladas se caracterizaron de forma preliminar mediante tinción de Gram
(Bergey, Holt, Krieg, & Sneath, 1994). La identificación se realizó mediante la
secuenciación del rDNA 16S.
Extracción de ADN: para realizar este procedimiento se empleó el kit de extracción
i.genomic CTB DNA Extraction Mini Kit Intron Biotechnology, siguiendo las
instrucciones del fabricante.
PCR 16S: Se amplificó la región ribosómica 16S. La reacción se preparó con las
siguientes concentraciones de reactivos en un volumen final de 25 uL: buffer a una
concentración final de 1X, 1,5 mM de MgCl2, 0,2 uM de cada dNTP, 0,4 uM de cada
uno de los primers específicos, 0,5 U/reacción de la enzima Taq polimerasa y 1 uL de
ADN a una concentración aproximada de 40 ng/uL. La reacción en el termociclador fue
de 2 min a 95º C, seguido de 31 ciclos de 45 seg a 95º C, 45 seg a 58º C y 45 seg a 72º
C, con un periodo de elongación final de 10 min a 72º C. El resultado obtenido se
12
sometió a electroforesis en gel de agarosa al 1% durante 30 min a 100V . El producto de
la PCR se secuenció para determinar el género y posible especie. Las secuencias
obtenidas se compararon con las bases de datos de secuencias disponibles, Ez – Taxon,
RDP y también se utilizó la herramienta BLAST de la página WEB del NCBI, de este
modo se buscaron las secuencias altamente homologas de la base de datos de
nucleótidos no redundante (nr).
3.2 Tolerancia a fenol y clorofenoles en medio de cultivo rico
La tolerancia de los aislamientos a fenol y clorofenoles se determinó en el medio TSA
suplementado con concentraciones crecientes de estos compuestos, que van desde 0 –
25 mM (fenol), 0- 3 mM (4 –clorofenol) y 0- 2 mM (2,4 –diclorofenol). Las placas
fueron incubadas a 28º C durante 3 a 4 días. La tolerancia se expresó según el índice
MTC, que es la máxima concentración del tóxico que permite el crecimiento bacteriano.
3.3 Resistencia a fenol y clorofenoles en medio mínimo
La resistencia de los aislamientos a fenol y clorofenoles se determinó en medio mínimo
sólido (Foght et al., 1989) suplementado con una concentración mínima de TSA
equivalente al 10% (v/v) con objeto de suministrarle una mínima dosis de carbohidratos.
A este medio se le adicionaron diferentes concentraciones de contaminantes: fenol (0-25
mM), clorofenol (0-2 mM) o 2,4-diclorofenol (0,1 mM-1mM). Las placas fueron
incubadas a 28º C por 72h, tras los cuales se evaluó el crecimiento.
3.4 Determinación de fenoles/polifenoles mediante métodos espectrofotométricos
Se realizaron varias curvas de calibración para determinar la concentración de fenoles
totales a partir de soluciones “stock” de 1000 ppm de: ácido tánico, ácido cafeico y
fenol (dado que el agua del procesado del corcho es una mezcla compleja, el contenido
de polifenoles se expresa en función de estos compuestos). La determinación de fenoles
totales se realizó por el método un método colorimétrico (Kinsley y Nicell, 1999). Se
añadieron reactivos en el siguiente orden: 700 uL de NaHCO3 0,25 mM, 100 uL de
muestra, 100 uL de 4-AAP 20,8 mM y 100 uL de ferricianuro de potasio 83,4 mM.
13
Después de 6 min, se leyó la absorbancia a 510 nm y la concentración de fenol se
determinó a partir de una curva estándar.
3.5 Degradación de Fenol
- Protocolo 1: Degradación de fenol en solución acuosa. Las bacterias se cultivaron
en matraces que contenían 25 mL de medio mínimo (Foght et al. 1989)
suplementado con TSB (10% v/v) y fenol (2,5 mM) durante 72 h a 28ºC en
agitación constante a 200 rpm. La cantidad de inoculo para cada cepa fue de 100 uL
de las cepas bacterianas (aprox. 108 C.F.U. /mL); alícuotas de 2 mL fueron tomadas
en intervalos de 2 horas para medir la D.O a 510 nm y determinar el crecimiento
bacteriano. Las alícuotas fueron centrifugadas a 10.000 rpm durante 10 minutos y la
concentración de fenol se determinó en el sobrenadante por el método colorimétrico
de Nicell (Kinsley y Nicell, 1999).
- Protocolo 2: Degradación de fenol por bacterias inmovilizadas en partículas de
corcho. Una colonia bacteriana fue inoculada en 2 mL de TSB y se incubo a 28º C
por 24 h en agitación. Luego en un tubo eppendorf se tomó 60 uL de la suspensión
bacteriana en medio TSB y se mezcló con 850 uL de medio mínimo, 100 uL de
medio TSB y 150 uL de fenol (1 mM) y partículas de corcho estériles y se incubó a
28 ° C en agitación constante a 200 rpm. Como control se usó 150 uL de fenol en 1
mL de medio estéril. Después de 10 días de incubación las partículas de corcho se
pasaron por un colador. El sobrenadante se centrifugó 10000 rpm por 15 min para
evitar interferencias en la determinación del fenol mediante el método colorimétrico
(Kinsley y Nicell, 1999).
3.6 Formación de “biofilms” en partículas de corcho
Las partículas de corcho fueron recogidas en terrenos de la industria del corcho. Se
homogenizaron con una máquina moledora de café, se pasaron por un tamiz de 0,5 mm,
se lavaron con 25 mL de HCl (1mM) por 10 min y se neutralizó el pH con un volumen
apropiado de NaOH (1M). Posteriormente, se realizaron 5 lavados con agua estéril y se
secaron al aire. Las partículas de corcho (0,01 gr) se inocularon con 1 mL de medio
mínimo conteniendo TSB (10% v:v), fenol (1 mM) y 60 uL de inóculo bacteriano. Esta
14
mezcla se incubó a 28º C por 10 días en agitación constante de 200 rpm. Transcurrido
este tiempo las partículas de corcho se lavaron 5 veces con agua destilada estéril y se
fijaron durante la noche en presencia de OsO4. La formación de biofilms en partículas
de corcho fue analizada por SEM (Microscopia Electrónica de Barrido). Para ello, las
partículas previamente fijadas fueron tratadas con Au para ser observadas en un
microscopio electrónico de barrido Jeol 6460LV.
3.7 Optimización de las condiciones para la biodegradación del fenol
En base a los resultados obtenidos de la resistencia y degradación de fenol, así como la
capacidad de formación de “biofilms” en la superficie del corcho (Hernández, 2011) se
seleccionó las cepas BAE9A y BAC4 para determinar las condiciones óptimas en el
proceso de degradación de fenol en aguas residuales del corcho. También se probaron
las cepas VH1, VH2 y VH3 en distintos consorcios bacterianos. Se usaron tres tipos de
controles: agua de corcho estéril, agua de corcho con medio TSB en proporción (50 mL:
5 mL) y agua de corcho, TSB y 500 uL de H2O2. Las condiciones usadas para este
ensayo fueron:
Agua de corcho + TSB + BAE9A
Agua de corcho + TSB + consorcio (BAE9A, BAC4,VR1,VR2 y VR3)
Agua de corcho + TSB + H2O2 + BAE9A
Agua de corcho + TSB + H2O2 + BAE9A + BAC4
Agua de corcho + TSB + H2O2 + BAE9A + VR1
Agua de corcho + TSB + H2O2 + BAE9A + VR2
Agua de corcho + TSB + H2O2 + BAE9A + VR3
Agua de corcho + TSB + H2O2 + consorcio
Agua de corcho + TSB
Agua de corcho + TSB + H2O2
Las cepas fueron incubadas 10 días a una temperatura de 28º C, luz y en agitación
constante a 200 rpm. Se cuantificó la cantidad de polifenoles totales (Kinsley y Nicell,
1999) usando como estándar el ácido tánico y el fenol, respectivamente.
3.8 Ensayos de Toxicidad aguda con semillas de alfalfa (Medicago sativa)
En este ensayo se evaluó el efecto fitotóxico de una solución post-remoción
(AC+TSB+BAE9A+H2O2) en la germinación de semillas de alfalfa. Como control
15
negativo se utilizó agua estéril. El ensayo se realizó 2 veces con un n = 5 para cada
tratamiento.
En cápsulas de Petri de 100 mm de diámetro, previamente esterilizadas se colocaron 3
mL de las soluciones a evaluar. Luego, con la ayuda de una pinza, se colocaron
cuidadosamente 100 semillas en cada placa. Las semillas fueron previamente
preparadas con varios lavados de una solución de HCl 0.001% v/v y lavados con agua
destilada tibia para romper la dormancia de las mismas; finalmente se las dejó en agua
destilada toda la noche. Posteriormente cada cápsula fue tapada y colocada en una caja
plástica envuelta en papel para evitar la entrada de luz, ya que dichas semillas requieren
de oscuridad para germinar (semillas fotoblásticas negativas). Las cajas fueron
incubadas durante 5 días en cámara a una temperatura de 25 ± 2 °C. Terminado el
período de exposición, se registró el número de semillas germinadas, considerando
como criterio de germinación la aparición visible de la radícula.
3.9 Mejora del proceso de auto-biorremediación por métodos moleculares
Dado que la cepa BAE9A (Acinetobacter soli) es la que muestra mayores tasas de
resistencia y degradación de fenol (Hernández, 2011) se hizo una búsqueda en la base
de datos del NCBI para obtener la secuencia que codifica la dicloro-fenolhidroxilasa
(DCPH). Sin embargo, al no encontrar el genoma completo de Acinetobacter soli en la
librería genómica del NCBI, se escogió a Acinetobacter baumanii como organismo base
para los ensayos moleculares. La cepa utilizada fue Acinetobacter baumanii ATCC
17978, cuya secuencia referencial en el NCBI es: NC_009085.1.
Técnicas genéticas
Extracción de ADN: para realizar este procedimiento se empleó el kit de extracción
i.genomic CTB DNA extraction mini kit, siguiendo las instrucciones del fabricante.
PCR DCPH: se diseñaron 4 parejas de cebadores para este ensayo. Los cebadores se
detallan a continuación (Tabla 2).
16
Las condiciones utilizadas para una reacción con final de 25 uL fueron: buffer 10x, 1
mM de MgCl2, 1 uM de dNTP, 1uM de cada primer, 0,2 U/reacción de la enzima
Ecotaq y 2 uL de ADN en una concentración de 40 ng/mL. La reacción en el
termociclador fue de 2 min a 95º C, seguido de 35 ciclos de 45 seg a 95º C, 45 seg
utilizando un gradiente de temperaturas ± 2, cuya temperatura media fue de 55º C y 90
min a 72º C, con un período final de elongación de 5 min. El resultado obtenido se
observó en gel de agarosa 1%, 100V, 30 min.
La banda obtenida fue purificada con el Kit de extracción QIAquik Gel Extraction Kit
de QIAGEN. Se midió la concentración de ADN en el Nanodrop y el producto fue
secuenciado para posteriormente comparar su secuencia con la base de datos del NCBI.
Primer Secuencia (5’-> 3’) Tm (º C)
Cloro Fw ATGGAAATTGTTCGAGACTTGGGG 61.0
Cloro Rv CTAATTCCAACTAAGTATTGATGAAATTGCGC 63.1
Cloro EcoR1 Fw GAATTCCGTCCATCGCCATCCACCTTCGAATGG 72.0
Cloro EcoR2 Rv GAATTCGCATCACCCATACAGAAAACTCGACC 68.2
Lph Fw AGGCATCAAGATCACCGACTG 59.8
Lph Rv CGCCAGAACCATTTATCGATC 57.9
Dcph degenerado Fw GGGSGAGAACACCTATTGCAC
61.8
Dcph degenerado Rv GAGTTCGCGCCGTCGGCKCC 68.6
Tabla 2. Secuencias y temperaturas de alineamiento de los cebadores diseñados para la
amplificación de la DCPH.
17
4. RESULTADOS
4.1 Identificación de bacterias procedentes de aguas residuales del procesamiento
del corcho
Inicialmente las bacterias aisladas fueron identificadas por tinción de Gram (Begey,
Holt, Krieg, & Sneath, 1994) y rDNA 16S (Tabla 3 y Figura 3). Las secuencias
obtenidas se compararon con las bases de datos de secuencias disponibles (Ez-Taxon,
RPD, BLAST). Los resultados indican que las bacterias correspondían a un bacilo
gram-negativo (Acinetobacter), tres bacilos gram-positivos (géneros Bacillus y
Microbacterium) y un estafilococo (Tabla 3).
Tabla 3. Identificación de bacterias por Tinción de Gram y rDNA 16S
CEPA GRAM 16 S ( NCBI/ Ez – Taxón - RDP)
BAE9A Cocobacilos Gram - Acinetobacter soli 99%
BAC4 Cocos Gram + Staphylococcus saprophyticus 99%
VR1 Bacilos Gram + Microbacterium oxydans 99%
VR2 Bacilos Gram + Microbacterium hydrocarbonoxydans 99%
VR3 Bacilos Gram + Bacillus weihenstephanensis 99%
Figura 3. Tinción Gram
de bacterias. A) Cepa
BAE9A. B) Cepa BAC4.
C) Cepa VR1. D) Cepa
VR2 E) Cepa VR3.
18
4.2 Tolerancia a fenol y clorofenoles en medio de cultivo TSA
Se probó la resistencia a compuestos fenólicos en las cepas: BAE9A, BAC4, VR1, VR2
y VR3. La resistencia a fenol, 4-clorofenol y 2,4 diclorofenol fue variable. Las cepas
que registraron los valores de resistencia más altos a fenol fueron: BAE9A, BAC4 y
VR2, cuya concentración máxima de tolerable fue de 25 mM. La cepa BAC4 mostró el
valor más alto de tolerancia a 4-clorofenol (2,5 mM). Finalmente la cepa que registró la
resistencia más alta a 2,4 diclorofenol fue la cepa BAC4 (2 mM). (Tabla 4 y Figura 4).
Tabla 4. Tolerancia a fenol de las cepas bacterianas A. baumanii, BAE9A, BAC4,
VR1, VR2 y VR3.
Figura 4. Imagen de placas control y bacterias resistentes a diferentes concentraciones
de fenol, 4-clorofenol y 2,4-diclorofenol
4.3 Resistencia a fenol y clorofenoles en medio mínimo
Se probó la resistencia a fenol, 4-clorofenol y 2,4 diclorofenol de las cepas: BAE9A,
BAC4, VR1, VR2 y VR3 en placas que contenían medio mínimo y los contaminantes
CEPA
Máxima identidad ( 16S r DNA)
CMT (mM)
Fenol 4 – clorofenol 2,4 – diclorofenol
BAE9A Acinetobactersoli 99% 25 mM 1.5 mM 0.5 mM
BAC4 Staphylococcus saprophyticus 99% 25 mM 2.5 mM 2 mM
VR1 Microbacterium oxydans 99% 10 mM 0.5 mM 0.1 mM
VR2 Microbacterium hydrocarbonoxydans 99% 25mM 1 mM 0.5 mM
VR3 Bacillus weihenstephanensis 98% 10 mM 1 mM 0.1 mM
19
como única fuente de carbono. Las cepas BAE9A, BAC4, VR1 y VR2 fueron las que
mostraron la mayor resistencia a fenol (15 mM). Las cepa BAE9A mostró la resistencia
más alta a 4-clorofenol (1mM). Ninguna de las cepas resistió a concentraciones de 2,4-
diclorofenol por encima de 0,1 mM en medio mínimo (Tabla 5 y Figura 5).
Tabla 5. Tolerancia a fenol, 4-clorofenol y 2,4 diclorofenol de las cepas bacterianas
BAE9A, BAC4, VR1, VR2 Y VR3
Figura 5. Imagen de placas de bacterias resistentes a diferentes concentraciones de
Fenol y 4-clorofenol
4.4 Degradación de fenol en solución acuosa.
Las cepas fueron cultivadas en medio mínimo (conteniendo un 10% de medio TSB)
suplementado con 2,5 mM de fenol. Se midió la DO600 nm como un parámetro de
crecimiento bacteriano. Por otro lado, se evaluó la desaparición de fenol en el medio de
cultivo. Los resultados se muestran en la Figura 6. La capacidad de crecer con fenol
varía entre cepas. Las cepas que mostraron una tasa de crecimiento rápido en presencia
de fenol fueron las cepas BAE9A y VR3. El resto de cepas (BAC4, VR1 y VR2)
CEPA
Máxima identidad ( 16S r DNA)
CMT (mM)
Fenol 4 – clorofenol 2,4 diclorofenol
BAE9A Acinetobactersoli 99% 15 mM 1 mM <0.1 mM
BAC4 Staphylococcus saprophyticus 99% 15 mM 0.5 mM <0.1 mM
VR1 Microbacterium oxydans 99% 10 mM 0.5 mM <0.1 mM
VR2 Microbacterium hydrocarbonoxydans 99% 15 mM 0.5 mM <0.1 mM
VR3 Bacillus weihenstephanensis 98% 15 mM 0.5 mM <0.1 mM
20
mostraron un retraso del crecimiento de 4h aproximadamente. Las cepas BAE9A y
BAC4 parecen ser las bacterias degradadoras de fenol más eficientes (Figura 7).
4.5 Consorcios
Se probaron distintas condiciones con el fin de evaluar el consumo de fenol en medio
mínimo líquido cuando se forman consorcios. En los consorcios bacterianos formados,
se usó BAE 9A como cepa principal por su alta tasa de degradación de fenol
(Hernández, 2011, del Castillo et al., 2012). Los consorcios bacterianos formados
Figura 7. Porcentaje de fenol remanente en el medio líquido tras la incubación en
presencia de distintas cepas bacterianas.
Figura 6. Consumo de
fenol por bacterias aisladas
de aguas residuales del
procesamiento del corcho.
21
fueron: BAE9A/BAC4, BAE9A/VR1, BAE9A/VR2, BAE9A/VR3 y
BAE9A/BAC4/VR1/VR2/VR3. Previo al ensayo, se cultivaron a todas las cepas
bacterianas juntas en medio TSB líquido. Se realizaron varias diluciones y se las hizo
crecer en placas con medio TSA para verificar que no haya ningún efecto inhibidor
entre ellas y sea procedente la formación de consorcios. Las 5 morfologías distintas se
observan en la Figura 8.
Las condiciones evaluadas fueron:
1. Control 2. Mm+Fenol+BAE9A
3. Mm+Fenol+BAE9A+BAC4
4. Mm+Fenol+BAE9A+VR1
5. Mm+Fenol+BAE9A+VR2
6. Mm+Fenol+BAE9A+VR3
7. Mm+Fenol+(BAE9A+BAC4+VR1+VR1+VH2)
Figura 8. Cepas bacterianas cultivadas en placa con TSA, dilución 10-2
Las cepas fueron cultivadas en medio mínimo que contenía Fenol 2,5 mM. Las
condiciones de incubación fueron: 48 h, luz, 28º C y agitación a 200 rpm. Se evaluó el
porcentaje de fenol residual luego de 24 h de incubación. Los resultados se muestran en
la Figura 9. El consorcio formado por las cepas: BAE9A, BAC4, VR1, VR2 y VR3 fue
el que mostró el menor porcentaje de fenol residual (18,8%), seguido del tratamiento
formado únicamente por la cepa BAE9A (22,4%). El resto de condiciones mostraron un
porcentaje de fenol residual entre el 30 y 40% aproximadamente.
22
4.6 Biodegradación de compuestos fenólicos en “muestras reales” de aguas
residuales del procesado del corcho
Las condiciones óptimas que permiten a las cepas BAE9A, BAC4, VR1, VR2 y VR3
degradar compuestos fenólicos con mayor eficiencia incluyen: la adición de una fuente
mínima de carbono (TSB) al agua de corcho en una proporción 1:10; la adición de H2O2
en una proporción 1/100; luz, agitación constante e incubación a 28º C. Luego de 10
días de incubación se midió la concentración de polifenoles totales en el agua de corcho
usando un método de colorimétrico. Como control se determinó el contenido inicial de
fenoles en las aguas residuales a tiempo cero (100%). Se realizaron los cálculos para ver
que condición fue la más eficiente en cuanto a consumo de polifenoles. El tratamiento
con la cepa BAE9A fue el que mostró una mayor degradación de polifenoles totales,
con un porcentaje de remoción del 70,66% (polifenoles totales remanentes 12.94 mg/L)
(Figura 10). Todos los consorcios bacterianos mostraron una remoción significativa de
polifenoles en muestras de agua de corcho, sin embargo, los consorcios bacterianos
más eficaces en la remoción de polifenoles fueron: consorcio formado por todas las
cepas (BAE9A, BAC4, VR1, VR2 y VR3) con un porcentaje de remoción del 63,5%
(polifenoles totales remanentes 16,09 mg/L), seguido del consorcio formado por la cepa
BAE9A/BAC4, con un porcentaje de remoción del 60,8% (polifenoles totales
remanentes 17,28 mg/L) (Figura 11). La adición de H2O2 disminuye el color, mejorando
el aspecto para posibles usos futuros.
Figura 9. Porcentaje de fenol residual en las diferentes condiciones evaluadas
23
4.7 Formación de “biofilms” en partículas de corcho
Los biofilms se crean cuando las bacterias libres flotantes perciben una superficie, se
adhieren a ella y, a continuación, elaboran señales químicas para coordinar
diferenciación y formación de estructura, incluyendo el desarrollo de una cubierta
polisacárida protectora (Carvalho et al., 2001). Los biofilms están estructurados
principalmente por grandes colonias de bacterias sésiles incrustadas en una matriz
polimérica extracelular o glicocálix. Las células bacterianas, que componen el 15%-
Figura 10. Concentración y porcentaje de polifenoles totales en muestras de agua de
corcho luego de 10 días de tratamiento (la barra roja corresponde al control a tiempo cero).
Figura 11. A. Detección de polifenoles por el método colorimétrico. B. Agua
de corcho no tratada y tratada.
A B
24
20% del volumen, no se dividen en el interior de los biofilms, lo cual podría atribuirse al
hecho de adoptar un fenotipo alterado, diferente al de las mismas bacterias en estado de
libre flotación.
En el proceso de fabricación del corcho se desprenden pequeñas partículas residuales
del mismo, las cuales pueden servir a las bacterias como superficie de adhesión para la
formación de biofilms. La capacidad de formar “biofilms” en la superficie de las
partículas de corcho fue evaluada. Como puede observarse en la Figura 12, las
partículas de corcho incubadas en presencia del consorcio bacteriano (BAE9A, BAC4,
VR1, VR2 y VR3) presentaban una coloración crema debido a que estaban
completamente recubiertas por una película bacteriana. La estructura del corcho
contiene una gran superficie de pared celular vegetal que parece ser un material
adecuado para inmovilización bacteriana.
Figura 12. Partículas de corcho antes y después de la incubación con el consorcio
bacteriano (BAE9A, BAC4, VR1, VR2 y VR3)
La formación de biofilms se observó mediante SEM. Se observó sobre las partículas de
corcho, la presencia de varias morfologías bacterianas correspondientes a las cepas que
formaron parte de los consorcios. Se ve claramente que las cepas BAE9A, BAC4 y VR2
son capaces de colonizar y crecer sobre la superficie de partículas de corcho residual,
con una cubertura superficial muy elevada (Figura 13).
25
Figura 13. Evaluación de la formación de “biofilms” sobre la superficie del corcho
por SEM. A. Control sin bacterias. B. Colonización de la superficie del corcho por las
cepas BAE9A, BAC4 y VR2.
4.8 Mejora del proceso de auto-biorremediación por métodos moleculares
Usando una cepa comercial de Acinetobacter baumanni se intentó amplificar, clonar y
sobreexpresar el gen que codifica a la 2-diclorofenolhidroxilasa (DCPH). El diseño de
los primers se realizó buscando, dentro de la secuencia codificante, una con un alto
contenido en GC. El tamaño de los primers estuvo entre 21 y 32 pb y la comprobación
de la idoneidad de los mismos se hizo usando el programa virtual OLIGOCALC.
Varias condiciones fueron probadas con el fin de ajustar las condiciones óptimas de
PRC. Todas las variantes utilizadas se muestran en la Tabla 6. Con la primera pareja de
primers Cloro1 y Cloro2, diseñados para amplificar el gen completo de la DCPH, se
obtuvo una banda de 1600 pb (tamaño esperado) (Figura 14). Sin embargo, al
secuenciar la banda, ésta no coincidió con la secuencia de la DCPH, sino que
correspondió a una tRNA- sintetasa (Tabla 6).
A B
26
Tabla 6. Condiciones de PCR probadas para cada pareja de primers e identificación de las bandas amplificadas.
NA: No aplica
Primer Rango de
Temperaturas
probadas y Tº
utilizada (Tº u)
MgCl uL DMSO uL ADN uL Tamaño de la banda Identificación
Cloro Fw
Cloro Rv
50,0 – 64,1 (52) 2 – 2,5 uL 1 uL 1 – 2,5 uL 1500-1600 pb t-RNA sintetasa
Cloro EcoR1 Fw
Cloro EcoR2 Rv
59- 71 2 – 3,5 uL NA 1 uL Sin banda Sin homología
Lph Fw
Lph Rv
46 – 56 (46) 2 uL NA 1 uL 700 – 800 pb Genoma de
A. baumanii
Dcph degenerado Fw
Dcph degenerado Rv
53 – 63 (53) 2 uL NA 1 uL 700 – 800 pb Sin homología
27
4.9 Ensayos de toxicidad con semillas de alfalfa (Medicago sativa)
Se determinó la fitotoxicidad del agua del procesado del corcho antes y después del
tratamiento de auto-biorremediación. Para ello se evaluó la germinación de semillas de
alfalfa. Los resultados obtenidos se muestran en las Figuras 15 y 16. El tratamiento de
auto-biorremediación permitió incrementar la germinación (del 40 al 80%
aproximadamente). Estos resultados sugieren que el agua podría ser re-utilizada para
riego.
Figura 15. Porcentaje de germinación de semillas de alfalfa
bañadas con soluciones de agua de corcho tratada y no tratada
mediante el procedimiento de auto-biorremediación.
1600pb
Figura 14. Fragmento de PCR de 1 600 pb obtenido mediante la amplificación
con los cebadores CloroF y CloroR.
28
5. DISCUSIÓN
Las industrias corcheras se manifiestan como el grupo industrial más pujante de todo el
sector forestal, ya que el alza constante de precios hace que siga siendo beneficioso el
tratamiento y especulación de este producto. Sin embargo, el corcho natural contiene en
la estructura lignínica una serie de compuestos clorados que, durante el proceso de
cocción, se hidrolizan transformándose, entre otros, en pentaclorofenol, 2,4,6-
tricloroanisol y ácidos polifenólicos (Sánchez, 2007). La estabilidad de algunos anillos
aromáticos hace que estos compuestos sean resistentes a su degradación en el medio
ambiente y que se conviertan en contaminantes muy persistentes (Hughes & Cooper,
1996). Esta contaminación en el agua reviste gran importancia ya que, además de ser un
compuesto tóxico para los seres humanos, es una amenaza tanto para la vida acuática
como para la terrestre (Annachhatre & Gheewala, 1996). Por tal motivo se han
desarrollado varias tecnologías de remediación encaminadas a eliminar contaminantes
orgánicos tóxicos y persistentes o simplemente reducir su concentración hasta niveles
permitidos.
La Biorremediación ha sido una alternativa favorable en relación a los métodos físico-
químicos debido a que estos últimos resultan ser costosos y producen compuestos
secundarios más tóxicos que los compuestos fenólicos propiamente dichos (Arutchelvan
Figura 16. Semillas de alfalfa bañadas con agua de corcho. Izda. Semillas
germinadas en presencia de agua de corcho sin tratar. Dcha. Semillas
germinadas en agua con agua de corcho tratada.
29
et al., 2006). Existen varios trabajos relacionados con la biorremediación de aguas
contaminadas con compuestos fenólicos a nivel mundial. Sin embargo, es indispensable
llevar a cabo estudios propios para la determinación de consorcios eficientes que estén
bien adaptados a las condiciones en las que van a cumplir su función y que no
representen un peligro para el ecosistema.
Si bien se han realizado diversos estudios con cepas puras para la degradación de
compuestos (Hidalgo et al., 2002; Arutchelvan et al., 2006; Agarry & Solomon, 2008;
Busca et al., 2008; Cordova et al., 2009) el uso de consorcios bacterianos junto con la
capacidad de ciertos microrganismos de formar “biofilms” sobre superficies inertes
como partículas de corcho, ha aportado una nueva estrategia para aumentar la tasa de
degradación y superar limitaciones para una mejor biodegradación. En general, en los
procesos de biorremediación se ha comprobado que la formación de biopelículas
incrementa de forma considerable las tasas de eliminación de contaminante. Esta
formación permite a las bacterias la adhesión a superficies y les confiere mayor
resistencia a factores externos adversos.
Diferentes productos residuales han sido utilizados como soportes para inmovilizar
cultivos, tales como tuberías, columnas de relleno, carbón activado granulado, cáscara
de coco, etc. (Amuda e Ibrahim, 2006; Carvalho et al 2001; Chan et al, 2003; Eker y
Kargi, 2006; Shieh et al, 1990; Wobus et al, 1995). En este estudio se ha demostrado
que las partículas de corcho son un soporte adecuado y eficiente para las bacterias
utilizadas en la biodegradación de compuestos fenólicos, ya que presentan una gran
superficie por unidad de volumen. Además, al ser estas partículas desechos residuales
provenientes de la industria del corcho, su obtención representa un costo mínimo,
brindando una alta durabilidad que permite que no se colapse fácilmente. Asimismo, el
corcho muestra una elevada estabilidad química y termodinámica, así como una buena
capacidad de retención de metales pesados del agua. Por otro lado, dado que las
partículas de corcho flotan sobre soluciones acuosas, la eliminación del fenol se puede
hacer aeróbicamente, lo que incrementa la tasa de degradación de compuestos fenólicos.
Teniendo en cuenta que las cinco cepas probadas en esta investigación mostraron
niveles altos de degradación de fenol, se les consideró idóneas para la formación de
30
consorcios utilizados en ensayos de degradación de polifenoles en agua residual del
procesamiento del corcho. Las cepas BAE9A y BAC4 fueron las que arrojaron mejores
resultados tanto en resistencia a fenol, degradación de polifenoles en agua de corcho y
colonización de partículas de corcho.
Se ha comprobado que las mejores condiciones de incubación bacteriana incluyen: agua
de corcho, cepa bacteriana BAE9A individualmente o en consorcio, medio TSB (10%
v/v), H2O2 (1% v/v), 28º C, luz y agitación constante. Lob & Tar (2000) observaron que
la tasa de degradación de fenol incrementa con la cantidad de glucosa suplementada, en
concentraciones de glucosa por debajo de 1 g.L-1
. Sin embargo, la cantidad de glucosa
añadida al medio no puede ser alta, ya que en este caso, las bacterias no utilizarían a los
compuestos fenólicos como fuente de carbono.
Por otra parte, sería importante que en un futuro se reemplace el medio TSB por otras
fuentes de carbono, tales como desechos lignocelulíticos provenientes de residuos
agrícolas, abaratando de esta manera el coste de la auto-biorremediación.
Luego de los ensayos de remoción de compuestos fenólicos, siempre queda un 20 % de
polifenoles remanentes. Probablemente éstos correspondan a compuestos refractarios a
la degradación por parte de las bacterias seleccionadas, las cuales podrían no disponer
de los genes para la degradación de estos compuestos fenólicos recalcitrantes (por
ejemplo, pentaclorofenol). Es por ello que sería conveniente crear, con la ayuda de
herramientas moleculares, microorganismos modificados genéticamente (OMG’s)
capaces de expresar genes que codifiquen enzimas que degraden los anillos aromáticos
en su totalidad.
31
6. CONCLUSIONES
1. Se han aislado e identificado 5 bacterias con alta resistencia frente al fenol y dos
clorofenoles procedentes de aguas residuales del hervido del corcho. Estas bacterias
tienen la capacidad de degradar el fenol.
2. Se han optimizado las condiciones para la máxima degradación de fenol.
3. Las partículas de corcho presentan grandes ventajas como soporte para la
inmovilización de bacterias: gran superficie, material inerte, resistencia, flotabilidad,
bajo coste y gran disponibilidad.
4. La inmovilización de bacterias sobre partículas de corcho residuales es un método de
bajo coste y adecuado para la auto-biorremediación de las aguas provenientes del
procesado del corcho.
5. El agua tratada mediante el procedimiento de auto-biorremediación permite la
germinación de semillas de alfalfa.
32
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