DETECCION DE PROTEINAS TOTALES

Es un análisis que se realiza por separado o en una petición general de bioquímico en la sangre. Mide la cantidad de proteínas presentes en el suero.

Las proteínas totales del suero se pueden separar en dos grandes grupos la Albúmina y las globulinas. La albúmina es la proteína de más concentración en la sangre. La albúmina transporta muchas moléculas pequeñas (bilirrubina, progesterona, y medicamentos), y tiene también la función de mantener la presión sanguínea ya que favorece la presión osmótica coloidal para mantener líquidos en el torrente sanguíneo y que no pasen a los tejidos, manteniendo un equilibrio.

¿Para qué se realiza este análisis?

La determinación de proteínas totales se realiza para evaluar la posible presencia de enfermedades nutricionales, estado nutricional tras intervenciones de cirugía, enfermedades del riñón o del hígado, o bien que el cuerpo no absorba bien suficientes proteínas.

Si el valor de las proteínas totales está alterado se debe realizar un estudio pormenorizado de cada grupo, albúmina y alfa-1, alfa-2, beta y gamma globulinas, para saber cuál es el desequilibrio existente.

Condiciones para realizar el analisis

Para realizar este análisis no se precisa estar en ayunas. La muestra de elección es un suero fresco, claro y no hemolizado.. Orina preferiblemente estéril Se puede realizar la toma en un lugar apropiado (consulta, clínica, hospital)

pero en ocasiones se realiza en el propio domicilio del paciente.

INTERFERENCIAS No deben utilizarse muestras hemolizadas, ya que la hemoglobina elevará

falsamente los valores de proteína total Las proteínas totales pueden estar aumentadas en el embarazo. Los medicamentos que pueden elevar la concentración de proteínas son los

esteroides anabolizantes, los corticoides, los andrógenos, la hormona de crecimiento, la insulina y la progesterona.

Hay otros medicamentos que pueden disminuir la concentración de proteínas totales, como los estrógenos, los anticonceptivos y otros medicamentos hepatotóxicos.

Las proteínas están presentes en todas las células y en los distintos líquidos corporales: suero o plasma (66-83g/L), orina (100-200 mg/L), líquido cefalorraquídeo (15-45 mg/dL).

LA DETERMINACION DE PROTEINAS TOTALES PUEDE HACERSE POR DIFERENTES METODOS:

REFRACTOMETRIA: PDF

MÉTODO DE BIURET

En solución alcalina el Cu+2 reacciona con el enlace peptídico de las proteínas dando un color purpúreo que se cuantifica espectrofotométricamente (540nm). El color depende de la naturaleza de las proteínas; proteínas y péptidos dan un color rosado; la gelatina da un color azul.

Principio Proteína + Cu++ → complejo azul-violeta

Muestra: suero o plasma (heparina o EDTA). Separar el suero del coágulo o el plasma de las células antes de 3h. Si el paciente está acostado durante la extracción el resultado será menor.A pH alcalino, la proteína reacciona con el cobre del reactivo de Biuret causando un aumento en la absorbancia.El incremento en la absorbancia a 540 nm debido a la formación del complejo azul-violeta es directamente proporcional a la concentración de proteína en la reacción.

Cálculo

Proteína Total g/L (g/dL) = A/Ac x concentración del calibradorA = absorbancia de la muestra desconocidaAc = absorbancia del calibrador

La linealidad del procedimiento descrito es de 100 g/L.

LimitacionesUna muestra con una concentración de proteína total que exceda el límite de linealidad deberá diluirse con solución salina a 0.9% y volver a analizar incorporando el factor de dilución en el cálculo del resultado.Las muestras muy lipémicas o ictéricas requieren el uso de un blanco de muestra, el cual puede prepararse agregando 50 μL de muestra a 2.5 mL de agua desionizada.

ELECTROFORESIS DE PROTEINAS

Técnica de laboratorio que permite la separacion de las pproteinas de acuerdo con sus características físicas. Las proteínas tienen cargas eléctricas diferentes y cuando se ponen en un campo eléctrico, sus moléculas se desplazan de acuerdo con su carga eléctrica y su peso molecular. La dirección de la migración de las

moléculas depende del pH de la solución y del punto isoeléctrico de la proteína mientras que el grado de desplazamiento depende de la carga eléctrica de cada proteína,peso molecular, tamaño de la molecula,conductividad del medio y el tipo de soporte Cuando se aplica un campo eléctrico a un medio que contiene partículas cargadas, las partículas cargadas negativamente migran hacia el ánodo o polo positivo mientras que, las cargadas positivamente migran hacia el electrodo negativo (cátodo).Este principio se puede aplicar para separar las fracciones de proteínas puesto que los aminoácidos (aa) constituyentes de la proteínas, y por tanto las proteínas, son compuestos anfóteros que se comportan como ácidos (ceden protones y quedan con carga negativa) o bases (captan protones y quedan con carga positiva) dependiendo del medio en el que estén.En soluciones muy ácidas todos los aa aparecen como cationes, mientras que en soluciones muy básicas los aa se encuentran en forma aniónica..

Condiciones de la muestra:El suero es la muestra de elección. Se puede usar plasma pero, en ese caso se observará una banda adicional de fibrinógeno.También se puede analizar orina y líquido cefalorraquídeo si se aumenta su contenido proteico (hasta 20-30 g/l) por ultra centrifugación, diálisis u otras técnicas de concentración.

Valores de referencia Proteína total: 6.4 a 8.3 g/dL Albúmina: 3.5 a 5.0 g/dL

Alfa-1 globulina: 0.1 a 0.3 g/dL

Alfa-2 globulina: 0.6 a 1.0 g/dL

Beta globulina: 0.7 a 1.2 g/dL

Gammaglobulina: 0.7 a 1.6 g/dL

Pasos de la electroforesis1. Separación electroforética mediante un campo eléctrico2. Fijación de las proteínas sobre el soporte3. Revelado de las proteínas para identificar su presencia y separación. Se realiza mediante colorantes ácidos, negro amido, rojo Ponceau... que se fijan sobre las funciones básicas de las proteínas. El exceso de colorante se arrastra con mezclas acético-agua, o metanol-acético, según el colorante utilizado con tal de que se decolore el soporte sin elución del colorante fijado a las proteínas.4. Cuantificación de las fracciones electroforéticas mediante fotómetros especiales (densitómetros) que permiten cuantificar el colorante fijado a diferentes distancias del punto de aplicación, y con ello la representación gráfica de la

separación (proteinograma: gráfica que representa las fracciones proteícas del suero sanguíneo).

Cuando el soporte utilizado para llevar a cabo el desarrollo electroforético es de “acetato de celulosa” las principales fracciones proteícas son· La fracción de albúmina (aprox. 64.5%): la que más migra respecto al punto de aplicación de la muestra (cátodo)· Las globulinas que se subdividen en las siguientes fracciones: alfa 1 (a-1 globulinas, aprox. 3.6%), alfa 2 (a-2 globulinas, aprox. 6.5%), beta (ß-globulinas, aprox. 12.6%), y gamma (? globulinas, inmunoglobulinas o anticuerpos, aprox. 7.9%, es la banda que menos se desplaza y en sueros no patológicos es la banda más ancha).

INMUNOELECTROFORESISLa inmunoelectroforesis es una inmunodifusión en la que se aplica una corriente eléctrica para separar las proteínas de la muestra.Esta técnica se realiza en dos fases:· Electroforesis para separar las proteínas de la muestra en función de su carga.· Aplicación de un antisuero, mono o poliespecífico, en un surco paralelo a la dirección del campo eléctrico. El o los anticuerpos difunden durante 18-24h. Si se produce el reconocimiento Ag-Ac se forman bandas de precipitación.

Se utiliza fundamentalmente para analizar, cualitativamente, alteraciones de distintas proteínas, especialmente inmunoglobulinas en suero, orina o líquido cefalorraquídeo.

METODO DE KJEKDAHL: PDF PROTEINOGRAMA

Técnica de laboratorio que permite la separación de las proteínas totales en función de su desplazamiento sobre un soporte sólido cuando son sometidas a un campo eléctrico. La migración dependerá del peso de la proteína así como de su carga eléctrica. En el soporte sólido de electroforesis podrán visualizarse bandas o fracciones correspondientes a los diferentes tipos de proteínas.

El termino proteínas totales hace referencia a los 2 grandes grupos de proteínas: albumina y globulinas, mediante la electroforesis se pueden separar las globulinas en cuatro grupos o fracciones :

alfa-1-globulinas: alfa-1-antitripsina, alfa-1-antiquimiotripsina, alfa-1-fetoproteína y alfa-1-glicoproteína ácida.

alfa-2-globulinas: alfa-2- macroglobulina, ceruloplasmina, haptoglobina y proteína C reactiva.

beta globulinas: fibronectina, transferrina, transcobalamina y el complemento (C3, C4)

gamma globulinas (o inmunogammaglobulinas): Ig M, Ig A, Ig G e Ig E.

¿Cómo se realiza?

El proteinograma se realiza habitualmente en plasma o suero sanguíneo, aunque también puede aplicarse a otros líquidos biológicos como la orina y el líquido cefalorraquídeo (LCR).

Para la realización de un proteinograma sérico se requiere una muestra sanguínea obtenida por punción venosa simple.

Cuando la exploración solicitada sea un proteinograma en orina se requerirá la recogida de orina de 24 horas en unos contenedores especialmente destinados para ello.

Para la obtención de una muestra del LCR se practicará una punción lumbar. El paciente deberá colocarse en decúbito lateral, con las piernas flexionadas sobre el abdomen y la cabeza flexionada sobre el pecho. Mediante una aguja fina se punciona a nivel del espacio entre las vértebras lumbares L3-L4 o L4-L5. Será siempre necesario comparar los resultados del proteinograma del LCR con los resultados del proteinograma en plasma. 

Preparación para el estudio: No se precisa ninguna preparación especial.

Interferencias: Existen ciertos fármacos que pueden alterar el resultado del proteinograma, entre los que se encuentran la clorpromazina, los corticoesteroides, la isoniazida, la neomicina, los salicilatos y las sulfamidas, entre otros. Deberá valorarse la retirada del fármaco o demorar la práctica del proteinograma hasta finalizar el tratamiento en caso de tomar estos fármacos.

La electroforesis de proteínas se desaconseja realizar en pacientes con elevados niveles de proteína C reactiva (PCR)

UTILIDAD

En Plasma. El proteinograma reflejará el exceso o déficit de una o varias fracciones de proteínas plasmáticas. El defecto detectado puede ser útil para el diagnóstico de procesos inflamatorios, cirrosis hepática, nefropatías o defectos inmunológicos. Resulta especialmente útil para el diagnóstico y seguimiento de gammapatías monoclonales, que son un conjunto de enfermedades hematológicas caracterizadas por la producción excesiva y anómala de una inmunoglobulina o parte de ella.

En orina será útil ante la sospecha de mieloma multiple ya que se evidenciara gran cantidad de globulinas que se han filtrado o ante la sospecha de una enfermedad renal pero siempre deberá confirmase su diagnostico con un proteinograma serico.

En LCR es útil para el diagnostico y segumiento de enfermedades neurológicas como esclerosis multiple o la enfermedad de Guillain-Barré.

Valores de referencia

Adultos entre 6 y 8,3 gramos por decilitro. Prematuros entre 4,2 y 7,6 gramos por decilitro.

Recién nacidos entre 4,6 y 7,3 gramos por decilitro.

Lactantes entre 6 y 6,7 gramos por decilitro.

Niños entre 6,2 y 8 gramos por decilitro

LA DETERMINACION DE ALBUMINA SERICA SE PUEDE REALIZAR MEDIANTE:

LA REACCION DE VERDE DE BROMOCRESOL: INSERTO

RELACION ALBUMINA - GLOBULINA

La proporción A/G es una expresión de la relación albúmina a globulinas en sangre u orina. Se usa para expresar los cambio de las proteínas de la enfermedad y se calcula dividiendo la concentración de albúmina entre la concentración de globulinas. Antes del advenimiento de las técnicas de electroforesis e inmunoforesis, la proporción A/G fue el mejor indicador disponible para apreciar la relación entre los componentes de las proteínas séricas, que para un individuo cualquier es constante.

Valores normales (g/100ml) Albúmina Menos de 15 años 3.3-5.5

15 años o más 3.3-5.0 Globulina 2.3-3.8 Proporción A/G 1.0-2.0

En varios estados patológicos hay una relación constante entre el aumento de las globulinas y la reducción de las concentraciones de albúmina por ejemplo: • Cirrosis • Nefrosis • Infecciones agudas • Neumonía • Fiebre reumática

Tifoidea

Por lo que seguir las variaciones de la proporción A/G fue uno de los mejores medios disponibles para observar la respuesta al tratamiento. En general, la concentración de albúmina tiende a decrecer en condiciones anormales y al globulina muestra un aumento simultánea. Ambos componentes proteínicos pueden medirse con gran precisión tanto en plasma como en suero.

En la actualidad se considera que la proporción A/G tiene escaso significado, en especial si se dispone de valores absolutos. Desde 1969 esta proporción dejó de tener importancia y se consideró de interpretación difícil, imprecisa y sin aplicación clínica real (Henry, 1991), por lo que una autoridad indicó que el análisis en estados patológicos podría mejorar si fuera abandonada (Tietz, 1990). A pesar de esta falta de “significado clínico patológico” su uso persiste.

LA PROPORCION A/G DISMINUYE EN: Cualquier trastorno que reduzca la fracción de albúmina de las proteínas totales. LA PROPORCION A/G AUMENTA EN: Cualquier trastorno que reduzca la globulina que la albúmina

LA DETECCION DE PROTEINAS EN ORINA PUEDE REALIZARSE POR DIFERENTES METODOS:

TURBIDIMETRÍA

FUNDAMENTO: la turbidimetria mide la disminución de la luz transmitida a través de una suspensión de partículas utilizando para ello un espectrofotómetro (detector en la misma dirección del haz de luz, se mide A o T). Se suele utilizar para soluciones concentradas (para que haya una buena disminución de la luz transmitida).

Se utiliza para la determinación de proteínas totales en suero, LCR u orina (haciendo que las proteínas precipiten con TCA o ácido sulfosalicílico)

Muestra Orina recogida mediante procedimientos estándard. La muestra de orina debe centrifugarse antes de realizar el ensayoLa albúmina en orina es estable 7 días a 2-8ºC.

VALORES DE REFERENCIAOrina, adultos: Hasta 15 mg/L.Límite de linealidad: 130 mg/L. Cuando se obtengan valores superiores, diluir la muestra 1/3 con agua destilada y repetir la medición. La linealidad puede variar considerablemente dependiendo del instrumento utilizadoInterferencias: la bilirrubina (20 mg/dL) no interfiere. La hemólisis (hemoglobina 1 g/L) medicamentos y sustancias pueden interferir.

MÉTODOS DE UNIÓN A COLORANTES: para semicuantificar la concentración de proteínas en orina se utilizan tiras reactivas.

LA DETERMINACION DE PROTEINAS ESPECÍFICAS REQUIERE METODOS ESPECIALES COMO:

INMUNODIFUSIÓN RADIAL:Se basa en la formación de bandas de precipitación Ag-Ac en medios semisólidos (generalmente de agarosa). En este caso se añade un antisuero específico a la agarosa que, a su vez, se vierte sobre placas. Se forman pozos en el gel y se colocan en ellos estándares de proteínas y problemas (antígenos). El antígeno difunde en el gel durante varias horas y va reaccionando con el Ac. En la zona de equivalencia se produce un anillo de precipitación

OTROS MÉTODOS DE DETECCIÓN DE PROTEÍNAS ESPECÍFICAS:

Nefelometría

Radioinmunoanálisis Ensayos inmunoradiometricos(IRMA) Ensayos inmunoenzimaticos(ELISA)