Determinación de la toxicidad aguda de inhibidores de...

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Determinación de la toxicidad aguda de inhibidores de corrosión empleados en Ductos de Petróleos Mexicanos, utilizando organismos acuáticos de importancia ecológica y económica en el Sureste de México.

Proyecto SIP20070093

INTRODUCCIÓN

Una gran cantidad de sustancias químicas son utilizadas en los procesos asociados con la recuperación de hidrocarburos en los yacimientos petrolíferos. Por ejemplo, durante la perforación de pozos, se emplean compuestos como inhibidores de hidratación, secuestrantes de oxígeno, emulsificantes, biocidas, inhibidores de corrosión y de incrustación (Cranford, 2001) y sustancias como la bentonita y barita que contienen trazas de metales pesados como arsénico, cobre, plomo (Sadiq et al., 2003) y mercurio (Zamudio et al., 2000), la mayoría de ellos, con probada toxicidad hacia los ecosistemas acuáticos. Durante las actividades de perforación y producción de petróleo se pueden presentar derrames accidentales de aceite alrededor de la plataforma, por lo que otros compuestos químicos pueden ser utilizados para “limpiar” la superficie marina; algunos de éstos, como los dispersantes de petróleo, disminuyen la tensión superficial del crudo y promueven la formación de pequeñas gotas de hidrocarburo que precipitan en el fondo marino, con una alta posibilidad de ser asimilado vía branquias en peces (Shahunthala et al., 2004) afectando con ello, a los ecosistemas circundantes. El agua producida, es agua fósil que ha estado atrapada junto con el aceite y el gas en reservorios geológicos del subsuelo terrestre por millones de años (Durell et al., 2006) y forma parte de las descargas de mayor proporción que se generan en las plataformas de producción de aceite y gas costa-fuera (Hurst et al., 2005), llegando a ser, dependiendo de la edad del yacimiento en explotación, la tecnología de explotación utilizada y las características del yacimiento, superior a 10 veces del hidrocarburo extraído (Li, et al., 2006). El agua fósil se compone de agua de formación que es extraída de la formación productora y de agua de inyección que se incorpora para facilitar la salida de aceite y gas (Hurst, op. cit.) y está constituida por una gran cantidad de sustancias tóxicas como aceite disperso, hidrocarburos parcialmente solubles como BTEX (Benceno, Tolueno, Etilbenceno y Xileno), hidrocarburos aromáticos policíclicos, naftalenos, ácidos orgánicos, fenoles, y restos de productos químicos adicionados en el proceso de producción como inhibidores de corrosión y de incrustación, rompedores de emulsión, secuestrantes de oxígeno (Faksness et al., 2004) y metales pesados como zinc, niquel, cobre, cadmio, mercurio y plomo (Johnsen et al., 2000). Una vez que el hidrocarburo es extraído del yacimiento productor, se transporta vía ductos, a los

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centros de proceso en donde se deshidrata para su distribución ya sea para su refinación o venta. En esta etapa, se utilizan también productos químicos para proteger la estructura interior de las Líneas de transporte, algunos de estos son surfactantes, emulsificantes, formadores de película, solventes, biocidas, inhibidores de incrustación y de corrosión (Sastri, 1998).

Los inhibidores de corrosión están constituidos por mezclas de compuestos químicos que se utilizan en diferentes etapas de los procesos de producción y transporte de hidrocarburos como ya se ha señalado. Hacia finales de la década de los ochenta y hablando exclusivamente en el contexto internacional pues es donde existe información publicada, estaban constituidos por compuestos inorgánicos como sales de cromo (Banerjee et al., 1999), arsénico, plomo y zinc, molibdatos, fosfatos y fosfonatos; compuestos orgánicos como: alquil fenoles, formaldehídos, piridinas, imidazolinas, aminas terciarias, amonios cuaternarios (Sastri, 1998), etc. Todos ellos con elevada toxicidad, baja biodegradabilidad y elevado potencial de bioacumulación (Frenier, 1996; Mayer et al., 1999; Gough, 1999) y considerados con riesgo a la salud en exposiciones ambientales prolongadas pues se clasifican como irritantes, asfixiantes, anestésicos y narcóticos, venenos sistémicos, sensibilizantes, carcinógenos, mutagénicos y teratogénicos (Yin Yee, 2004).

En respuesta al riesgo que representan los inhibidores de corrosión, países como El Reino Unido, Noruega y los Estados Unidos regulan el uso y disposición de productos químicos empleados costa-fuera, incluidos por su puesto, los inhibidores mencionados. Así pues, el Reino Unido, en el año de 1978, estableció una regulación ambiental en la que se consideró un esquema de cumplimiento voluntario de la calidad de los productos utilizados en instalaciones petroleras costa-fuera en la cual se evaluaba la toxicidad de los productos con el camarón café Crangon crangon. En este primer instrumento regulatorio, se asignaron 5 categorías a los productos químicos; de CERO hasta CUATRO, en donde el cero consideró a los productos no tóxicos y el cuatro a los más tóxicos. Este esquema no incluyó la evaluación de biodegradabilidad y bioacumulación de los productos por lo que a partir de 1993 se revisó y modificó en una clasificación alfabética, vigente a la fecha, que va de la letra A a la E (Henderson et al., 1999). La letra A agrupa a los inhibidores que se pueden descargar a razón de hasta 40 toneladas al año debido a su elevada toxicidad, y baja biodegradabilidad; mientras que la letra E agrupa a los que pueden descargar hasta 1000 toneladas anuales pues son de baja toxicidad y biodegradables (CEFAS, 2000). Los criterios consisten en realizar pruebas de toxicidad aguda con especies marinas como la diatomea Skeletonema costatum, el copépodo Acartia tonsa y el rodaballo (lenguado) Scophthalmus maximus; mientras que en sedimento, se emplea al anfípodo Corophium volutator. Las pruebas de biodegradabilidad se llevan a cabo considerando las normas de la OCDE 306 o 302 (Obeyesekere et al., 2001), aunque es aceptada la norma OCDE 301 (agua dulce)

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cuando el solicitante justifica el uso de este método por las características fisicoquímicas del sitio en donde aplicará su producto. En el caso de que un inhibidor presente un valor de toxicidad que lo ubique, por ejemplo en la letra C, pero que no sea biodegradable y además se bioacumule, la categoría final en la que se le colocaría sería la A, con lo cual sólo podrían descargarse al mar 40 toneladas al año de este producto (CEFAS, 2000). Ejemplos de la aplicación de esta regulación en el Reino Unido son la lista de inhibidores de corrosión y su clasificación alfabética publicada por el Centre for Environment, Fisheries & Aquaculture Science1 en los años 2005 y 2006 en donde el número de productos de elevada toxicidad y baja biodegradabilidad (letra A) es muy reducido (solo 2 de 35 en la lista liberada el día 21 de septiembre de 2005 y sólo 1 de 36 en la lista liberada el 15 de agosto de 2006) (página web: http://www.cefas.co.uk/ocns/documents/RankedListOutputs.zip), comparado con el número de productos que se autorizan con baja toxicidad y elevada biodegradabilidad (letra E), cuyo número en la publicación del 21 de septiembre, fue de 13 productos y en la del 15 de agosto de 2006 de 11. Lo anterior denota que en el Reino Unido la preocupación por utilizar productos químicos que sean amigables con el ambiente, dentro de éstos los inhibidores de corrosión, está considerado como parte del proceso de producción de petróleo.

En el caso de Noruega y otros países escandinavos, no es la toxicidad aguda uno de los criterios utilizados, sino la biodegradabilidad y el potencial de bioacumulación del producto (Obeyesekere et al., 2001). Por ello, los productos químicos que reflejan una pobre biodegradabilidad (menor al 20%) y un alto potencial de bioacumulación (valores de coeficiente de partición octanol/agua o “Log Pow “ > 5) no pueden ser descargados. Para componentes que reflejan biodegradabilidad y potencial de bioacumulación moderado, los operadores están forzados a reemplazar estos componentes por otros que sean más fácilmente biodegradables (biodegradabilidad mayor al 60%) y con valores de Log Pow < 5. Lo anterior indica que para cumplir con esta legislación los productos necesitan ser rápidamente biodegradables y con bajo potencial de bioacumulación (Gough, 1999).

Para el Golfo de México, dentro de las aguas territoriales norteamericanas, al efluente total de una plataforma se le asigna un “factor de dilución crítico”. Este factor es asignado en función del tamaño de la tubería de descarga, volumen de agua descargado y profundidad de ésta en el mar. Una vez que se conoce el factor de dilución crítico, se realiza un ensayo de toxicidad a 7 días con dos especies (Chen y Chen, 2002), el crustáceo miscidáceo Mysidopsis bahia y el pez Cyprinodon variegatus en caso de que las plataformas sean instalaciones ya existentes; mientras que para instalaciones nuevas se emplea al aterínido Menidia beryllina utilizando como medio de dilución agua marina artificial (Martin et al., 1999). 1 Este centro, tiene su sede en el Reino Unido.

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En todas las regulaciones señaladas, se advierte que la preocupación de las autoridades ambientales de esos países, incide en los procesos de exploración y producción de petróleo, para que éstos sean cada vez más estrictos en el cuidado del ambiente en el que realizan sus operaciones. Inclusive, en países del Oriente medio, como Egipto y los Emiratos Árabes Unidos, aún cuando no se conoce si existe alguna legislación ambiental al respecto, hay trabajos serios que se referirán en páginas siguientes, en los que el uso de inhibidores de corrosión a partir de productos naturales cada vez es mas frecuente lo que desde luego, denota un interés creciente por el cuidado y protección de sus ecosistemas.

En nuestro país, la regulación ambiental que tienda a promover la utilización de productos químicos amigables con el ambiente es inexistente y sólo se cuenta con instrumentos que medianamente regulan a los residuos peligrosos y no peligrosos (D.O.F., 2006) pues no lo hacen mediante una caracterización del efecto de éstos sobre el ambiente; es decir mediante la evaluación toxicológica de los residuos en organismos de prueba sino a través de características señaladas con el acrónimo CRETIB (corrosivo, reactivo, explosivo, tóxico ambiental, inflamable y biológico-infeccioso) en el cual, a pesar de estar incluida la toxicidad ambiental, su definición no involucra la realización de alguna prueba de toxicidad en el extracto PECT (lixiviado a partir del cual se determinan los constituyentes tóxicos del residuo y su concentración con la finalidad de identificar si es peligroso por su toxicidad al ambiente), sino si se encuentran en una lista de compuestos químicos y si éstos sobrepasan unos limites máximos permisibles (LMP), los que por cierto, son extremadamente altos, como el caso del arsénico y el cromo con 5.0 ppm de LMP o del o, p y m-cresol con 200 ppm o el pentaclorofenol con 100 ppm.

En materia de inhibidores de corrosión, la Paraestatal Petróleos Mexicanos publicó en el año 2000 la norma de referencia NRF-005-PEMEX-2000 “Protección Interior de Ductos con Inhibidores”, la cual obliga a las compañías que provean de inhibidores de corrosión a todas las subsidiarias de Pemex, a cumplir con requisitos mínimos de calidad, especificaciones y pruebas de laboratorio y campo de los inhibidores de corrosión. Dentro de esta norma se señaló textualmente en el párrafo cuarto del numeral 8.15: “Los factores ambientales, seguridad, salud ocupacional y la toxicidad del inhibidor son factores que deben ser considerados en el proceso de evaluación del inhibidor de corrosión” (Pemex, 2000). Este instrumento normativo, aunque ambiguo y de carácter general, es el único con el que cuenta México en materia de inhibidores de corrosión y su posible efecto en el ambiente. Con lo que se puede pensar, que la decisión de algunos directivos de la paraestatal de incluir este texto en la norma fue debido a que están empezando a reconocer la necesidad de realizar estudios técnicos que permitan identificar el estado del arte en materia de toxicidad de los productos utilizados para inhibir la corrosión; para posteriormente, incluir en la misma norma y/o

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en los términos de referencia de los contratos que en la materia se puedan publicar, los criterios que se deriven de su identificación inicial.

En este estudio se realizó la evaluación química y toxicológica del complejo químico denominado inhibidor de corrosión y su integración multivariada que permitirá en otra etapa, identificar el nivel de toxicidad y biodegradabilidad de los inhibidores utilizados en nuestro país. A partir de dicho nivel, se obtendrán límites mínimos de toxicidad y biodegradabilidad ó criterios BASE que se recomendarán como una proyección a los tomadores de decisión de la paraestatal Petróleos Mexicanos para que, en caso de que lo consideren pertinente, se incluyan en los instrumentos regulatorios futuros o se modifiquen los existentes, para obligar a los fabricantes o distribuidores de estos productos en México, a desarrollar inhibidores de corrosión que cumplan con los criterios para minimizar posibles daños a ecosistemas acuáticos ecológicamente sensibles localizados principalmente en el Sureste de México. Como parte importante del estudio, en las pruebas de toxicidad se utilizaron además de especies de referencia nacional e internacional, especies colectadas en la zona de influencia de las líneas de transporte en los humedales del Sureste de México. De igual manera se buscó desarrollar con estas especies, procedimientos rápidos pero sensibles con la consecuente reducción en costos, para que la evaluación de los productos en un futuro pueda ser realizada de una manera simple, rápida y con poca infraestructura.

MATERIALES Y MÉTODOS.

Los inhibidores de corrosión que se emplearon en este estudio, proceden de las áreas de operación de Ductos de las Regiones: Marina Noreste (RMNE), de la Región Sur (RS) y de la Región Norte (RN) de Pemex Exploración y Producción (PEP); además se utilizaron productos que tiene bajo se resguardo el Laboratorio de Corrosión del Instituto Mexicano del Petróleo (IMP) y que fueron entregados por las compañías fabricantes y/o distribuidoras con el fin de ser evaluados pues formarían parte de un proceso de licitación. Por lo tanto, se asumió que estos últimos serían productos con elevada eficiencia para inhibir la corrosión y por ello, estar en posibilidades de ser empleados por PEP. El número total de inhibidores de corrosión que se utilizaron fue de 16. Además, 2 productos adicionales son utilizados, uno de ellos fue colectado en la Región Marina Noreste de PEP y otro en el laboratorio de corrosión del IMP, estos productos son inhibidores de incrustación y son utilizados en los ductos que transportan aguas producidas de instalaciones terrestres hacia plataformas.

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En la tabla 1, se señalan los inhibidores de corrosión e incrustación que se utilizan y los usos ó servicios que les prestan a los ductos, así como las claves con las que se les identificarán en este trabajo.

Tabla 1.- Inhibidores que se utilizan en este trabajo. Se señala la clave, usos y región de Pemex Exploración y Producción en donde fueron OBTENIDOS.

INHIBIDOR CLAVE ASIGNADA USO REGIÓN DE PEP DE DONDE

PROCEDEN

1 OG-01 Oleogasoductos RMNE

2 OG-02 Oleogasoductos R SUR

3 OG-03 Oleogasoductos R Norte

4 I-01 Inhibidor de incrustación RMNE

5 I-02 Inhibidor de incrustación Laboratorio de corrosión del IMP

6 GASOL-01 Gasolinoductos RMNE

7 GASOL-02 Gasolinoductos Laboratorio de corrosión del IMP

8 GAS-01 Gasoductos RMNE

9 GAS-02 Gasoductos R SUR

10 GAS-03 Gasoductos R Norte

11 E-01 Ductos empacados RMNE

12 E-02 Ductos terrestres empacados

Laboratorio de corrosión del IMP

13 OLEO-01 Oleoductos R SUR

14 OLEO-02 Oleoductos Laboratorio de corrosión del IMP

15 OLEO-03 Oleoductos R Norte

16 M-01 Multifuncional Laboratorio de corrosión del IMP

17 M-02 Multifuncional R Norte

18 M-03 Multifuncional RMNE

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Como se puede apreciar, son un total de 18 productos; 6 proceden de la Región Marina Noreste de PEP, cinco son inhibidores de corrosión y uno de incrustación (Claves: OG-01, I-01, GASOL-01, GAS-01, E-01 y M-02). Otros 3 se colectaron en la Región Sur y todos son inhibidores de corrosión (Claves: OG-02, GAS-02 y OLEO-01); 4 más se obtuvieron de la Región Norte y todos son también inhibidores de corrosión (Claves: OG-03, GAS-03 OLEO-03 y M-02). Los restantes 5, proceden del Laboratorio de Corrosión del IMP siendo cuatro de corrosión y el restante de incrustación (Claves: I-02, GASOL-02, E-02, OLEO-02 y M-01).

Ensayos de toxicidad con Microalgas y Cladóceros

Pseudokirchneriella subcapitata (Chlorophyceae:Chlorococcales)

Las algas son componentes esenciales de los ecosistemas acuáticos. Producen oxígeno y substancias orgánicas de las que dependen otras formas de vida, además de proveer de alimento a invertebrados y peces (Ma, et al., 2005). Los efectos de sustancias químicas a estos organismos podrían causar daños a niveles tróficos superiores y afectar directamente la estructura y función de un ecosistema (Geis et al., 2000).

Diferentes tipos de muestras ambientales como las que provienen de plantas de tratamiento, lixiviados, aguas superficiales, eluatos y sustancias químicas diversas, son caracterizadas ecotoxicológicamente usando ensayos de inhibición de crecimiento en algas. Debido al alto costo de las pruebas crónicas tradicionales ya que se efectúan en matraces erlenmeyer de 100 y 150 mL y al elevado consumo de tiempo para su realización, se han desarrollado diferentes procedimientos con el fin de establecer ensayos de este tipo pero a pequeña escala utilizando celdas pequeñas, tubos de ensayo o microplacas. Estos métodos difieren entre sí por la forma de efectuar la cuantificación del crecimiento algal ya que se realizan mediante observación microscópica por conteo celular, fotométrica por medición de absorbancia, electrónicamente empleando contadores celulares ó fluorométricamente (Eisentraeger et al., 2003).

La realización de pruebas crónicas de inhibición de crecimiento a pequeña escala utilizando microplacas con Pseudokirchneriella subcapitata ha sido estandarizada por Canada (Environment Canada, 1992) y utilizada por diferentes autores (Lukavsky, 1992; Benhra et al., 1997; Rojíckova et al., 1998; Rocheleau et al., 1999; Eisentraeger et al., 2003), lo que justifica su utilización como especie de prueba y como

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procedimiento usado para evaluar la toxicidad crónica de los inhibidores de corrosión seleccionados en este trabajo.

El método general que se ha seguido es el que se señala en Environment Canada (1992), con el cual se evaluó la concentración que inhibe el crecimiento de P. subcapitata en un 50% (CE50), comparado con el control. Se utilizó la cepa que tiene en su poder el Laboratorio de Hidrobiología Experimental de la Escuela Nacional de Ciencias Biológicas, empleando microplacas de poliestireno blanco y fondo transparente de 96 pozos (marca Costar) y capacidad de 360 µL con volumen de prueba de 300 µL. La cuantificación se realizó a las 72 horas de exposición, mediante fluorometría directa en microplacas empleando un fluorómetro de microplacas Marca Thermolabsystems modelo Ascent con un par de filtros (excitación-emisión) de 584 nm y 680 nm. Cada inhibidor se evaluó 5 veces realizando las pruebas en diferentes días del mismo modo que con la bacteria V. fischeri como ya fue mencionado.

Las diferentes actividades necesarias para la realización de pruebas de inhibición de crecimiento con P. subcapitata se describen a continuación:

• Preparación del medio de crecimiento algal

Las microalgas de la especie P. subcapitata se obtuvieron del cepario del Laboratorio de Hidrobiología Experimental de la ENCB del IPN y fueron cultivadas monoespecíficamente (no axénico) empleando el Medio Basal de Bold (MBB) (Stein, 1973), en matraces Erlenmeyer de 1,000 mL con un volumen total de medio de 850 mL. Previamente, el medio fue esterilizado en autoclave a 1.05 kg cm-2 durante 15 min. El inóculo de algas que se adicionó fue aproximadamente de 5 mL en condiciones estériles. Como fuente de carbono y como sistema de agitación para favorecer la disponibilidad de nutrientes, los cultivos fueron aireados constantemente utilizando aire comprimido. El crecimiento algal se efectuó a temperatura ambiente (23 ± 1.5°C) e iluminación continua con lámparas fluorescentes “luz de día” (ca.8,500 luxes). Con el fin de obtener alimento de calidad estable, las microalgas se cosecharon en la fase de crecimiento exponencial (Moreno-Garrido, et al., 2000), que se presentó una vez transcurridos de 7 a 9 días. El concentrado algal en esta fase presentó una densidad aproximada de 2.0 a 3.0E+08 cel mL-1 Una vez cosechado, se mantuvo en refrigeración a 4°C hasta su uso. Dos semanas después de haber sido efectuada la cosecha, el concentrado algal no utilizado fue desechado.

Los reactivos necesarios para la preparación del medio de crecimiento de P. subcapitata se muestra en la Tabla 2.

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Tabla 2: Formulación del Medio Basal de Bold (MBB), (tomado de Stein, 1973).

Solución Reactivos Concentración mg l-1)

1 NaNO3 250

2 CaCl2.2H2O 25

3 MgSO4.7H2O 75

4 K2HPO4 75

5 KH2 PO4 175

6 NaCl 25

7 FeSO4.7H2O 4.98

H2SO4 0.001 (ml l-1)

8 H3BO3 11.42

9 E.D.T.A. 50

KOH 31

10 ZnSO4.7H2O 8.82

MnCl2.4H2O 1.44

MoO3 0.71

CuSO4.5H2O 1.57

Co(NO3)2.6H2O 0.49

• Acondicionamiento del inóculo para su uso en pruebas de toxicidad.

Una vez cosechada la biomasa algal, el matraz se mantuvo en refrigeración de 24 a 48 horas para favorecer la sedimentación celular. Enseguida se procedió a decantar el sobrenadante para concentrar las células algales a las que se adicionaron de 25 a 50 mL de solución de NaHCO3 (15 mg l-1) en el matraz y se agitó hasta homogeneizar la suspensión que fue colocada en tubos para centrífuga de 10 ml los cuales se centrifugaron a 4,000 rpm por 15 minutos. A continuación se decantó de nuevo el sobrenadante y se resuspendió el paquete celular en 5 mL de la solución de NaHCO3, repitiendo el proceso de centrifugado y decantando una vez más. El paquete celular obtenido, se resuspendió en 3 mL de la solución antes mencionada. La suspensión celular se colocó en un frasco de dilución de 80 ml previamente esterilizado y se cubrió con papel aluminio. La suspensión se mantuvo en refrigeración a 4°C para su posterior cuenta celular por hematocitometría (Blaise, 1999).

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• Cuenta celular

La suspensión celular antes obtenida se agitó vigorosamente para obtener una mezcla homogénea; enseguida, se colocaron 100 µL de la suspensión en un matraz aforado de 10 mL para muestras sensibles a la luz y se aforó con agua destilada (dilución 1:100). Previa agitación, se tomó una alícuota que se colocó en una cámara de Neubauer, efectuándose el conteo celular correspondiente (Blaise, 1999). Este procedimiento se repitió 3 veces para determinar la concentración celular final a partir del valor promedio. De nueva cuenta el concentrado celular se preservó en las condiciones ya señaladas hasta su utilización como inóculo en las curvas de calibración y en las pruebas de toxicidad de los inhibidores seleccionados, no debiendo de pasar mas de dos semanas para su uso, en cuyo caso fue desechado por lo que fue utilizado un nuevo concentrado celular.

• Determinación de la curva de calibración del concentrado celular cuantificado, mediante fluorometría de microplacas.

Con el fin de determinar la correlación entre los valores de fluorescencia que proporciona el fluorómetro de microplacas, medidos como Unidades de Fluorescencia Absoluta (UFA), y la densidad celular (cél mL-1) correspondiente a cada concentración seleccionada de los inhibidores en estudio, fue necesario efectuar previo a las pruebas, curvas de calibración con cada inóculo cosechado. Para ello, se prepararon 10 concentraciones celulares del inóculo cosechado una vez que se determinó su densidad celular promedio; éstas fueron: 5x103, 1x104, 1.5x104, 2.5x104, 5.0x104, 7.5x104, 1.0x105, 1.50.0x105, 2.0x105 y 2.5x105 cél/mL. Las concentraciones se prepararon en matraces aforados de 10 mL para muestras sensibles a la luz empleando como diluyente MBB estéril. Se utilizaron microplacas estériles de 96 pozos de poliestireno de 360 µL de capacidad, color blanco con fondo plano y transparente, Marca Costar (3596). En la Figura 1, se representa de manera esquemática el llenado de los 96 pozos en la microplaca.

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Fig. 1.- Esquema de llenado de microplacas de 96 pozos, para las curvas de calibración que se corrieron con Pseudokirchneriella subcapitata.

El volumen final en cada pozo fue de 300 µL. La concentración más alta del inóculo algal se colocó en los pozos B11, C11, D11, F11 y G11, es decir 5 réplicas por concentración y la más baja en los pozos B2, C2, D2, F2 y G2. Los pozos periféricos (líneas A y H; columnas 1 y 12) se llenaron únicamente con agua destilada pues con esta distribución se elimina o reduce la evaporación en los pozos de prueba (Rojíckova et al., 1998). Una vez que se llenaron todos los pozos de la microplaca, se realizó la lectura inicial en el fluorómetro de microplacas Fluoroskan ASCENT, ajustando el equipo para utilizar filtros de emisión:excitación a 584:680 nm pues se encontró una correlación más alta con este par de filtros, en comparación con el par 444:680 señalado por Eisentraeger, et al., (2003) para el mismo tipo de microplacas y la misma especie algal. Al terminar la lectura inicial, se colocó sobre la microplaca una tapa de acrílico transparente con anillos de condensación que cubren cada pozo, con el fin de reducir la evaporación (Eisentraeger op. cit.). Este tipo de material en las tapas de las microplacas, permite la difusión del CO2 (Lukavsky, 1992) necesario para el metabolismo de las células algales. Posteriormente la microplaca se colocó en el

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Agua destilada

Concentraciones del inóculo algal. La concentración más alta se colocó en la columna 11 y la más baja en la 2.

Blanco (MBB)

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interior de una bolsa de plástico transparente (Geis, et al., 2000) con perforaciones para facilitar aún más, la difusión de CO2; por último, se introdujo en una cámara de incubación a temperatura de 25°C ± 1.5°C e iluminación continua con lámparas fluorescentes “luz de día” (5,500 ± 500 luxes).

Cada 24 horas, se le dio agitación manual a los 96 pozos de la microplaca empleando una micropipeta de 12 canales de 50 a 300 µl, con puntas y en un ambiente estéril. El tiempo de exposición fue de 72 horas, por lo que una vez que se efectuó la última agitación, se procedió a realizar la lectura en el fluorómetro en los mismos términos mencionados para la lectura inicial.

Mediante un análisis de correlación lineal se determinó la concentración celular de algas versus las UFA´s. El coeficiente de determinación (r2) que se obtuvo en todas las curvas de calibración que se corrieron durante esta parte del estudio, fue de 0.9957 ± 0.0014 al 95%.

• Pruebas de toxicidad con P. subcapitata con los inhibidores seleccionados

Una vez que se obtuvo la información derivada de la curva de calibración respectiva, se iniciaron los ensayos de toxicidad con los inhibidores de corrosión e incrustación seleccionados utilizando como organismo de prueba a P. subcapitata. La concentración inicial que se empleó en cada pozo de la microplaca, fue de 10,000 cel ml-1 (OECD; 1984; Environment Canada, 1992) debido a que existe evidencia de que una concentración celular inicial menor, incrementa la sensibilidad en la respuesta de la especie (Moreno-Garrido, 2000). Ya que en cada pozo se colocó un volumen final de 300 µL, se consideró adicionar, por pozo: 15 µL de inóculo algal, 15 µL de medio de crecimiento (MBB) y 270 µL del inhibidor seleccionado.

Se calculó la dilución necesaria para obtener una concentración de 10,000 cél mL-1 partiendo de la suspensión celular de concentración conocida cosechada previamente, dicha dilución se preparó empleando un matraz aforado de 50 mL esterilizado en lámparas UV y utilizando como diluyente MBB estéril.

Se ensayaron dos inhibidores por placa con cinco diluciones de cada uno comenzando con la concentración más baja empleando matraces aforados para materiales sensibles a la luz de 10 mL, los cuales se esterilizaron también con lámparas UV y en general todo el material que estuvo en contacto con la preparación de diluciones. El diluyente utilizado fue agua destilada, también previamente esterilizada.

Las microplacas utilizadas fueron del mismo tipo a las empleadas en las curvas de calibración. En la Figura 2 se presenta el esquema de llenado de microplacas para las pruebas de toxicidad corridas con P. subcapitata.

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La concentración más baja del inhibidor 1 se colocó en los pozos de la columna 2 (excepto, como se aprecia en la Figura anterior, en los pozos de las líneas A, B, E y H) y la mas alta en los de la columna 6 (excepto también en los pozos de las líneas A, B, E y H). La concentración más baja del inhibidor 2 se colocó en los pozos de la columna 7 (excepto, como se observa en la Figura de abajo, en los pozos de las líneas A, B, E y H) y la mas alta en los de la columna 11 (excepto también en los pozos de las líneas A, B, E y H). Como se puede apreciar, cada concentración del inhibidor evaluado, se corrió con 4 réplicas. En cada una de ellas, o bien en cada pozo, se adicionaron: células algales (15µL), MBB estéril (15µL) e inhibidor de corrosión (270µL). La concentración celular final en cada pozo fue de 10,000 cél mL-1 como ya se dijo con antelación.

Fig. 2.- Esquema de llenado de microplacas de 96 pozos, para las pruebas de toxicidad con los inhibidores seleccionados utilizando como organismo de prueba a P. subcapitata.

A

B

C

D

E

F

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Agua destilada

Diluciones del inhibidor de corrosión 1

Control de crecimiento

Diluciones del inhibidor de corrosión 2

Blanco (inhibidor + MBB)

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La fila B de la microplaca correspondió al control de crecimiento, al que se le adicionó en cada pozo: células algales (15µL) y MBB estéril (285µL), los pozos B6 y B7 correspondieron a los blancos y se llenaron únicamente con MBB estéril (300µL).

La fila E correspondió a los blancos de cada columna, siendo así que a los pozos E2 a E11 se les agregó: MBB estéril (30µL) y la dilución correspondiente del inhibidor (270µL). El volumen final en cada pozo fue de 300 µL como en todos los casos.

Las columnas y filas periféricas de la microplaca, se llenaron con agua destilada.

Una vez que se llenaron todos los pozos de la microplaca, se procedió a realizar la lectura inicial en el fluorómetro de microplacas, enseguida, se taparon, incubaron y agitaron para realizar finalmente la lectura correspondiente a las 72 horas; todo esto de la misma forma señalada en el protocolo descrito para la curva de crecimiento algal.

• Tratamiento de Datos

Una vez efectuada la última lectura en el fluorómetro de microplacas, se procedió a calcular el valor final de UFA´s para cada concentración ensayada, de acuerdo con la siguiente relación:

BnCnFcn UFAUFAUFA −=

Donde:

=FcnUFA Unidades de Fluorescencia Absoluta finales de la Concentración n.

=CnUFA Unidades de Fluorescencia Absoluta promedio para la Concentración n.

=BnUFA Unidades de Fluorescencia Absoluta del Blanco para la Concentración n.

El valor obtenido se utilizó en la ecuación de la recta que se generó con el análisis de regresión realizado para la curva de calibración ya señalada. De este modo, se calculó la concentración celular correspondiente a cada concentración seleccionada del inhibidor. Con esta información y la del control de crecimiento que se colocó en cada microplaca, fue posible calcular el porcentaje de inhibición en el crecimiento en cada concentración de los inhibidores evaluados para luego determinar la EC50 utilizando el método Probit o de unidades probabilísticas descrito en Stephan, (1977). Con el fin de identificar la variabilidad en la respuesta de la cepa y del propio análisis, se realizaron 5 pruebas de toxicidad a diferentes tiempos con cada inhibidor. De este modo, se obtuvo el coeficiente de variación para cada uno de los 18 productos evaluados.

15

La sensibilidad en la respuesta de la cepa de P. subcapitata se determinó con Cr (VI) a partir de dicromato de potasio (K2Cr2O7) de alta pureza (99.8%) fabricado por J. T. Baker.

Al inicio y término de cada prueba, se registró la temperatura y el pH en cada una de las concentraciones que se prepararon por inhibidor.

La prueba se consideró válida, si al término de la misma, el incremento celular en el control de crecimiento fue de al menos 16 veces, el pH no varió en mas de 1 unidad entre el tiempo inicial y el final (Environment Canada, 1992) y la temperatura se mantuvo en 25.5 ± 1.5°C.

Evaluación de la toxicidad con cladóceros de distribución regional.

Los cladóceros se colectaron a partir de muestreos realizados dentro del corredor de ductos Atasta-Cd. Pemex. La colecta se efectuó de dos formas: mediante arrastre empleando una red de zooplancton de 100 µm de apertura de malla y mediante remoción de las raíces de macrofitas flotantes, principalmente de lirio acuático (Eichhornia crassipes). Una vez que se realizó la colecta de muestras, se separó a los organismos del Orden Anomopoda (antes Cladocera) y se les transfirió a recipientes de polipropileno de 500 mL con agua del medio en el que se colectaron previamente filtrada con filtros Whatman del No. 1. Una vez en estos recipientes, se añadió 1 mL de concentrado algal a base de Ankistrodesmus falcatus a una concentración aproximada de 4E+08 cel mL-1 y se colocaron en un lugar fresco hasta su traslado al laboratorio. Una vez ahí, se separaron los organismos, colocando, cuando se observó, a una hembra grávida por recipiente con agua del medio original y agua reconstituida dura (EPA, 2002) en la misma proporción, la que fue variando paulatinamente hasta ser por completo agua reconstituida. El alimento fue A. falcatus a una concentración celular aproximada de 400,000 cel mL-1.

Cuando se estabilizó el cultivo, se continuó con la identificación taxonómica, obteniéndose las siguientes dos especies:

Scapholeberis armata freyi (Branchiopoda:Anomopoda) Dumont y Pensaert, 1983.

Macrothrix elegans (Branchiopoda:Anomopoda) Sars, 1901.

Como se indicó en los resultados de la etapa previa del proyecto, se definieron experimentalmente las mejores condiciones para la propagación de estad dos especies de cladóceros y para la producción controlada de organismos de prueba.

16

En las pruebas de toxicidad que se realizaron con estas dos especies, se determinó la concentración que ocasiona la mortalidad en el 50% de los organismos expuestos (CL50) utilizando de manera general los métodos referidos por Environment Canada (1992) y el de la NMX-AA-087-1995-SCFI (SECOFI, 1995).

El agua utilizada tanto para los cultivos, como para las pruebas de toxicidad, fue dura reconstituida preparada según U.S.EPA ( 2002), aunque adicionada con 0.001 mg L-1 de selenio en forma de selenito de sodio, ya que se ha visto que reduce la posibilidad de daño de la porción birrámea del segundo par de antenas de los cladóceros (Winner, 1989), la presencia de abortos masivos en cultivos a 25 °C (Winner y Whitford, 1987), aumenta el vigor (Cooney et al., 1992) y la sobrevivencia y reproducción bajo condiciones de prueba (Cooney et al., 1992a).

La calidad final del agua reconstituida se presenta en la Tabla siguiente:

Tabla 3.- Calidad final del agua dura reconstituida

P A R Á M E T R O Oxígeno dis. (mg L-1)

Dureza (mg CaCO3 L-1)

Alcalinidad (mg CaCO3 L-1)

pH

5-7

160-180

110-120

7.6-8.0

Una vez que se cultivaron las dos especies de cladóceros en las condiciones determinadas, se obtuvo su descendencia, que se empleó en los ensayos con los inhibidores de corrosión e incrustación, utilizando animales con edad de hasta 24 horas y provenientes de la tercer camada en adelante. El procedimiento de las pruebas de toxicidad, de sensibilidad con Cr+6, de obtención de resultados y el número de repeticiones que se realizaron con estas dos especies, fueron los mencionados para Ceriodaphnia dubia, como se describió en el informe anterior.

17

RESULTADOS

Evaluación de la toxicidad aguda con organismos acuáticos.

Pseudokirchneriella subcapitata

Se realizaron el mismo número de pruebas y réplicas mencionadas para V. fischeri aunque para este caso el tiempo de exposición fue de 72 horas (CE50 a 72 horas) además, se corrieron 2 pruebas con el tóxico de referencia Cr+6 y dos pruebas más con el solvente de inhibidores base hidrocarburo (NaOH). Los valores promedio de CE50 en mg L-1, se resumen en la Tabla 4, junto con datos de estadística básica como valor máximo, mínimo, desviación estándar, intervalo de confianza al 95% y coeficiente de variación para cada inhibidor probado.

Los tres inhibidores utilizados en oleogasoductos (OLEOGAS-01 al 03), presentaron promedios de mayor a menor toxicidad que van de 6.71 a 53.8 mg L-1; es decir, la diferencia entre el más y el menos tóxico fue de 8 veces. El inhibidor más tóxico en este uso fue el OLEOGAS-02 y el menos tóxico el OLEOGAS-03. El coeficiente de variación más bajo se dio con el producto OLEOGAS-02 con 10.27% y el más alto con el OLEOGAS-01 con 27.08%.

En el caso de los dos inhibidores de incrustación (anti-incrustantes), presentaron valores promedio de CE50 similares entre sí ya que con el I-01 se obtuvieron 107.62 mg L-1 y con el I-02 86.79 mg L-1. La variación entre uno y otro, apenas fue de 1.2 veces Los coeficientes de variación, fueron de 17.56% para el señalado primero y de 39.41% para el segundo.

En cuanto a los dos inhibidores usados en gasolinoductos, los valores promedio de CE50 fueron parecidos entre sí (como también lo fueron entre sí, en el caso de V. fischeri señalado anteriormente) ya que el GASOL-01 presentó 55.45 mg L-1 y el GASOL-02, 55.80 mg L-1. Los coeficientes de variación fueron bajos ya que el primer producto mencionado alcanzó 11.06% y el segundo apenas 5.51%.

En lo que se refiere a los tres productos usados en gasoductos se puede apreciar en la Tabla 4 que también fueron resultados muy parecidos entre sí. El producto GAS-01 registró 5.10 mg L-1; mientras que los dos restantes (GAS-02 y GAS-03) presentaron 8.73 y 8.10 mg L-1, en ese orden; es decir, apenas una diferencia entre el menos y el más tóxico de 1.70 veces. Los coeficientes de variación fueron bajos para los tres productos pues como se puede observar en la Tabla 4, el más alto apenas alcanzó 13.15%.

18

Los dos productos usados en tuberías empacadas tuvieron valores promedio de CE50 de 21.46 mg L-1 para el producto E-01 y de 3.11 mg L-1 para el E-02. La diferencia entre uno y otro fue de de casi 7 veces. Los coeficientes de variación fueron reducidos pues en el primer producto fue de 17.33% y en el segundo de 15.76%.

Tabla 4.- Valores de CE50 (mg L-1) a 72 horas obtenidos en las pruebas realizadas con inhibidores de corrosión e incrustación (anti-incrustantes) utilizando el alga clorofícea Pseudokirchneriella subcapitata. Los valores que se presentan son: promedio, máximo, mínimo, desviación estándar, intervalos de confianza (P=95%) y coeficiente de variación (%). El número de pruebas realizadas por producto fue de 5. Se incluyen los resultados con Cr+6 (tóxico de referencia) y con NaOH.

INHIBIDOR USO promedio máx mín desv. std.

I. C. (95%)

C. V.

(%)

OLEOGAS-01 Oleogasoductos 20.358 28.97 14.72 5.513 4.832 27.08



I-01 Anti-incrustante 107.626 127.67 80.87 18.904 16.570 17.56


GASOL-01 Gasolinoductos 55.454 63.96 49.36 6.133 5.376 11.06


GAS-01 Gasoductos 5.108 5.83 4.31 0.642 0.563 12.57

GAS-02 Gasoductos 8.734 9.66 8 0.656 0.575 7.51

GAS-03 Gasoductos 8.102 9.83 7.04 1.066 0.934 13.15

E-01 Empacados 21.462 25.54 15.99 3.718 3.259 17.33

E-02 Empacados 3.118 3.82 2.56 0.491 0.431 15.76

OLEO-01 Oleoductos 9.248 10.47 8.08 1.008 0.884 10.90

OLEO-02 Oleoductos 2.534 3.18 2.1 0.401 0.351 15.81

OLEO-03 Oleoductos 47.734 51.95 43.35 4.110 3.603 8.61

M-01 Multifuncionales 21.132 29.24 17.33 4.705 4.124 22.27



Tóxico de referencia (Cr+6) 0.16 0.162 0.158 0.003 0.002 1.77

Solvente de inhibidores base hidrocarburo (NaOH) 292.7 305.12 280.28 17.565 15.396 6.00

19

Para el caso los tres productos utilizados en oleoductos, las diferencias en el valor promedio de CE50 fueron considerables pues mientras en el producto OLEO-02 se registró un promedio de 2.534 mg L-1 en el OLEO-03, éste fue de 47.73; es decir, una diferencia de casi 19 veces como se puede ver en Tabla 4. Los coeficientes de variación en ningún caso superaron el 16%, por lo que se considera que son bajos.

En los tres inhibidores multifuncionales que se evaluaron con P. subcapitata, el promedio más bajo y por lo tanto, el producto más tóxico fue el M-01 con una CE50 de 21.13 mg L-1 y el más alto, con ello el menos tóxico fue el M-02 con 55.65 mg L-1. La diferencia entre los valores extremos fue de 2.6 veces. El coeficiente de variación mas bajo fue de 9.76% para el producto M-02 y el más alto de 22.27% para el M-01, con un valor muy cercano a este último de 22.36% para el M-03.

En la Figura 3, se puede observar el gradiente de toxicidad que se obtuvo con todos los productos evaluados utilizando a la microalga P. subcapitata como organismo de prueba. El producto OLEO-01 fue el que resultó con mayor toxicidad, seguido por el E-02 y el GAS-01.

Con toxicidad intermedia se encontraron el OLEOGAS-01, OLEOGAS-03, los tres productos multifunción (M-01, M-02 y M-03) y el E-01. Los de menor toxicidad fueron los anti-incrustantes (I-01 e I-02) aunque como se puede observar en la Figura 3, fueron los de mayor variabilidad en la respuesta evaluada pues las barras de desviación estándar fueron las de mayor amplitud de todos los productos probados. La diferencia entre el producto más y el menos tóxico fue de 42.47 veces.

0

20

40

60

80

100

120

140

OLE

O-0

2

E-02

GA

S-01

OLE

OG

AS-

02

GA

S-03

GA

S-02

OLE

O-0

1

OLE

OG

AS-

01

M-0

1

E-01

M-0

3

OLE

O-0

3

OLE

OG

AS-

03

GA

SOL-

01

M-0

2

GA

SOL-

02

I-02

I-01

I N H I B I D O R E S

CL 5

0 (m

g L-1

)

Fig. 3.- Gradiente de toxicidad obtenido con inhibidores de corrosión e incrustación (anti-incrustantes) utilizando a P. subcapitata como organismo de prueba. Se presentan los valores promedio ± desviación estándar.

20

Del mismo modo señalado para Microtox® en párrafos previos, si se considera la clasificación de la CEFAS (2000) que fue comentada antes, los primeros siete productos de la Figura 3 que se evaluaron con la microalga P. subcapitata, se clasificarían como Tóxicos pues los valores promedio obtenidos están entre 1 y 10 ppm; los restantes con excepción del último, en Toxicidad intermedia pues los valores de CE50 estuvieron entre 10 y 100 ppm; mientras que uno de los dos productos anti-incrustantes (el I-01) en Toxicidad Baja pues el rango obtenido con el promedio de CE50 estuvo entre 100 y 1,000 ppm.

Derivado de la conjunción de todos los resultados de CE50 que se obtuvieron por cada uno de los 7 usos incluidos en esta tesis para los ensayos realizados con la microalga P. subcapitata, en la Tabla 5 se indican los valores promedio globales y los intervalos de confianza (P=0.05) correspondientes.

Tabla 5.- Valores de CE50 (mg L-1) promedio globales obtenidos con P. subcapitata para cada uso o servicio de los inhibidores.

De modo que el gradiente de toxicidad por USOS, de mayor a menor, que resultó con los promedios señalados en la Tabla anterior, fue el siguiente:

Gasoductos > Empacados > Oleoductos > Oleogasoductos > Multifuncionales > Gasolinoductos > anti-incrustantes

En lo que respecta al tóxico de referencia utilizado con P. subcapitata (Cr+6) en las dos pruebas que se corrieron a diferentes tiempos, los valores obtenidos fueron

USO O SERVICIO DEL INHIBIDOR

Promedio global de CE50 ± I. C. al 95%

Oleogasoductos 26.95 ± 18.77

Anti-incrustante 97.21 ± 24.78

Gasolinoductos 55.62 ± 0.4.01

Gasoductos 7.31 ± 1.57

Empacados 12.29 ± 8.75

Oleoductos 19.83 ± 18.17

Multifuncionales 35.23 ± 14.16

21

prácticamente idénticos pues en uno el resultado fue de 0.160 ±0.002 mg L-1 y en el segundo de 0.162 mg L-1, lo que se traduce en un coeficiente de variación de apenas 1.77%. Este valor podría indicar que la reproducibilidad de la prueba y su replicabilidad es muy alta aún cuando sólo se realizaron 2 pruebas.

El hidróxido de sodio (NaOH) utilizado en este trabajo como solvente de inhibidores base hidrocarburo, el cual se probó con todas las especies que se utilizaron, registró un valor promedio de CE50 resultante de dos ensayos corridos a diferentes tiempos de 292.7 ±15.39 mg L-1, valor 20 veces más alto que la máxima concentración utilizada para disolver un inhibidor base hidrocarburo en agua, como fue señalado.

Scapholeberis armata freyi

Se realizaron el mismo número de pruebas y réplicas mencionadas para V. fischeri en el informe anterior; aunque en este caso el tiempo de exposición fue de 48 horas (CL50 a 48 horas) además, se corrieron 5 pruebas con el tóxico de referencia Cr+6 y dos pruebas más con el solvente de inhibidores base hidrocarburo (NaOH). Los valores promedio de CL50 en mg L-1, se resumen en la Tabla 6, junto con datos de estadística básica como valor máximo, mínimo, desviación estándar, intervalo de confianza al 95% y coeficiente de variación para cada inhibidor probado.

Los tres productos utilizados en oleogasoductos, presentaron promedios de CL50 diferentes entre sí. De mayor a menor toxicidad, fueron de 0.714, 5.856 y 16.568 mg L-1 para los productos OLEOGAS-01, OLEOGAS-02 y OLEOGAS-03, respectivamente. La diferencia entre el más y el menos tóxico fue de 23 veces. Los tres coeficientes de variación que se calcularon fueron menores a 30% como se observa en la Tabla 6, lo que indica una variación tolerable entre pruebas con el mismo producto.

En lo que respecta a los dos inhibidores de incrustación (anti-incrustantes), éstos presentaron valores promedio de CL50 con esta especie, similares entre sí y con los otros dos cladócero ya mencionados (C. dubia y D. magna). Con el producto E-01 se obtuvieron 2913.75 y en el E-02, 3075.78 mg L-1. Los coeficientes de variación que se calcularon fueron aceptables pues estuvieron debajo del 15% en ambos productos.

En cuanto a los dos inhibidores usados en gasolinoductos, los valores promedio de CL50 tuvieron una diferencia superior a 2 veces pues con el GASOL-01 se obtuvieron 0.82 mg L-1 y con el GASOL-02, el promedio fue de 1.94 mg L-1. La variabilidad resultante fue elevada aunque aceptable en el caso del producto GASOL-01 ya que el coeficiente calculado fue de 49.12%. En cuanto al producto restante (GASOL-02), se obtuvo una variación menor, la cual fue del 26.66% como se aprecia en la Tabla 6.

22

Tabla 6.- Valores de CL50 (mg L-1) a 48 horas obtenidos en las pruebas realizadas con inhibidores de corrosión e incrustación (anti-incrustantes) utilizando al cladócero Scapholeberis armata freyi. Los valores que se presentan son: promedio, máximo, mínimo, desviación estándar, intervalos de confianza (P=95%) y coeficiente de variación (%). El número de pruebas realizadas por producto fue de 5. Se incluyen los resultados con Cr+6 (tóxico de referencia) y con NaOH.


I. C. (95%)

C. V.

(%)








GAS-01 Gasoductos 3.062 4.17 2.57 0.642 0.563 20.96

GAS-02 Gasoductos 8.88 13.53 5.61 3.356 2.942 37.79

GAS-03 Gasoductos 5.834 8.22 4.75 1.403 1.230 24.05

E-01 Empacados 0.22 0.36 0.13 0.094 0.082 42.76

E-02 Empacados 0.52 0.87 0.27 0.218 0.191 41.93

OLEO-01 Oleoductos 8.022 10.37 5.31 2.029 1.778 25.29

OLEO-02 Oleoductos 3.644 4.43 3.2 0.485 0.425 13.32

OLEO-03 Oleoductos 1.65 2.09 1.12 0.359 0.315 21.75





Solvente de inhibidores base hidrocarburo (NaOH)

54.47 55.69 53.25 1.725 1.512 3.17

23

En cuanto a los tres productos usados en gasoductos, se pueden apreciar en la Tabla anterior valores promedio de CL50 parecidos pues la diferencia entre el más y el menos tóxico apenas alcanzó 2.9 veces. El producto más tóxico fue el GAS-01 con 3.062 mg L-

1; seguido por el GAS-03 con 5.83 mg L-1. El menos tóxico fue el GAS-02 con 8.88 mg L-1. Los coeficientes de variación fueron tolerables aun cuando uno de ellos (el calculado para el producto GAS-02) estuvo cercano al 40% como se puede apreciar en la Tabla 6.

Los dos productos usados en tuberías empacadas tuvieron una diferencia entre uno y otro de apenas 2.3 veces. El menos tóxico fue el E-02 con 0.52 mg L-1 y el más tóxico fue el E-01 con 0.220 mg L-1. Los coeficientes de variación resultaron altos aunque tolerables; ambos superaron el 40% como se observa en la Tabla 6.

En lo que concierne a los tres productos utilizados en oleoductos, la diferencia entre el mas y el menos tóxico fue de 4.8 veces. El producto OLEO-03 fue el de mayor toxicidad con una CL50 promedio de 1.65 mg L-1, mientras que la toxicidad intermedia fue para el OLEO-02, con 3.64 mg L-1: El menos tóxico fue el OLEO-01 con 8.022 mg L-1. Los coeficientes de variación de los tres productos se consideran tolerables pues estuvieron por debajo del 30%, como aparece en la Tabla anterior.

En cuanto a los tres inhibidores multifuncionales que se evaluaron con S. armata, los promedios resultantes fueron muy diferentes entre sí, como lo fue con las dos especies de cladóceros antes mencionadas. La diferencia entre el menos y el más tóxico fue de casi 50 veces. El producto más tóxico fue el M-03 con una CL50 promedio de 0.536 mg L-1 contra 26.25 mg L-1 del M-01. El producto M-02 presentó una toxicidad intermedia con 17.51 mg L-1. El coeficiente de variación en los tres casos es muy bajo pues en ningún caso se superó el 12% como se aprecia en la Tabla 6.

En la Figura 4, se puede observar el gradiente de toxicidad que se obtuvo con todos los productos evaluados utilizando como organismo de prueba al cladócero S. armata freyi. Cinco productos resultaron ser los de más alta toxicidad (del producto E-01 al GASOL-01) y el resto con toxicidad intermedia excepto los productos anti-incrustantes (I-01 e I-02) que de nueva cuenta fueron los de menor toxicidad, aunque también con la mayor variabilidad en la respuesta evaluada pues las barras de desviación estándar fueron las de mayor amplitud de todos los productos probados, aunque en la Figura no se aprecie por la escala utilizada (ver Tabla 6). La diferencia entre el producto más y el menos tóxico fue de 13,980.85 veces, la cual resultó ser el doble de las que se obtuvieron con C. dubia y D. magna antes mencionadas, por lo cual de nueva cuenta la escala utilizada fue de tipo logarítmico como se puede apreciar en la Figura 4.

24

Del mismo modo señalado previamente para Microtox®, las dos algas clorofíceas y los dos cladóceros (D. magna y C. dubia), de acuerdo con la clasificación de la CEFAS (2000), los primeros cinco productos de la Figura 4, se clasificarían como Altamente Tóxicos pues los valores promedio obtenidos fueron menores a 1 ppm; los siguientes ocho (del producto OLEO-03 al GAS-02) se clasificarían como Tóxicos pues los valores de CL50 estuvieron entre 1 y 10 ppm; tres más se considerarían en Toxicidad Intermedia (productos OLEOGAS-03, M-02 y M-01) pues el rango de CL50 que se obtuvo con esos productos estuvo entre 10 y 100 ppm. Por último y al igual que la respuesta con C. dubia y D. magna, los dos productos anti-incrustantes, se considerarían en la categoría de No Tóxicos pues el promedio de CL50 que se obtuvo con ellos, fue superior a 1,000 ppm.

Derivado de la conjunción de todos los resultados de CL50 que se obtuvieron por cada uno de los siete usos incluidos en esta tesis para S armata freyi, en la Tabla 7 se indican los valores promedio globales y los intervalos de confianza (P=0.05) correspondientes.

El gradiente de toxicidad por USOS, de mayor a menor, que resultó con los promedios señalados en la Tabla anterior, para S. armata freyi, fue el siguiente:

Empacados > Gasolinoductos > Oleoductos > Gasoductos > Oleogasoductos > Multifuncionales > anti-incrustantes

0.1

1

10

100

1000

10000

E-01

E-02

M-0

3

OLE

OG

AS-

01

GA

SOL-

01

OLE

O-0

3

GA

SOL-

02

GA

S-01

OLE

O-0

2

GA

S-03

OLE

OG

AS-

02

OLE

O-0

1

GA

S-02

OLE

OG

AS-

03

M-0

2

M-0

1

I-01

I-02


CL 5

0 (m

g L-1

)

Fig. 4.- Gradiente de toxicidad obtenido con inhibidores de corrosión e incrustación (anti-incrustantes) utilizando a S. armata freyi como organismo de prueba. Se presentan los valores promedio ± desviación estándar en una escala logarítmica.

25

Tabla 7.- Valores de CL50 (mg L-1) promedio globales obtenidos con S. armata freyi para cada uso o servicio de los inhibidores.

USO O SERVICIO DEL INHIBIDOR

Promedio global de CE50 ± I. C. (95%)



Gasolinoductos 1.3800 ± 0.643


Empacados 0.3700 ± 0.196



El tóxico de referencia utilizado con S armata freyi, de la misma forma que con las dos algas clorofíceas y los cladóceros C. dubia y D. magna que ya se señalaron, fue cromo hexavalente. El promedio de CL50 resultante de cinco pruebas realizadas en diferentes tiempos fue de 0.114 ± 0.028 mg L-1: El coeficiente de variación fue ligeramente alto pero tolerable pues se obtuvo un 28.15% el cual se considera dentro de los límites permisibles de acuerdo con De Graeve et al. (1992).

El valor promedio de CL50 que se obtuvo en dos ensayos con hidróxido de sodio (NaOH), utilizado como solvente de inhibidores base hidrocarburo, fue de 54.47 ±1.512 mg L-1, valor 3.6 veces más alto que la máxima concentración utilizada para disolver un mililitro de inhibidor base hidrocarburo en agua (concentración máxima utilizada de 15 mg L-1 de NaOH).

Macrothrix elegans

Se realizaron el mismo número de pruebas y réplicas que ya fueron mencionadas para V. fischeri; aunque para este caso el tiempo de exposición fue de 48 horas (CL50 a 48 horas) además, se corrieron 5 pruebas con el tóxico de referencia Cr+6 y dos pruebas más con el solvente de inhibidores base hidrocarburo (NaOH). Los valores promedio de CL50 en mg L-1, se resumen en la Tabla 8, junto con datos de estadística básica como valor máximo, mínimo, desviación estándar, intervalo de confianza al 95% y coeficiente de variación para cada inhibidor probado.

26

Los tres productos utilizados en oleogasoductos, presentaron diferencias de hasta 5 veces entre el menos y el más tóxico. En el producto OLEOGAS-01 se cuantificó una CL50 promedio de 3.46 mg L-1; el más bajo y por ello el más tóxico; mientras que con el producto OLEOGAS-02 se registró un valor de 6.032 mg L-1; el tercer producto (OLEGAS-03) resultó con el promedio mas alto y por ello con la menor toxicidad, siendo esta de 17.59 mg L-1. Los tres coeficientes de variación que se calcularon fueron aceptables pues estuvieron por debajo del 30%, incluso el calculado para el producto OLEOGAS-02 fue de apenas 6.23% como se puede observar en la Tabla 8.

En lo que respecta a los dos inhibidores de incrustación (anti-incrustantes), éstos presentaron los valores de toxicidad más baja con esta y con todas las especies que ya se han mencionado (excepto V. fischeri). El promedio global que se deduce de cada uno de los dos valores promedio que se señalan en la Tabla 8, es aproximadamente de 3000 mg L-1: En particular, el valor del producto I-01 fue de 2849.93 mg L-1 y el del producto I-02 de 3287.52 mg L-1. Los coeficientes de variación que se calcularon fueron aceptables pues estuvieron debajo del 15% en ambos productos, igual que los señalados para S. armata freyi.

En los dos inhibidores usados en gasolinoductos, los valores promedio de CL50 que se registraron fueron similares entre sí, pues el de mayor toxicidad, apenas fue 1.09 veces más tóxico. En el producto GASOL-01 se obtuvieron 4.34 mg L-1 y en el GASOL-02, el promedio fue de 3.95 mg L-1. La variabilidad resultante fue tolerable pues se calcularon coeficientes de variación máximos de 31.78% como se puede apreciar en la Tabla 8.

En cuanto a los tres productos usados en gasoductos, se puede apreciar en la Tabla 8 que la diferencia entre el más y el menos tóxico fue de 2.75 veces. El producto más tóxico fue el GAS-01 con 4.31 mg L-1; seguido por el GAS-03 con 8.57 mg L-1. El menos tóxico fue el GAS-02 con 11.86 mg L-1. Los coeficientes de variación fueron aceptables pues los tres productos presentaron valores por debajo de 20% como aparece en la Tabla 8.

Los dos productos usados en tuberías empacadas tuvieron una diferencia entre uno y otro de apenas 1.22 veces. El menos tóxico fue el E-02 con 3.20 mg L-1 y el más tóxico fue el E-01 con 2.62 mg L-1. El coeficiente de variación resultó alto aunque tolerable para el producto E-02 con 33.61% y muy bajo para el E-01 con 9.94%, como se aprecia en la Tabla 8.

En los tres productos utilizados en oleoductos, la diferencia entre el más y el menos tóxico fue significativa pues alcanzó casi las 9 veces. El producto OLEO-02 fue el de mayor toxicidad con una CL50 promedio de 1.62 mg L-1, mientras que la toxicidad intermedia fue para el OLEO-03, con 5.23 mg L-1: El menos tóxico fue el OLEO-01 con 14.27 mg L-1. Los coeficientes de variación de los tres productos son aceptables.

27

Tabla 8.- Valores de CL50 (mg L-1) a 48 horas obtenidos en las pruebas realizadas con inhibidores de corrosión e incrustación (anti-incrustantes) utilizando al cladócero Macrothrix elegans. Los valores que se presentan son: promedio, máximo, mínimo, desviación estándar, intervalos de confianza (P=95%) y coeficiente de variación (%). El número de pruebas realizadas por producto fue de 5. Se incluyen los resultados con Cr+6 (tóxico de referencia) y con NaOH.


I. C. (95%)

C. V.

(%)








GAS-01 Gasoductos 4.318 5.51 3.57 0.721 0.632 16.70

GAS-02 Gasoductos 11.868 14.14 10.23 1.966 1.723 16.57

GAS-03 Gasoductos 8.576 10.1 7.37 1.175 1.030 13.71

E-01 Empacados 2.622 2.97 2.39 0.261 0.228 9.94

E-02 Empacados 3.208 4.44 2.07 1.078 0.945 33.61

OLEO-01 Oleoductos 14.27 18.36 10.76 3.147 2.758 22.05

OLEO-02 Oleoductos 1.62 2.03 1.36 0.270 0.237 16.67

OLEO-03 Oleoductos 5.236 6.31 4.8 0.629 0.551 12.01





Solvente de inhibidores base hidrocarburo (NaOH)

48.09 49 47.18 1.287 1.128 2.68

28

En el caso de los tres inhibidores multifuncionales que se evaluaron con M. elegans, los promedios resultantes fueron muy diferentes entre sí, como lo fue con las tres especies de cladóceros antes mencionadas (C. dubia, D. magna y S. armata freyi). La diferencia entre el menos y el más tóxico fue mayor a 25 veces. El producto más tóxico fue el M-03 con una CL50 promedio de 5.64 mg L-1 contra 141.73 mg L-1 del M-02. El producto M-01 presentó una toxicidad intermedia de 48.67 mg L-1. El coeficiente de variación en dos de los tres productos fue muy bajo (apenas 10.3% en el mayor de los dos); mientras que el del producto M-03 se considera tolerable pues este alcanzó 32.89% como lo indica la Tabla 8.

En la Figura 5, se puede observar el gradiente de toxicidad que se obtuvo con todos los productos evaluados utilizando como organismo de prueba al cladócero M. elegans.

Se puede apreciar en la Figura 5, a diferencia de las respuestas con los otros cladóceros, que todos los valores de toxicidad aguda obtenidos estuvieron por encima de 1 ppm; de éstos, once estuvieron por debajo de 10 ppm (del producto OLEO-02 al GAS-03); cinco mas por debajo de 150 ppm (del producto GAS-02 al M-02) y los productos anti-incrustantes (I-01 e I-02) de nueva cuenta fueron los de menor toxicidad. La diferencia entre el producto más y el menos tóxico fue de 2,029.33 veces, diferencia marcadamente menor que la obtenida con las otras tres especies de cladóceros.

1

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100

1000

10000

OLE

O-0

2

E-01

E-02

OLE

OG

AS-

01

GA

SOL-

02

GA

S-01

GA

SOL-

01

OLE

O-0

3

M-0

3

OLE

OG

AS-

02

GA

S-03

GA

S-02

OLE

O-0

1

OLE

OG

AS-

03

M-0

1

M-0

2

I-01

I-02


CL 5

0 (m

g L-1

)

Fig. 5.- Gradiente de toxicidad obtenido con inhibidores de corrosión e incrustación (anti-incrustantes) utilizando a M. elegans como organismo de prueba. Se presentan los valores promedio ± desviación estándar en una escala logarítmica.

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Del mismo modo que lo indicado previamente para Microtox®, las dos algas clorofíceas y los tres cladóceros (D. magna, C. dubia y S. armata freyi), de acuerdo con la clasificación de la CEFAS (2000), los primeros once productos de la Figura 5, se clasificarían como Tóxicos pues los valores promedio obtenidos estuvieron en el rango de 1 a 10 ppm; los siguientes cuatro se clasificarían en Toxicidad Intermedia pues los valores de CL50 estuvieron entre 10 y 100 ppm; uno solo en Toxicidad Baja pues el rango de CL50 que se obtuvo con ese producto estuvo entre 100 y 1000 ppm. Por último y al igual que la respuesta con C. dubia, D. magna y S. armata freyi, los dos productos anti-incrustantes, se considerarían en la categoría de No Tóxicos pues el promedio de CL50 que se obtuvo con ellos, fue superior a 1,000 ppm.

Derivado de la conjunción de todos los resultados de CL50 que se obtuvieron por cada uno de los 7 usos incluidos en esta tesis para M. elegans, en la Tabla 9 se indican los valores promedio globales y los intervalos de confianza (P=0.05) correspondientes.

Tabla 9.- Valores de CL50 (mg L-1) promedio globales obtenidos con M. elegans para cada uso o servicio de los inhibidores.

USO DEL INHIBIDOR Promedio global de CE50 ± I. C. (95%)



Gasolinoductos 4.1530 ± 1.085


Empacados 2.9150 ± 0.702



El gradiente de toxicidad por USOS, de mayor a menor, que resultó con los promedios señalados en la Tabla anterior, para M. elegans, fue el siguiente:

Empacados > Gasolinoductos > Oleoductos > Gasoductos > Oleogasoductos > Multifuncionales > anti-incrustantes

El tóxico de referencia utilizado con M elegans, de la misma forma que con las dos algas clorofíceas y los cladóceros que ya se señalaron, fue cromo hexavalente. El promedio de CL50 resultante de cinco pruebas realizadas en diferentes tiempos fue de

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0.36 ± 0.059 mg L-1: El coeficiente de variación es aceptable pues se calculó un 18.84%.

El valor promedio de CL50 que se obtuvo en dos ensayos con hidróxido de sodio (NaOH), utilizado como solvente de inhibidores base hidrocarburo, fue de 49.09 ±1.128 mg L-1, valor 3.2 veces más alto que la máxima concentración utilizada para disolver un mililitro de inhibidor base hidrocarburo en agua (concentración máxima utilizada de 15 mg L-1 de NaOH).

Discusión

Debido a que uno de objetivos de este trabajo fue el de establecer criterios BASE de toxicidad de los inhibidores de corrosión y de incrustación ó anti-incrustantes usados por Petróleos Mexicanos, a continuación se presentan los niveles de toxicidad de los productos evaluados. Para ello se retomará la clasificación establecida por el Centre for Environment, Fisheries & Aquaculture Science (CEFAS por sus siglas en inglés) en el año 2000, en la que se asignan jerarquías a los productos químicos usados en actividades petroleras Costa-Fuera en el Mar del Norte, incluidos en esta a los inhibidores de corrosión, en función al nivel de toxicidad acuática (medida como CE50 ó CL50) que presentaron con especies de referencia seleccionadas. Esta clasificación establece, en su categoría inicial, criterios que van desde productos de alta toxicidad (aquéllos con valores de CE ó CL50 menores a 1 mg L-1), hasta aquéllos que se consideran como No tóxicos (valores de CE ó CL50 mayores a 1,000 mg L-1 del producto evaluado). Estos criterios serán presentados en función a los usos de los inhibidores seleccionados, de las especies de prueba y de la interacción entre usos y especies.

A partir de los promedio de CE y CL50 globales obtenidos con las especies de prueba, se puede concluir que al agruparse los productos en función de su uso, por ejemplo, ductos empacados (EMPAC), anti-incrustantes (ANTI-INCRUST), etcétera, indicando que los tres productos utilizados en gasoductos (GAS) fueron los de mayor toxicidad pues el valor promedio obtenido fue de 5.07 mg L-1. Esto indica de acuerdo con el criterio del CEFAS (2000) que los productos de este uso son considerados Tóxicos pues el rango en el que se define a este criterio es de 1 a 10 mg L-1. Los gasoductos, tienen como grupos químicos funcionales en común, a los hidrocarburos aromáticos, derivados fenólicos y éteres en dos de ellos. Todos estos grupos químicos considerados de alta toxicidad como ya se mencionó en párrafos previos.

31

A los productos utilizados en líneas empacadas (EMPAC) y en oleoductos (OLEO) también se les asignó el mismo criterio, es decir Tóxicos como se puede apreciar en la Figura 6 aunque los valores promedio fueron de 6.56 y 6.83 mg L-1, respectivamente. Los grupos químicos en común para ambos usos, solamente fueron los hidrocarburos aromáticos y las aminas. En el caso particular de los productos usados en líneas empacados, los grupos químicos en común fueron las amidas y los derivados del azufre, posiblemente formando parte de bactericidas y tensoactivos.

Tres usos se colocaron en la clasificación de toxicidad intermedia, estos fueron el OLEOGAS con un promedio global de 13.02 mg L-1, el GASOL con 17.15 mg L-1 y el MULTI con 49.07 mg L-1. A pesar de esta asignación, la diferencia entre usos fue de 3.76 veces (diferencia poco notoria en la gráfica debido a la escala logarítmica utilizada) lo que, independientemente de la clasificación del CEFAS (2000), indica en terminos generales que uno de los usos con menor toxicidad fue el de los productos utilizados como multifuncionales (MULTI). Por otra parte, de los tres productos empleados en oleogasoductos, sólo uno de ellos presentó grupos funcionales de probada toxicidad como los derivados fenólicos (Producto OLEOGAS-02), además de los hidrocarburos saturados. En el caso de los productos usados en gasolinoductos (GASOL), fueron de los de mas baja diversidad en cuanto a grupos funcionales se refiere, sólo por encima de los anti-incrustantes. Los tres productos con uso multifunción (MULTI), fueron diversos entre sí pues sólo uno de ellos presentó éteres, alcoholes, derivados fenólicos

0.1

1

10

100

1000

10000

GAS EMPAC OLEO OLEOGAS GASOL MULTI ANTI-INCRUST

U S O S

CL

ó C

E 50 (

mg

L-1)

No tóxico

Toxicidad Baja

Toxicidad Intermedia

Tóxico

Altamente tóxico

0.1

1

10

100

1000

10000

GAS EMPAC OLEO OLEOGAS GASOL MULTI ANTI-INCRUST

U S O S

CL

ó C

E 50 (

mg

L-1)

No tóxico

Toxicidad Baja

Toxicidad Intermedia

Tóxico

Altamente tóxico

Fig. 6.- Valores promedio globales de CE ó CL50 obtenidos con las ocho especies utilizadas en este trabajo agrupadas de acuerdo al uso de los inhibidores de corrosión e incrustación (anti-incrustantes). Las líneas trazadas horizontalmente dividen los rangos de toxicidad de acuerdo con el criterio del CEFAS (2000).

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y del fósforo (M-01); los otros dos presentaron mayor proporción de grupos funcionales similares.

Los productos con menor toxicidad fueron los anti-incrustantes, pues el valor promedio global que se obtuvo con las especies utilizadas fue de 1,916.57 mg L-1 el cual es considerado de acuerdo con el criterio del CEFAS como No tóxico pues supera el límite inferior de 1,000 mg L-1 definido en referida clasificación. Los grupos químicos funcionales que se presentaron en los dos productos caracterizados fueron derivados de ácidos fosfónicos y de ácidos carboxílicos, los cuales se consideran de baja toxicidad o ambientalmente amigables y concuerdan con lo señalado por Hamounti et al. (1995) y Moretti et al. (2002) a este respecto. Por otra parte, la presencia de los mismos grupos funcionales en ambos productos, indica una gran semejanza química entre los dos productos.

Martin et al., (1999) señalan en su trabajo que la propiedad de las imidazolinas para reducir o inhibir la corrosión de estructuras metálicas se relaciona en gran medida, con el número de carbonos que constituyen a la molécula; es decir, una inhibición óptima se presenta con una longitud en la cadena alifática de 18 carbonos; inhibición razonable con 10 carbonos y por debajo de este límite, la eficiencia se reduce de manera significativa. En este mismo rango, la toxicidad de las imidazolinas muestra sus valores menos tóxicos, los cuales aumentan a medida que la cadena incrementa en el número de carbonos. Es factible que la diversidad química que presentaron los 18 inhibidores de corrosión caracterizados en este trabajo, tenga relación con la toxicidad global registrada. Lo anterior, se puede apreciar en la Figura 7 que se presenta a continuación en donde se observa de izquierda a derecha el aumento en el número de grupos funcionales de los productos utilizados, agrupados de acuerdo con su uso.

Se observa a la izquierda de la Figura, que los productos usados como anti-incrustantes sólo presentaron 2 grupos funcionales, los cuales además, son de baja toxicidad como ya se ha señalado. En la extrema derecha, se puede apreciar a los productos usados en líneas empacadas, los cuales presentaron la mayor diversidad química y también, como se señaló en la Figura 7, fueron de los más tóxicos junto con los usados en gasoductos, los cuales también fueron los segundos en diversidad química.

En general, los xenobióticos pueden ejercer efectos aditivos, sinérgicos o antagónicos en los organismos expuestos. Al parecer, los inhibidores de corrosión e incrustación (anti-incrustantes) utilizados, agrupados de acuerdo con su uso, fueron más tóxicos mientras mayor diversidad química presentaron por lo que tentativamente se les puede clasificar como productos con tendencia sinérgica.

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En una revisión efectuada a la asignación de criterios para productos utilizados costa fuera por la industria petrolera en el Reino Unido y que publica la CEFAS en Internet (http://www.cefas.co.uk/ocns/documents/RankedListOutputs.zip) para conocimiento de los fabricantes o distribuidores de esos productos químicos y para el público en general, se contabilizaron (en 39 de las 75 páginas de que consta todo el listado, el cual se liberó el 15 de agosto del 2006) un total de 596 productos tales como controladores de acidez, antiespumantes, solventes de asfaltenos, biocidas, salmueras, acarreadores de solventes, aditivos cementantes, coagulantes, anticongelantes, inhibidores de corrosión, emulsificantes, detergentes, dispersantes, lubricantes de perforación, colorantes, reductores de filtrado, floculantes, fluidos hidráulicos, atrapadores de gas sulfhídrico, aditivos de fluidos de perforación base agua y aceite, etc. De este total de productos, sólo el 4.02% se clasificó entre los criterios Altamente tóxico y Tóxico. Sólo el 6.04% en Toxicidad intermedia mientras que el 7.04% en Toxicidad baja. El 82.88% restante, en No tóxico. La misma distribución se calculó sólo para los inhibidores de corrosión y se encontró que el 22.22% de los productos, de un total de 36, se ubicaron entre Altamente tóxico y Tóxico (con sólo un producto en el criterio de Altamente tóxico); el 25% en Toxicidad intermedia, mientras que en Toxicidad baja el 16.66%. Los productos en la categoría de No Tóxico sumaron un 36.11% del total.

Lo anterior claramente denota que a nivel internacional, las compañías productoras o comercializadoras de inhibidores de corrosión invierten parte de sus ganancias en

0

2

4

6

8

10

12

ANTI-INCRUST

GASOL OLEOGAS OLEO MULTI GAS EMPAC

U S O S

PRO

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CIO

NA

LES

Fig. 7.- Grupos químicos funcionales de los inhibidores utilizados en este trabajo, agrupados de acuerdo a su uso. Se presentan los valores promedio de cada uso ± la desviación estándar. En el caso de de los usos ANTI-INCRUST y GASOL, la barra de error estándar no existe pues el número de grupos funcionales en cada producto fue el mismo.

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realizar investigación para diseñar productos eficientes para inhibir la corrosión de las líneas de transporte de hidrocarburos (Gough, 2000). Lo cual, tal parece que no acontece en nuestro país, pues el 97.91% de los valores promedio que se obtuvieron (ver Fig. 29) indicaron que los productos evaluados se encontraron entre los criterios de Altamente tóxicos y Toxicidad Intermedia.

CONCLUSIONES

Con el fin de identificar los criterios basales de toxicidad y biodegradabilidad en los que se encuentran los inhibidores de corrosión e incrustación usados en México, y a partir de ellos definir límites máximos permisibles susceptibles de ser incluidos en la normatividad correspondiente, en este trabajo se efectuaron pruebas de toxicidad y de biodegradabilidad-detoxificación con dichos productos químicos. En la primera serie de pruebas se emplearon 18 productos representativos de la industria petrolera nacional, mientras que en las pruebas de biodegradabilidad-detoxificación se utilizaron sólo 7 de ésos, definidos en función a su toxicidad e importancia en cuanto a su aplicación en las líneas de transporte. Los productos evaluados se agruparon de acuerdo con su uso en los ductos, estos fueron: oleogasoductos, gasolinoductos, gasoductos, empacados, oleogasoductos, multifuncionales y de incrustación (anti-incrustantes).

Los criterios basales de toxicidad indican de acuerdo con la clasificación del Center for Environment, Fisheries & Aquaculture Science (CEFAS por su acrónimo en inglés), entidad europea que se encarga de definir los niveles de contaminantes producidos por actividades petroleras en el Mar del Norte, que los productos utilizados para inhibir la corrosión en México se consideran tóxicos, pues entre el nivel de altamente tóxico (productos con CE ó CL50 de 0.1 a 1.0 mg L-1) y el tóxico (productos con CE ó CL50 de 1.0 a 10.0 mg L-1) se encontraron el 58.33% de los valores promedios obtenidos con todas las especies; el 39.58% en la categoría de moderadamente tóxico (productos con CE ó CL50 de 10 a 100 mg L-1) y sólo el 2.08% del total en el criterio de No tóxico (productos con CE ó CL50 mayor a 1,000 mg L-1). El origen de esta toxicidad puede deberse a la complejidad química identificada en los productos evaluados. Algunos de los grupos funcionales determinados mediante análisis de infrarrojo fueron: Hidrocarburos saturados, insaturados, aromáticos, amidas alifáticas, cetonas, aminas, éter, y derivados fenólicos, la mayoría de ellos de probada toxicidad aguda y crónica.

El gradiente de toxicidad (de mayor a menor) de los productos agrupados de acuerdo con su uso fue el siguiente:

GAS > EMPACADOS > OLEO > OLEOGAS > GASOL > MULTI > ANTI-INCRUST

35

Es necesario tomar en cuenta este gradiente en caso de un derrame accidental o fortuito, pues se pueden tomar medidas correctivas que estarán en función con la toxicidad del producto derramado.

La especie de prueba seleccionada para ser recomendada en la normativa de PEMEX aplicable a los inhibidores de corrosión (NRF-005-PEMEX) fue Macrothrix elegans, pues fue la que presentó la mas alta correlación en su comparación con las especies de referencia, principalmente con las correspondientes a su mismo nivel trófico (D. magna, r= 0.9608, C. dubia, r = 0.9016). Esta selección se realizó aún cuando la especie S. armata freyi, resultó con mayor sensibilidad que M. elegans, sin embargo también presentó menor correlación entre especies que M. elegans. Es necesario mencionar que la inclusión de una nueva especie de referencia o de prueba, implica primero, la estandarización del protocolo de ensayo y la realización de pruebas inter e intra laboratorios para identificar posibles variaciones en las respuestas de los organismos y del método de prueba; por lo que no se descarta que Daphnia magna se considere como especie de prueba sustituta en la normativa de PEMEX, en caso de que se enfrenten inconvenientes con M. elegans que no puedan resolverse con la prontitud necesaria. Además, Daphnia magna, se encuentra formando parte de las normas de referencia de México desde el año 1995, aun cuando no se distribuye en las aguas dulces del país.

LITERATURA CITADA

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Blaise, C., J. F. Ferard y P. Vasseur, 1997. Microplate toxicity tests with microalgae: a review. In: Wells, P.G., Lee, K., Blaise, C. (Eds.), Microscale Testing in Aquatic Toxicology: Advances, Techniques, Practice. CRC Press, Boca Raton, FL. pp. 269–288.

Blaise, C., G. Forget y S. Trottier, 1999.Toxicity Screening of Aqueous Samples Using a Cost-Effective 72-h Exposure Selenastrum capricornutum Assay. Technical Methods. 352-359.

CEFAS, 2000. Guidelines for the UK revised offshore chemical notification scheme. In Accordance With the Requirements of the OSPARCOM Harmonised Offshore Chemical Notification Format. Aberdeen U. K. 33 p.

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