Desarrollo de Metodos Por HPLC

7/27/2019 Desarrollo de Metodos Por HPLC

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QUANTAR ; Laboratorio de Anlisis Qumico Especializado


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La cromatografa Lquida de Alta Eficiencia es la tcnicacon mayor mercado en el mundo instrumentalanaltico gracias a su versatilidad, excelente capacidadpara el anlisis de trazas, rapidez y adaptabilidad.


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Limitaciones del HPLC : Falta de operadoresexperimentados.

Razones :

-Escaso entrenamiento en las universidades (costos deequipos y escasa experiencia de la mayora de losprofesores).

-Pocas personas interesadas en aprendercromatografa.

- Poca oportunidad practica de contacto con la tcnica.


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6QUANTAR ; Laboratorio de Anlisis Qumico Especializado


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Tiempo de retencin. Tiempo que

transcurre desde la inyeccin de lamuestra hasta que el soluto alcanza eldetector( tambin Ve, Te Tr)

Tiempo muerto. Tiempo necesariopara que una especie que no seretiene en la fase estacionariaalcance el detector (tambin Vm).

CROMATOGRAMA

Lnea base. Seal de la fase mvil

Ancho del pico en la base.

Medida del tiempo endonde se inicia la salida dela seal hasta dondetermina sta.


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Longitudde la

columnaAltura equivalente del plato (HEPT) H = L

N

Es el sitio de interaccin donde se consigue un equilibrio transitorio deleluato entre la fase estacionaria y la fase mvil.


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As10% =b/a

Ideal = 1Aceptable = 0.8 a 1.3

10% Altura


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k = Nmero de moles de soluto en la fase estacionariaNmero de moles de soluto en la fase mvil


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Procedimientos empricos = interminables ensayos de prueba y error.

Ejemplos de resultados :

- kmuy prximo a cero- Tailing > 2.0

- Cromatogramas con amplios sectores vacios separando bandasparcialmente solapadas.

- Ninguna documentacin de los ensayos realizados- etc

1. Intentar separacin por fase reversa regular2. Intentar por apareamiento inico3. Probar con diferentes columnas4. Modificar pH, temperatura, , etc.


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Pico 1

Pico 2

Pico 3

Pico 4

20 min.5 min. 15 min.


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Procedimientos sistemticos = Lgica y sentido comn (Bases tericas)

Reduccin de tiempos y costos !!

Pico 1

Pico 2

Pico 3

Pico 4

20 min.15 min.5 min.

Pico 1

Pico 2

Pico 3

Pico 4

20 min.5 min. 15 min.


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Objetivos :

- Screening, identificacin o cuantificacin ?

- Nivel de concentracin (macro o microcomponentes) ?

- Precisin requerida ?

- Ncomponentes a valorar ?

- Nmuestras a procesar ?

- Nivel de tecnologa disponible ?

- Operadores (habilidades, experiencia, capacitacin)


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Informacin Sobre la Muestra :

- Identidad de componentes de inters

- Rango de pesos moleculares

- Estructura qumica, pKa, solubilidad, espectros UV

- Concentracin de los componentes de inters

- Naturaleza de la matriz ( producto natural, muestra biolgica, tabletas, etc.)


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Definicin del Sistema Preliminar :

- Preparacin de la muestra :SolubilizacinExtraccin

PreconcentracinDerivatizacin

- Detector a utilizar :IRUV/VISConductividadElectroqumicoFluorescencia

- Peso molecular del analito (WM > 2000 Daltons WM < 2000 Daltons ?)


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- Mtodo cromatogrfico para molculas con WM > 2000 Daltons :Aplicacin en anlisis de Pptidos, Protenas, Polinucletidos, etc.

Primer alternativa :- Exclusin por tamao o SEC (GPC, GFC)

Otras alternativas :- C. Afinidad (anticuerpos, hormonas, etc. como fase estacionaria)- C. Intercambio Inico o IEC ( intercambiadores dbiles WAX y WCX o fuertes

SAX y SCX sobre base Slica o polimrica)- Interaccin hidrofbica, IEC, RP- Fase reversa (Partculas de 300 a 1000 )


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-Mtodo o forma cromatogrfica para molculas con WM < 2000 Daltons :

a. Soluble en solventes orgnicos:- Slica gel no modificada- Fase normal (NP-BPC)- Fase reversa (RP-BPC)

b. Soluble en agua :- InicoIPC, IEC- No InicoNP, RP


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Compuestos Mtodo Columna Fase mvil y Aditivos

NeutrosNo inicos

RP C8 - C18Phe - CN

Aguamodificador(MeOH, AcN, THF)

Acidos dbiles RP Control de laIonizacion

C8 - C18Phe - CN

AguamodificadorAcido Fosfrico a pH 3.0 a 3.5

Bases dbiles RP C8 - C18Phe - CN

Aguamodificador30mM Trietilamina

Inicos e Ionizables RP de Apareamiento

ionico

Preferida C18

Alternativa C8 -CN

AguaMeOH

Alquilsulfonatos pH 3.5 (bases)Tetraalquilamonio pH 7.5 (cidos)

Lipoflicos insoluble en solventeshidroalcoholicos

NP CNNH2Silica

Solventes polares

Iones inorgnicos, Aminocidos, Pptidos,derivados de Acidos nucleicos

IEC SAXSCXBase silica opolimerica

AguamodificadorpH controlado

Fuerza inica controlada

Macromoleculas SEC

IEC

Base silica o

polimerica

Acuosos (GFC)

Orgnicos (GPC)

EstereoismerosIsmeros de posicin

NP Silica Solventes no polares

Enantimeros (Ismeros pticos) RPColumna Quiral

Quirales C18 AcuososCompuestos Quirales

Carbohidratos Columna Amino NH2 Agua - modificador

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A. Determinar longitud de onda de trabajo (Deteccin UV) :

- Mximo de absorcin-Normalmente 190 a 210 nm 254nm para muestras desconocidas.

B. Concentracin de muestra y volumen de inyeccin :

-Hasta 100 g en 20 l.

C. Control del flujo, presin y tiempo de corrida :


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D. Determinar tipo y caractersticas de columna :

- Forma y dimetro de partcula

- Longitud de Columna


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- Longitud y tipo de fase ligada C4, C8, C18, CN, Phe

Bondapak CN

Bondapak Phe

Bondapak C18


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- Y la Marca (Fabricante ) ??


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E. Establecer fase mvil de partida :

- Tipo de modificador orgnico (MeOH, ACN, THF)- Proporcin modificador : agua (%)

- pH y aditivos- Modo Isocrtico vs Gradiente


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- Determinacin del tipo de modificador orgnico:


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Propiedades de solventeshabituales de HPLC


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- Determinacin de la proporcin agua - modificador orgnico:

1. Comenzar con concentracin media de modificador ?2. Comenzar con concentracin alta de modificador ?

3. Realizar gradiente (Lineal 0 100% de modificador) y calcular composicinpara corrida socrtica ?.


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- Determinacin de la proporcin agua - modificador orgnico:


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. Ejercicio!


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-Regulacin del pH de la fase mvil : Supresin Inica (Control de la Ionizacin)

a. Compuestos neutros (No ionizables)b. Compuestos cidos o bsicos (Control de la ionizacin)

AH A- + H+

B + H2O BH+ + OH-

pH = pKa + log Cs/ Ca

Cuidado con

la columna !!


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- Mejorando el Tailing : (Columnas con base de Slica)

Muestra : Base NitrogenadaConc. : 0.05 y 5.0 mg/mlColumna : C18F.M. : Buffer MeOH (1:3)pH = 7.0Flujo : 1.0 ml/min.

Muestra : Base NitrogenadaConc. : 0.05 y 5.0 mg/mlColumna : C18F.M. : Buffer MeOH (2:3)con TEA 30mMpH = 3.0Flujo : 1.0 ml/min.


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F. Resultados no satisfactorios ? Cromatografa de apareamiento inico (IPC)

Limitaciones :

- Generalmente uso de columnas C18.- Principal modificador orgnico es MeOH. Solvente con mayor poder dedisolucin de sales.

- Los contraiones de apareamiento (alquilsulfonatos, tetraalquilamonio) sondifciles de remover. Modifican la selectividad de la columna.

-Las sales de tetraalquilamonio, complejan la silica gel aumentando susolubilidad especialmente a pH alcalino.


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- Condiciones en Cromatografa de apareamiento inico (IPC)

Para Bases :

Fase mvil : aguaMeOH (20:80) + Hexanosulfonato de sodio 5mM

pH : 3.0 - 4.0 con buffer 0.050.1M Fosfrico/Fosfato de amonioReducir proporcin de Metanol hasta conseguir separacin manteniendoconstantes el pH y la concentracin del contrain.

Para cidos :

Fase mvil : aguaMeOH (20:80) + Hidrxido de tetrabutil amonio 5mMpH : 7.07.5 con buffer de fosfatosReducir proporcin de Metanol hasta conseguir separacin manteniendoconstantes el pH y la concentracin del contrain.


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G. Realizar inyecciones de prueba :

1. Inyectar estndar de analito (puede ser materia prima)2. Inyectar cantidad suficiente para diferenciar de picos de posibles impurezas.3. Reducir cantidad inyectada hasta tener una respuesta menor a 0.5UA para asegurar

trabajar dentro del rango lineal del detector UV, aunque esto deber verificarsedurante la validacin.

+

Respuesta

Tiempo


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Una vez establecido un sistema apropiado

(columna, solvente, parmetrosinstrumentales), se tiene un mtodopreliminar que deber optimizarse para

mejorar al mximo la separacincromatogrfica.


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Ajuste de los parmetros cromatogrficos :

- Resolucin (R)- Capacidad (k)- Eficiencia (N)

- Selectividad ()

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Formula de calculo basada enel grafico.

1. Resolucin :

R = (t2t1) .

(W2+ W1)

Formula dependiente de lostres factores :

- Capacidad (k)- Eficiencia (N)- Selectividad ()

R = (1).. N. k .

(1 + k)


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tn , tiempo de retencin del pico de intersT0 , tiempo de volumen muerto

kvaria simplemente ajustando la fortaleza de la fase mvil

2. Regulacin de la capacidad (k):

k = (tnt0).

t0

Para fase reversa :

- A mayor proporcin de agua mayor k,o sea mayor retencin- A mayor proporcin de modificador menor k(MeOH, ACN, THF)

- Cambios de pH en la F.M. no modifican tr de compuestos neutros- Cambios de pH en la F.M. producen grandes cambios en el tr decompuestos disociables.- En IPC tr aumenta con la concentracin y longitud de la cadena alqulica


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La resolucin no varia linealmentecon k sino con k/(1 + k) de modo

que un aumento en la retencinproduce significativos cambios en laresolucin solo si k


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Pico k

1 1.72 3.03 4.44 6.2

Pico k1 2.8

2 5.63 9.34 14.6

2. Regulacin de la capacidad (k): . Ejercicio !


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N , platos tericos

tn, tiempo retencin del pico ensimo

wtan, ancho del pico tangencial

3. Regulacin de la eficiencia (N) :

N = 16(tn/ wtan).

N aumenta de varias formas :

- Disminuyendo el caudal- Utilizando columnas mas largas

- Columnas con partculas de menor dimetro- Acoplando columnas- Aumentando la temperatura- Columnas nuevas o regeneradas- Menor longitud de tuberas y menores volmenes muertos


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La resolucin no varia linealmentecon la eficiencia (N) sino con su raz

cuadrada (N).

N N

10000 100.0

20000 141.440000 200.0

R = (1). . N. k . (1 + k)



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Aumentar N :

-Disminuyendo el caudal-Utilizando columnas mas largas-Columnas con partculas de menor dimetro-Acoplando columnas-Aumentando la temperatura-Columnas nuevas o regeneradas-Menor longitud de tuberas y menores volmenes muertos


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4. Regulacin de la selectividad () :

Coeficiente del factor de capacidad de un par de picos = k2/ k1.

Agotadas las variaciones de k y N, si la resolucin no es la adecuada seintenta un cambio de selectividad.

Implicaciones :

Modificaciones importantes en el sistema cromatogrfico con resultados quepueden ser imprevistos (mejores o peores).

1. Fase mvil2. Columna


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4. Regulacin de la selectividad () : . Mejorando la fase mvil

Triangulo deselectividad desolventes propuestopor Snyder segn eltipo y magnitud deinteraccin


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Fuerza de elucin de fase mvil:

Metanol

(Grupo II)Acetonitrilo

(Grupo VI)

Cambio de selectividad

F , Fuerza total de la fase mvilFi , Fuerza del solvente ii , Fraccin en volumen del solvente i



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SolventeFuerza de

elucion

Agua 0.0

Metanol 2.6

Acetonitrilo 3.2

Tetrahidrofurano 4.5



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FF.M.= FMeOHMeOH+ FH2OH2O

FMeOH.MeOH

ACN = F MeOHMeOHFACN

FACN.ACN=

ACN = 2.6 x 70

3.2

F.M.MeOH - H2O

(70:30)

F.M.

ACN - H2O

Cambio de selectividad

ACN = 56.88


(57:43)


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Efecto delmodificador orgnicosobre la resolucin yseleccin de una fasemvil ternaria en

base a los resultados.



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GRACIAS POR TU ATENCION Y

EXCELENTE DISPOSICION !!

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