1

Desplegamiento térmico de

proteínas: análisis de

transiciones

bajo control cinético

2

Desde hace varios años, y hasta la fecha, una práctica

común en la Biología Molecular y la Bioquímica ha sido

la determinación comparativa de la estabilidad de

proteínas con cierto grado de similitud estructural

(mutantes de una misma molécula silvestre, enzimas

termófilas vs. mesófilas, etc.)

3

Los métodos más usados para este propósito son:

1. Inducción del desplegamiento (unfolding) de las

proteínas, a baja temperatura, mediante la adición

de urea o GuHCl.

2. Desplegamiento inducido por aumento de la

temperatura. Con proteínas de gran tamaño se

encuentra frecuentemente que el desplegamiento

térmico es irreversible.

4

A pesar del problema de irreversibilidad, el método de

desplegamiento térmico tiene la ventaja de ser

fácilmente efectuado con los instrumentos

espectrofotométricos modernos (CD, fluorescencia,

absorción de luz) que están equipados con

portaceldas tipo Peltier.

5

Análisis de transiciones inducidas por cambio en la temperatura

(barridos térmicos con una velocidad de calentamiento o

enfriamiento constante): ¿Es reversible el proceso?¿Cercano al

equilibrio?

20 30 40 50 60 70 80

-12

-11

-10

-9

-8

-7

[θ] x 1

0-3

Temperature (°C)

lisozima de huevo,

pH 3.0, 2.0 °C/min,

10 µg/mL

6

En este caso, el uso de las ecuaciones del equilibrio

termodinámico está justificado. En particular, para una transición

de dos estados (N ↔ U), después de transformar datos a

fracción de proteína desplegada (fU) vs temperatura:

fU = K / (1 + K)

K = exp(−∆G0/RT)

∆G0 = ∆H − T∆S

7

Si se emplea calorimetría diferencial de barrido (DSC), el trazo de la

capacidad calorífica de exceso (Cp) se obtiene restando una línea

base que representa ∆Cp

4 0 4 5 5 0 5 5 6 0 6 5

0

5 0

1 0 0

1 5 0

2 0 0

2 5 0

3 0 0

4 0 4 5 5 0 5 5 6 0 6 5

Cp (

kJ [m

ol K

]-1

)

te m p e ra tu re (°C )

8

4 0 4 5 5 0 5 5 6 0 6 5

0

5 0

1 0 0

1 5 0

2 0 0

2 5 0

te m p e r a tu r e ( °C )

Cp

,ex (

kJ [m

ol K

]-1

)

∆ H ( k J /m o l)

La integral bajo la curva, hasta diferentes temperaturas, da

la función de entalpía de exceso, <H>

Esas dos funciones se relacionan con fU:

<H> = fU ∆H , y Cp = d<H>/dT

9

En muchos casos, sin embargo, las transiciones térmicas

ocurren bajo control cinético porque son operativamente

irreversibles

←→

r

u

k

k

N → dkU D (kd >> kr)

o son reversibles pero lejanas del equilibrio, como en el

ejemplo siguiente

10

Triosafosfato isomerasa de levadura (TIM o TPI)

Proteína dimérica, aprox. 52,000 Da

11

20 30 40 50 60 70

-20

-18

-16

-14

-12

-10

-8

[θ] x 1

0-3

temperature (°C)

yTIM, pH 8.4, 10 µg/mL

2.0 °C/min (líneas continuas); 0.5 °C/min (líneas de puntos)

Benítez-Cardosa et al. Biochemistry 40, 9049-9058 (2001).

12

Para el análisis de transiciones térmicas lejanas del

equilibrio se recurre a plantear las ecuaciones

diferenciales apropiadas.

Para una transición irreversible sencilla (de dos estados):

→kdN U

dfU/dt = kd fN = kd (1 − fU)

Y, como dT/ dt = v, donde v es la velocidad de barrido, se

obtiene

13

dfU/dT = (kd / v) (1 − fU) ……...........(1)

La variación de kd con la temperatura se expresa, como es

común, por medio de

kd = A exp(−Ea/RT)

o de

kd = E exp(−∆G‡ / RT)

∆G‡ = ∆H‡ − T∆S‡

14

fU = 1− exp [(1/v) ∫ A exp(−Ea/RT) dT ]

fU puede calcularse por integración numérica:

Donde el límite inferior es una temperatura baja (T0) a la

cual fU = 0

Alternativamente, fU puede obtenerse resolviendo

numéricamente la ecuación (1), usando métodos Runge-

Kutta implementados en paquetes de software.

15

La resolución numérica de ecuaciones diferenciales permite

tratar mecanismos más complejos

→ 1k →2kIN U

16

En cualquier caso, para simular perfiles térmicos de fU o

trazos de Cp es necesario conocer la dependencia de la

temperatura de las “constantes” de velocidad. Esta

información puede ser obtenida de estudios cinéticos clásicos

realizados a diferentes temperaturas.

17

20 30 40 50 60 70 80

-0 .2

0 .0

0 .2

0 .4

0 .6

0 .8

1 .0

1 .2

fu

tem pera ture (°C )

Desplegamiento/replegamiento (unfolding/refolding) de yTIM:

dfU/dT = (ku/v) (1 −fU) − 2(kr/v) C0 fU2

18

¿Cómo proceder si no hay información

cinética disponible?

Desconvolución de trazos de Cp y

perfiles de fU

19

Transición irreversible de dos estados:

310 315 320 325 330 335 340 345 350 355

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

fU

T (K)

dfU/dT

Datos de inicio: un

perfil térmico de fU

20

→kdN U

dfU/dT = (kd / v) (1 − fU)

(dfU/dT)/(1 − fU) = (kd / v)

kd = v (dfU/dT)/(1 − fU) …..(3)

For a Cp curve, the equivalent expression is:

kd = v Cp/(∆H − <H>) …..(4)

Eq (4) was first derived by Sánchez-Ruiz et al. (1988) Biochemistry

27: 1648−1652

21

Entonces, construyendo la función V (dfU/dT)/(1 − fU) a partir

de datos experimentales se obtiene kd como función de T

315 320 325 330 335 340 345 350

0.000

0.005

0.010

0.015

0.020

0.025

kd

T (K)

k(T)

22

0.0029 0.0030 0.0031 0.0032-18

-16

-14

-12

-10

-8

ln (k/T)

1/T

Los parámetros de activación (∆H‡ and ∆S‡) son

determinados de un gráfico de Eyring:

ln(kd/T) = ln(E) − (∆H‡ / R)(1/T)

∆H‡/R = 27 973 ± 10

∆S‡/R + ln E = 71.7 ± 0.04

23

En situaciones más complejas, por ejemplo, moléculas de

proteína que tienen dominios que se despliegan

independientemente

24

los trazos de Cp pueden sugerir mecanismos de tres o más

estados

3 1 0 3 2 0 3 3 0 3 4 0 3 5 0

0

5

1 0

1 5

2 0

Cp

T (K )

Kcal/mol

datos sintéticos

25

N → I → U

dfI/dT = k1 fN − k2 fI

dfU/dT = k2 fI

<H> = fI HI + fU HU ..... (5)

Cp = (dfI/dT) HI + (dfU/dT) HU ….. (6)

26

Usando la ecuación (4), se construye una función T

llamada, por ejemplo kap

kap = v Cp/(∆H − <H>)

donde ∆H es la entalpía total de la desnaturalización

0 .0 0 2 9 0 .0 0 3 0 0 .0 0 3 1 0 .0 0 3 2

- 1 8

- 1 6

- 1 4

- 1 2

- 1 0

- 8

- 6

ln (

kap/T

)

1 /T

Gráfico de Eyring

27

A partir del gráfico anterior:

Ajuste de la zona de baja temperatura (k1):

∆H‡/R = 26,574 ± 95.4

∆S‡/R + ln E = 68.70831 ± 0.29914

k1 = 0.509 at 80 °C (69% de error)

Ajuste de la zona de alta temperatura (k2):

∆H‡/R = 56,604 ± 153

∆S‡/R + ln E = 155.0 ± 0.44879

k2 = 1.79 at 80 °C (7% de error)

28

310 320 330 340 350

0

50

100

150

200

<H>

T (K)

Afinamiento de k1. El gráfico de <H> indica que la entalpía del

intermediario (HI) es cercana a 100 kcal/mol (con respecto a N)

29

A baja temperatura, donde el estado final U no está

poblado apreciablemente, una función más adecuada

para determinar k1 es:

k1 ≅ v Cp /(HI − <H>) ……(7)

30

0.00300 0.00305 0.00310 0.00315 0.00320 0.00325-17

-16

-15

-14

-13

-12

-11

-10

ln (

k1/T

)

1/T

Gráfico de Eyring, de la nueva función calculada

según ecuación (7)

31

Recálculo de los parámetros de

activación para k1:

∆H‡/R =28 070 ± 31

∆S‡/R + ln E = 74.2 ± 0.1

k1 = 1.70 s-1 at 80 °C (2% de error)

32

Un caso difícil para la desconvolución. Dos reacciones

secuenciales

N → I → U

pero k1 determina la velocidad dentro de la mayor parte

del intervalo de temperatura donde ocurren las

transiciones.

33

320 325 330 335 340 345 350

0

5

10

15

20

25

30

Cp

T (K)

34

320 325 330 335 340 345 350

0

50

100

150

200

<H>

T (K)

kcal/mol)

35

Como se observa en las dos figuras anteriores, no

hay indicio evidente de que exista un estado

intermediario

Procediendo como en el caso anterior, se calcula una

kap, en función de T:

kap = v Cp/(∆H − <H>)

36

0.0029 0.0030 0.0031

-18

-16

-14

-12

-10

-8

ln (

ka

p/T

)

1/T

Gráfico de Eyring de kap

37

Alta temperatura:

∆H‡/R = 28 231 ± 39

∆S‡/R + ln E = 72.5 ± 0.1

Baja temperatura:

∆H‡/R = 28 076 ±143

∆S‡/R + ln E = 71.4 ± 0.4

Ajustes de las zonas de baja y alta temperatura dan juegos de

parámetros de activación muy parecidos

38

310 320 330 340 350

0

4

8

12

16

20

24

28

C p

T (K )

Cp,ca lc

C p, exp

Sin embargo, la simulación llevada a cabo con los

parámetros de activación obtenidos de la

desconvolución da un trazo de Cp que no coincide con

el trazo experimental

39

En casos como el anterior, el procedimiento a seguir

consiste en un proceso iterativo en el que se calculan las

fi, resolviendo las ecuaciones diferenciales apropiadas, y

con éstas se ajusta la curva de <H> para encontrar

valores de Hi más adecuados.

40

Gracias por su atención

aha@xanum.uam.mx