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DIRECCIÓN GENERAL DE SANIDAD VEGETAL

Dirección del Centro Nacional de Referencia Fitosanitaria

Área de Desarrollo, Validación de Protocolos y Diagnóstico

Protocolo de Diagnóstico

para la

Detección de Globodera rostochiensis

mediante PCR cuantitativa (qPCR)

Elaborado por

M.C. Liliana Elizabeth Ronces Frutos

Revisado por

M.C. José Manuel Cambrón Crisantos

M.C. José Gustavo Torres Martínez

Autorizado por

M.C. José Abel López Buenfil

Datos de Control

Revisión Fecha de

Elaboración Laboratorio Nº de páginas

00

Octubre de 2016

Desarrollo,

Validación de

Protocolos y

Diagnóstico

30




TABLA DE CONTENIDO

ÍNDICE DE FIGURAS

ÍNDICE DE TABLAS

I. ANTECEDENTES

Información taxonómica

Hospedantes

Ciclo de Vida

Dispersión

Síntomas

II. IMPORTANCIA

III. TÉCNICAS DE DETECCIÓN

IV. PROCEDIMIENTO PARA EL DIAGNÓSTICO

1. Toma y envio de muestra

2. Recepción y almacenamiento del material

3. Extracción de ADN

a) Extracción de ADN a partir de quistes

b) Extracción de ADN a partir de juveniles J2

4. Amplificación de Ácidos Nucleicos

5. Resultados

6. Confirmación de resultados

V. DESTRUCCIÓN DE LA MUESTRA

VI. RECOMENDACIONES DE TRABAJO

VII. REFERENCIAS

VIII. ANEXOS




ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1. Prevalencia y distribución mundial del nemátodo dorado de la papa (G.

rostochiensis).

Figura 2. Ciclo de Vida de G. rostochiensis.

Figura 3. Hembras de G. rostochiensis en raíces infectadas de papa.

Figura 4. Cultivo de papa mostrando síntomas de la infección por G. rostochiensis.

Figura 5. Resultados de la amplificación de una muestra positiva a G. rostochiensis

mediante qPCR.

ÍNDICE DE TABLAS

Tabla 1. Secuencia de la sonda y oligonucleótidos usados para la amplificación de

G. rostochiensis

Tabla 2. Concentraciones para la mezcla de reacción para qPCR

Tabla 3. Condiciones de termociclaje para qPCR.

Tabla 4. Condiciones de termociclaje para la PCR punto final.




I. ANTECEDENTES

El Nemátodo Dorado de la papa, nombre común con el que se conoce a Globodera

rostochiensis, forma parte, junto con Globodera pallida, del complejo de nemátodos

formadores de quistes en papa (PCN por las siglas en inglés de Potato Cyst

Nematodes). Es un endoparásito sedentario que ocasiona problemas a nivel mundial

en solanáceas, sobre todo el cultivo de papa Solanum tuberosum L. (Núñez et al.

2003)

Se considera originario de Sudamérica, específicamente de la Cordillera de los Andes,

que incluyen Perú, Chile y Bolivia, al sur del lago Titicaca (Mugniéry, 1999). Se cree que

el nemátodo fue llevado a Europa en el siglo XVI, pero fue hasta el siglo XVIII cuando

se diseminó debido al incremento en el uso de variedades mejoradas de papa

(OIRSA, 2015). Según lo reportado por la EPPO en 2016, G. rostochiensis tiene una

amplia distribución geográfica en todos los continentes (figura 1).

En México, este organismo fue detectado por primera vez en 1971 en un lote de

producción de papa en el estado de Nuevo león (Leo, 1972) y después apareció en

los municipios de Saltillo y Arteaga, Coahuila, impidiendo la comercialización de la

papa como semilla, ocasionando pérdidas económicas considerables en los

productores. Hasta 2009, el nemátodo se encontraba distribuido oficialmente en

nueve Estados de la República (Guanajuato, Nuevo León, Hidalgo, Tlaxcala, Puebla,

Veracruz, Estado de México y Ciudad de México) (SENASICA, 2013).

De acuerdo a la normatividad fitosanitaria mexicana, G. rostoshiensis es considerada

plaga P2/P9 presente solamente en algunas áreas y sujeta a control oficial (NOM-025-

FITO-2000).




Figura 1. Prevalencia y distribución mundial del nemátodo dorado de la papa (G. rostochiensis).

EPPO, 2016

Información Taxonómica

Los nemátodos del quiste de la papa pertenecen a la clase Nematoda. El sistema de

clasificación tradicional del nemátodo dorado está basado en la anatomía y

morfología de los especímenes. Adicionalmente, existe una nueva clasificación

basada en su filogenia que considera las propiedades del gen 16S del ARN ribosomal.

Anatomía y morfología (Siddiqui,

2000)

Reino: Animalia

Phyllum: Nematoda

Clase: Secernentea

Orden: Tylenchida

Familia: Heteroderidae

Género: Globodera

Especie: G. rostochiensis

16S del ARNr (De Ley et al., 2006)

Reino: Animalia

Phyllum: Nematoda

Clase: Chromadorea

Orden: Rhabditida

Familia: Meloidogynidae

Género: Globodera

Especie: G. rostochiensis

Hospedantes




Los hospederos de este nemátodo son especies de cultivos y malezas de la familia

Solanaceae, como papas, tomate, pimentón, berenjena, tabaco, entre otras.

Algunos híbridos de Solanum spp y especies silvestres del género Solanum son

hospedantes, como: S. aviculare, S. gilo, S. indicum, S. marginatum, S. nigrum, S.

quitoense, S. dulcamara, S. rostratum, S. triflorum, S. elaeagnifolium, S. xantii, S.

integrifolium y S. Sarachoides, así como cuatro especies del subgenero Lycopersicon

(OIRSA, 2015, EPPO, 2016).

Ciclo de vida

El ciclo de vida de los nemátodos formadores de quistes comienza en primavera,

cuando la eclosión de los huevos se induce por estímulo de los exudados radiculares

del hospedante (INIA, 2016) (figura 2).

La fase infectiva es el segundo estadio juvenil (J2), el cual, al salir del huevo, es atraido

por los exudados radiculares y llega al hospedante . Los juveniles utilizan su estilete

para penetrar mecánicamente a las raíces y migrar a la vasculatura, donde se

convierten en endoparásitos sedentarios obligados (Davis et al., 2004).

Al pasar al tercer y cuarto estadio, los nemátodos se alimentan del periciclo, la

corteza y la epidermis de la raíz (Nicol et al., 2011, OIRSA, 2015). La disponibilidad de

alimento define el sexo de la población. Si el alimento es abundante y existen pocos

nemátodos, la población está constituida principalmente por hembras. Por el

contraio, cuando hay escases de alimento y un alto número de nemátodos,

predominan los machos (Franco, 1986).




Figura 2. Ciclo de vida de G. rostochiensis. A) En primavera, cuando las condiciones ambientales son

óptimas, los huevos eclosan y se liberan los juveniles; B) Los juveniles penetran la raíz del hospedero y

se movilizan al interior de estas para comenzar a alimentarse; C) Después del apreamiento, las hembras

se adhieren al tejido para alimentarse y formar los huevos; D) Al final de la temporada, los quistes que

contienen los huevos son liberados al suelo, donde pueden permanecer viables por muchos años.

Modificado de INIA, 2016

Durante el cuarto estadio, las hembras maduras son esféricas, mientras que los

machos son vermiformes. Las hembras incrementan su tamaño, rompen la superficie

de la raíz y exponen sus cuerpos esféricos dejando la cabeza dentro de la raíz. Los

machos son atraídos por las hembras y ocurre la reproducción sexual y la fase de

producción de huevos (Brodie et al., 1993).




Al alcanzar la madurez, la cutícula de las hembras se endurece y forma una capa

dura externa o quiste que le sirve para proteger los huevos. Cuando la hembra muere,

la cutícula de su cuerpo esférico cambia químicamente y el color que era blanco o

amarillo se torna marrón. La hembra muerta se convierte en un quiste duro, resistente

a las condiciones ambientales, que puede permanecer latente en el suelo hasta por

30 años conteniendo huevos viables (CABI, 2016, INIA, 2016, Mimee et al. 2015).

Dispersión

El nemátodo dorado de la papa es incapaz de desplazarse por sí solo a grandes

distancias debido a que no posee los medios naturales para hacerlo, por lo que se

considera que su dispersión es pasiva. El pequeño tamaño de los quistes facilita la

diseminación del nemátodo, ya que estos son llevados fácilmente de un lado a otro

en la tierra adherida a los tubérculos, maquinaria, herramientas o cualquier material

que implique traslado de suelo (INIA, 2016, CABI, 2016)

El movimiento de semilla-tubérculo, plántulas y suelo que estén contaminados con

este nemátodo y el movimiento de implementos agrícolas, contenedores y agua de

riego en campos infectados con G. rostochiensis, pueden influir en la diseminación de

los quistes de áreas infectadas hacia áreas libres (SENASICA, 2013).

Síntomas

Los nemátodos del quiste de la papa no causan síntomas aéreos inmediatamente,

por lo que pueden permanecer por años en el suelo sin que se detecte su presencia

(Mimee et al. 2015)




La principal característica del ataque de estos nemátodos es la presencia de

pequeños cuerpos blancos, que corresponden a las hembras en proceso de

madurez, y de pequeños quistes en forma de globos (445 + m de largo por 382 + 61

m de ancho, en promedio) adheridos a las raíces y a la superficie de los tubérculos

(Brodie et al., 1993). El color de los quistes varía dependiendo de la madurez de la

hembra: al principio parecen perlitas blancas y poco a poco se tornan dorados,

anaranjados y finalmente cafés (figura 3) (INIA, 2016).

Figura 3. Quistes de G. rostochiensis en raíces de papa infectada.

Créditos: Central Science laboratory, York, GB.

Cuando las poblaciones de nemátodos son bajas no se observan síntomas específicos

que se puedan asociar directamente a la enfermedad, por el contrario, pueden ser

confundidos con síntomas de deficiencia de agua o algún nutriente (SENASICA, 2013,

OIRSA, 2015).

A medida que la población de nemátodos aumenta, los síntomas se hacen más

evidentes. En general, se produce una disminución en el desarrollo e inhibición en el




crecimiento de las plantas (Bello et al., 2005). El nemátodo extrae los nutrientes de las

raíces y reduce el suministro de nutrientes y agua a los tallos y hojas de las plantas.

También se observa clorosis en el follaje, marchitez y, en casos de poblaciones muy

altas del nemátodo, muerte del cultivo (figura 4) (Bello et al., 2005, INIA, 2016). Ello se

traduce en una disminución en el rendimiento y, en consecuencia, pérdidas

económicas.

Los síntomas en campo son no-específicos. Se observa la presencia de manchones

en el cultivo que se extienden con el tiempo hasta generalizarse al total de la parcela.

Estos manchones pueden ser confundidos con un exceso de herbicidas, fitotoxicidad,

etcétera (Mackesy et al. 2014).

Figura 4. Cultivo de papa mostrando síntomas de la infección por G. rostochiensis.

Se aprecia la marchitez y clorosis del follaje, mismos que dan pie a los manchones

que se extienden a lo largo de los cultivos. Créditos: UNECE, 2016




II. IMPORTANCIA

G. rostochiensis es uno de los principales problemas fitosanitarios de la papa a nivel

mundial, considerándose una amenaza en la producción de este cultivo. Se

considera una fuente limitante para la producción agrícola, ocasionando pérdidas

económicas importantes en las regiones donde se encuentra presente (Marks y

Brodie, 1998, Mackesy et al. 2014).

El incremento continuo de la población de G. rostochiensis en los suelos infectados se

debe a su alto índice de reproducción, a la capacidad de permanecer viable en el

suelo hasta por tres décadas en ausencia del hospedante y a la facilidad de ser

dispersado a través del suelo adherido a implementos agrícolas y material

propagativo (Nicol et al. 2011).

El daño causado por este nemátodo se relaciona con el número de huevos por

unidad de suelo y se refleja en el tamaño del tubérculo producido. Su impacto se

manifiesta en la disminución del rendimiento de cultivo, los altos costos en el control,

manejo y erradicación del patógeno, disminución en la rentabilidad de los campos

afectados, restricción o cierre de mercados y restricciones cuarentenarias impuestas

al país con presencia del nemátodo (SENASICA, 2013, CABI, 2016).

III. TÉCNICAS DE DETECCIÓN

Durante años, los métodos tradicionales de taxonomía clásica han sido empleados

para determinar la identidad de los nemátodos formadores de quistes. Los buenos

resultados obtenidos con estas metodologías dependen, en gran medida, de contar

con personal con amplias habilidades en nematología así como de la inversión de

mayor cantidad de horas-hombre.




Sin embargo, la gran similitud morfológica existente entre G. rostochiensis y G. pallida

ha impulsado el desarrollo de técnicas bioquímicas que permitan diferenciar estas

dos especies (Schots et al., 1990, Karssen et al., 1995). Por otra parte, la

implementación de metodologías complementarias más versátiles y rápidas, como el

análisis de material génico mediante técnicas moleculares, ha solucionado los

problemas de ambigüedad en la identificación, además de agilizar el diagnóstico y

favorecer el incremento de la robustez y confiabilidad de los resultados (Carta y

Handoo, 2005).

Por lo general, la discriminación molecular de G. rostochiensis y G. pallida se realiza

mediante la amplificación de las regiones del espacio inter transcrito (ITS, por sus siglas

en inglés) y la posterior digestión enzimática de los productos de amplificación

(Skantar et al., 2011). Actualmente, el SENASICA cuenta con un protocolo de

diagnóstico para nemátodos en papa que combina los métodos taxonómicos con el

uso de marcadores moleculares y el análisis de polimorfismos de longitud de

fragmentos de restricción (RFLP´s) (SENASICA, 2014).

Dentro de las técnicas moleculares, la Reacción en Cadena de la Polimerasa

cuantitativa (qPCR) ha ido ganando aceptación en la identificación de patógenos

debido a que, en comparación con la PCR convencional, es un método de

detección rápido, róbusto y más sensible que permite monitorear el producto de

amplificación conforme transcurre la reacción, sin que sea necesario el empleo de

geles de agarosa para saber si la reacción fue exitosa, además de que reduce el

riesgo de contaminación (Tamay de Dios, 2013).




Por esta razón, en el presente protocolo se propone el diagnóstico de Globodera

rostochiensis mediante qPCR con ayuda de oligos específicos que permiten su

diferenciación de G. pallida así como de otras especies del género Globodera

similares morfológicamente. De este modo, se generará un diagnóstico acertado y

eficiente en un menor tiempo, lo que se verá reflejado en la oportuna toma de

decisiones relacionadas a la regulación de este patógeno en México.

IV. PROCEDIMIENTO PARA EL DIAGNÓSTICO

1. Toma y envío de muestra

Todas las muestras para la detección del nematodo dorado de la papa deberán ser

enviadas al Centro Nacional de Referencia Fitosanitaria (CNRF) debidamente

etiquetadas y acompañadas por el formato de solicitud de diagnóstico (Ver Anexo

1).

La toma y envío de las muestras se deberá realizar con apego al procedimiento

especificado en el apéndice final de la NOM-040-FITO-2002 que establece los

requisitos y especificaciones para la producción y movilización nacional de papa

comercial (Anexo 2).

2. Recepción y almacenamiento del material

El almacenamiento y tratamiento dado a las muestras depende de la naturaleza del

sustrato (suelo, raíces, tubérculos) que se pretende analizar.

El diagnóstico molecular requiere que se cuente con los especímenes aislados,

preferentemente hembras, ya que estas han mostrado ser más adecuadas para la

identificación morfológica.




Los métodos de aislamiento a partir de un sustrato dado se pueden consultar en el

Protocolo de Diagnóstico para Nemátodos de Importancia Cuarentenaria en papa

para México (SENASICA, 2014).

3. Extracción de ADN

El protocolo de Diagnóstico para Nemátodos del SENASICA propone dos técnicas de

extracción de material génico para estos patógenos, uno para quistes y otro para

especímenes individuales (Juveniles J2). En ambos casos es necesaria la observación

previa al microscopio, ya sea para confirmar que los quistes contengan masas de

huevecillos o para realizar el análisis morfométrico y así asegurar una extracción

exitosa.

El procedimiento para llevar a cabo la extracción de ADN se encuentra detallado en

el anexo 3. Para más información, consultar el Protocolo de Diagnóstico para

Nemátodos de Importancia Cuarentenaria en papa para México (SENASICA, 2014).

4. Amplificación de ácidos nucleicos

El diagnóstico molecular de G. rostochiensis se emplea, generalmente, como un

método complementario al diagnóstico taxonómico. Sin embargo, también puede

ser utilizado como único método de diagnóstico cuando las condiciones de las

muestras así lo requieran, siempre y cuando se cuente con material génico de buena

calidad a concentraciones adecuadas.

En este protocolo se propone la identificación del nemátodo dorado de la papa

mediante la Reacción en Cadena de la Polimerasa cuantitativa (qPCR), la cual

requiere el uso de oligonucleótidos específicos que generen amplicones de un




tamaño que oscile entre 100-150 pb y un sistema reportero de fluorescencia para

detectar los productos amplificados (sonda). Los oligonucleótidos y sonda específicos

para el nemátodo dorado de la papa fueron diseñados por Nakhla y colaboradores

(2010) a partir de la región ITS1 y se describen en la tabla 1.

Tabla 1. Secuencia de la sonda y oligonucleótidos usados para la amplificación de

G. rostochiensis por qPCR.

Nombre Secuencia (5´- 3´) Tamaño del

amplicón

PGrtf TCTGTGCGTCGTTGAGC 105

Postor CGCAGACATGCCGCAA

Nombre Secuencia (5´- 3´) Absorción-Emisión

GTETp TET/CGCAGATATGCTAACATGGAGTGTAG/BHQ-2 521-536 nm

Los ingredientes químicos en la reacción de qPCR son los mismos que los utilizados en

la PCR punto final. En la tabla 2 se muestran las concentraciones requeridas de cada

uno de los componentes que conforman la mezcla de reacción.

Tabla 2. Componentes y concentraciones para la mezcla de reacción para qPCR

Reactivo Concentración

inicial Volumen (L)

Concentración

final

Agua grado PCR ---- 7.3 ----

Amortiguador de

amplificación 10X 2.5 1X

MgCl2 50 mM 2.5 5 mM

dNTP´s 10 mM 0.5 200 M

Oligos PGrtf 2 M 2 160 nM

Prostor 2 M 2 160 nM

Sonda GTETp 2 M 5 400 nM

Taq polimerasa 5U/L 0.2 0.04 U/L

ADN 10-100 ng/L 3 1.2-12 ng/L

Volumen final ---- 25 ----




NOTA: El método ha demostrado ser confiable en un rango de 5 pg/L a 100 ng/L

de ADN molde (concentración final), siendo las concentraciones recomendadas de

1 a 15 ng/L.

Para la preparación de la mezcla de reacción deberá considerarse el total de

muestras a analizar más un control positivo y un control negativo o NTC. Preparar la

mezcla añadiendo todos los reactivos excepto el ADN. Homogeneizar y colocar 23

L de la mezcla en placas o tiras de tubos para qPCR. Cargar 2 L de muestra,

recordando cambiar de punta entre muestras.

Las condiciones de termociclaje para el diagnóstico de G. rostochiensis se describen

en la tabla 3.

Tabla 3. Condiciones de termociclaje para qPCR.

Temperatura Tiempo Ciclos

95ºC 2 minutos 1

95ºC 1 segundo 40

*58ºC 40 segundos

*Tiempo en el que se realiza la lectura de la fluorescencia

Para poder llevar a cabo la identificación de G. rostochiensis se requiere la tecnología

incluida en los termocicladores de PCR en tiempo real para: a) excitar el reportero, b)

capturar la señal de emisión del mismo y c) realizar el análisis cuantitativo.

El monitoreo de los productos amplificados se produce conforme transcurre la

reacción. En este caso, el software acoplado al equipo de tiempo real genera una

serie de gráficas en donde se muestran todos los datos necesarios para determinar si

la reacción fue exitosa. Dichas gráficas permiten conocer la relación existente entre




el ciclo de amplificación y la fluorescencia detectada por el equipo, generando un

valor numérico de cuantificación (Ct o Cq).

Figura 5. Resultados de la amplificación de muestras positivas a G. rostochiensis mediante qPCR. La

curva de amplificación de las muestras positivas pasa por una fase basal hasta que la señal

fluorescente puede distinguirse del ruido de fondo (Ct) e inicia la fase exponencial. La amplificación

continúa durante varios ciclos hasta alcanzar un nivel constante e independiente del número de ciclos.

Tal como se observa en la figura 5, durante los ciclos iniciales de la PCR no hay

cambios significativos en la intensidad de la fluorescencia emitida. Conforme avanza

la reacción, aumenta la cantidad de ADN amplificado y la señal fluorescente. El

punto donde se observa un incremento en la fluorescencia, distinguiendo entre el

ADN amplificado y el ruido basal, se conoce como fase inicial o Ct y marca el

comienzo de la fase exponencial o logarítmica. Posteriormente, inicia una fase lineal

en la que la eficiencia de la amplificación no es constante. Por último, se alcanza la

fase estacionaria donde el producto de amplificación permanecerá constante

aunque se aumente el número de ciclos.




5. Interpretación de Resultados

Para determinar un resultado de diagnóstico se debe considerar lo observado en los

controles y la forma de la curva.

En este caso, el control negativo no debe presentar un valor de cuantificación

(Ct=N/A) y el control positivo deberá presentar un valor de Ct menor a 37. Además, la

curva del control positivo deberá contar con las tres fases mostradas en la figura 5

(basal, exponencial y estacionaria). Si alguno de los controles no presenta los valores

requeridos, la prueba no puede ser considerada válida y todas las muestras deberán

analizarse nuevamente. En caso de que las curvas generadas no presenten la forma

deseada, las muestras deberán analizarse nuevamente para descartar una posible

degradación de la sonda.

Las muestras que presenten valores de Ct menores a 37 serán consideradas positivas,

mientras que aquellas cuyo valor Ct sea mayor a 37 serán consideradas negativas.

6. Confirmación de Resultados

En caso de que el diagnóstico molecular de G. rostochiensis se hay realizado como

método complementario al análisis taxonómico, los resultados de este estudio

deberán tener concordancia con lo observado durante el diagnóstico morfológico

(a excepción de los casos en los que las condiciones de la muestra no permitan la

caracterización morfológica).

Adicionalmente, el resultado positivo puede confirmarse mediante secuenciación de

los productos de amplificación y la posterior comparación mediante alineamiento de

secuencias. Para ello, es necesario realizar un reacción de PCR punto final




empleando los mismos componentes de la mezcla de reacción mostrados en la tabla

2 exceptuando la sonda, cuyo volumen se sustituye por agua. Las condiciones de

termociclaje para esta nueva reacción son las siguientes:

Tabla 4. Condiciones de termociclaje para la PCR punto final.

Temperatura Tiempo Ciclos

95ºC 3 minutos 1

95ºC 30 segundos

40 58ºC 1 minuto

72ºC 1 minuto

72ºC 5 minutos 1

4ºC ----

V. DESTRUCCIÓN DE LA MUESTRA

Al finalizar el diagnóstico, las muestras deberán ser resguardadas a 4ºC durante un

mes en caso de que sea necesaria alguna corroboración o algún otro diagnóstico.

Pasado este tiempo, desactivar las muestras en autoclave a 121ºC durante 20-25

minutos a 15-20 libras/pulgadas2 (psi) y, finalmente, desechar o incinerar.

VI. RECOMENDACIONES DE TRABAJO

a) Limpiar y descontaminar perfectamente su área de trabajo.

b) Trabajar con guantes de nitrilo.

c) Siempre trabajar con consumibles (tubos, puntas etc.) estériles.

d) Cada muestra y submuestra debe de ir en un tubo independiente rotulado con

su respectivo número de identificación.




e) Las mezclas de reacción deben realizarse en la campana de flujo laminar o

bien en un gabinete para PCR.

f) Ocupar una punta nueva cada que pipetee una muestra, lo mismo para el

caso de los controles positivos y negativos.

g) Utilizar las concentraciones de ADN recomendadas. Si se requiere, deben

hacerse diluciones.

h) Descongelar los reactivos a temperatura ambiente sobre hielo, no forzar su

descongelamiento con la mano o aplicando calor.

i) La enzima Taq polimerasa debe almacenarse siempre a -20°C.

j) De ser posible, utilizar puntas con filtro para la mezcla de reacción.

k) Verificar que el fluoróforo para el ensayo sea el apropiado de acuerdo con el

equipo que se usará.

l) La alícuota del fluoróforo debe estar en tubos color ámbar ya que es

fotosensible.

m) Utilizar consumibles ópticos o fotosensibles que permitan la detección de la

fluorescencia emitida durante el proceso.

VII. REFERENCIAS




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de Referencia Fitosanitaria. México. pp 81

Siddiqui, M. R., 2000. Tylenchida: parasites of plants and insects. CABI Bioscience. St

Albans, UK. 2ª edición. pp 835

Tamay de Dios l. Ibarra C., Velasquillo C., 2013. Fundamentos de la reacción en

cadena de la polimerasa (PCR) y de la PCR en tiempo real. Investigación en

Discapacidad, 2 (2); 70-78

VIII. ANEXOS

1. Solicitud de Diagnóstico Fitosanitario I. DATOS DE LA MUESTRA




Fecha de registro: No. de registro:

Producto/Hospedero y/o insecto: Parte vegetal enviada: Variedad:

Órgano de donde se colecto: Uso del producto: Fase fenológica del cultivo:

Fecha de muestreo: Fecha de envió Cantidad:

Frascos

Cepas

Tubos

Sobres

Macerado

RNA/ADN

Suelo

Otro

Nombre del colector:

II. PROCEDENCIA

Campo Huerto Coordenadas GPS y anexar croquis Nombre del predio/Invernadero/Huerto:

Bodega Trampa

Invernadero

Otro (Especifique) No. Lote/Registro:

Localidad o población Municipio y Estado:

III. DATOS DEL INTERESADO

Nombre completo: RFC:

Domicilio completo: Teléfono con lada:

Localidad/Colonia: Correo electrónico:

Micología Bacteriología Virología Nematología Entomología Biología Molecular Malezas

Motivo del Diagnóstico

Campaña Vigilancia Sospecha de Corroboración Programa Programa Otros Fitosanitaria Epidemiológica nueva plaga Exportación Emergente

*Todos son datos obligatorios cuando se disponga de ellos.

Recibe Envía

2. Procedimiento para el diagnóstico fitosanitario del lote de producción de papa

comercial. NOM-040-FITO-2002

Un organismo de certificación, unidad de verificación o, en su ausencia, personal




oficial capacitado en esta materia y designado por la Secretaría, quien examinará

y/o tomará muestras antes de la plantación/siembra, durante el desarrollo del cultivo,

durante o después de la cosecha, para constatar la fitosanidad del cultivo.

I. Antes de la siembra

Selección de sitios de muestreo.

a) Zonas libres sin reconocimiento oficial.

En cada lote de producción de papa comercial, el organismo de certificación,

unidad de verificación o el personal oficial seleccionará 5 sitios de muestreo al

azar, en cada uno de estos puntos colectará 100 submuestras de suelo de

aproximadamente 30 g cada una a una profundidad de 0 a 5 cm. Las

submuestras se colectarán cada 10 m cubriendo un área aproximada de una

hectárea, se homogeneizarán en el campo y se colocarán aproximadamente

2 kg en una bolsa plástica, la cual se identificará con los datos del lote. Esta

muestra la enviará el organismo de certificación, unidad de verificación o

personal oficial al laboratorio de pruebas que elija el interesado para análisis de

Globodera rostochiensis. Los gastos del envío y diagnóstico serán cubiertos por

el interesado.

b) Zonas bajo control fitosanitario

En cada lote de producción de papa comercial, el organismo de certificación,

unidad de verificación o el personal oficial colectará por cada hectárea del

predio, 100 submuestras de suelo de aproximadamente 30 g cada una, a una

profundidad de 0 a 5 cm. Las submuestras se tomarán cada 10 m, se

homogeneizarán en el campo y se colocarán aproximadamente 2 kg en una

bolsa plástica, la cual se identificará con los datos del lote. Esta muestra la




enviará el organismo de certificación, unidad de verificación o personal oficial

al laboratorio de pruebas que elija el interesado para el análisis de Globodera

rostochiensis. Los gastos del envío y diagnóstico serán cubiertos por el

interesado.

II. Cosecha

En la cosecha, el organismo de certificación, unidad de verificación o personal oficial

examinará visualmente de manera aleatoria una muestra de 100 tubérculos por cada

10 hectáreas o menos, para detectar Meloidogyne chitwoodi y Globodera

rostochiensis.

Cualquier síntoma que no pueda diagnosticarse con seguridad deberá confirmarse

enviando el material a un laboratorio de pruebas para su diagnóstico. Los gastos de

envío y diagnóstico deben ser cubiertos por el interesado.

El laboratorio de pruebas entregará el original del dictamen al interesado y enviará

copia a la Delegación de la Secretaría que envió la muestra y a la Dirección General

de Sanidad Vegetal.

3. Protocolo para la extracción de material génico de nematodos formadores de

quistes




a) Extracción de ADN a partir de quistes

1. Limpiar los residuos de suelo adheridos a los quistes con ayuda de un flotador

de Fenwick. Colocar los quistes limpios en tubos de microcentrífuga estériles de 1.5

mL. La extracción se puede realizar a partir de un solo quiste.

Adicionar 150 μL de solución amortiguadora de extracción A (200 mM Tris-

HCl, pH 8.0, 250 mM NaCl, 25 mM EDTA, 0.5 % SDS).

2. Macerar con un pistilo estéril o con la ayuda de un taladro manual.

3. Congelar a -40°C por 10 min.

4. Volver a macerar con otro pistilo estéril antes de que se descongele la solución.

5. Agregar 0.5 volúmenes de Acetato de Sodio 3M pH 5.8.

6. Mezclar por inversión. Incubar a -20°C por 10 min.

7. Descongelar y agitar por vórtex. Centrifugar a 13,200 rpm por 5 min.

8. Transferir el sobrenadante a otro tubo de microcentrífuga estéril de 1.5 mL.

9. Adicionar 1 volumen de Isopropanol frío (± 4°C) y mezclar por inversión.

10. Incubar a -20°C por 20 min.

11. Centrifugar a 13,200 rpm por 15 minutos para precipitar el ADN.

12. Eliminar el sobrenadante teniendo cuidado de no perder la pastilla de ADN.

13. Lavar la pastilla con 200 μL de etanol al 70% enfriado a - 20°C.

14. Centrifugar a 12,000 rpm por 5 minutos.

15. Eliminar el sobrenadante teniendo cuidado de no perder la pastilla de ADN.

16. Repetir los últimos tres pasos una vez más.

17. Lavar la pastilla con 200 μL de etanol al 100% a -20ªC.

18. Centrifugar a 12,000 rpm durante 5 minutos y eliminar el sobrenadante teniendo

cuidado de no eliminar la pastilla de ADN.

19. Dejar secar la pastilla a temperatura ambiente (± 23°C).

20. Resuspender el ADN en 20 μL de agua grado Biología Molecular.




21. Cargar 5μL del ADN extraído para visualizar la integridad del ADN mediante

electroforesis en gel de agarosa al 1%.

b) Extracción de ADN a partir de juveniles J2

1. Después de haber realizado el análisis morfométrico, recuperar los juveniles J2 del

medio de montaje.

2. Transferir un solo espécimen en 10 μL de amortiguador de extracción B (10 mM Tris-

HCl pH 8.0, 2.5 mM MgCl2, 50 mM KCl, 0.45% Tween 20, 0.05% gelatina) sobre un

cubreobjetos limpio.

NOTA: La cantidad de amortiguador de extracción a utilizar es proporcional al

número de especímenes individuales utilizados, es decir, un espécimen: 10 μL de

amortiguador.

3. Macerar el nematodo con una punta de micropipeta bajo el microscopio

estereoscópico.

NOTA: Tener precaución al momento del macerado, debido a que el

amortiguador de extracción contiene detergentes que pueden generar burbujas,

lo que ocasiona que el espécimen se mueva y se dificulte el macerado. Cambiar

de punta cada vez que se trabaje con esta solución.

4. Mezclar la solución amortiguadora de extracción con el

nematodo macerado con ayuda de la micropipeta.

5. Transferir la solución a un tubo de microcentrifuga estéril de 200 μL. Colocar

el tubo en hielo mientras se continúe trabajando en el macerado de otros

especímenes.

6. Congelar a -40°C por, al menos, 30 minutos.

7. Pasado el tiempo de congelación, incubar inmediatamente los tubos con

muestras a 65ªC por una hora.




NOTA: Se recomienda hacer la incubación en un termociclador.

8. Durante el periodo de incubación, agitar las muestras con vórtex al menos una

vez.

9. Agregar 0.1 μL de Proteinasa K (60 μg/mL) cuando falten 10-15 minutos para

terminar la incubación a 65ªC.

10. Incubar a 95ªC por 15 minutos. Esto permitirá la inactivación de la Proteinasa K.

11. Enfriar a 4°C.

12. Centrifugar por 1 min a 6,000 rpm.

13. Emplear 3 μL del extracto crudo de ADN para una reacción de PCR.

Detección de Globodera rostochiensis - gob.mx · raíces y reduce el suministro de nutrientes y...

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