DESARROLLO DE GELES A BASE DE ALGINATO DE SODIO CON …

DESARROLLO DE GELES A BASE DE ALGINATO DE SODIO CON ALTO

CONTENIDO DE ÁCIDO αL-GULURÓNICO PARA USO POTENCIAL COMO

ADHESIVO PARA HUESOS.

PAULA ANDREA SARMIENTO HUERTAS

ALEJANDRA SUAREZ ARNEDO

UNIVERSIDAD DE LOS ANDES

FACULTAD DE INGENIERÍA

DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA QUÍMICA

BOGOTÁ D.C.

DESARROLLO DE GELES A BASE DE ALGINATO DE SODIO CON ALTO

CONTENIDO DE ÁCIDO αL-GULURÓNICO PARA USO POTENCIAL COMO

ADHESIVO PARA HUESOS.

PAULA ANDREA SARMIENTO HUERTAS

ALEJANDRA SUAREZ ARNEDO

Trabajo de grado para optar al título de Ingeniero Químico

Asesor:

FELIPE SALCEDO GALÁN

Departamento de Ingeniería Química

UNIVERSIDAD DE LOS ANDES

FACULTAD DE INGENIERÍA

DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA QUÍMICA

BOGOTÁ D.C.

AGRADECIMIENTOS

A nuestros padres, quienes nos apoyaron en todas nuestras decisiones, por su amor, comprensión, paciencia,

por acompañarnos en esta importante etapa de nuestras vidas. Por darnos todas las herramientas para salir

adelante, por formarnos como las personas que actualmente somos y por impulsarnos a cumplir nuestros

sueños y hacernos felices con su presencia.

A Olga Ortiz, de la empresa FMC BioPolymer, que nos facilitó el proceso de obtención del alginato a trabajar y

nos proporcionó una muestra gratuita del producto, con el fin de que pudiéramos realizar la presente

investigación.

A Laura Pinzón y Francisco Cedano, por su ayuda con las diferentes pruebas que nos ayudaron a desarrollar, por

su guía, disponibilidad y acompañamiento.

A nuestro asesor Felipe Salcedo, por confiar en nosotras, darnos su apoyo y conocimiento, además de paciencia

y guía que nos permitieron desarrollar el presente trabajo.

TABLA DE CONTENIDOS

1. RESUMEN .................................................................................................................................................................... 1 2. OBJETIVOS .................................................................................................................................................................. 2

GENERAL ....................................................................................................................................................................... 2 2.1.

ESPECÍFICOS ................................................................................................................................................................... 2 2.2.

3. INTRODUCCIÓN ........................................................................................................................................................... 3 4. MATERIALES Y MÉTODOS ............................................................................................................................................ 7

CARACTERIZACIÓN DEL ALGINATO ....................................................................................................................................... 7 4.1.

4.1.1. Peso Molecular promedio viscoso (MV) ............................................................................................................ 7 4.1.2. Tamaño Partícula .............................................................................................................................................. 8 4.1.3. Relación de Monomeros M/G ............................................................................................................................ 8 4.1.4. Viscocidad al 1% a 25°C ..................................................................................................................................... 9 4.1.5. pH…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………9 4.1.6. Curva de humedad ............................................................................................................................................. 9 FORMULACIÓN DE LOS GELES ............................................................................................................................................. 9 4.2.

4.2.1. Formación de geles por difusión ........................................................................................................................ 9 4.2.2. Formación de geles por Gelificación Interna ................................................................................................... 10 PRUEBAS REOLÓGICAS (MONITOREO DEL PROCESO DE GELIFICACIÓN) ..................................................................................... 11 4.3.

4.3.1. Preparación de muestra .................................................................................................................................. 11 4.3.2. Procedimiento.................................................................................................................................................. 11 PRUEBA DE PÉRDIDA DE MASA.......................................................................................................................................... 12 4.4.

PRUEBA DE HINCHAMIENTO ............................................................................................................................................ 12 4.5.

ENSAYO DE TRACCIÓN .................................................................................................................................................... 13 4.6.

5. RESULTADOS Y ANÁLISIS ........................................................................................................................................... 14 CARACTERIZACIÓN DEL ALGINATO ..................................................................................................................................... 14 5.1.

5.1.1. Peso Molecular ................................................................................................................................................ 14 5.1.2. Tamaño De Partícula ....................................................................................................................................... 15 5.1.3. Relación Monomeros M/G .............................................................................................................................. 17 5.1.4. Viscosidad al 1 % a 25°C .................................................................................................................................. 18 5.1.5. pH……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….19 PRUEBAS REOLÓGICAS (MONITOREO DEL PROCESO DE GELIFICACIÓN) ..................................................................................... 21 5.2.

5.2.1. Gelificación por difusión .................................................................................................................................. 21 5.2.2. Gelificación Interna.......................................................................................................................................... 22 PÉRDIDA DE MASA PARA GELES POR GELIFICACIÓN INTERNA ................................................................................................... 28 5.3.

5.3.1. Variación de Alginato de sodio. ....................................................................................................................... 28 5.3.2. Variación de Carbonato de Calcio ................................................................................................................... 29 5.3.3. Variación de GDL ............................................................................................................................................. 30 PRUEBA DE HINCHAMIENTO PARA GELES POR GELIFICACIÓN INTERNA ...................................................................................... 30 5.4.

5.4.1. Variación de Alginato de sodio. ....................................................................................................................... 30 5.4.2. Variación de Carbonato de Calcio ................................................................................................................... 31 5.4.3. Variación concentración de GDL ...................................................................................................................... 32 ENSAYO DE TRACCIÓN .................................................................................................................................................... 32 5.5.

6. CONCLUSIONES ......................................................................................................................................................... 34 7. TRABAJO FUTURO ..................................................................................................................................................... 35 8. BIBLIOGRAFÍA ........................................................................................................................................................... 36

TABLA DE FIGURAS

Figura 1. a) Monómeros M y G del alginato de sodio y b) su secuenciación en cadenas (Rehm, 2009) ...................3

Figura 2. MODELO CAJA DE HUEVO 1.Posibles punto de unión en el alginato a) GG/GG uniones b). GM/GM

uniones c). GM/GG uniones. 2. Unión entre el monómero G y el ion divalente de calcio (Ingar Draget, Smidsrod,

& Skjâk-Braek; Pawar & Edgar, 2012).........................................................................................................................4

Figura 3. Diagrama de la gelificación por difusión (Ingar Draget, Smidsrod, & Skjâk-Braek).....................................4

Figura 4. Diagrama de gelificación interna (Ingar Draget, Smidsrod, & Skjâk-Braek). ...............................................5

Figura 5. Montaje para la hidrólisis parcial de Alginato en presencia de nitrógeno ..................................................8

Figura 6. Ejemplo del comportamiento reológico de los geles, obtenido para la muestra 8% 30/70 0.5 .............. 11

Figura 7. Montaje para prueba de pérdida de masa ............................................................................................... 12

Figura 8. Esquema de ensayo de prueba de Tensión TT90 y montaje del experimento en la máquina de ensayos

universal uniaxial (Instron modelo 3367) ................................................................................................................ 13

Figura 9. Curvas de viscosidad específica e inherente en función de la concentración de alginato de sodio. ....... 14

Figura 10. Distribución del tamaño de partículas para el alginato de sodio Protanal ............................................ 15

Figura 11. Distribución del tamaño de partículas para el alginato de sodio Sigma, Chino y Protanal .................... 16

Figura 12. FTIR para el alginato Protanal (A) y los monómeros G de este (B)......................................................... 18

Figura 13. Barrido de flujo para soluciones acuosas al 1% del alginato Sigma, Chino (Suarez, Salcedo , & Tabima,

2014) y Protanal ...................................................................................................................................................... 19

Figura 14. Curva de humedad de los diferentes alginatos trabajados en la Universidad de los Andes.................. 20

Figura 15. Módulo elástico en función del tiempo para geles a partir de difusión variando la concentración de

cloruro de calcio y manteniendo el nivel de alginato de sodio en 4% .................................................................... 21

Figura 16. Módulo elástico en función del tiempo para geles con variación de fuentes de alginato (alginato Sigma

(Moreno Borda, Salcedo Galán , & Tabima Martinez, 2014), alginato Chino (Suarez, Salcedo , & Tabima, 2014) y

protanal), al mantener constante todos los niveles de concentración en 4% de alginato de sodio, 30/70 de

carbonato de calcio y 0.5 de GDL ............................................................................................................................ 22

Figura 17. Tangente de delta en función del tiempo para geles con variación de fuentes de alginato (alginato

Sigma (Moreno Borda, Salcedo Galán , & Tabima Martinez, 2014), alginato Chino (Suarez, Salcedo , & Tabima,

2014) y protanal), al mantener constante todos los niveles de concentración en 4% de alginato de sodio, 30/70

de carbonato de calcio y 0.5 de GDL ....................................................................................................................... 23

Figura 18. Módulo elástico en función del tiempo para geles con variación de la concentración de alginato, al

mantener constante en nivel 30-70 de carbonato de calcio y nivel 0.5 de GDL ..................................................... 24

Figura 19. Módulo elástico en función del tiempo para geles con variación de carbonato, al mantener constante

en nivel 8% de alginato y nivel 0.5 de GDL .............................................................................................................. 25

Figura 20. Módulo elástico en función del tiempo para geles con variación de GDL, al mantener constante en

nivel 8% de alginato y nivel 30-70 de carbonato..................................................................................................... 26

Figura 21. Módulo elástico en función del tiempo para geles al mantener constante el nivel 8% de alginato. Con

A)40/60-0.7 y B)30/70-0.5 carbonato de calcio y GDL respectivamente ............................................................... 27

Figura 22. Módulo elástico en función del tiempo para geles al mantener constante el nivel 12% de alginato.

Con: A)30/70-0.7 B)40/60-0.5 C)40/60-0.7 carbonato de calcio y GDL respectivamente ...................................... 28

Figura 23. Fracción de pérdida de masa en función del tiempo para geles con variación de alginato medio y alto

al mantener constante el carbonato de calcio y GDL en nivel bajo (30/70) y bajo (0,5) respectivamente ............ 29

Figura 24. Fracción de pérdida de masa en función del tiempo para geles con variación de carbonato en niveles

bajo y medio al mantener constante el alginato y GDL en nivel medio (8%) y bajo (0,5) respectivamente .......... 29

Figura 25. Fracción de pérdida de masa en función del tiempo para geles con variación de GDL al mantener

constante el alginato y carbonato en nivel medio (8%) y bajo (30-70) respectivamente....................................... 30

Figura 26. Fracción de hinchamiento en función del tiempo para geles con variación de alginato de sodio en

niveles medio y alto al mantener constante el carbonato de calcio y GDL en nivel bajo (30/70) y bajo (0,5)

respectivamente ...................................................................................................................................................... 31

Figura 27. Fracción de hinchamiento en función del tiempo para geles con variación de carbonato en niveles

bajo y medio al mantener constante el alginato y GDL en nivel medio (8%) y bajo (0,5) respectivamente .......... 31

Figura 28. Fracción de hinchamiento en función del tiempo para geles con variación de GDL al mantener

constante el alginato y carbonato en nivel medio (8%) y bajo (30-70) respectivamente....................................... 32

Figura 29. Resultados del ensayo de tracción para geles de alginato protanal y chino .......................................... 33

LISTADO DE TABLAS

Tabla 1. Diseño experimental para las formulaciones a trabajar ............................................................................ 10

Tabla 2. Valores de la viscosidad intrínseca y peso molecular promedio viscoso del alginato Chino, Sigma (Suarez,

Salcedo , & Tabima, 2014) y Protanal. ..................................................................................................................... 14

Tabla 3. Resumen de la distribución del tamaño de partículas............................................................................... 16

Tabla 4. Comparación másica porcentual de monómeros M y G para el Alginato Protanal .................................. 17

Tabla 5. Comparación másica porcentual de monómeros M y G para el Alginato Sigma, Chino (Moreno Borda,

Salcedo Galán , & Tabima Martinez, 2014) y Protanal ............................................................................................ 17

Tabla 6. Viscosidades y grado de viscosidad del alginato Sigma, Chino (Suarez, Salcedo , & Tabima, 2014) y

Protanal ................................................................................................................................................................... 19

Tabla 7. pH de una solución acuosa de alginato de sodio Protanal a 20°C ............................................................. 20

Tabla 8. Tiempo de gelificación para geles con variación de fuentes de alginato alginato Sigma (Moreno Borda,

Salcedo Galán , & Tabima Martinez, 2014), alginato Chino (Suarez, Salcedo , & Tabima, 2014) y protanal), al

mantener constante todos los niveles de concentración en 4% de alginato de sodio, 30/70 de carbonato de

calcio y 0.5 de GDL y sus respectivos módulos elásticos y viscosos ........................................................................ 23

Tabla 9. Tiempo de gelificación para geles con variación de alginato al mantener constante en nivel 30-70 de

carbonato de calcio y nivel 0.5 de GDL y sus respectivos módulos elásticos y viscosos ......................................... 25

Tabla 10. Tiempo de gelificación para geles con variación de carbonato, al mantener constante en nivel 8% de

alginato y nivel 0.5 de GDL y sus respectivos módulos elásticos y viscosos ........................................................... 25

Tabla 11. Tiempo de gelificación para geles con variación de GDL, al mantener constante en nivel 8% de alginato

y nivel 30-70 de carbonato y sus respectivos módulos elásticos y viscosos ........................................................... 26

Tabla 12. Tiempo de gelificación para geles al mantener constante el nivel 8% alginato y realizar variación de los

niveles de carbonado de calcio y GDL ..................................................................................................................... 27

Tabla 13. Tiempo de gelificación para geles al mantener constante el nivel 12% alginato y realizar variación de

los niveles de carbonado de calcio y GDL ................................................................................................................ 28

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1. RESUMEN En este proyecto de grado, se ha desarrollado una investigación para la síntesis de hidrogeles a base de alginato

de sodio, que permitan la adhesión de huesos en fracturas de tipo conminuta. Se plantea que debido al

mecanismo de reticulación de estos geles, se tendrá mayor resistencia mecánica al trabajar un alginato con un

alto porcentaje de monómeros de ácido αL-gulurónico (Tipo G). Adicionalmente, se plantea que estos tendrán

un tiempo de gelificación adecuado para su manipulación y uso médico. Se caracterizó el alginato a trabajar por

medio de su pH, viscosidad, peso molecular y tamaño de partícula. Al ser comparado con los alginatos

trabajados con anterioridad, se encontró que existen diferencias significativas en estas variables que afectan el

proceso de gelificación de las soluciones preparadas. Adicionalmente, se validó la especificación del alginato a

trabajar, pues presenta una proporción de 70% residuos tipo G. La formación de los geles se realizó por medio

de difusión y gelificación interna. El primero demostró ser inviable para uso médico y para el segundo, se realizó

un análisis al variar su formulación para todos sus componentes: tres niveles de alginato (4%, 8%, 12%), tres

niveles de carbonato de calcio (30/70, 40/60, 50/50) y dos niveles de glucodeltalactona (GDL) (0.5, 0.7). Para

todos los geles se monitoreo el proceso de gelificación de manera reológica y con base a este para algunos de

los geles se desarrollaron pruebas de hinchamiento y pérdida de masa. Se eliminó el uso de los niveles 12% de

alginato, 50/50 de carbonato y 0.7 de GDL, debido a que presentaron tiempos muy cortos de gelificación, baja

mojabilidad y un mayor hinchamiento. Así mismo, se eligió como el gel con resultados más prometedores el

dado por la formulación 8% 40/60 0.5, el cual se sometió a un ensayo de tracción. De esta manera se obtuvo que

los geles formulados alcanzan módulos elásticos de 106 Pa y una carga de rotura de aproximadamente 200kPa,

valores superiores a los obtenidos con los alginatos trabajados con anterioridad en la Universidad de los Andes,

demostrando que tal como se esperaba, los geles con alto contenido de monómeros G, son más reticulados y

presentan características más deseables.

2

2. OBJETIVOS

GENERAL 2.1.Obtener geles con potencial uso como adhesivo óseo a partir de soluciones de alginato de sodio con un alto

contenido de ácido αL-gulurónico, por medio de dos métodos de gelificación. Determinar su comportamiento

físico y reológico y compararlos con los geles realizados previamente en la Universidad de los Andes.

ESPECÍFICOS 2.2.

Caracterizar el alginato de sodio con un alto contenido de ácido αL-gulurónico, y comparar su tamaño de

partícula y peso molecular con los alginatos de sodio trabajados con anterioridad.

Realizar y caracterizar fisicoquímicamente geles con diferentes formulaciones formados por medio de

agentes de entrecruzamiento, es decir con glucodeltalactona (GDL) y carbonato de calcio, a diferentes

concentraciones.

Realizar y caracterizar fisicoquímicamente geles formados a través de difusión, es decir con base en

cloruro de calcio a diferentes concentraciones

Comparar las propiedades reológicas y fisicoquímicas de los geles de alginato de sodio obtenidos con los

realizados previamente en la Universidad de los Andes.

3

3. INTRODUCCIÓN En la actualidad la cantidad de biopolímeros desarrollados para campos médicos está escalando rápidamente.

Esto se debe a las diferentes ventajas que presentan estos compuestos con respecto a otras soluciones médicas.

Este es, por ejemplo, el caso de las fracturas conminutas, fracturas en las que un hueso no resiste a la fuerza

aplicada a él y se rompe en pequeños y numerosos trozos. Este tipo de fracturas tiene gran dificultad en

tratamiento de tipo convencional como lo es el uso de placas, tornillos o agujas (Whiting & Zernicke, 2008). Es

por esto que se han desarrollado diferentes métodos, como son los bioadhesivos, que tienen grandes ventajas

sobre los tratamientos convencionales como lo es la compatibilidad con el cuerpo, la facilidad para rearmar

estructuras y menor rechazo inmune (Rehm, 2009)

Con base en lo anterior, se ha decidido desarrollar una solución polimérica que sufra un proceso de gelificación

por medio de entrecruzamiento iónico, desarrollando un reordenamiento estructural que dé como resultado un

hidrogel (Hassan, Gobouri, & Zaafarany, 2013) (LeRoux, Guilak, & Setton, 1999). Esto con el fin de que se

permita su aplicación como adhesivo para huesos que pueda ser utilizado en este tipo de fracturas. El gel se

realiza a partir del alginato de sodio, debido a sus diversas ventajas en aplicaciones médicas como lo son sus

propiedades estabilizadoras, espesantes y gelificantes, su retención acuosa y su compatibilidad con el cuerpo

humano (Rehm, 2009). Como biomaterial, los alginatos pueden ser formulados en diferentes productos como lo

son geles elásticos, fibras, espumas, nanopartículas, entre otros productos usados en la industria alimentaria y

farmacéutica; lo que asegura que no afecta el comportamiento ni seguridad de las células con las que

interactúa. (Andersen, Strand, Formo, & Alsberg, 2012)

El alginato es un polisacárido compuesto de unidades monoméricas de ácido αL-gulurónico (G) y ácido β-D-

manurónico (M) en diversas cantidades, cuya frecuencia depende de la fuente de la cual haya sido extraído

(Avedaño, Lopez, & Palou, 2013). Los residuos de M y G son organizados, como se muestra en la Figura 1, en

cadenas consecutivas de M (Bloques M), cadenas consecutivas de G (Bloques G) o cadenas alternantes de M y G

(Bloques MG) (Murillo & Hernandez, 2007).

Figura 1. a) Monómeros M y G del alginato de sodio y b) su secuenciación en cadenas (Rehm, 2009)

Las características de gelificación de los alginatos cambian considerablemente según la composición

monomérica y su secuencia. De esta manera, el método más común para preparar hidrogeles a partir de

soluciones acuosas de alginato consiste en combinar el alginato con cationes divalentes, conocidos como

agentes de entrecruzamiento iónico (Sun & Tan, 2013). Esta unión se da por la interacción entre bloques de

monómeros G que se asocian con el catión divalente (Pawar & Edgar, 2012). Esto se logra gracias a la

4

estereoquímica del monómero G que proporciona un ácido carboxílico reactivo y en presencia de iones

divalentes, estos son sustituidos iónicamente en el sitio del ácido (Becker, Kipke, & Brandon, 2000). La unión de

bloques G de una cadena polimérica con la unión de los bloques G de otra cadena polimérica es conocida como

el modelo de caja de huevo y representa el entrecruzamiento molecular del alginato que da como resultado la

estructura del gel (Figura 2) (Yong Lee & Mooney, 2013). De igual forma, en presencia de bloques M y bloques

MG se forman uniones débiles (Sun & Tan, 2013; Pawar & Edgar, 2012). Usualmente, Ca2+ es uno de los cationes

más comunes usados en el entrecruzamiento iónico (Pawar & Edgar, 2012).

Figura 2. MODELO CAJA DE HUEVO 1.Posibles punto de unión en el alginato a) GG/GG uniones b). GM/GM uniones c). GM/GG uniones. 2. Unión entre el monómero G y el ion divalente de calcio (Ingar Draget, Smidsrod, & Skjâk-Braek; Pawar & Edgar, 2012).

Hay que tener en cuenta, que el proceso de gelificación en alginatos se puede dar por medio de gelificación por

difusión o interna. La difusión es el proceso de entrecruzamiento en el cual los iones se difunden en la solución

de alginato desde un depósito exterior, normalmente una solución de cloruro de calcio CaCl2 (Figura 3) (Ingar

Draget, Smidsrod, & Skjâk-Braek; Pawar & Edgar, 2012). Este tipo de entrecruzamiento es caracterizado por la

rápida cinética de gelificación y es utilizado para procesos de inmovilización, en donde gotas de la solución

acuosa de alginato forman un solo gel. Sin embargo, esta alta tasa de gelificación genera un control pobre

debido a la alta solubilidad el cloruro de calcio, lo que produce geles que presentan gradientes de concentración

de los cationes divalentes (Ingar Draget, Smidsrod, & Skjâk-Braek).

Figura 3. Diagrama de la gelificación por difusión (Ingar Draget, Smidsrod, & Skjâk-Braek)

5

Por otro lado, en la gelificación interna adicional a la fuente de iones es necesario otro compuesto que permita

la liberación y reticulación, mediante un cambio en el pH del sistema (Figura 4). Este cambio es provocado por

una lactona que lentamente hidroliza y desemboca a la liberación de iones de calcio y posterior formación del

gel (Ingar Draget, Smidsrod, & Skjâk-Braek). De esta manera, dado que la tasa de gelificación es un factor crítico

para controlar la uniformidad del gel y la fuerza del mismo cuando se usan cationes divalentes, este tipo de

gelificación produce estructuras más uniformes y con una mayor integridad mecánica (Yong Lee & Mooney,

2013). Para la gelificación interna se usa como fuente de calcio CaCO3 y como agente entrecruzante la

glucodeltalactona GDL.

Figura 4. Diagrama de gelificación interna (Ingar Draget, Smidsrod, & Skjâk-Braek).

En la Universidad de los Andes, a partir del año 2012, se ha desarrollado una investigación que lleva a cabo la

formulación y caracterización fisicoquímica y mecánica de geles a partir de alginato de sodio, en la que se ha

evaluado el efecto de la fuente de alginato y las diferentes composiciones de los componentes del gel. En todos

estos trabajos previos se hizo uso de alginatos con relación de M/G de 4.4 y 3.1 (Alginato Chino y Sigma

respectivamente) (Moreno Borda, Salcedo Galán , & Tabima Martinez, 2014). El Alginato Chino fue el primero en

ser utilizado en la Universidad de los Andes para producir geles con potencial uso como adhesivo óseo. Según

los resultados obtenidos, se estableció que los geles a partir del alginato Chino presentan mayores módulos

elásticos. De este modo, fue posible realizar pruebas mecánicas a este tipo de geles (Cedano, Tabima, & Salcedo,

2013).En este sentido, uno de los problemas más relevantes de los geles producidos a partir de alginato chino es

su dificultad al manipularse, ya que gelifican muy rápidamente (Suarez, Salcedo , & Tabima, 2014).

Adicionalmente, con los hidrogeles a partir de alginato Sigma no se realizaron pruebas mecánicas en probetas

de hueso, ya que se generaba una débil adhesión a la superficie (Cedano, Tabima, & Salcedo, 2013). Igualmente,

con este alginato, se presenta un fenómeno denominado sinéresis; en el que se genera una fragmentación o

separación del gel, como la mostrada en la Figura 5 (Moreno Borda, Salcedo Galán , & Tabima Martinez, 2014;

Tocarruncho, Salcedo, & Tabima, 2014).

De acuerdo con lo anterior y debido a que se desea obtener un hidrogel con mayores módulos elásticos y con

una mayor resistencia a esfuerzos al ser aplicado, en este proyecto se decidió trabajar con un alginato cuya

composición sea alta en G (relaciones de M/G menores a 1), con el fin de obtener un mayor número de bloques

de este monómero y por lo tanto un gel más fuerte y con una mayor estabilidad. (Andersen, Strand, Formo, &

Alsberg, 2012). Asimismo, en este trabajo se desarrolla una comparación cuantitativa y cualitativa de los

métodos de gelificación interna y por difusión con el fin de evaluar si existen diferencias considerables entre los

mismos.

6

Figura 5. Separación de los geles de alginato de sodio Sigma con alto contenido de Carbonato de calcio (Tocarruncho, Salcedo, & Tabima, 2014)

7

4. MATERIALES Y MÉTODOS Para el desarrollo de todo el proyecto, se hace uso de Alginato Protanal LFR 5/60 (FMC BioPolymer) que

presenta una proporción alta de monómeros G (entre 65% y 75%) (FMC Biopolymer, 2014), carbonato de calcio

(Panreac), glucodeltalactona (Alfa Aesar, United States), agua desionizada y cloruro de calcio para la preparación

de hidrogeles. Para las pruebas de caracterización del alginato se usó cloruro de sodio, ácido clorhídrico e

hidróxido de sodio.

CARACTERIZACIÓN DEL ALGINATO 4.1.Con el fin de caracterizar el alginato a trabajar, y poder realizar una comparación cuantitativa de este, con los

alginatos trabajados con anterioridad en la Universidad de los Andes, se desarrollaron las pruebas de peso

molecular promedio viscoso, tamaño de partícula, relación de monómeros M/G, viscosidad y curva de humedad.

Adicionalmente, con base en estas se analizó si estas variables tienen influencia en las propiedades de los geles

producidos.

4.1.1. PESO MOLECULAR PROMEDIO VISCOSO (MV)

Para la determinación del peso molecular promedio viscoso se siguió el protocolo establecido por Gómez-Díaz y

Navaza (2002) En primer lugar, se realizaron 5 mezclas de 0 a 2,4 gl-1 de alginato de sodio en soluciones 0,1 M de

NaCl. Para determinar la viscosidad de cada solución se utilizó el reómetro Discovery Hybrid Rheometer (DHR1)

(TA Instruments), es este se realizó una prueba de flujo con un rango de velocidad de cizallamiento de 0 a 100

1s-1 y una temperatura de 25° C. Para determinar el peso molecular promedio viscoso Mv se aplicó la relación

entre la viscosidad intrínseca [𝜂] y el peso molecular Mv, mostrada en la Ecuación 1.

[𝜂] = 𝐾𝑀𝑣𝑎 (1)

Donde, K = 7.30x10-5 [g-1 dl] y a = 0,92 son parámetros que corresponden a constantes específicas para

soluciones de alginato de sodio en NaCl entre 20 a 40°C (Gómez-Díaz & Navaza, 2002). De esta manera, para

obtener la viscosidad intrínseca se utilizaron las relaciones entre los diferentes tipos de viscosidad (Ecuaciones 2

y 3) y las ecuaciones Huggins y Kramer (Ecuaciones 5 y 6):

𝜂𝑟 = 𝜂/𝜂𝑜 (2)

𝜂𝑠𝑝 = 𝜂𝑟 − 1 = (𝜂 − 𝜂0)/𝜂0 (3)

Donde ηr (Ecuación 2) es la viscosidad relativa, ηsp (ecuación 3) es la viscosidad específica, ηo es la viscosidad de

la solución blanco de NaCl en agua y η es la viscosidad de las diferentes soluciones de alginato de sodio en NaCl.

De esta manera, si se tiene la viscosidad relativa a diferentes concentraciones de alginato y se le aplica logaritmo

natural y a su vez se divide por la concentración de alginato se obtiene la curva modelada por la Ecuación 4.

Asimismo, se obtiene la curva representada por la ecuación 5 al determinar la viscosidad específica a diferentes

concentraciones de alginato.

ln(𝜂𝑟)

𝑐= [𝜂] + 𝑘1[𝜂]2𝑐

(4)

𝜂𝑠𝑝

𝑐= [𝜂] + 𝑘2[𝜂]2𝑐 (5)

Si se aplica límite cuando la concentración tiende a cero en las ecuaciones 4 y 5 se obtiene:

lim𝑐→0

ln(𝜂𝑟)

𝑐= lim

𝑐→0

ηsp

𝑐= [𝜂]

(6)

8

De acuerdo con lo anterior, se gráfica las curvas modeladas por las Ecuaciones 4 y 5 en función de la

concentración de alginato y se obtiene la viscosidad intrínseca al determinar el punto de inserción con el eje y

(el cual debería ser el mismo para las dos curvas). Finalmente, el peso molecular promedio viscoso se haya al ser

aplicada la ecuación 1.

4.1.2. TAMAÑO PARTÍCULA

Para la distribución del tamaño de partícula del alginato se usó del MASTERSIZER 300 (Malvern). Las mediciones

fueron realizadas en soluciones al 10% de alginato de sodio. Las emulsiones se realizaron a 400 rpm durante 40

min.

4.1.3. RELACIÓN DE MONOMEROS M/G

Con el fin de verificar la cantidad de monómeros tipo M/G en el alginato a trabajar, se realizó una hidrólisis

parcial. Este proceso, permite la separación de las cadenas según su secuenciación, es decir si son cadenas

heteropoliméricas u homopoliméricas M o G (Chandia, Matsuhiro, & Vásquez, 2001). Con base en la cantidad de

cadenas homopoliméricas obtenidas, es posible realizar una aproximación de la composición de los monómeros

presentes en cada tipo de alginato. El proceso se desarrolló bajo el siguiente protocolo:

Se disolvió 1 gramo de alginato de sodio en 100 mL de HCl [0,3M] y se calentó la solución por 2.5 horas a 100°C

en presencia de nitrógeno para evitar su oxidación, como se muestra en la Figura 5. El precipitado fue

centrifugado y disuelto en 100 mL de NaOH [0.15M] y su pH se ajustó a 2.35 por adición de HCl [1M]. Dicha

solución fue centrifugada, el nuevo precipitado se recolectó y de nuevo se ajustó su pH a 2.35 según el paso

anterior.

Figura 5. Montaje para la hidrólisis parcial de Alginato en presencia de nitrógeno

Finalmente, esta última solución se centrifugó, y se conservó el precipitado y el sobrenadante. El precipitado fue

nuevamente suspendido en 100 mL de agua y a ambas soluciones les fueron agregados 200 mL de etanol, con el

fin de acelerar el proceso de precipitación.

Las soluciones se dejaron decantar por 7 días y posteriormente se filtraron los precipitados y se secó la muestra

en un horno a 40°C durante 4 horas. Las muestras obtenidas fueron pesadas y comparadas para obtener la

9

relación M/G, teniendo en cuenta que el sobrenadante era rico en cadenas heteropoliméricas tipo M y el

precipitado en tipo G.

Con el fin de comprobar la composición de cada una de las muestras obtenidas se realizó una prueba en un

espectrofrotómetro infrarrojo de transformada de Fourier (FTIR) con él se puede mostrar la diferencia entre los

diferentes ácidos. Para esto, se observa principalmente la presencia de las bandas a 808 y 787 cm-1, que son

características de los monómeros M y G, respectivamente. Adicionalmente, se analiza la banda a 948 cm-1 que

corresponde al enlace α característico del ácido gulurónico. Finalmente, se observa el comportamiento de la

banda en 820 cm-1, que corresponde a residuos de tipo M. (Chandia, Matsuhiro, & Vásquez, 2001)

4.1.4. VISCOCIDAD AL 1% A 25°C

Para medir la viscosidad del alginato de sodio Protanal y compararla con la viscosidad de los demás alginatos, se

tomó una solución acuosa de alginato al 1% que se realizó al disolver la muestra durante 40 minutos en un

dispersor de peso a temperatura ambiente y una agitación de 600 rpm. Se realizó una prueba de flujo en un

rango de tasas de cizalla de 0 s-1 a 100 s-1 a 25°C en el reómetro Discovery Hybrid Rheometer (DHR1) (TA

Instruments). Adicionalmente, con esta información se determina el grado de viscosidad que es una propiedad

importante de este polímero ya que esta está directamente relacionada con otras propiedades del compuesto.

En concordancia con lo anterior, el grado de viscosidad del alginato es una medida indirecta del peso molecular

promedio o el grado de polimerización del compuesto (McHugh, s.f.).

4.1.5. PH

La prueba de pH, se realizó con el fin de comprobar los valores reportados en la hoja de especificación del

producto (BioPolymer, 2003). Para desarrollarla, se realizó a una solución al 1% según el protocolo especificado

para las soluciones en la prueba de viscosidad. Posteriormente, se midió el pH de esta solución mediante el

pHmetro Mettler Toledo.

4.1.6. CURVA DE HUMEDAD

Debido a que uno de los problemas principales de los geles de alginato realizados previamente en la universidad

es que no resisten esfuerzos en ambientes húmedos, se estudia el grado de hidrofobicidad de cada alginato a

partir de la medición indirecta de la humedad que absorbe el polvo seco. Para la prueba, se toma

aproximadamente 0.5 g de cada uno de los alginatos estudiados (Chino, Sigma y Protanal) y se dejan secar en

cajas de Petri de 60 x 15 mm por 15 minutos en un honor a 40 °C durante 1 semana. Posteriormente, las cajas de

Petri con las muestras de polvo seco se introducen a una cámara de estabilidad Thomson RGX 250 a 89%

humedad y 45°C y se pesan en diferentes momentos del tiempo hasta completar las 4 horas y media.

FORMULACIÓN DE LOS GELES 4.2.Para la formulación de los geles, se inició con base en los resultados obtenidos con anterioridad en los trabajos

de la Universidad de los Andes y se desarrollaron los diferentes niveles para la evaluación del comportamiento

de estos.

4.2.1. FORMACIÓN DE GELES POR DIFUSIÓN

Para el desarrollo de los geles por difusión, se dejó estable el nivel de alginato de sodio al 4%, a esta solución se

agregó una cantidad del 50%v/v de cloruro de calcio en solución acuosa a diferentes concentraciones y se

observó su comportamiento.

10

4.2.1.1. DISEÑO EXPERIMENTAL

Para la preparación de geles por medio de gelificación por difusión, se decidió seguir un diseño experimental en

el cual se mantuviese constante la concentración de alginato de sodio en 4% de porcentaje peso/volumen y en

donde se tomaron concentraciones de cloruro de calcio CaCl2 en porcentaje peso/volumen de 4%, 2%, 1% y

0.5%.

4.2.2. FORMACIÓN DE GELES POR GELIFICACIÓN INTERNA

Para la preparación de geles por medio de la gelificación interna, se hizo uso del protocolo especificado por

Talero y Tabima (Talero Niño & Tabima Martínez, 2013). En primer lugar, se realizan las soluciones de alginato

en agua desionizada y se agitan a 600 rpm, en un Dispermat (VMA) con un dispersor de peso ligero de diámetro

de 25mm, durante 40 min a 40°C para homogeneizar. Posteriormente, se añade a la solución la cantidad

necesaria de carbonato de calcio, y se agita a la misma velocidad y a temperatura ambiente durante 20 minutos.

Finalmente, se disuelve la cantidad requerida de GDL en 5 ml de agua desionizada y esta mezcla se añade a las

soluciones de alginato con carbonato de calcio y se agita a 600 rpm durante 30 s.

4.2.2.1. DISEÑO EXPERIMENTAL

Para el desarrollo de los geles, el diseño experimental elegido se muestra a continuación en la Tabla 1, estos

niveles fueron definidos según el comportamiento de las muestras. Adicionalmente, el formato de formulación

se adoptó de los trabajos realizados con anterioridad en la universidad con otros tipos de alginatos, de manera

que para este trabajo, solo fueron replanteados los niveles a utilizar.

Para la concentración de alginato, se tomaron 3 niveles. Estos están dados en porcentaje p/v para la solución

inicial. De igual manera, para la concentración de carbonato de calcio se tomaron 3 niveles dados en la

especificación porcentual de peso de carbonato y alginato respectivamente, tomando como la suma de estos la

totalidad de la relación. Finalmente, para la concentración de glucodeltalactona, se analizan 2 niveles que se

refieren a la relación molar de glucodeltalactona/carbonato.

Tabla 1. Diseño experimental para las formulaciones a trabajar

Alto Medio Bajo

Alginato 12% 8% 4%

Carbonato de Calcio 50/50 40/60 30/70

GDL 0.7 - 0.5

Para el trabajo se maneja la siguiente nomenclatura: NAlginato NCarb. de Ca NGDL. Por ejemplo, 4% 30/70 0.5, en el caso

en que la formulación esté dada por los niveles bajos de todos los componentes. En este se tiene un contenido

de 4% de alginato, al agregar el carbonato de calcio este constituye el 30% de las partículas sólidas mientras que

el alginato corresponde al 70% y finalmente, se tiene 0.5 mol de GDL por cada mol de carbonato de calcio

presente en el gel.

Con base en los diferentes niveles establecidos para el diseño experimental, se decidió tomar como base el gel

definido 8% 30/70 0.5 para el cual se mantuvieron constantes dos variables, mientras se realizaba el análisis

para los diferentes niveles de la tercera. Posteriormente, con los resultados obtenidos, se analizó el cambio de

dos niveles, mientras solo uno se mantuvo contante, con el fin de completar el diseño factorial propuesto con

los niveles encontrados como viables.

11

PRUEBAS REOLÓGICAS (MONITOREO DEL PROCESO DE GELIFICACIÓN) 4.3.

4.3.1. PREPARACIÓN DE MUESTRA

4.3.1.1. POR DIFUSIÓN

Para las pruebas reológicas realizadas por difusión, se preparó la solución acuosa al 4% de alginato, de la cual se

vertieron 10 gotas en el reómetro Discovery Hybrid Rheometer (DHR1) (TA Instruments) y a esta se le agregaron

5 gotas de la solución correspondiente cuando el gap entre platos no era mayor a 5 cm.

4.3.1.2. POR GELIFICACIÓN INTERNA

Para las pruebas reológicas realizadas por gelificación interna, se preparó cada uno de los geles según el

protocolo establecido. Una vez completado el procedimiento, se vertió 0.5mL de este en el reómetro Discovery

Hybrid Rheometer (DHR1) (TA Instruments).

4.3.2. PROCEDIMIENTO

Se utilizó una geometría de platos paralelos, un “gap” de 1000 micrómetros y una temperatura constante de

37°C para todos los ensayos. Se realizó un barrido de tiempo a cada uno de los geles de alginato, dejando fijos el

porcentaje de deformación (1%) y la frecuencia de oscilación (1 Hz), durante 30 minutos.

A partir de los módulos obtenidos se realizó el cálculo del tiempo de gelificación, para este, se analizó la

tangente de delta, dada la relación mostrada en la Ecuación 7. En la cual G’’ presenta el módulo viscoso o de

pérdida y G’ presenta el modulo elástico o de almacenamiento.

tan(𝛿) =𝐺′′

𝐺′

(7)

Figura 6. Ejemplo del comportamiento reológico de los geles, obtenido para la muestra 8% 30/70 0.5

Con base en esta relación, se analiza el comportamiento de cada uno de los geles, que muestran una concavidad

pronunciada al inicio y posteriormente varían según la muestra, tal como la mostrada en la Figura 6. De acuerdo

con estos resultados, se eligió el tiempo de gelificación como el tiempo al cual se presenta el punto mínimo de la

0,01

0,1

1

1

10

100

1000

10000

0 500 1000 1500 2000

Tan

gen

te d

e d

elta

(P

a/P

a)

Mó

du

los

G',G

'' (P

a)

Tiempo (s)

G' G'' Tiempo de gelificación Tan (delta)

12

tangente en la primera parte de la gráfica, pues en esta se muestra que existe un mayor almacenamiento de

energía y determina el cambio de solución a gel.

PRUEBA DE PÉRDIDA DE MASA 4.4.Para analizar la pérdida de masa se registró la masa inicial y a diferentes intervalos de tiempo, con lo cual se determinó estabilidad de los geles en el tiempo. Para esta, se prepararon los geles bajo el protocolo anteriormente mencionado, se dejaron gelificar en cajas de Petri de 60 x 15 mm por 15 minutos, como se muestra en la Figura 7. Se registró la masa en el tiempo 0 una vez gelificadas las muestras.

Figura 7. Montaje para prueba de pérdida de masa

Posteriormente, se introdujeron los geles a la cámara de estabilidad Thomson RGX 250 a 80% humedad y 40°C, siguiendo el protocolo establecido en trabajos anteriores (Moreno Borda, Salcedo Galán , & Tabima Martinez, 2014) (Talero Niño & Tabima Martínez, 2013) (Mendoza & Castro, 2012), y se tomó el peso cada 20 minutos durante la primera hora. Se hizo el seguimiento cada hora hasta completar 4 horas. Para determinar el porcentaje de pérdida de masa se empleó la siguiente ecuación:

%𝑃. 𝑑𝑒 𝑀𝑎𝑠𝑎 =𝑃𝑒𝑠𝑜0 − 𝑃𝑒𝑠𝑜𝑡

𝑃𝑒𝑠𝑜0 (8)

En donde 𝑃𝑒𝑠𝑜𝑡 corresponde al peso en el tiempo t y 𝑃𝑒𝑠𝑜0 corresponde al peso en el tiempo 0, al iniciar la

prueba.

PRUEBA DE HINCHAMIENTO 4.5.Para la prueba de hinchamiento, es necesario trabajar con geles sólidos, por esto las muestras inicialmente se

dejaron gelificar en moldes circulares durante 15 minutos. Posteriormente, se tomó el peso inicial del gel y se

sumergió en cajas de Petri de 60 x 15 mm con 15mL de agua desionizada y se introdujeron en una cámara de

estabilidad Thomson RGX 250 a 80% humedad y 40°C. Con el fin de hallar el hinchamiento, los geles eran

extraídos de la cámara cada media hora y puestos sobre papel filtro durante 1 minuto. Una vez perdido el

exceso de agua, se registró su peso. El proceso se repitió durante 2 horas. Para determinar el perfil de

hinchamiento se empleó la ecuación 9, que se muestra a continuación:

%𝐻𝑖𝑛𝑐ℎ𝑎𝑚𝑖𝑒𝑛𝑡𝑜 =𝑃𝑒𝑠𝑜𝑡 − 𝑃𝑒𝑠𝑜𝑜

𝑃𝑒𝑠𝑜0 (9)

13

ENSAYO DE TRACCIÓN 4.6.Con el fin de observar las propiedades mecánicas del adhesivo, se realizan ensayos de tracción, a cargo del

departamento de ingeniería biomédica. En estos, se implementa un sistema de unión adhesivo-hueso sobre

probetas con área transversal de 7 mm x 7 mm, obtenidos de húmero bobino. La prueba se realiza usando una

máquina de ensayos biaxial con una orientación de fractura controlada a 90° (TT90), respecto a la dirección de

carga, tal como se muestra en la Figura 8.

Figura 8. Esquema de ensayo de prueba de Tensión TT90 y montaje del experimento en la máquina de ensayos universal uniaxial (Instron

modelo 3367)

Para la prueba, la probeta es manufacturada en el laboratorio y unida con 0.10 g de adhesivo, las variables para

el proceso de curado del adhesivo se aproximan a condiciones similares a las del cuerpo humano (40 °C y 80% de

humedad relativa) en una cámara de estabilidad por un día. Las pruebas de tensión se desarrollan a una taza de

deformación constante (0.1 mm/s) y se reportará la carga y esfuerzo de ruptura.

14

5. RESULTADOS Y ANÁLISIS

CARACTERIZACIÓN DEL ALGINATO 5.1.

5.1.1. PESO MOLECULAR

Para determinar la viscosidad relativa y específica a partir de la viscosidad de cada solución acuosa de alginato

de sodio en cloruro de sodio, se emplearon las ecuaciones de la 2 a la 5 obteniéndose los resultados

consignados en la Figura 9.

Figura 9. Curvas de viscosidad específica e inherente en función de la concentración de alginato de sodio.

Al establecer el punto de corte con el eje y a la curva de la viscosidad específica sobre la concentración (ecuación

4) y al logaritmo de la viscosidad relativa sobre la concentración (ecuación 5) se puede determinar la viscosidad

intrínseca (Ecuación 6); la cual está directamente relacionada con el peso molecular promedio viscoso Mv. En

este caso la viscosidad intrínseca es de 1,506 dl/g. Para comprobar el resultado obtenido se realizaron 2 réplicas,

con lo que se obtuvo una viscosidad intrínseca promedio de 1.327 dl/g con una desviación estándar de 0.118. Al

emplear la Ecuación 1, el peso molecular promedio viscoso Mv es de 42.669 kDa con una desviación estándar de

4.133. Finalmente, en la Tabla 2 se reportan los resultados promedios obtenidos y se comparan con los

reportados previamente para el alginato Chino y el alginato Sigma (Suarez, Salcedo , & Tabima, 2014):

Tabla 2. Valores de la viscosidad intrínseca y peso molecular promedio viscoso del alginato Chino, Sigma (Suarez, Salcedo , & Tabima, 2014) y Protanal.

Alginato

Constantes Mark-Houwink

[η] dl g-1 K/ dl g-1 a Mw/kDa

Promedio Desviación

7.30E-05 0.92

Promedio Desviación

Chino 4.55 0.51 162.94 15.11

Sigma 1.06 0.06 33.44 1.57

Protanal 1.33 0.12 42.67 4.13

y = -0,0041x + 0,1506 R² = 0,9703

y = 0,007x + 0,1506 R² = 0,9874

0,10

0,12

0,14

0,16

0,18

0,00 1,00 2,00 3,00

ln(η

r)/c

,ηsp

/c (

L/g)

Concetración (g/L)

ln(ηr)/c ηsp/c Lineal (ln(ηr)/c) Lineal (ηsp/c)

15

Según los resultados reportados en la Tabla 2 se puede afirmar que el peso molecular promedio viscoso del

alginato Sigma y Protanal difieren significativamente del alginato Chino. De esta forma, se puede observar que el

alginato que presenta mayor Mv es el alginato Chino, el cual tiene un peso molecular promedio

aproximadamente 4 veces más alto que los otros dos alginatos. Al comparar el peso del alginato Protanal con el

del alginato Sigma, se observa que presentan pesos moleculares promedio similares en un mismo orden de

magnitud y sólo difieren en 10 kDa. En este sentido, se puede afirmar que la longitud promedio de las cadenas

poliméricas de cada uno de los alginatos difiere de acuerdo a su procedencia. Para corroborar los resultados

obtenidos se validó que las viscosidades intrínsecas halladas estuvieran dentro del rango de viscosidades

reportadas en la literatura para el alginato. Debido a que el rango está entre 0.93 dl/g y 36.00 dl/g (Masuelli &

Illanes, 2014) se puede inferir que los resultados obtenidos son confiables.

5.1.2. TAMAÑO DE PARTÍCULA

Para la distribución del tamaño de partículas para el alginato de sodio Protanal se establecieron las condiciones

descritas en la metodología, con lo cual se obtuvieron los resultados de la Figura 10.

Según los resultados reportados en esta, se puede observar que el tamaño del polvo para el alginato Protanal va

de 0.314 µm a 66.9 µm. Presenta una curva bimodal con picos en tamaño de partícula entre 0.675 µm a 0.991

µm con aproximadamente 2.5 % de densidad de volumen y 21.2 µm a 27.4 µm con aproximadamente 4.5 % de

densidad de volumen. Adicionalmente, si se comparan los resultados obtenidos con los reportados en la ficha de

seguridad del producto (FMC Biopolymer, 2014), se puede afirmar que los resultados son coherentes ya que en

el certificado de análisis el 100% del polvo paso por una malla de 250 µm (MESH 60 BS).

Figura 10. Distribución del tamaño de partículas para el alginato de sodio Protanal

Para comparar la distribución de tamaño de partícula de este alginato respecto a los utilizados previamente, en

la Figura 11 se reportan la distribución tanto del alginato Sigma, como el Chino (Suarez, Salcedo , & Tabima,

2014) y el Protanal.

0,00

1,00

2,00

3,00

4,00

5,00

0,3

1

0,4

6

0,6

8

0,9

9

1,4

5

2,1

3

3,1

2

4,5

8

6,7

2

9,8

6

14,5

0

21,2

0

31,1

0

45,6

0

66,9

0Den

sid

ad d

e vo

lum

en %

Tamaño (µm)

16

Figura 11. Distribución del tamaño de partículas para el alginato de sodio Sigma, Chino y Protanal

Al observar cada una de las distribuciones de los tres alginatos se puede afirmar que estas difieren entre s, a

pesar de que dos de los tres alginatos presentan una curva bimodal con dos picos de porcentaje de densidad de

volumen presentes en extremos opuestos de las distribuciones. En este sentido, se aprecia que los picos más

altos de porcentaje de densidad se encuentran en el extremo superior de todas las distribuciones de tamaño de

partícula. Dado que la distribución de tamaño de polvos depende del método de extracción y purificación del

alginato, se presume que el comportamiento bimodal de las curvas se debe a este factor.

Adicionalmente, para determinar cuál de los tres alginatos presenta un tamaño de partículas promedio mayor

en la Tabla 3 se presenta la densidad de volumen en los percentiles 10, 50 y 90, además de otros medidas

comparativas entre los alginatos.

Tabla 3. Resumen de la distribución del tamaño de partículas

Alginato

Sigma Chino Protanal

Dv(10) µm 1.19 3.13 0.83

Dv(50) µm 13.00 25.40 9.59

Dv(90) µm 37.90 70.10 38.20

D[3,2] µm 3.64 7.39 2.81

D [4,3] µm 17.40 31.70 15.20

% Residual ponderado 0.56 0.78 2.53

Según el tamaño de partículas reportados en cada uno de los percentiles analizados, se puede afirmar que el

alginato Chino presenta un tamaño de partícula mayor que el de los otros dos alginatos en todos los percentiles,

lo que se valida posteriormente con los valores de la media momento superficie (diámetro medio de Sauter) y el

volumen o la media momento de masas (diámetro medio de Brouckere). Adicionalmente, dado la similitud de

todos los valores de medias para el alginato Sigma como para el alginato Protanal se puede inferir que el tamaño

de polvos de estos dos alginatos es muy similar.

0,00

1,00

2,00

3,00

4,00

5,00

6,00

0,1 1 10 100

Den

sid

ad d

e vo

lum

en %

Tamaño (µm)


17

5.1.3. RELACIÓN MONOMEROS M/G

Al pesar el sobrenadante como la fase rica en monómeros M y el precipitado como la fase rica en monómeros G

se obtuvieron los porcentajes másicos de las unidades poliméricas para el alginato de sodio Protanal reportados

en la Tabla 4.

Tabla 4. Comparación másica porcentual de monómeros M y G para el Alginato Protanal

Porcentaje monómeros

% másico monómero M % másico monómero G Relación M/G

Alginato Protanal 23.08 76.92 0.30

Réplica Alginato Protanal 36.36 63.64 0.57

Promedio 29.72 70.28 0.44

Desviación 6.64 6.64 0.14

Dado que en el boletín de especificación del producto (BioPolymer, 2003) se reporta un porcentaje de

monómeros G entre 65% y 75% se puede afirmar que los datos reportados en la Tabla 4 son correctos, pues el

porcentaje promedio de monómero G fue de 70.28 % un valor que se encuentra dentro del rango especificado.

En la Tabla 5 se reporta la comparación másica porcentual de los dos monómeros en los alginatos Sigma, Chino

(Moreno Borda, Salcedo Galán , & Tabima Martinez, 2014) y Protanal.

Tabla 5. Comparación másica porcentual de monómeros M y G para el Alginato Sigma, Chino (Moreno Borda, Salcedo Galán , & Tabima Martinez, 2014) y Protanal

Alginato


Promedio Desviación Promedio Desviación Promedio Desviación

% másico monómero M 74.7 5.4 81.1 3.2 29.7 6.6

% másico monómero G 25.3 5.4 19.0 3.2 70.3 6.6

Relación M/G 3.1 0.8 4.4 0.9 0.4 0.1

Como se aprecia en la anterior tabla el porcentaje de monómeros G y M en los alginatos Chino y Sigma son muy

similares, por lo que la relación de M/G en estos alginatos es mayor a 1. Contrario a lo que se observa en el

alginato Protanal dado que al tener un mayor proporción de ácido αl-gulurónico (≈ 70%) la relación M/G

obtenida es menor a 1. En este sentido, se espera que los geles obtenidos a partir de este alginato tengan

interacciones moleculares más fuertes (Rioux, Turgeon, & Beaulieu, 2007) que los realizados previamente.

Adicionalmente, debido a que la proporción de monómeros M/G es la única propiedad en la que difieren

significativamente el alginato Protanal del alginato Sigma se supone que todas las posibles diferencias que se

presenten en la forma de gelificación de sus hidrogeles se deba a esta característica.

5.1.3.1. ESPECTROFOTOMETRÍA INFRARROJA DE LA TRANSFORMADA DE FOURIER (FTIR)

Para la comprobación de los resultados de la relación M/G, se realizó una prueba FTIR, con la que se esperaba

comprobar la diferencia entre el precipitado y el sobrenadante obtenidos por medio de la hidrólisis parcial con

la que se determinó el contenido de monómeros M y G. Sin embargo, al realizar las pruebas, la muestra de

sobrenadante (correspondiente a la fracción rica en M), no pudo ser realizada. Sin embargo se realizó la prueba

para el alginato y el precipitado (monómero G), cuyos resultados se muestran en la Figura 12.

18

Figura 12. FTIR para el alginato Protanal (A) y los monómeros G de este (B)

En esta figura, se esperaba encontrar diferencias entre las bandas de 808 y 820 cm-1 que corresponden a los

monómeros tipo M y en las bandas a 787 y 948 cm-1 que corresponden a monómeros tipo G (Chandia,

Matsuhiro, & Vásquez, 2001), tal como se había enunciado con anterioridad. Es posible ver, que la curva del

alginato, presenta un pico a 813 cm-1 que debe corresponder a una de las dos bandas características de los

residuos M, que no presenta la curva de los residuos G. Adicionalmente, la curva de los monómeros G, presenta

las bandas a 788 cm-1 y 747,3, cm-1 características de los residuos de este tipo, donde la primera no está presente

en la curva del alginato Protanal, y la segunda tiene el mismo valor. Es por esto, que se validan los resultados de

la hidrólisis parcial, pues se comprueba que la fase heteropolimérica G, tiene muy pocos o nulos residuos de

monómeros M, y que por lo tanto los resultados en el numeral anterior, corresponden a una aproximación

cercana a la realidad.

5.1.4. VISCOSIDAD AL 1 % A 25°C

En la Figura 13 y en la Tabla 6 se presenta la viscosidad y su comparación con los alginatos Chino, Sigma (Suarez,

Salcedo , & Tabima, 2014) y Protanal en una solución acuosa al 1%:

19

Figura 13. Barrido de flujo para soluciones acuosas al 1% del alginato Sigma, Chino (Suarez, Salcedo , & Tabima, 2014) y Protanal

Tabla 6. Viscosidades y grado de viscosidad del alginato Sigma, Chino (Suarez, Salcedo , & Tabima, 2014) y Protanal

Alginato


Viscosidad (mPa.s)

Promedio 6.96 102.39 4.17

Desviación 0.66 18.72 0.16

Grado de visocidad Bajo Medio Bajo

La viscosidad promedio del alginato Chino difiere significativamente de la viscosidad promedio de los otros dos

alginatos. De esta manera, se puede observar que la menor viscosidad es la obtenida por el alginato Protanal.

Por lo anterior, se puede inferir que debido a que el porcentaje másico de monómeros difiere significativamente

entre el alginato Sigma y Protanal, la proporción de las secuencias de monómeros no es la variable que

determina la viscosidad del sistema, sino que por el contrario es la longitud de las cadenas poliméricas

representada a su vez por el peso molecular promedio viscoso la que influye en esta propiedad. Así mismo, si se

tiene en cuenta la clasificación reportada por Dennis J. McHugh (McHugh, s.f.) el alginato Sigma y Protanal

tienen una viscosidad baja dado que está es menor a 50 mPa.s. El alginato Chino por el contrario, al tener una

viscosidad mayor a 50 mPa.s y menor a 400 mPa.s se puede clasificar como de viscosidad media.

5.1.5. pH

Al medir el pH a las mismas las condiciones detalladas en el boletín de especificación del producto (BioPolymer,

2003), se obtuvieron los resultados reportados en la Tabla 7. Según los resultados obtenidos experimentalmente

se puede observar que el pH aunque se encuentra dentro del rango (6.0-8.0) no es el mismo al reportado en el

certificado de análisis del material. Esto se puede deber a que el agua destilada con la que se realizó la solución

tenía un pH diferente al neutro.

0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10

0,12

0 20 40 60 80 100 120

Vis

cosi

dad

[P

a*s]

Tasa de corte [1/s]

Chino Sigma Protanal

20

Tabla 7. pH de una solución acuosa de alginato de sodio Protanal a 20°C

pH 1% 20°C

Rango 6.0-8.0

Valor Especificado 6.60

Valor Experimental 6.93

5.1.5.1. CURVA DE HUMEDAD

Al pesar la ganancia de peso de los alginatos durante 4.5 horas en diferentes intervalos de tiempo se obtuvo la

Figura 14.

Figura 14. Curva de humedad de los diferentes alginatos trabajados en la Universidad de los Andes

Según los resultados obtenidos en esta figura, se puede observar que sin importar el alginato la ganancia de

peso debido al aumento de humedad en el sistema es menor al 9%, dado que el peso inicial promedio de todas

muestras es de aproximadamente 0.5 g. De esta manera, se observa que aunque las curvas de humedad son

muy semejantes el alginato que menos tiende a adsorber agua del ambiente es el alginato Chino. Esto sugiere

que propiedades como el tamaño de partículas o el peso molecular promedio viscoso que mide el grado de

polimerización afectan en la hidrofobicidad del alginato. Asimismo, si se comparan las curvas de humedad el

alginato Protanal y el Sigma se observa que aunque son semejantes el alginato Sigma absorbe más agua, por lo

que se puede afirmar que no sólo es el peso molecular promedio viscoso o el tamaño de partículas los que

influyen en la hidrofobicidad del alginato, sino que también la proporción de monómeros M y G. En este sentido,

se supone que al tener más unidades de monómeros G en su cadena polimérica el alginato Protanal es más

estable y por lo tanto menos soluble en agua. De acuerdo con lo anterior, se pueden plantear que los geles

producidos a partir del alginato Protanal no presentaran propiedades tan similares con los geles de alginato

Sigma como se suponía previamente.

0

0,005

0,01

0,015

0,02

0,025

0,03

0,035

0,04

0,045

0,05

0 1 2 3 4 5

Gan

anci

a d

e p

eso

[g]

Tiempo [h]

Chino Sigma Protanal

21

PRUEBAS REOLÓGICAS (MONITOREO DEL PROCESO DE GELIFICACIÓN) 5.2.

5.2.1. GELIFICACIÓN POR DIFUSIÓN

5.2.1.1. VARIACIÓN DE CLORURO DE CALCIO

En primer lugar, hay tener en cuenta que a los geles realizados a partir del método de gelificación por difusión

sólo se sometieron a monitoreo del proceso de gelificación debido a las características que presentaban recién

hechos. En este sentido, al mezclar las soluciones de alginato de sodio con la de CaCl2 se observó una gelificación

instantánea que no permitió la formación de un gel homogéneo ni compacto, sino que por el contrario el gel

estaba fragmentado, perdía agua fácilmente y no era manejable.

De este modo, el monitoreo de la gelificación mediante pruebas reológicas se realizó para verificar que el

comportamiento de los geles no depende de la concentración de Cloruro de calcio. Así, en la Figura 16 se

observa el comportamiento reológico de cuatro geles analizados. Cabe resaltar que en las pruebas reológicas

presentadas de aquí en adelante, se obtiene el módulo elástico y el módulo viscoso, sin embargo, ambos tienen

el mismo comportamiento, siendo el modulo viscoso (G’’) menor que el módulo elástico en el rango analizado.

Por tal razón, con el fin de no saturar las figuras, se ha elegido presentar únicamente el modulo elástico (G’) para

realizar su análisis.

Figura 15. Módulo elástico en función del tiempo para geles a partir de difusión variando la concentración de cloruro de calcio y manteniendo el nivel de alginato de sodio en 4%

Según lo esperado en las curvas observadas no hay una relación aparente entre el aumento de la concentración

de cloruro de calcio y la magnitud del módulo elástico de los geles evaluados. De esta manera, si se detalla en el

comportamiento del módulo elástico del gel con 2% de CaCl2 se observa un comportamiento irregular con

cambios de concavidad a lo largo de la curva. Por otro lado, si se compara el comportamiento de cada uno de los

geles se puede suponer que a concentraciones menores al 1% el módulo elástico de los geles permanece

relativamente constante a lo largo del tiempo evaluado. Las inconsistencias entre los módulos y en las

propiedades observadas cualitativamente al realizar los geles se explican gracias a los gradientes de iones

divalentes en los geles debidos a la alta tasa de gelificación, por lo que se genera un control pobre y se produce

0,01

0,1

1

10

100

1000

10000

0 100 200 300 400 500 600 700

Mó

du

lo E

lást

ico

G' (

Pa)

Tiempo [s]

0.5% 1% 2% 4%

22

geles poco uniformes (Ingar Draget, Smidsrod, & Skjâk-Braek). De este modo, no fue posible determinar el

tiempo de gelificación a partir del comportamiento reológico de los geles.

5.2.2. GELIFICACIÓN INTERNA

5.2.2.1. VARIACIÓN FUENTE DE ALGINATO

Para verificar que la fuente de alginato es una variable importante en la formación de geles con potencial uso

como adhesivos óseos se monitoreo el proceso de gelificación mediante pruebas reológicas de tres geles con las

mismas proporciones de alginato, carbonato de calcio y GDL y sólo se varió la fuente de alginato. De esta

manera, en la siguiente figura se presenta el módulo elástico en función del tiempo de geles con 4% de alginato

30/70 de carbonato de calcio y 0.5 de GDL producidos a partir de los diferentes alginatos caracterizados

previamente. Dado que en trabajos previos se realizaban las pruebas reológicas sólo 15 minutos (Moreno Borda,

Salcedo Galán , & Tabima Martinez, 2014; Suarez, Salcedo , & Tabima, 2014; Tocarruncho, Salcedo, & Tabima,

2014), las curvas presentadas a continuación sólo muestran los primeros 900 segundos.

Figura 16. Módulo elástico en función del tiempo para geles con variación de fuentes de alginato (alginato Sigma (Moreno Borda, Salcedo Galán , & Tabima Martinez, 2014), alginato Chino (Suarez, Salcedo , & Tabima, 2014) y protanal), al mantener constante todos los niveles

de concentración en 4% de alginato de sodio, 30/70 de carbonato de calcio y 0.5 de GDL

Según lo observado en la Figura 16 se puede afirmar que el proceso de gelificación para los geles varía

significativamente en función de la fuente de alginato utilizado. De esta manera, se afirma que mientras que el

alginato Chino y Sigma aumentan el valor del módulo elástico con el tiempo, de forma constante, el alginato

Protanal presenta una disminución inicial en un primer momento y cerca de los 200 segundos (más de 3

minutos) comienza a aumentar el valor de su módulo superando en una magnitud el valor de su módulo inicial.

Lo anterior se puede explicar debido a las propiedades descritas previamente. En este sentido, el alto módulo

que presenta el alginato Chino desde el principio es debido a su peso molecular promedio viscoso el cual es

mucho mayor al del alginato Sigma y Protanal. Del mismo modo, el valor del módulo elástico inicial se puede

atribuir a esta misma propiedad ya que el punto inicial de las curvas para el alginato Sigma y Protanal es

1

10

100

1000

10000

0 200 400 600 800 1000

Mó

du

lo e

lást

ico

, G' (

Pa)

Tiempo (s) Alginato Protanal Alginato Sigma

Alginato Chino Tiempo de gelificación

23

aproximadamente el mismo. No obstante, las diferencias que se presentan entre el gel producido a partir del

alginato Sigma y el Protanal son debidas al porcentaje de monómeros G en la cadena polimérica. De acuerdo

con esto, la proporción de la proporción de monómeros G no sólo permite que el gel sea manejable al comienzo,

sino que además contribuye a la fuerza y estabilidad del gel.

Adicional, para analizar la relación del módulo elástico y el viscoso de los geles en función de la fuente de

alginato, en la Figura 17 se muestra las tangentes de delta:

Figura 17. Tangente de delta en función del tiempo para geles con variación de fuentes de alginato (alginato Sigma (Moreno Borda, Salcedo Galán , & Tabima Martinez, 2014), alginato Chino (Suarez, Salcedo , & Tabima, 2014) y protanal), al mantener constante todos los

niveles de concentración en 4% de alginato de sodio, 30/70 de carbonato de calcio y 0.5 de GDL

Según lo observado en la Figura 17 se puede afirmar que la relación y el comportamiento entre los dos módulos

analizados cambia considerablemente debido a la fuente de alginato. De esta manera, se muestra que el gel con

alginato Chino aunque es el que alcanza mayores módulos elásticos según la Figura 16 es el que también

mayores módulos viscosos tiene, por lo que aunque se gelifique más rápidamente, también es el que menos

estable es. Por otro lado, aunque el valor de la tangente delta del alginato Sigma es similar al del Protanal, es

prácticamente constante a lo largo del tiempo, por lo que no se puede asegurar que haya un paso de solución a

gel, lo cual explica porque aún en seco las pruebas mecánicas no se pudieron realizar en este gel.

Finalmente, se analiza el tiempo de gelificación de cada uno de los geles teniendo en cuenta la información

contenida en la Tabla 8.

Tabla 8. Tiempo de gelificación para geles con variación de fuentes de alginato alginato Sigma (Moreno Borda, Salcedo Galán , & Tabima Martinez, 2014), alginato Chino (Suarez, Salcedo , & Tabima, 2014) y protanal), al mantener constante todos los niveles de concentración

en 4% de alginato de sodio, 30/70 de carbonato de calcio y 0.5 de GDL y sus respectivos módulos elásticos y viscosos

Formulación T[s] Módulo elástico [Pa] Módulo viscoso [Pa]

Alginato Sigma 232.768 130.03 14.7454

Alginato Chino 76.532 1031 157.1

Alginato Protanal 326.321 180.574 10.275

0,01

0,1

1

10

0 200 400 600 800 1000

Tan

(d

elta

) (P

a/P

a)

Tiempo (s)

Alginato Protanal Alginato Sigma

Alginato Chino Tiempo de gelificación

24

De acuerdo a la anterior tabla el tiempo gelificación es altamente influenciado por la fuente o tipo de alginato.

De este modo el tiempo del gel a partir de alginato Chino es de 76.532 s, tiempo insuficiente para permitir la

manipulación del gel y su uso como adhesivo óseo. Tanto el alginato Sigma como Protanal presentan tiempo de

gelificación adecuados para la manipulación del gel.

5.2.2.2. VARIACIÓN DE CONCENTRACIÓN DE ALGINATO

Para la variación de alginato se caracterizaron los geles de manera reológica en los diferentes niveles

obteniéndose como resultado la gráfica y tiempos de gelificación mostrados en la Figura 18.

Figura 18. Módulo elástico en función del tiempo para geles con variación de la concentración de alginato, al mantener constante en nivel 30-70 de carbonato de calcio y nivel 0.5 de GDL

Dentro de los resultados obtenidos para la variación de alginato, es posible observar que al aumentar la

cantidad de alginato utilizado, existe un aumento en los módulos. Asimismo, se observa que todos los geles

realizados presentan módulos pequeños al comienzo de la prueba reológica, por lo que se puede determinar de

forma cuantitativa que tan manejables son en los primeros segundos previos a su gelificación (Ulman & Sweet,

1998). Adicionalmente, el rápido aumento del módulo elástico representa la rápida gelificación, la cual es una

característica adecuada para el uso de los geles en el campo médico, ya que se pueden fijar los huesos del

paciente con un gel que se estabiliza en poco tiempo. Esto da como resultado que se presente una mayor

adhesión entre el biomaterial y la superficie del hueso y no se pierdan las fuerzas en el sistema de unión (Franck,

2013). En cuanto al valor final del módulo, de acuerdo a los trabajos realizados con anterioridad en la

Universidad de los Andes, un mayor módulo no conduce necesariamente a una mayor adhesión (Talero Niño &

Tabima Martínez, 2013). Sin embargo, se afirma que al tener un mayor módulo, tienen una mayor resistencia a

la fractura, y por lo tanto se espera un mejor comportamiento en las pruebas mecánicas a realizar. De acuerdo

con los resultados mostrados en la anterior figura el módulo elástico alcanzado por la formulación con nivel bajo

de alginato es considerablemente menor al presentado por los otros dos geles, por tal razón se descarta y no se

le realiza pruebas de hinchamiento ni de pérdida de masa. Igualmente, en la Tabla 9 se presentan los tiempos

de gelificación de los geles estudiados.

1

10

100

1000

10000

100000

0 500 1000 1500 2000

Mó

du

lo E

lást

ico

G' (

Pa)

Tiempo (s)

4% 8% 12% Tiempo de gelificación

25

Tabla 9. Tiempo de gelificación para geles con variación de alginato al mantener constante en nivel 30-70 de carbonato de calcio y nivel 0.5 de GDL y sus respectivos módulos elásticos y viscosos


4%-30-70-0.5 (BBB) 326,32 180.00 10.27

8%-30-70-0.5 (MBB) 247.00 402.00 35.51

12%-30-70-0.5 (ABB) 216.21 1069.00 163.95

El criterio principal para determinar un adecuado tiempo de gelificación es que este debe estar entre un rango

menor a 8 minutos y mayor a 2, de esta manera, da tiempo de ser aplicado al paciente, pero de igual manera,

gelifica rápidamente evitando que el tiempo de cirugía aumente considerablemente. A partir de esta

especificación es posible decir que para las tres muestras analizadas se cumple con este criterio.

5.2.2.3. VARIACIÓN CONCENTRACIÓN DE CaCO3

Para la variación de carbonato se caracterizaron los geles de manera reológica en los diferentes niveles

obteniéndose como resultado la gráfica y tiempos de gelificación mostrados en la Figura 19 y en la Tabla 10.

Figura 19. Módulo elástico en función del tiempo para geles con variación de carbonato, al mantener constante en nivel 8% de alginato y nivel 0.5 de GDL

De estos módulos mostrados, se espera el mismo comportamiento explicado con anterioridad en la variación de

alginato. Sin embargo, es posible ver que la curva correspondiente al nivel alto de carbonato (50-50) tiene un

inicio de aproximadamente 700 Pa, que da como resultado que tenga muy poca mojabilidad, por lo tanto la

adhesión hueso gel será menor y el gel tendrá una menor resistencia a fuerzas externas.

Tabla 10. Tiempo de gelificación para geles con variación de carbonato, al mantener constante en nivel 8% de alginato y nivel 0.5 de GDL y sus respectivos módulos elásticos y viscosos


8%-30-70-0.5 (MBB) 246.84 401.91 35.51

8%-40-60-0.5 (MMB) 145.41 592.54 47.30

8%-50-50-0.5 (MAB) 71.94 858.12 404.55

1

10

100

1000

10000

100000

0 500 1000 1500 2000

Mó

du

lo E

lást

ico

G' (

Pa)

Tiempo [s]

30-70 40-60 50-50 Tiempo de gelificación

26

Con respecto al tiempo de gelificación, es posible observar que para la mezcla de nivel alto de carbonato, se

tiene un tiempo de gelificación de alrededor de 1 minuto, lo que en la práctica no le daría el tiempo necesario a

quien aplique el gel para lograr la operación en su totalidad.

Con base en los resultados obtenidos, se decide descartar el nivel alto en carbonato, puesto que su

comportamiento no se ajusta a las características deseadas. Sin embargo, cabe resaltar que los geles formulados

con el alginato trabajado en el presente trabajo, se diferencian de los geles formulados en trabajos anteriores de

la Universidad de los Andes, pues estos al tener un nivel de carbonato alto presentaban sinéresis. La sinéresis es

la separación de fases debido a la saturación de los ácidos tipo G con el calcio presente en solución. (Moreno

Borda, Salcedo Galán , & Tabima Martinez, 2014). Esto indica que tal como se esperaba, al tener una proporción

menor M/G se obtienen geles más reticulados, capaces de capturar una mayor cantidad de Ca+2.

5.2.2.4. VARIACIÓN DE GDL

Para la variación de GDL se caracterizaron los geles de manera reológica en los diferentes niveles obteniéndose

como resultado la gráfica y tiempos de gelificación reportados en la Figura 20 y la Tabla 11.

Figura 20. Módulo elástico en función del tiempo para geles con variación de GDL, al mantener constante en nivel 8% de alginato y nivel 30-70 de carbonato

Para el cambio de GDL, es posible ver que las dos curvas del módulo elástico corresponden a las curvas deseadas

para trabajar, sin embargo, el módulo es mayor y por lo tanto, se dice que el nivel alto de GDL, presenta mejores

resultados para la formulación estudiada.

Tabla 11. Tiempo de gelificación para geles con variación de GDL, al mantener constante en nivel 8% de alginato y nivel 30-70 de carbonato y sus respectivos módulos elásticos y viscosos


8%-30-70-0.5 (MBB) 246.83 401.918 35.51

8%-30-70-0.7 (MBA) 300.71 2004.80 354.92

Con base en el tiempo de gelificación, se puede decir que los tiempos obtenidos no corresponden con el

1

10

100

1000

10000

100000

0 500 1000 1500 2000

Mó

du

lo E

lást

ico

G' (

Pa)

Tiempo (s)

0,5 0,7 Tiempo de gelificación

27

comportamiento visto en la realidad, pues al agregar una mayor cantidad de GDL, se pudo ver un

comportamiento más viscoso y una gelificación más rápida. Sin embargo, se puede advertir que los tiempos

siguen cumpliendo con las características deseadas y el nivel más alto, al presentar módulos mayores, tiene un

comportamiento más deseable.

5.2.2.5. VARIACIÓN BINARIA DE COMPONENTES

Con el fin de observar si existe alguna interacción entre los diferentes niveles definidos para cada materia prima,

se desarrollaron geles con cambios en dos de los niveles que definen la formulación del gel. Debido a que los

mejores resultados se obtuvieron con mayores niveles de alginato, se estudian las interacciones en los niveles

8% (Figura 21) y 12% (Figura 22) de alginato. Adicionalmente, se obtienen sus tiempos de gelificación (Tabla 12 y

Tabla 13).

Figura 21. Módulo elástico en función del tiempo para geles al mantener constante el nivel 8% de alginato. Con A)40/60-0.7 y B)30/70-0.5 carbonato de calcio y GDL respectivamente

Tabla 12. Tiempo de gelificación para geles al mantener constante el nivel 8% alginato y realizar variación de los niveles de carbonado de calcio y GDL


8%-40-60-0.5 (MMB) 246,839 401,917 35,515

8%-40-60-0.7 (MMA) 110,916 791,060 366,774

1

10

100

1000

10000

100000

0 500 1000 1500 2000

Mó

du

lo E

lást

ico

G' (

Pa)

Tiempo (s)

A B Tiempo de gelificación

28

Figura 22. Módulo elástico en función del tiempo para geles al mantener constante el nivel 12% de alginato. Con: A)30/70-0.7 B)40/60-0.5 C)40/60-0.7 carbonato de calcio y GDL respectivamente

Tabla 13. Tiempo de gelificación para geles al mantener constante el nivel 12% alginato y realizar variación de los niveles de carbonado de calcio y GDL


12%-30-70-0.7 (ABA) 185,143 821,174 125,681

12%-40-60-0.5 (AMB) 66,6589 565,419 80,7558

12%-40-60-0.7 (AMA) 78,3589 1718,25 2146,05

Según los resultados mostrados en la Tabla 13, es posible ver que los tiempos de gelificación obtenidos para los

geles con 12% de alginato y 40/60 de carbonato, son muy bajos y por lo tanto estos no permitirían la correcta

fijación de los huesos. Adicionalmente, como se muestra en Figura 22, estos presentan módulos elásticos

iniciales más altos, lo que indica una menor mojabilidad y posteriormente no presentan un gran aumento,

indicando que tendrán menores fuerzas adhesivas. De igual manera, como se muestra en la Figura 21, el gel con

40/60 y 0.7 de carbonato y GDL, presenta un decaimiento en el módulo con el paso del tiempo, lo que indica

una pérdida de adhesividad. Es por esto, que se decide no trabajar con el nivel alto de GDL junto con el nivel

40/60 de carbonato, pues a pesar de que estos niveles tuvieran un mejor comportamiento por separado, al

unirlos, presentan un comportamiento indeseado. Con base en estos resultados, se decide que el mejor

comportamiento se da con los niveles 40/60 0.5.

PÉRDIDA DE MASA PARA GELES POR GELIFICACIÓN INTERNA 5.3.

5.3.1. VARIACIÓN DE ALGINATO DE SODIO.

Para la pérdida de masa se obtuvo la siguiente curva en la que se muestra el comportamiento de la fracción de

pérdida de masa al pasar el tiempo.

1

10

100

1000

10000

100000

0 500 1000 1500 2000

Mó

du

lo E

lást

ico

G' (

Pa)

Tiempo (s)

A B C Tiempo de gelificación

29

Figura 23. Fracción de pérdida de masa en función del tiempo para geles con variación de alginato medio y alto al mantener constante el carbonato de calcio y GDL en nivel bajo (30/70) y bajo (0,5) respectivamente

Según la Figura 23 se puede observar que la pérdida de masa después de los 100 minutos es significativamente

mayor para el gel formado a partir de un nivel alto de alginato de sodio, pero posteriormente después de los

300 min, sin importar la concentración de alginato la fracción de pérdida de masa es semejante para los dos

geles analizados. Contrario a lo anterior, en los primeros 100 min la pérdida de masa es menor en el gel que

presenta mayor cantidad de alginato, lo cual es lo que debería pasar, ya que a mayor cantidad de alginato

debería presentarse un mayor entrecruzamiento. Para explicar el comportamiento del gel con nivel alto de

alginato se supone que llega un punto en que sin importar la concentración de alginato no se presenta más

entrecruzamiento debido a que para que haya un mayor grado de entrecruzamiento es necesario una mayor

concentración de iones divalentes de calcio en el sistema.

5.3.2. VARIACIÓN DE CARBONATO DE CALCIO

Para la pérdida de masa se obtuvo la siguiente curva en la que se muestra el comportamiento de la fracción de

pérdida de masa al pasar el tiempo.

Figura 24. Fracción de pérdida de masa en función del tiempo para geles con variación de carbonato en niveles bajo y medio al mantener constante el alginato y GDL en nivel medio (8%) y bajo (0,5) respectivamente

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0 100 200 300 400

Frac

ció

n d

e P

érd

ida

Tiempo [min]

8 12

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0 100 200 300 400 500 600

Frac

ció

n d

e P

érd

ida

Tiempo [min]

30/70 40/60

30

En la Figura 24 se observa que para un nivel medio de carbonato, se tiene una menor pérdida de masa, que es lo

que se desea, pues esto indica que en el cuerpo tendrá una mayor estabilidad y no se reducirá hasta el punto de

que la unión pierda su efectividad. Es posible afirmar, de igual manera que el porcentaje perdido por cada gel

varía un poco más entre réplicas al pasar el tiempo, sin embargo el error no es significativo. Adicionalmente,

para las muestras que se conservaron a las mismas condiciones a lo largo de una semana para corroborar la

fracción de pérdida total de masa, se obtuvo que las muestras se reducen en un 90%, es decir pierden toda la

masa de agua inicial.

En comparación con los geles trabajados con anterioridad, es posible decir que el cambio ha sido perceptible,

pues al tener un alginato diferente, los geles retenían un mayor porcentaje de agua y por lo tanto presentaban

una mayor pérdida de masa. Adicionalmente, de manera cualitativa, es posible ver este comportamiento, pues

los geles de alginato anteriormente trabajados reducían su diámetro a la mitad en el proceso de secado (Suarez,

Salcedo , & Tabima, 2014), mientras que los trabajados en el presente proyecto, no reducen su diámetro de

manera relevante.

5.3.3. VARIACIÓN DE GDL

Para la pérdida de masa se obtuvo la Figura 25 en la que se muestra el comportamiento de la fracción de

pérdida de masa al pasar el tiempo. En esta, es posible observar que existe una menor pérdida de masa con un

nivel alto de GDL, que es el objetivo, pues esto indica que en el cuerpo tendrá una mayor estabilidad y no se

reducirá hasta el punto de que la unión pierda su efectividad. De igual manera, tal como los otros geles

formulados se encontró que los geles pierden hasta el 90% de su masa y conservan su diámetro.

Figura 25. Fracción de pérdida de masa en función del tiempo para geles con variación de GDL al mantener constante el alginato y carbonato en nivel medio (8%) y bajo (30-70) respectivamente

PRUEBA DE HINCHAMIENTO PARA GELES POR GELIFICACIÓN INTERNA 5.4.

5.4.1. VARIACIÓN DE ALGINATO DE SODIO.

Para la prueba de hinchamiento se obtuvo la siguiente curva en la que se muestra el comportamiento de la

fracción de hinchamiento al pasar el tiempo.

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0 50 100 150 200 250 300

Frac

ció

n d

e P

érd

ida

Tiempo [min]

0.5 0.7

31

Figura 26. Fracción de hinchamiento en función del tiempo para geles con variación de alginato de sodio en niveles medio y alto al mantener constante el carbonato de calcio y GDL en nivel bajo (30/70) y bajo (0,5) respectivamente

Según los resultados obtenidos en la Figura 26 se puede afirmar que el gel que menos se hincha es el de nivel

medio de alginato de sodio. En este sentido, es posible observar que al aumentar la cantidad de alginato el gel

presenta una mayor absorción de agua. Lo anterior se puede explicar debido a que aunque haya mayor

concentración de alginato esta no genera un mayor grado de entrecruzamiento, ya que es necesaria una mayor

cantidad de iones divalentes para formar las cajas de huevo. De esta manera, al agregar más alginato lo que se

va a tener es más cadenas poliméricas sueltas que no contribuyen a la fuerza del gel, sino que por el contrario

dado la naturaleza hidrofilica del alginato van a permitir que entre más agua al sistema. De esta manera, se

puede suponer que el aumento de la concentración de alginato con los niveles de CaCO3 y GDL constantes,

disminuye el grado e entrecruzamiento del gel.

5.4.2. VARIACIÓN DE CARBONATO DE CALCIO

Para la prueba de hinchamiento se obtuvo la siguiente curva presentada en la Figura 27 en la que se muestra el

comportamiento de la fracción de hinchamiento al pasar el tiempo.

Figura 27. Fracción de hinchamiento en función del tiempo para geles con variación de carbonato en niveles bajo y medio al mantener constante el alginato y GDL en nivel medio (8%) y bajo (0,5) respectivamente

-1

-0,5

0

0,5

1

1,5

0 50 100 150 200Frac

ció

n d

e h

inch

amie

nto

tiempo [min]

8 12

-1,00

-0,50

0,00

0,50

1,00

0 50 100 150 200 250Frac

ció

n d

e h

inch

amie

nto

tiempo [min]

30-70 40-60

32

De acuerdo a la Figura 27, es posible observar que al aumentar la cantidad de carbonato tiene una menor

absorción de agua y por lo tanto se puede inferir que se trata de geles más reticulados. Este comportamiento es

el deseado, pues de esta manera existe una mayor cohesión en el gel dando como resultado que la adhesión de

los huesos sea la adecuada.

Adicionalmente, es posible ver que a lo largo de las pruebas que los geles se secan, sin embargo no se

fragmentan como lo hacían los geles preparados en proyectos anteriores (Suarez, Salcedo , & Tabima, 2014) lo

que indica que el gel tiene una mayor cohesión, por lo que tendrá la oportunidad de resistir mayores fuerzas en

agua.

5.4.3. VARIACIÓN CONCENTRACIÓN DE GDL

Para la prueba de hinchamiento se obtuvo la siguiente curva en la que se muestra el comportamiento de la

fracción de hinchamiento al pasar el tiempo.

Figura 28. Fracción de hinchamiento en función del tiempo para geles con variación de GDL al mantener constante el alginato y carbonato en nivel medio (8%) y bajo (30-70) respectivamente

De acuerdo a la Figura 28, es posible observar que el aumento de GLD da como resultado una menor pérdida de

masa, debido a geles más reticulados como se explicó con anterioridad. De igual manera estos geles no

presentaron fragmentación y por lo tanto se analizarán los dos niveles, a pesar de que el nivel alto (0,7) presente

mejores resultados.

ENSAYO DE TRACCIÓN 5.5.Para esta prueba se desarrolló la metodología descrita con anterioridad. En esta, se hizo una prueba de adhesión

para el gel obtenido por medio de gelificación interna, con resultados más prometedores 8% 40/60 0.5.

Al poner en prueba este gel se obtienen los resultados mostrados en la Figura 29, que comparan el desempeño

del alginato Protanal con la formulación enunciada, con el alginato chino con formulación 4% 30/70 0.5, que se

refiere a los mejores resultados obtenidos con este tipo alginato. De esta manera se corrobora que se trata de

geles más reticulados que son capaces de soportar una mayor carga de rotura de hasta 207,1 +/- 80.2 kPa, en

comparación con la soportada por el alginato chino de 57.98 +/- 40.8 kPa.

-1,00

-0,50

0,00

0,50

1,00

1,50

0 50 100 150 200

Frac

ció

n d

e h

inch

amie

nto

tiempo [min]

0,5 0,7

33

Figura 29. Resultados del ensayo de tracción para geles de alginato protanal y chino

0

50

100

150

200

250

300

350

Protanal (8% 40/60 0.5) Chino (4% 30/70 0.5)

Car

ga d

e ro

tura

(kP

a)

34

6. CONCLUSIONES El peso molecular promedio viscoso del alginato de sodio Protanal es de 42.67 kDa, valor similar al del alginato

Sigma y aproximadamente cuatro veces menor al del alginato Chino. En cuanto al tamaño de partícula, el

alginato de sodio caracterizado presentó una distribución de tamaño bimodal con tamaños semejantes al del

alginato Sigma en todos los percentiles analizados y en los valores del diámetro medio de Sauter el diámetro

medio de Brouckere. Se observó que los procesos de gelificación y los geles formados con diferentes muestras

son dependientes del peso molecular promedio viscoso del alginato de sodio.

El alginato de sodio Protanal presenta un porcentaje de monómeros G de aproximadamente 70% lo que a su vez

genera una razón M/G de 0.44.

Los geles desarrollados con alginato Protanal, alcanzaron módulos elásticos de hasta 106 Pa y presentaron cargas

de rotura de aproximadamente 200kPa, siendo estos valores considerablemente más altos que los obtenidos

con anterioridad en la Universidad de los Andes con los alginatos sigma y chino. Con base a esto, se afirma que

tal como se anticipaba, según los modelos teóricos sobre los enlaces iónicos entre el grupo carboxilo presente

en los monómeros G y los cationes de Ca+2, los geles obtenidos son más reticulados y por lo tanto presentan un

mayor potencial para su uso como adhesivo para huesos.

Los hidrogeles formados por medio de difusión, presentan una gelificación por superficie, lo que provoca

tiempos de gelificación muy cortos y gran retención de agua dentro del mismo, de manera que estos presentan

módulos elásticos muy bajos y tiempos de gelificación muy cortos que hacen el uso de esta técnica inviable para

el potencial médico.

Para la preparación de los geles por gelificación interna, es posible ver que la formulación de geles con

resultados más prometedores se trata de 8% alginato, 40/60 carbonato y 0.5 GDL. Esta formulación es elegida, a

pesar de que para los tres compuestos, los niveles altos mostraran un mejor comportamiento. Sin embargo, en

el caso del alginato, el nivel 12% presenta un mayor hinchamiento y pérdida de masa, y se desea el efecto

contrario. Adicionalmente, el carbonato de calcio en el nivel 50/50 provoca tiempos de gelificación muy cortos y

módulos elásticos iniciales muy altos que no permiten su uso en un campo médico. Finalmente, el nivel de 0.7

de GDL, tiene una interacción fuerte con el carbonato, pues su aumento provoca una disminución en el módulo

elástico, disminuyendo su adhesividad.

35

7. TRABAJO FUTURO Con el fin de evaluar el comportamiento de los geles en condiciones reales, se propone como trabajo a futuro el

desarrollo de ensayos de tracción en medios acuosos o soluciones isotónicas de sal, de manera que simulen las

condiciones internas del organismo. Adicionalmente se propone realizar pruebas de citotixicidad, que permitan

verificar que los geles no son nocivos para las células y tejidos con los que entren en contacto. Finalmente, se

recomienda la adición de compuestos que permitan la regeneración ósea, como la hidrioxiapatita.

36

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